DK148482B

DK148482B - Fremgangsmaade til fremstilling af et antibiotikum hoerende til bleomycingruppen

Info

Publication number: DK148482B
Application number: DK394472AA
Authority: DK
Inventors: Hamao Umezawa; Jp Tomohisa Takita; Yasuhiko Muraoka; Aklo Fujii
Original assignee: Microbial Chem Res Found
Priority date: 1971-08-13
Filing date: 1972-08-10
Publication date: 1985-07-15
Also published as: DE2239740A1; JPS5337321B2; SU515461A3; FR2150775A1; FR2150775B1; AU461403B2; DK148482C; GB1345320A; JPS4828401A; CH565745A5; CS168000B2; CA967561A; AU4509172A; NL150119B; NL7211052A; DE2239740B2; DE2239740C3

Description

U8482

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et antibiotikum hørende til bleomycingruppen og med delstrukturen: N—--i—CO-NH- (11)

I I

N-r\s/ -co-nh-ch2-ch2-*L ^

S

2 148482 I 1956 fandt opfinderne phleomyein, der er omtalt i "The Journal of Antibiotics", bind A9, side 82-85 (1956), bind A12, side 111 (1959) samt bind A12, side 285-289 (1959).

Phleomycinet er imidlertid ustabilt, især ustabilt i surt miljø, og det har således været vanskeligt at opnå antibiotikummet i stort udbytte. Antibiotika, der ligner phleomyein, og som er stabile i surt miljø, er blevet undersøgt, og der er herunder blevet fundet bleomycin som beskrevet i "The Journal of Antibiotics", bind A19, side 200-209 (1966).

Bleomycins struktur er blevet undersøgt, og det har vist sig, at der i bleomycins struktur indgår følgende delstruktur: N-j— CO-NH- f-(II) -i y

-CO-NH-CH2-CH2 \ s yS

Ved yderligere undersøgelser af phleomyein er det desuden blevet konstateret, at phleomyein har følgende delstruktur: N-T-CO-NH- II !l n-r\ s/ (i) 11 -CO-NH-CH2-CH2 —^ y i stedet for delstrukturen (II), og at delstrukturen (I) er ustabil men kan omdannes til delstrukturen (II) , således at det stabile bioaktive glycopeptid som hel forbindelse dannes.

Formålet med opfindelsen er at fremstille et stabilt antibiotikum hørende til bleomycingruppen ud fra et ustabilt antibiotikum hørende til phleomycingruppen.

Dette opnås med fremgangsmåde ifølge opfindelsen, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at et antibiotikum hørende til phleomycingruppen og med delstrukturen: N--T- CO-NH- -A.7 -CC-NH-OH -OH —J χ (I) “2 "2 ^ s / 3 U8482 oxideres med kaliumferricyanid eller mangandioxid.

Efter at phleomycinerne og bleomycinerne er blevet fundet, er der blevet undersøgt forskellige antibiotika produceret af Streptomy-ces. Det har vist sig, at forskellige antibiotika fremstillet ved hjælp af forskellige Streptomycesarter svarer til phleomyciner og bleo-myciner. Det er f.eks. blevet konstateret, at phleomycin-bleomyein-grupper frembringes ved anvendelse af Streptomyces flavoviridis, og der fås et molekyle med en ustabil delstruktur, der svarer til delstrukturen (I) for phleomycinerne.

Bleomycin-phleomycin-type antibiotikummet YA-56, der er omtalt i "The Journal of Antibiotics", bind 24, nr. 10, side 727-731j er et af de ustabile glycopeptidantibiotika. Antibiotikum YA-56 blev isoleret fra kulturmediet for en variant af Streptomyces humidus, og det fremstilles ved dyrkning af stammen i 5~7 dage ved 27°C i et væskeformigt medium indeholdende glycose, glycerol, dextrin, sojabønnemel, NaCl, CaCO^ og

CuSOjj.

YA-56 er et ustabilt glycopeptidantibiotikum med delstrukturen (I) i molekylet, der kan anvendes som udgangsmateriale ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse.

Glycopeptidantibiotika med delstrukturen (I) kan adskilles fra forgæringskulturen ved ekstraktion, hvorved det opnås i en form, der indeholder kobber i molekylet. Det er muligt at anvende antibiotika, der indeholder kobber i molekylet som udgangsmateriale. Det er også muligt at anvende antibiotika, hvorfra kobbet ved anvendelse af hydrogensulfid er fjernet fra molekylet, som udgangsmateriale.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes i forbindelse med alle ustabile glycopeptidantibiotika hørende til phleomycingruppen og med delstrukturen (I) til omdannelse af disse til stabile glycopeptidantibiotika hørende til bleomycingruppen og med delstrukturen (II). Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse anvendes kaliumferricyanid eller mangandioxid som oxidationsmiddel til at omdanne thiazolinringen i delstrukturen (I) til thiazolringen i delstrukturen (II).

Glycopeptidantibiotika har en β-lamtamstruktur, som let dekom-poneres ved oxidation, en OH-gruppe, som let oxideres og en glucosid-binding, som let fraspaltes. Når sådanne glycopeptidantibiotika med delstrukturen (I) oxideres med andre oxidationsmidler end kaliumferricyanid eller mangandioxid, sker der en oxidation af andre dele af molekylet end af thiazolinringen, og der opnås derved ikke de Ønskede forbindelser.

148482 4

Kun ved anvendelse af kaliumferricyanid eller* mangandioxid som oxidationsmiddel opnås der således en selektiv oxidation af thiazolin-ringen til dannelse af en thiazolring og en dannelse af et stabilt gly-copeptidantibiotikum med delstrukturen (II) i et stort udbytte, nemlig fra 30 til 60¾.

Glycopeptidantibiotika med delstrukturen (I) og (II) har karakteristiske ultraviolette absorptionsspektrer.

Glycopeptidantibiotika med delstrukturen (I) har ultraviolet 11 absorptionsspektrer med absorptionsmaksima på ΕΊ 140-160 ved ca.

244 my og Ε.^ 50-60 ved ca. 300 my. Glycopeptidantibiotika med del strukturen (II) har ultraviolette absorptionsspektrer med absorptionsmaksima på E^cm 150-170 ved ca. 244 my og E^cm 120-135 ved ca.

293 mu-

Begge antibiotikatyper har hver for sig to absorptionsmaksima. Imidlertid er forholdet mellem det langbølgede absorptionsmaksimum og det kortbølgede absorptionsmaksimum ca. 2,8 for førstnævnte type antibiotika, men ca. 1,2 for sidstnævnte type antibiotika, således at de to antibiotikatyper let kan identificeres.

Ved fremstilling af glycopeptidantibiotika med delstrukturen (II) ved oxidation af glycopeptidantibiotika med delstrukturen (I) opløses sidstnævnte antibiotikum i et medium, såsom vand eller methanol, og det milde oxidationsmiddel tilsættes opløsningen. Når mangandioxid anvendes som oxidationsmiddel, dispergeres mangandio-xidet i mediet og bringes til at reagere ved 0-50°C i 20 - 240 timer.

Reaktionsblandingen indeholder det ønskede oxiderede produkt med delstrukturen (II) og ikke-reageret produkt. For at adskille disse opløses reaktionsblandingen f.eks. i vand og føres gennem en kolonne pakket med "CM-Sephadex S-25" (Sephadex er et her i landet registreret varemærke) forudbehandlet med natriumchloridopløsning til adsorption af bestanddelene, og derefter udludes bestanddelene med natriumchlorideluat, hvorved det ikke-reagerede produkt først elueres, og de ønskede antibiotika med delstrukturen (II) derefter elueres. Den resulterende opløsning indeholdende glycopeptidantibiotika med delstrukturen (II) adsorberes på almindelig kendt måde, såsom ved at føre opløsningen gennem en kolonne pakket med aktivt carbon, og derefter vaskes kolonnen med vand for at fjerne de uorganiske salt, og en fortyndet HCl-acetoneblanding føres igennem til eluering af det ønskede produkt. En basisk anionbytterharpiks sættes til eluatet til indstilling af pH på 6,0, og opløsningsmidlet fjernes ved destillation for at opnå det ønskede produkt i form af 5 148482 hydrochlorid. Glycopeptidantibiotika med delstrukturen (I) er ustabile og er vanskelige at rense ved ekstraktion.

Det er følgelig absolut hensigtsmæssigt ved industriel udøvelse at anvende fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse på det rå produkt indeholdende urenheder på det indledende trin af ekstraktionsrensningsbehandlingen og at omdanne det til de stabile glycopeptidantibiotika med delstrukturen (II) , og derefter rense det til fraskillelse af det ønskede produkt.

Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fremstilles f.eks. phleomycin ved hjælp af den konventionelle tankforgæringsmetode, og filtratet adsorberes på kationbytterharpiks ("Ambarite IRC-50 H type")/Og bestanddelen elueres med fortyndet HC1 og neutraliseres og adsorberes på aktivt carbon samt udvaskes med vand til fjernelse af de uorganiske salte. Derefter elueres bestanddelen med en fortyndet HCl-acetoneblanding, og der tilsættes en ionbytterharpiks til indstilling af pH på 6,0, hvorpå acetonen afdestilleres til opnåelse af en vandig opløsning indeholdende rå phleomycingrupper.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse anvendes på den vandige opløsning for at oxidere de ustabile glycopeptidantibiotika med delstrukturen (I) for derved at omdanne dem til de stabile antibiotika med delstrukturen (II),og derefter fraskilles det ønskede produkt og renses. Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er absolut hensigtsmæssig som følge af, at udbyttet af renset produkt er væsentligt forøget, samtidig med at de stabile antibiotika kan fraskilles .

Phleomycin blev fremstillet ved hjælp af den konventionelle tankforgæringsmetode og renset ved.hjælp af chromatografisk adskillelse under anvendelse af aktivt carbon, aluminiumoxid og Sephadex , og derefter blev den rensede phleomycinblanding yderligere fraskilt ved hjælp af chromatografi under anvendelse af "CM-Sephadex C-25" (Sephadex er registreret varemærke). Resultaterne er vist på fig. 1, hvor transmissionen ved 280 my er vist som ordinat, og antallet af elueringer er vist som abscisse, og den punkterede linie viser koncentrationen af natriumchlorid i eluatet, og bogstaverne, der er vist ved spidserne på elueringskurven, repræsenterer navne på phleomy cinbestanddele.

Af de bestanddele, der er vist på fig. 1, blev det bekræftet, at phleomycin D^, E og G var glycopeptid med delstrukturen (I), og at bestanddelene Ώ^ι F og G' var glycopeptider med delstrukturen 6 148482 (II) ifølge analyse af ultraviolette absorptionsspektrer.

Ifølge de fysisk kemiske egenskaber og syrehydrolyseprodukterne af bestanddelen D2 og bestanddelen F blev det konstateret, at bestanddelen D2 var bleomycin Β2, og at bestanddelen F var bleomycin B^. Phleomycinblandingen blev oxideret med mangandioxid, og produkterne blev fraskilt under anvendelse af CM-Sephadex chromatografi ved de samme betingelser. Resultaterne er vist på fig. 2, hvor spidserne for produktet svarende til phleomycin D-^, E, øg G var formindskede,og spidserne for produkterne svarende til bleomycin D2> F og G' var forøgede.

Ifølge resultatet på fig. 2 af sammenligningsforsøgene med syre-hydrolyseprodukterne af bestanddelene konstateredes det, at der skete følgende omdannelse: D1 -* D2, E -> F og G -> G’ 500 mg Rå phleomycinblanding og produktet oxideret med mangan-dioxid blev hver for sig adskilt ved hjælp af "CM-Sephadex" chromatografi) . Mængderne af bestanddele i det ikke-oxiderede phleomycin og det oxiderede produkt er vist i nedenstående tabel.

Bestanddel Ikke-oxideret Oxideret produkt ___ phleomycin _ 39 mg 17 mg D2 22 mg 40 mg E 114 mg 56 mg F 33 mg 69 mg G 96 mg 43 mg G' 17 mg 45 mg I det følgende vil den foreliggende opfindelse blive omtalt nærmere i forbindelse med en række eksempler.

Eksempel 1.

Phleomycin D (Cu-indeholdende hydrochlorid), der i methanol ‘ is har absorptionsmaksimum på °cm 147 ved 244 mp og et andet absorptionsmaksimum på e]'° 54 ved 300 mp samt en stigende absorption i det lavere bølgelængdeområde af det ultraviolette spektrum, blev anvendt. 20 mg Pulverformet phleomycin blev opløst i 1 ml vand, og 20 mg mangandioxid blev opslæmmet i opløsningen og bragt til at reagere ved stuetemperatur i 40 timer under omrøring. Efter reaktionen blev opløsningen filtreret, og filtratet blev ført gennem en kolonne 7 148482 pakket "CM-Sephadex 025" (Sephadex er registreret varemærke) forud-behandlet med 0,05 M natriumchloridopløsning til adsorption af reaktionsproduktet. Derefter blev koncentrationen af natriumchloridopløsningen, der er benyttet som elueringsmiddel, forøget lineært fra 0,05 M til 1 M til eluering af reaktionsproduktet. Som resultat heraf blev det uomsatte phleomycin elueret i 0,40 M natriumchlorid-elueringsfraktionen, og reaktionsproduktet bleomycin B2 blev elueret i 0,44 M natriumchloridelueringsfraktionen. Sidstnævnte fraktion blev ført gennem en kolonne pakket med 1 ml aktivt carbon til adsorption af bleomycinet B2. Derefter blev dette vasket med vanf for at fjerne uorganiske salte, og derefter blev et elueringsmiddel i form af 0,02 NHCl-acetone (1:1) ført gennem kolonnen til eluering af en blå opløsning indeholdende bleomycin B2 (Cu-indeholdende hydrochlo-rid) .

Anionbytterharpiks (Dow® X-44) (OH-type) blev sat til eluatet til indstilling af pH på 6,0, eluatet blev filtreret, opløsningsmidlet blev fjernet og remanensen tørret til opnåelse af 12 mg blåt pulverformet bleomycin B2 (Cu-indeholdende hydrochlorid).

Den resulterende forbindelse har det specifikke ultraviolette absorptionsspektrum, der er karakteristisk for det glycopeptid, der har delstrukturen (II) og med absorptionsmaksimum i'methanol på 1 % 1 % E1 cm ved mV °9 ^et an<^et absorptionsmaksimum på cm 127 ved 293 my samt en stigende absorption i det lavere bølgelængdeområde af det ultraviolette spektrum.

Den resulterende forbindelse har en Rf-værdi på 0,66 ved silikageltyndlagschromatografi (CH^OHrlO/? CH^COONH^:10% NH^OH = 10:9:1) og en Rf-værdi på 0,56 ved Avicel® tyndlagschromatografi (CH^CH2CH20H:pyridin:CH^C00H:H20 = 15:10:3:12), der er de samme som for bleomycin Β2·

Hydrolysenedbrydningsprodukterne for det resulterende produkt er vist i nedenstående tabel 1, og de var de samme som for bleomycin Β2· 8 148482

Tabel 1.

Hydrolyseprodukter.

I. - CH,-CH-CH-COOH

3 I ! OH NH2 II. H0N .

2 \_N

CH3 —^ CH-CH2COOH

N WH2

HOOC

III. CH-, - CH - CH - CH - COOH

3 i i i NH2 OH CH3

IV. Ν' Π—CH - CH - COOH

kJ s- k

H

V. NH„-CH^-CH-COOH

2 2 , . . NH2

VI. N--—COOH

|l I

N-S

I! I s nh2ch2-ch2—i VII. nh2-ch2-ch2-ch2-ch2-nh-c-nh2

Ih 9 140482

Den antimikrobielle virkning overfor Mycobacterium 607 ved kopbe s teinmel sesmetoden (standardbleomycin A2 fri base 1000 U/mg) var 2720 U/mg.

Stabiliteten af det resulterende bleomycin B2 og udgangsmaterialet i form af phleomycin blev sammenlignet under sure forhold.

1,0 mg Af det resulterende bleomycin B2 henholdsvis phleomycin blev opløst i 10 ml 1/100 NHC1 opløsning, og opløsningerne blev holdt ved pH 2 ved 27°C i 1 time, og den resterende antimikrobielle aktivitet overfor Mycobacterium 607 blev målt ved kopbestemmelsesmetoden og er angivet i nedenstående tabel i forhold til den antimikrobielle aktivitet til at begynde med, som er fastsat til 100.

Tabel 2.

Tidsrum (timer)_0_1_6_24_72_

Det resulterende 100 102 97 99 102 bleomycin B2

Phleomycin 100 20,8 5*3 2,7 0

Eksempel 2.

20 mg Pulverformet phleomycin E (Cu-indeholdende hydrochlorid), . 1 % der i methanol har et absorptionsmaksimum pa E1 154 ved 244 my og et andet absorptionsmaksimum på E.J cm 57 ved 300 my samt en stigende absorptions i det lavere bølgelængdeområde af det ultraviolette spektrum, blev oxideret på tilsvarende måde som den i eksempel 1 beskrevne, og det resulterende produkt blev fraskilt ved chromatografi under anvendelse af "CM-Sephadex C-25" (Sephadex er registreret varemærke) på tilsvarende måde som den i eksempel 1 beskrevne. Som resultat heraf blev det uomsatte phleomycin E elueret i 0,60 M natriumchlorid-elueringsfraktionen, og det resulterende bleomycin blev elueret i 0,64 M natriumchloridelueringsfraktionen.

På tilsvarende måde som den i eksempel 1 beskrevne blev den sidstnævnte fraktion behandlet med aktivt carbon, saltene fjernet, opløsningen neutraliseret, opløsningsmidlet fjernet og produktet tørret til tilvejebringelse af 10 mg blåt pulverformet bleomycin B^ (Cu-indeholdende hydrochlorid).

Den resulterende forbindelse havde det specifikke ultraviolet absorptionsspektrum, som er karakteristisk for det glycopeptid, der 1 % har delstrukturen II og har absorptionsmaksimum i methanol på Ε·| cm 162 148482 10 1 % ved 244 my og det andet absorptionsmaksimum på cm 130 ved 293 my samt en stigende absorption i det lavere bølgelængdeområde af det ultraviolette spektrum.

Den resulterende forbindelse har en Rf-værdi på 0,50 ved sili-cageltyndlagschromatografi (CH3OH:10% CH3COONH4:10% NH^OH = 10s9s 1) og en Rf-værdi på 0,54 ved Avicel® tyndlagschromatografi (CH3CH2CH2OH:pyridin:CH3C00H:H20 = 15:10:3:12).

Den antimikrobielle aktivitet overfor Mycobacterium 607 ved kopbestemmelsesmetoden (standardbleomycin A2 fri base 1000 U/mg) var 6354 ϋ/mg. Stabiliteten af det resulterende bleomycin B4 og udgangsmaterialet af phleomycin D^ i surt miljø blev sammenlignet. De opnåede resultater er vist i nedenstående tabel 3.

Tabel 3.

Tidsrum (timer)_0_24_

Det resulterende bleomycin B4 100 95

Phleomycin E 100 1,8

Eksempel 3.

20 mg Pulverformet phleomycin D. (Cu-frit hydrochlorid), der 1 % i methanol har et absorptionsmaksimum på E. 150 ved 244 my og et andet absorptionsmaksimum på E.J cm 56 ved 300 my samt en stigende absorption i det lavere bølgelængdeområde af det ultraviolette spektrum, blev oxideret på tilsvarende måde som den i eksempel 2 beskrevne, og det resulterende produkt blev fraskilt ved chromatografi under anvendelse af "CM-Sephadex C-25" (Sephadex er registreret varemærke) på tilsvarende måde som i eksempel 1. Som resultat blev det uomsatte phleomycin D^ elueret i 0,42 M natriumchloridelueringsfraktionen, og det resulterende bleomycin B2 blev elueret i 0,46 M natriumchlorid-elueringsfraktionen.

På tilsvarende måde som i eksempel 1 blev den sidstnævnte fraktion behandlet med aktivt carbon, saltene blev fjernet, opløsningen blev neutraliseret, opløsningsmidlet blev fjernet, og produktet blev tørret til opnåelse af 9 mg farveløst pulverformet bleomycin B2 (Cu-frit hydrochlorid).

Den resulterende forbindelse har det specifikke ultraviolet absorptionsspektrum, som er karakteristisk for det glycopeptid, der 11 148482 har delstrukturen II, og som (indeholdende CuSO.) i methanol har et 1 % ^ absorptionsmaksimum på E^ cm 127 ved 293 my samt en stigende absorption i det lavere bølgelængdeområde af det ultraviolette spektrum.

Den resulterende forbindelse har en Rf-værdi på 0,61 ved silica-geltyndlagschromatografi (CH3OH:10% CH3COONH4:10% NH4OH = 10:9:1) og en Rf-værdi på 0,48 ved Avicel ® tyndlag schr oma tograf i (CH-jCE^CH^OH: pyridin:CH3C00H:H20 = 15:10:3:12). Den antimikrobielle aktivitet over for Mycobacterium 607 ved kopbestemmelsesmetoden (standardbleomycin

V

A2 fri base 1000 U/mg) var 2680 U/mg.

Eksempel 4.

20 mg Pulverformet phleomycin D. (Cu-indeholdende hydrochlorid), ' 1 % der i methanol har et absorptionsmaksimum på E. 147 ved 244 my og o 1 % ' cm et andet absorptionsmaksimum på cm 54 ved 300 my samt en stigende absorptions i det lavere bølgelængdeområde af det ultraviolette spektrum, og 20 mg kaliumferricyanid blev opløst i 1 ml vand og bragt til at reagere ved stuetemperatur i 48 timer.

Efter reaktionen blev reaktionsblandingen ført gennem en kolonne pakket med 30 ml "CM-Sephadex C-25" (Sephadex er registreret varemærke) forbehandlet med 0,05 M natriumchloridopløsning. Kaliumferricya-nidet og reaktionsproduktet heraf passerede igennem, medens phleomycin og reaktionsproduktet heraf blev absorberet under dannelse af natrium-chloridopløsningen, der blev benyttet som elueringsmiddel, blev lineært forøget fra 0,05 M til 1,0 M ved elueringen af reaktionsproduktet. Som resultat blev uomsat phleomycin elueret i 0,40 M natriumchlorid-elueringsfraktionen, og reaktionsproduktet bleomycin B2 blev elueret i 0,44 M natriumchloridelueringsfraktionen.

På tilsvarende måde som den i eksempel 1 beskrevne blev den sidstnævnte fraktion behandlet med aktivt carbon, saltene blev fjernet, opløsningen neutraliseret, opløsningsmidlet fjernet og produktet tørret til opnåelse af 6 mg blåt pulverformet bleomycin B2 (Cu-inde-holdende hydrochlorid).

Den resulterende forbindelse har det specifikke ultraviolette absorptionsspektrum, som er karakteristisk for det glycopeptid, der har delstrukturen (II), og som i methanol har absorptionsmaksimum på E1 cm "^4 ve<3 ^93 πφ samt en stigende absorption i det lavere bølgelængdeområde af det ultraviolette spektrum.

Den resulterende forbindelse har en Rf-værdi på 0,66 ved sili-cageltyndlagschromatografi (CH3OH:10% CH3COONH4:10% NH40H = 10:9:1) og en Rf-værdi på 0,56 ved Avicel® tyndlagschroma tograf i 148482 12 (CH3CH2CH20H:pyridin:CH3COOH:H20 = 15:10:3:12).

Eksempel 5.

100 mg YA-56 (Cu-indeholdende hydrochlorid) bestående af 70 mg X-bestanddel med absorptionsmaksimum i methanol på E. 126,6 ved 1 % cin . 246,5 my og et andet absorptionsmaksimum på E.J cm 45,6 ved 300-303 my samt en stigende absorption i det lavere bølgelængdeområde af det ultraviolette spektrum og 30 mg Y-bestanddel med absorptionsmaksimum 1 ^ i methanol på E,° 134 ved 245,5 my og et andet absorptionsmaksimum •j o_ i cm på E,j °cm 47 ved 302 my samt en stigende absorption i det lavere bølge-. længdeområde af det ultraviolette spektrum blev opløst i destilleret vand og indstillet på en pH-værdi på 7,5 ved tilsætning af TN natrium-hydrogencarbonat.

20 mg raangandioxidpulver blev sat til opløsningen, og denne blev omrørt ved 5-8°C i 9 dage og filtreret til fjernelse af mangan-dioxidet. Filtratet blev koncentreret ved formindsket tryk og tørret ..til opnåelse af 96 mg rå pulver.

Produktet blev opløst i 0,05 NHCl og opbevaret ved stuetemperatur i 1& timer, og opløsningen blev indstillet til pH 6,0 ved tilsætning af natriumhydrooxidopløsning og absorberet i en kolonne pakket ' + med 100 ml "CM-Sephadex G-25" (Na type) (Sephadex er registreret varemærke).

Koncentrationen af natriumchloridopløsningen, der blev benyttet som elueringsmiddel, blev lineært forøget fra 0,05 M til 1,0 M ved elueringen af reaktionsproduktet under anvendelse af en samlet mængde på 1 liter natriumchloridopløsning. Dehydro-Ya-56 Y-bestanddelen blev elueret i 0,32 M natriumchloridelueringsfraktionen, og dehydro-YA-56 X-bestanddelen blev elueret i Q,38 M natriumchlorideluerings-. fraktionen. Uomsat YA-56 Y-bestanddelen blev elueret i 0,44 M natriumchlor idelueringsfraktionen, og uomsat YA-56 X-bestanddelen blev elueret i 0,48 M natriumchloridelueringsfraktionen.

På tilsvarende måde som den i eksempel 1 beskrevne blev det resulterende produkt behandlet med aktivt carbon, saltene fjernet, opløsningen neutraliseret, opløsningsmidlet fjernet og produktet tørret til opnåelse af en blåviolet pulverformet 32 mg dehydro-YA-56 X-bestanddel og 12 mg dehydro-YA-56 Y-bestanddel,

Den resulterende dehydro-YA-56 X-bestanddel har ultraviolet absorptionsspektrum med absorptionsmaksima på cm 152 ved 242 my og E^ 117 ved 292 my.

J i cm

Rf-værdierne ved silicageltyndlagschromatografi (CH3OH:10% 13 1Λ 8 Λ δ 2 CH3COONH4:10% ΝΗ4ΟΗ = 10:9:1) var 0,68 for dehydro-ΥΑ-56 X-bestand-delen og 0,71 for dehydro-YA-56 Y-bestanddelen.

Rf-værdierne ved Avicel^ tyndlagschromatografi (CHjCI^CI^OH: pyridin:CH3COOH:H20 = 15:10:3:12) var 0,56 for dehydro-YA-56 X-be-standdelen og 0,66 for dehydro-YA-56 Y-bestanddelen.

Den antimikrobielle aktivitet overfor Mycobacterium 607 ved kopbestemme1sesmetoden (standardbleomycin A2 fri base 1000 U/mg) var 2665 U/mg for dehydro-YA-56 X-bestanddelen og 1848 U/mg for dehydro-YA-56 Y-bestanddelen.

I det sure hydrolysat af dehydro-YA-56 X- og Y-bestanddelene blev i tabel 1 vist aminosyre VI fundet, og den ninhydrinpositive plet, der er karakteristisk for YA-56, blev frembragt ved todimensional papirchromatografi.

Stabiliteten af forbindelserne blev bestemt på tilsvarende måde som den i eksempel 1 beskrevne. De opnåede resultater er vist i nedenstående tabel 4.

Tabel 4.

Tidsrum (timer)_ 0_24

Resulterende dehydro-YA-56 X 100 96

Resulterende dehydro-YA-56 Y 100 94 YA-56 X 100 4,5 YA-56 Y 100 3,8