DE2239740C3

DE2239740C3 - Verfahren zur Herstellung von Glykopeptid- Antibiotika

Info

Publication number: DE2239740C3
Application number: DE2239740A
Authority: DE
Inventors: Akio Yono Saitama Fujii; Yasuhiko Tokio Muraoka; Tomohisa Asaka Saitama Takita; Hamao Tokio Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1971-08-13
Filing date: 1972-08-12
Publication date: 1974-10-17
Also published as: FR2150775B1; CS168000B2; CH565745A5; GB1345320A; SU515461A3; JPS4828401A; AU4509172A; NL150119B; DK148482C; CA967561A; DE2239740A1; AU461403B2; DE2239740B2; FR2150775A1; NL7211052A; DK148482B; JPS5337321B2

Description

-CO-NH-CH₇-CH-

CO—NH-

mit Kaliumferricyanid, Ferrichlorid. Quecksilber- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn-

acetat. Mangandioxid. Bleidioxid, Benzochinon zeichnet, daß die Behandlung bei O bis 50 C durch-

oder Sauerstoff behandelt wird. 25 geführt wird.

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Glyko- 30 besondere im saurem Milieu, so daß es schwierig

peptid-Antibiotika. ist, derartige Antibiotika in hoher Ausbeute zu erhal-

Aus »The Journa: of A äbiotics«. Vol.A9, S. 82 ten. Es wurden Antibiotika untersucht, die dem Phleo-

bis 85 (1956),, Vol. Λ12. S.lll (1959). V0I.AI2. mycin ähnlich und in saurem Milieu stabil sind. AuPer-

S. 285 bis 289, ist das Antibiotikum Phleomycin be- dem wurde das Bleomycin gefunden, vgl. The Journal

kannt. Dieses Antibiotikum ist jedoch instabil, ins- 35 of Antibiotics, Vol. A19, S. 200 bis 209 (1966).

Wie gefunden wurde, hat das Bleomycin die Partialstruktur

N-

-CO-NH-CH₂-CH₂-Jl_x

CO—NH-

(II)

das Phleomycin jedoch die Partialstruktur

N— -CO-NH-CH₂-CH₂-I

CO—NH-

Diese Struktur (I) ist instabil und kann in die Fdruaisifükiur <!!}unicr Eüdung eines stabilen bioaktiven Glykopeptids übergeführt werden.

Demgemäß ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren /ur Herstellung von stabilen Glykopeptid-Antibiotika aus instabilen Glykopeptid-Antibiotika zu entwickeln.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß ein Phleomycin oder das Bleomycin-Phleomycin-Antibiotikum YA-56 mit der Partialstruktur

N tr- CO—NH-

—CO—NH-CH.

mit Kaliumferricyanid, Ferrichlorid, Quecksilberacetat, Mangandioxid, Bleidioxid, Benzochinon oder 'Sauerstoff behandelt wird.

Das Bleomycin-Phleomycin-Antibiotikum YA-56, das im Journal of Antibiotics, Vol.24, Nr. 10, S. 727 bis 731, beschrieben ist, gehört zu den instabilen

■/

Antibiotika. Es wurde aus der Kulturfiüssigkeit einer Variante von Streptomyees humidus isolieruind durch Fermentation während 5 bis 7 Tagen bei 27 C" in einem flüssigen Medium, enthaltend Glukose. Ghcerin. Dextrin. Sojabohnenmehl. NaCl. CaCO, und CuSO₄ gebildet.

Phieomycine werden unter anderem durch Kultivierung von Streptomyces flavoviridis gebildet. Sie können aus der Fermentationsflüssigkeil in Kupferkomplexform extrahiert werden. Es ist möglich, die Antibiotika mit Kupfer im Molekül als Ausgangsmaterial zu verwenden. Es sind .ber auch Antibiotika geeignet, denen das Kup.'cr unter Verwendung von Schwefelwasserstoff entzogen i.

Die Glykopeptid-Antibioiik · mt der Purlialstruk- lur(I) und (II) haben ehc.^4.· ι istische Ultravioleti-Absorptionsspekiren. Ci·· "■'<..'Bindungen mit der Par-.ialstruktur(I) haben ' .. UV-Spektrum Absorpii<>nsmaxima von F'\ i4d bis 160 bei 244 mu und E,¹"; 50 bis 60 bei .· «· nv*. Die Glykopeptid-Antibiolika mit der Partialstruktur (II) haben Absorptionsmaxima von EJ^ 150 bis 170 bei etwa 244 m_:i und Ei^ 120 bis 135 bei eiwa 293 ma. Beide Antib.otika haben jeweils zwei Absorptionsmaxjma. Das Verhältnis des Absorptionsmaximums der kürzeren Wellenlänge /um Absorptionsmaximum der längeren Wellenlänge beträgt etwa 2,8 für die ersteren Antibiotika und eiua 1.2 für die letzteren Antibiotika, so daß beide leicht identifiziert werden können.

Bei der Oxidation des Glykopeplid-Antibiotikums der Pariiaistruktur(I) wird das Antibiotikum in Wasser oder Methanol gelöst, und das Oxidationsmittel wird zugegeben Bei Verwendung von Mangandioxid wird dieses rjispergiert und bei 0 bis 5*0 C" 20 bis 240St'jnden zur Reaktion gebracht.

Das Reaktionsgemisch wird bei pielsweise /ur Abtrennung des Produkts mil der Partialstruktur (II) in Wasser gelöst und durch eine mit einem sauren Ionenaustauscher (f.in Carboxymethvlälherderivat von Dextrangel) beladene Kolonne geleitel, die mit NjCI-Lösung zur Absorption der Bestandteile vorbehandelt ist. Sodann werden die Bestandteile mit NaC'I-Lösung eluiert. wobei das nicht reagierende Produkt zuerst eliiiert wird und dann das Antibiotikum mit der Partialstruktur (II).

Die anfallende Lösung mit dem Antibiotikum der Partialstruktur (II) wird auf übliche Weise adsorbiert. z. B durch eine mit Aktivkohle beladene Kolonne, worauf die Kolonne zur Entfernung der anorganischen Salze mit Wasser gewaschen wird. Anschließend wird eine verdünnte HCI-Acetonmischung durchgeleitet, um das Endprodukt zu eluieren. Ein basisches Anionenaustauscherharz wird zum Eluat zur Einstellung auf pH 6.0 eeiiehen und Hh« Lösungsmittel abdestilliert, wobei das Endprodukt als Hydrochlorid anfällt.

Die Glykopeptid-Antibiotika mit der Partialstruktur (I) sind instabil und schwer durch Extraktion zu reinigen. Demgemäß ist es durchaus vorteilhaft, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Verunreinigungen enthaltende Produkte in der Anfangsstufc des Extraktionsreinigungsprozesses einzusetzen und in das stabile Produkt umzuwandeln. Beispielsweise wird erlindungsgemäS Phleomycin im üblichen Tank-Fcrmentationsverfahien gewonnen. Das f iltrat wird an ein saures Kationeru'ustauscherhar/(Methacryisäii repolymeresi adsorbiert, das Produkt mit verdünnter HCI-Lösung cluicn. r.cutralisicrl und an Aktivkohle adsor-

biert, sodann mit Wasser zur Entfernung der anorganischen Salze gewaschen. Das Produkt wird mit verdünnter HCl-Acetonmischung eluiert. worauf ein Anionenaustauscherharz zur Einstellung auf pH 6,0 zugegeben und das Aceton abdestilliert wird, wobei eine das rohe Phleomycin enthaltende wäßrige Lösung erhalten wird.

Das Phleomycin wurde auf chromatographischem Wege unter Verwendung von Aktivkohle, Aluminiumoxid und einem Carboxymethylätherderivat von Dextrangei gereinigt. Die gereinigte Phleomycinmischung wurde nochmals chrumatographisch mit einem Carboxymelhylätherderivat von Dextrangel gereinigt.

Die Resultate sind in F i g. 1 gezeigt, in der die Absorption bei 280 ΐτίμ an der Ordinate und die Zahl der Eluate an der Abszisse aufgezeichnet sind. Die punktierte Linie stellt die Konzentration von Natriumchlorid im Eiuat dar. die Buchstaben an den Spitzen der Kurven sind die Namen der Phleomycin-Komponenten.

Die Phieomycine D₁, E und G sind Glykopeptide mit der Partialstruktur (I). Die Phieomycine D₂. F und G' sind auf Grund des UV-Absorptionsspektrums Glykopeptide mit der Partialstruklur (II). Auf Grund der physiko-chemischen Eigenschaften und Säurehydrolyseprodukte der Phieomycine D₂ unu F ist D₂ das Bleomycin B₂ und F das Bleomycin B₄.

Die Phleomycinmischung wird mit Mangandioxid oxidiert, und die Produkte werden chromatographisch unter Verwendung von einem Carboxymethylätherderivat von Dextrangel bei den gieichen Bedingungen getrennt Die Resultate sind in Fig. 2 dargestellt, wobei die Peaks der Phieomycine D,, E und G erniedrigt sind, während die Peaks der Phieomycine D₂. Γ und CV erhöh', sind.

Nach einem Vergleichstest mit den Säurehydrolyseprodukten der Bestandteile haben gemäß F1 g. 2 die Umwandlungen D, —► D₂. E —» F und G —»■ C-' stattgefunden.

500 mgRohphleomycinmischung bzw. das mi; Mangandioxid oxidierte Produkt werden chrumatographisch mit einem Carboxymethylätherderivat von Dextrangel getrennt. Die Substanzmenger. beim nicht oxidierten und beim oxidierten Phleomycin sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.

Bcslandleil

Nicht oxidiertes	Oxidiertes PhI
Phleomycin	17 mg
39 mg	40 mg
22 mg	56 mg
114 mg	69 mg
ft mo —σ	43 mg
96 mg	45 mg
17 mg

D₁

D₂
E
F

ss G

G'

Im folgenden soll die Erfindung an Hand von Beispielen näher erläutert werden:

Beispiel 1

Phleomycin (Cu enthaltendes Hydrochlorid) mit einem Absorptionsmaximum von Ej^₁ 147 bei 244 πΐμ un·'. EJ* bei 300ιτίμ und Endabsorption im UV-Absorptionsspektrum in Methanol wurde verwendet.

20 mg pulverförmiges Phleomycin D₁ wurden in i cm³ Wasser gelöst und 20 mg Mangandioxid in

der Lösung suspendiert. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 40 Stunden unter Rühren behandelt.

Anschließend wurde filtriert und das Filtrat durch eine mit einem Carboxymethylätherderivat von Dextrangel beladene Kolonne geleitet. Der Ionenaustauscher war vorher zur Absorption des Reaktionsproduktes mit einer 0,05-rii NaCI-Lösung behandelt. Sodann wurde die Konzentration der NaCl^aLösung linear von 0.05-m bis l-m für die Elution des Reaktionsprodukte gesteigert Dabei wurde das nicht reagierte Phleomycin D, in der Fraktion mit 0.40-m NaCI eluiert. das Reaktionsprodukt Bleomycin B₂ in der Fraktion mit 0.44-m NaCI Letztere Fraktion wurde durch eine mit 1 ecm Aktivkohle beladcnc Kolonne zur Adsorption des Bleomycin B₂ geschickt und anschließend mit Wasser zur Entfernung der anorganischen Salze gewaschen Ein F.luat von O.02n-H('l-Aceton (1 I) wurde hindurchgclcilet. wobei eine blaue Lösung, enthaltend Bleomycin B, (Cu-haltiges Hydrochlorid) erhalten wurde.

Anionenaustauscherhar/ (Reaktioiisprodukl von Epichlorhydrin und Ammoniak) (OH-Typj wurde /um Eluat zur Einstellung auf pH 6.0 zugegeben, das Eluat filtriert, das Lösungsmittel entfernt und das Produkt getrocknet.

Ausbeute: 12mg pulverförmiger blaues Bleomycin B, tCu-haltiges Hydrochlorid).

Das Produkt hatte das spezifische UV-Absorptionsspektrum, das charakteristisch für Glykopepiidc mit der Partialstrukturill) ist und ein Absorptionsmaximum von EJX 159 bei 244 mu und FJX 127 bei 293 mu und Endabsorption in Methanol.

Das Endprodukt hatte einen Rf-Wert von 0.66 bei der Dünnschichichromatographie mit Silikagel

(CH₁OH 10% CH₁COONH₄ 10% NH₄OH
- 10:9:It

und einen Rf-Wert von 0.56 bei der Diinnschichtchromatoqraphie mn kristalliner Celluloss

In-C₄HyOH : Pyridin : CH₃COOH : W₁ 0
= 15:10:3:12)

Die Werte sind die gleichen wie bei Bleomycin B₂.

Die Hydrolysate des Produkts sind in Tabelle I aufgeführt Sie sind identisch mit denjenigen von Bleomycin B₂:

Tabelle I
Hydrolysate

I CH₃ - CH — CH — COOH

I I

OH NH₂

NH₂

J",

COOH ^NH2

II. CH,

> CH-CH₂COOH

III. CH3—CH — CH — CH — COOH
NH₂ OH

V. N [r-CH — CH- COOH

/ OfI NH₂
NH

V. NH₂-CH₂-CH-COOH

NH₂

^N IT
N j K J

COOH

Vl NH₂(H, CH₂

VII NH₂ CH₂ CH₂ CW₂ CH₂ NH C NH₂

NH

DieantimikrobiellcAfctivitäl gegen Mycobaklcrium smcgmatis 607 nach der Bccherprobe betrug

2s -720 U mg. Bei Standard-Bleomycin-A₂ in freier Base beträgt der Wert KKX) I; mg.

Die Stabilität des erhaltenen BIcomycins H₂ und des Ausgangsmatcrials I Phleomycin D₁) in saurem Milieu wurden verglichen Je 1.0 mg Bleomycin B₂

bzw. Phleomycin D, wurden in 10 ml '.,„,, n-HCI-Lösung gelöst und die Lösungen 1 Stunde bei pH 2 und bei 27 C gehalten. Die verbleibende antimikrobielle Aktivität gegen Mycobakterium smegmatis 607 wurde mit der Becherprobe gemessen. Die ursprüng-

3S liehe Aktivität erhält den Wert 100.

	I a belle II	/eil (Slundcnl	I	ή	2	24	72
		102 20.S	97 5.3	99 2.7	102 0
	(I	Beispiel
Erhaltenes Bleomycin B, Phleomycin D,	HX) HX)

20 mg pulverförmiges Phleomycin E (Cu enthaltendes Hydrochlorid) mit Absorplionsmaximum EiX 154 bei 244nw und EJX 57 bei 30Om-* und Endabsorption des UV-Spektrums in Methanol wurden wie nach Beispiel I oxidiert. Das Produkt wurde chromatographisch unter Verwendung von einem Carboxymethylätherderivat von Dextrangel enlspre-

chend Beispiel 1 getrennt. Das nicht reagierte Phleomycin E wurde in der Fraktion von QJO-R NaCi dajcri. das erhaltene Bleomycin B₄ in der Fraktion von 0.64-m NaCI. Entsprechend Beispiel 1 wurde die letztere Fraktion mit Aktivkohle behandelt, die Salze entferr'.. die Lösung neutralisiert das Lösungsmittel entfernt und das Produkt getrocknet.

Ausbeute: IOmg pulverförmiges blaues Bleomycin B₄ (Cu-haltiges Hydrochlorid).

Die erhaltene Verbindung hatte das UV-Absorp-

tionsspektrum der Glykopeptide mit der Partialstruktur(H) und Absorptionsmaxima von EJX 162 bei 244 πΐμ und EJX 130 bei 293 πΐμ sowic™Endabsorption in Methanol.

239 740

Die Verbindung hatte einen Rf-Wert von 0.5 bei der Dünnschichlchromalographie mit Silikagel

(CH₁OH : 10% CH₁COONH₄ : 10% NH₄OH
= 10:9:1)

und einen Rf-Wcrl von 0,54 bei Dünnschichtchromatographic mit kristalliner Cellulose

(CHjCH₂CH₂OH : Pyridin : CH₁COOH : H₂O
= 15: Kr: 3:12)

Die antimikrobielic Aktivität gegenüber Mycobaktcrium smcgmatis 607 nach dem Bechertest (Slandard-BIeomycin A₂. freie Base 1000 U mg) betrug 6354 U mg».

Die Stabilität des erhaltenen Bleomycms B₄ unü des Ausgangsmaterials (Phleomycin D, I in saurem Milieu wurde verglichen (Tabelle III)

/cn iSlundcnl

hrliallcncs Bleomycin B₄
Phleomycin I

KXi
100

95
I.X

Beispiel

20 mg pulverförmiges Phleomycin I)₁ (Cu-freics Hydrochlond) mit UV-Absorplionsmaxima EjX 150 bei 244 m< und E|^_m 56 bei 3(K) m-i sowie Endabsorplion in Methanol wurde wie nach Beispiel I oxidiert und das erhaltene Produkt chromatographisch mit einem Carboxytnelhylälherderivat von Dextrangel separiert. Das nicht reagierte Phleomycin D₁ wurde in der Fraktion von 0.42-m NaCl-Lluat eluicrt, das erhaltene Bleomycin B₂ in der Fraktion von 0.46-m NaCI-EIuat.

Wie nach Beispiel I wurde die letztere Fraktion mit Aktivkohle behandelt, die Sai/e entfernt, die Lösung neutralisiert, das Lösungsmittel entfernt und das Produkt getrocknet.

Ausbeute: 9mg pulverförmiges farbloses Bleomycin B₂ (Cu-freies Hydrochlond).

Dic erhaltene Verbindung hatte das spezifische UV-Absorptionsspektrum, das für Glykopeptide mit der Pariialsiruklur(Il) charakteristisch ist. Absorplionsmaxima: i\\ 161 bei 244 ma und Ej^, 127 bei 293 πΐμ sowie Lndabsorption (in Methanol, enthaltend CuSC)₄)

Die erhaltene Verbindung hat einen Rf-Wcrt νυπ 0.6/ bei der Dünnschichtchromatographie mil Silikagel

(CH₃OH : 10% CH₃COONH₄:: 10% NH₄OH
= 10:9:1)

und einen Rf-Wert von 0,48 bei der Dünnschichtchromatographie mit kristalliner Cellulose

(CHjCH₂CH₂OH : Pyridin : CHxCOOH : H_?O
" = 15'10:3:12)

Die antimikrobiell Aktivität gegen Mycobakterium smcgmalis 607 nach dem Bechertest (Standard-BIeomycin A₂. freie Base 1000 U.'mg) betrug 2680 U/mg

Beispiel 4

20 mg pulverförmiges Phleomycin D₁ (Cu enthaltendes Hvdrochlorid) mit Absorptionsmaximum von EJ* 147 bei 244 ιτίμ und EJ^ von 54 bei 300 ΓΠμ und Endabsorption des UV-Absorptionsspektrums in Methanol und 20 mg Kaliumferricyanid wurden in I ml Wasser gelöst und bei Raumtemperatur 48 Stunden zur Reaktion gebracht.

Das Reaktionsgemisch wurde durch eine mit 30 ml eines Carboxymethylätherderivats von Dextrangel beladerte. zuvor mit 0,05-m NaCl-Lösung behandelte Säule geschickt. Das Kaliumferricyanid und das Reaktionsprodukt liefen durch, jedoch das Phleomycin und das Rcaktionsprodiikl wurden unter Bildung eines

blauen Bandes am oberen Ende der Kolonne absorbiert Die Konzentration der NaCl-Lösung als Eluat wurde linear von 0.05-m bis 1.0-m bei der Elutionierung des Reaktionsprodukts gesteigert. Das nicht reagierte Phleomycin D, wurde in der Fraktion von 0.40 NuCI-Eluat cluicrt. das Reaktionsprodukt Bleomycin B₂ in der Fraktion des 0.44-m NaCI-Eluats.

Entsprechend Beispiel I wurde die letztere Fraktion mit Aktivkohle behandelt, die Salze wurden entfernt, die Lösung neutralisiert, das Lösungsmittel entfernt und das Produkt getrocknet.

Ausbeutet mg pulverförmiges blaues Bleomycin B₂ (Cu enthaltendes Hydrochloride

Die erhaltene Verbindung hatte das spezifische UV-Absorptionsspektrum, das für Glykopeptide mit der Partialstruktur(II) charakteristisch ist. mit AbsorpiHinsmaxima von EJ^_n, 156 bei 244 ΐτίμ und E[^, 124 bei - * ma sowie Endabsorption in Methanol.

Die erhaltene Verbindung hatte einen Rf-Wert von 0.66 bei der Dünnschichtchromatographie mit Silikagel

(CH₃OH 10% Ch₃COONH₄: 10% NH₄OK
- 10.9:1)

und einen Rf-Wert von 0,56 bei der Dünnsehieht-Chromatographie mit kristalliner Cellulose

(CH₁CH₂CH₂OH Pvridin CH₁COi)H H₂O
15:10:3.12)

B e i s ρ i e 1 5

lOOmgBlcomycin-Phleomyein-AntibiotikumYA-Sf» (Cu enthaltendes Hydrochloride bestehend zu 70 mg aus der X-Komponente mit Absorptionsmaxima EJ". 126.6 bei 246.5 m-i und EJ^ 45.6 bei 3(K) bis 303 mu sowie Endabsorption und 30 mg der Y-Komponente mit Absorptionsmaxima von EJ^_n, 134 bei 245.5 mu und Ej". 47 bei 302 mu sowie Endabsorplion in Methanol wurden in dest. Wasser gelöst und durch Zugabe von 1 n-Natriumbicarbonat auf pH 7.5

eingestelli.

20 mg pulverförmiges Mangandioxid wurden zur Lösung gegeben, und diese wurde bei 5 bis 8 C 9 Tage lang gerührt und dann zur Entfernung des Mangandioxids abfiltriert. Das Filtrat wnrdc unter Vakuum konzentriert und dann getrocknet: 96 mu Rohprodukt

Das Produkt wurde in 0.05 n-HCl gelöst, bei RauitiicfnpcfäiUf i& Stünden gcharicn. durch Zugabe von NaOH-Lösung auf pH 6.0 eingestellt, sodann in einer mit 100 ml eines Carboxymethylätherderivats von Dextrangel (Na ⁺ -Typ) beladenen Kolonne absorbiert.

Die Konzentration der NaCi-Lösung wurde linear von 005-m bis 1.0-m bei der Elusion des Rraktionsprodukis gesteigert unter Verwendung von 11 NaCI-Lösung.

Die Dehydro-Komponenle des YA-56 wurde in der Fraktion von 0.32-m NaCl-Eluat eluicrl. die

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Dehydro-X-Komponenle des YA-56 in der Fraktion von 0,38-m NaCI-Eluat. Die nicht reagierte ΥΛ-56Υ-Komponente wurde in der Fraktion von 6.44-m NaCI-Eluat eluiert, die nicht reagierte YA-56X-Komponcnle in der Fraktion von 0,48-m NaCI-Eluat.

Entspiechend Beispiel I wurde das erhaltene Produkt mit Aktivkohle behandelt, die Salze entfernt, die Lösung neutralisiert, das Lösungsmittel entfernt und das Produkt getrocknet. Ausbeute: 32 mg violettblaues Pulver der Dehydro-X-Komponcnte und 12 mg Dehydro-Y-Komponente des YA-56.

Die Dehydro-X-Kompi>nente des YA-56 hatte im UV-Spektrum Absorptionsmaxima von E!|°„ 153 bei 243 ιτίμ und EjI 116 bei 293 πΐμ in Methanol. Die Dehydro-Y-Komponente des YA-56 hatte Absorptionsmaxima von Ej^, 152 bei 242mu und EJ *_m 117 bei 292 νημ.

Die Rf-Werte der Dünnschichtchromatographic mit Silikagel

(CH₃OH : 10% CH₃COONH₄:10% NH₄OH
- 10:9:1)

betrugen 0,68 für die Dehydro-X-Komponcntc und 0,71 für die Dehydro-Y-Komponente des YA-56

Die Rf-Werte bei Dünnschichtchromatographie mit kristalliner Cellulose

(CH₃CHZH₂OH : Pyridin : CHjCOOH : H₂O

= 15:10:3:12)

betrugen 0.56 für die Dehydro-X-Komponcntc und 0.66 für die Deh>dro-Y-Komponente des YA-56

Die antimikrobiell Aktivitäten gegen Mycobukterium smegmatis 607 nach dem Bechertest (Slandard-Bleomycin A₂. freie Base 10(X) U/mg) betrugen 266511mg für die Dehydro-X-Komponente und 1848 U rng Fur die Dehydro-Y-Komponente des YA-56

Im sauren Hydrolysat der Dchydro-X- und -Y-Komponcntcn des YA-56 wurde die Aminosäure Nr. IV der Tabelle I gefunden, die für YA-56 charakterislisehe Ninhydrinpr^be bei der zweidimensionalen Papierchromatographie fiel positiv aus.

Die Stabilität der Verbindungen wurde wie nach Beispiel I gemessen (Tabelle IV):

Zimmertemperatur während 48 Stunden unter Rühren umgesetzt. Nach der Reaktion wird die Lösung abfiltrierl. Das F'illral wird durch Absorption und Eluierung chromatographisch gereinigt. Das nicht umgesetzte Phleomycin wird in der Fraktion von 0.28-m Natriumchlorid eluierl. und das angestrebte Produkt 3 - S.S - Dimclhylmercaptopropylamino - bleomycin (Bleomycin A₁. Cu-haltiges Hydrochlorid) wird in der Fraktion von 0.33-m Natriumchlorid eluiert. Die

ίο Lösung des Blcomycins A₂ in letzterem Elu.it wird gemiiß Beispiel 1 aufgearbeitet, wobei 40mg eines blauen pulverförmigen Bleomycin*A, (Cu-haltigcs Hydrochlorid) erhallen werden Das Produkt hat ein Absorptionsmaximum von F[^, - !61 bei 244mu undein weiteres Absorptionsmaximum von Ei"^ = 130 bei 293 mu sowie Endabsorption im UV-Absorptionsspektrum in Methanol Dieses Spektrum ist charakteristisch für Glykopeptidc der Formel II Die Rf-Wcrte des Produkts wurden gemiiß Beispiel I gemessen Die Werte sind 0.44 und 0.48. und sie einsprechen dem bekannten Bleomycin A, Die Aktivität gegen Mycnbakteriiim Mnegmatis 607 betragt 925 U mg.

■Z5

Tabelle IV

Erhaltene Dehydro-X-Komponente des YA-56

Erhaltene Dehydro-Y-Komponente des YA-56

YA-56X

YA-56Y

/cit !Stunden I

100

100
100
100

96

94
4.5

3.8

Beispiel 7

»eis pier ο K)O mg pulvriges l-Morphcihiio-propylamini'phleumyein (Cu-haltigcs Hydrochlorid) mit einem Absorptionsmaximum von ¥.l\ - 150 bei 244 nvz und mit einem weiteren Absorplionsmaximum von F.|X - 54 bei 3(X) mn und mit F.ndabsorption im UV-Absorptionsspektrum in Methanol sowie mit einer Aktivität gegen Mycobakterium smegmatis 607 von 474 U mg werden in 5 ml Wasser aufgelöst, und 50 mg Mangandioxid werden suspendiert, und das Ganze wird wah rend 48 Stunden unter Rühren bei Zimmertemperatur umgesetzt. Nach der Reaktion wird die Lösung abnitrier!, und das Filtrat wird absorbiert und eluiert und auf diese Weise chromatographisch gereinigt Das nicht umgesetzte Phleomycin wird in der Fraktion von 0.29-m Natriumchlorid eluiert. und das angestrebte Produkt 3-Morphofinopropylamino-bleomyein {Cu-haltiges Hydrochlorid) wird in der Fraktion von 0.34-m Natriumchlorid eluiert. Die Lösung des 3-Morpholinopropylamino-bleomycin* (Cu-halligcs

Hydrochloridl der letzteren Fraktion wird gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet, und man erhält 50 mg blaues pulvriges 3-Morpholinopropylamino-bIeomycin. Das Produkt hat Absorplionsmaxima von Ej^ = !59 bei 244 mu und von EJ* = 128 bei 293 mu sowie Endabsorption im UV-Absorptionsspektrum in Methanol. Dieses Spektrum ist charakteristisch Tür Glykopeptide mit der Formel II.

Die Rf-Werte des Produkts wurden gemäß Beispiel 1 gemessen und betragen 0,74 und 0,58 und sind identisch mit denjenigen von dem bekannten 3-Morpholinopropylamino-bleomycin (Cu-haltiges Hydrochlorid). Die Aktivität gegen Mycobakterium smegmatis 607 beträgt 587 U/mg.

100 mg pulveriges S-S.S-Dimethylmercaptopropylamino-phleomycin (Cu-haltiges Hydrochlorid) mit einem Absorptionsmaximum bei 244 mfi (Ej^, = 158) und mit einem Absorptionsmaximum bei 5'x)mu (Ε'"» = 55) und mit Endabsorption im UV-Absorptionsspektrum (in Methanol) sowie mit einer Aktivität Ecaen Mycobakterium smegmatis 607 von 865 U mg werden in 5 ml Wasser aufgelöst, und 50 mg Mangandioxid werden in der Lösung suspendiert und bei

Beispiel 8

100 mg pulvriges 3-N,N-DimethyIaminopropylamino-phleomycin (Cu-haltiges Hydrochlorid) mit einem Absorptionsmaximum von E{^ = 149 bei 244 ηΐμ und mit einem weiterem Absorptionsmaximum von EJi = 53 bei 300 ma sowie mit Endabsorption im UV-Absorptionsspektrum in Methanol sowie mit einer Aktivität gegen Mycobakterium smegmatis 607

von (>48 U mg werden in 5 ml Wasser aufgelöst, und 50 mg Mangandioxid werden in der Lösung suspendiert und unter Rühren bei /immcrieniperalur während 48 Stunden umgesel/l. Nach der Reaktion wird die Lösung abiiltriert. Das Filtrat wird chromaiographisch durch Absorption und nitrierung gereinigt. Das nicht umgesetzte Phleomycin wird in der Fraktion von 0,28-m Natriumchlorid cluiert, und das-angestrebte 3- N.N- Dimcthylaminopropylamino- bleomj ein (Cu-haltigcs Hydrochloridi wird in 0.33-m Natriumehlorid eluiert.

Die Lösung des cluiertcn Produkts (let/tere Fraktion) wird gemäß Heispiel I aufgearbeitet, und man

erhält 65 mg eines blauen pulvrigen 3-N,N-Dimethylaminopropylamino-bleomycin (Cu-haltiges Hydrochlorid).

Das Produkt hat ein Absorptionsmaximum von E\?„ = 162 bei 244 ιτίμ und ein Absorptionsmaximum von E[]"_m — 134 bei 293 ma sowie Endabsorption im UV-Absorptionsspektrum in Methanol. Dieses Spektrum ist charakteristisch für Glykopeptide mit der Formel II. Die Rf-Wertc des Produkts werden gemäß Beispiel 1 gemessen und betragen 0,44 bzw 0,55 und sind gleich denjenigen des bekannten 3-N,N-Dimethylaminopropylamino-bleomycins. Die Aktivität gegen Mycobakterium smegmatis 607 beträgt P20 U/mg.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von Glykopeptid-Antibiotika mit der Partialstruktur

N n— CO—NH-

—CO—NH-CH,-CH,

dadurchgekennzeichnet, daß ein Phleomycin oder das Bleoipycin-Phleomycin-Antibiotikum YA-56 mit der Partiaistruktur