DE2212929B2

DE2212929B2 - Verfahren zur herstellung von citronensaeure

Info

Publication number: DE2212929B2
Application number: DE19722212929
Authority: DE
Inventors: Helmut Dr Siebert Diethelm Dr 6802 Ladenburg Hustede
Original assignee: Joh A Benckiser GmbH, 6700 Ludwigshafen
Priority date: 1972-03-17
Filing date: 1972-03-17
Publication date: 1977-08-25
Also published as: DE2264763C3; DE2212929A1; DE2264763B2; DE2264763A1; DE2212929C3

Description

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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure durch aerobes Fermentieren einer Citronensäure produzierenden Hefe in einem wäßrigen Nährmedium mit mindestens einem η-Paraffin mit 9—20 Kohlenstoff-Atomen in Gegenwart eines Aconitase-Hemmstoffes oder dessen Vorstufe und Gewinnung der Citronensäure.

Citronensäure findet in der Lebensmittelindustrie, Pharmazie, Kosmetik und anderen Industriezweigen in großen Mengen Verwendung. Ihre industrielle Gewin- 4c nung durch mikrobielle Fermentation beschränkte sich bisher auf die Verwendung von Schimmelpilzen und kohlenhydrathaltigen Rohstoffen. Zwar wurden in den letzten Jahren in Veröffentlichungen und Patentschriften in zunehmendem Maße die Möglichkeiten des Einsatzes einzelliger Mikroorganismen, wie Hefen oder Bakterien, sowie die Verwendung von Kohlenwasserstoffen als Rohmaterial zur Herstellung von Citronensäure beschrieben. Für eine Herstellung im industriellen Maßstab sind jedoch diese Verfahren in der Praxis den herkömmlichen Verfahren mit Aspergillus und Kohlenhydraten als Substrat noch unterlegen. Dafür sind hauptsächlich die folgenden Gründe zu nennen:

Bei nahezu allen beschriebenen Verfahren sind die Citronensäure-Konzentrationen in der Fermentationssuspension noch verhältnismäßig niedrig und dadurch wird die Aufarbeitung mitunter unrationell.

Neben Citronensäure wird Iso-Citronensäure, z. T. in beträchtlichen Mengen, gebildet, die unter großtechnischen Bedingungen nur mit größten Schwierigkeiten von der Citronensäure zu trennen ist. Es ist bekannt, daß Candida oleophila mit guter Ausbeute in hochprozentigen Kohlenhydrat-Lösungen in relativ kurzen Gärzeiten Citronensäure anreichert (siehe DT-OS 18 12 710). Versuche mit η-Paraffinen als Substrat erlaubten zwar den Einsatz von etwa 10% n-Paraffin im Gärmedium mit einer Säureausbeute von 120 bis 140%, bezogen auf das eingesetzte Paraffin-Gewicht, jedoch erwies die Analyse ein Säuregemisch von 50 bis 60 Teilen Citronensäure und 40 bis 50 Teilen Iso-Citronensäure.

Weiterhin wurden Versuche unternommen, die Beiproduktion von Iso-Citronensäure zu unterdrücken. In der DT-OS 2155 514 wird ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure mittels Hefen, Pilzen oder Bakterien beschrieben, deren Wachstum durch einen Citronensäure-Antimetaboliten oder dessen Vorstufe gehemmt wird. Diese Mikroorganismen besitzen die Fähigkeit das Verhältnis Citronensäure : Iso-Citronensäure weitgehend zugunsten der Citronensäure zu verschieben, aber nicht die Iso-Citronensäurebildung vollständig auszuschalten.

Erfindungsgemäß ist es nun gelungen die Fermentation so zu leiten, daß keine Iso-Citronensäure entsteht.

Gegenstand der Anmeldung ist ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure durch aerobes Fermentieren einer Citronensäure produzierenden Hefe in einem wäßrigen Nährmedium mit mindestens einem η-Paraffin mit 9—20 Kohlenstoff-Atomen in Gegenwart eines Aconitase-Hemmstoffes oder dessen Vorstufe und durch die Gewinnung der Citronensäure, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Fermentation ein die Atmungsketten-Phosphorylierung entkoppelndes

Agens eingesetzt wird.

Die Erfindung ermöglicht, erstmals für die großtechnische Citronensäure-Produktion Kohlenwasserstoffe als preisgünstige Rohstoffe einzusetzen. Dies ist bei der zunehmenden Verknappung der Kohlenhydrate von erstrangiger wirtschaftlicher Bedeutung. Da als Nebenprodukt keine Iso-Citronensäure gebildet wird, ergeben sich keine über den jetzigen Stand der Technik hinausgehenden Schwierigkeiten zur Herstellung reiner kristalliner Citronensäure.

Um die Bildung von unerwünschten Begleitstoffen, insbesondere der Iso-Citronensäure, bei der Fermentation von Kohlenwasserstoffen mittels Hefen zu vermeiden, wurden erfindungsgemäß die Regulationsvorgänge in den Hefezellen mit einfachen Mitteln dahingehend beeinflußt, daß bei Verwertung von Kohlenwasserstoffen große Mengen von Citronensäure, jedoch keine Iso-Citronensäure, ausgeschieden werden. Dieses Ziel wird durch den gleichzeitigen Einsatz eines Aconitase-Hemmstoffes und eines die Atmungskettenphosphorylierung entkoppelnden Agens erreicht.

Obwohl die ausbeutesteigernde Wirkung von Aconitase-Hemmstoffen auf die Citronensäure-Fermentation mit Bakterien, Hefen und Schimmelpilzen bei Verwendung von Kohlenhydraten oder auch Kohlenwasserstoffen als Rohstoffen bekannt ist, wurde jedoch noch kein Verfahren beschrieben, bei dem auch sogenannte Entkoppler zum Einsatz kommen. Die Kombination von Aconitase-Hemmstoff und Entkoppler bietet zudem den ungeheuren Vorteil, daß in der Gärsuspension keine Iso-Citronensäure mehr nachweisbar ist. Bei Einsatz von Kohlenhydraten als Rohmaterial für die Fermentation konnte keine Ausbeutesteigerung durch den Entkoppler beobachtet werden, sondern mit steigernder Entkoppler-Konzentration trat eine Ausbeuteverminderung ein. Dagegen wurde bei Verwendung von η-Paraffinen als Rohmaterial die durch Zusatz eines Aconitase-Hemmstoffes bewirkte Steigerung der Citronensäure-Ausbeute durch die Einwirkung eines Entkopplers noch verstärkt und die Iso-Citronensäure-Ausscheidung vollständig unterbunden.

Für das erfindungsgemäße Verfahren zur fermentativen Herstellung von Citronensäure wird der Hefe-

summ von einem Schrägagarröhrchen in ein für die Zellvermehrung geeignetes flüssiges Medium geimpft und unter Rühren oder Schütteln 24 Stunden kultiviert. Mit einer solcherart zubereiteten Zellsuspension wird eine weitere Vorkultur beimpft, die zumindest ein η-Paraffin der Kettenlänge von 9-20 C-Atomen enthält. Diesem Medium kann außerdem ein Kohlenhydrat als zusätzliche Kohlenstoffquelle in geringer Konzentration zugesetzt werden. Die Fermentation wird in einem wäßrigen Medium durchgeführt, das für den Organismus geeignete Kohlenstoff-, Stickstoff-, Vitamin- und Spurenelementquellen sowie Nährsalze enthält.

Als Kohlenstoffquellen können Kohlenhydrate oder kohlenhydrathaltige Materialien dem Medium zügesetzt werden, jedoch muß die Nährlösung erfindungsgemäß zumindest einen Kohlenwasserstoff, vorzugsweise ein η-Paraffin mit 9-20 C-Atomen oder ein n-Paraffingemisch geeigneter Zusammensetzung als Hauptkohlenstoffquelle enthalten. Die Konzentration an n-Paraffinen soll 5-20 Vol.-%, bezogen auf das Kulturmedium, betragen.

Die Versorgung der Zellen mit Stickstoff kann durch verschiedene anorganische oder organische stickstoffhaltige Verbindungen erfolgen, die einzeln oder im Gemisch zweier oder mehrerer Verbindungen dem Medium zugesetzt werden.

Es können z. B. folgende Stickstoffquellen verwandt werden:

Ammoniak, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat, Harnstoff, Aminosäuren, Peptone, Hefeextrakte, Fischmehl,
Maiseinweichwasser u. a.

Diese Stoffe werden in einer solchen Konzentration verwendet, daß der Gehalt des Fermentationsmediums an assimilierbarem Stickstoff für eine ca. 24stündige Zellvermehrung ausreichend ist.

Vitamine, wie z. B. Thiaminhydrochlorid oder Nikotinsäure können der Nährlösung einzeln in geeigneter Konzentration der durch komplexe Vitaminquelien wie Hefeextrakt, Corn steep powder u. a. zugeführt werden. Ebenso können wichtige Spurenelemente wie Eisen, Zink, Kobalt u. a. durch synthetische Spurenelementlösungen oder natürliche Quellen geboten werden.

Als Nährsalze dienen anorganische Verbindungen wie Dinatriumhydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Manganchlorid oder Mangansulfat, Calciumchlorid oder Natriumchlorid.

Die Kultivierung des Hefestammes während der Hauptfermentation erfolgt unter aeroben Bedingungen, die entweder durch Schütteln des Kulturgefäßes oder im üblichen Submersverfahren durch Rührung und Luftzufuhr hergestellt werden. Die zugeführte Luftmenge beträgt etwa das 15- bis 12Ofache des Volumens des Mediums pro Stunde.

Die Züchtung wird vorteilhaft bei einem pH-Wert zwischen 2 und 8,0 und in einem Temperaturbereich von 20 bis 35°C durchgeführt.

In der Zeit bis zu 15 Stunden nach der Beimpfung des Hauptfermentationsmediums wird der Kultur ein Citronensäureantimetabolit oder dessen Vorstufe, z. B. Fluoracetat, zugesetzt und die Züchtung unter den oben beschriebenen Bedingungen fortgesetzt.

Nach 24stündiger Kultivierung ist das Wachstum der Hefe abgeschlossen. Zu diesem Zeitpunkt wird der Zellsuspension ein entkoppelndes Agens zugesetzt, und während der folgenden Fermentationszeit reichert sich Citronensäure, jedoch keine Iso-Citronensäure, rasch und mit beträchtlicher Ausbeute im Medium an.

Je nach der eingesetzten Kohlenwasserstoffkonzentration ist die Fermentation innerhalb 2 bis 5 Tagen beendet und die Citronensäure als solche oder in Form ihrer Alkali- oder Erdalkalisalze kann nach den üblichen Aufbercitungsmethoden aus der Kulturlösung gewonnen werden.

Für das erfindungsgemäße Verfahren sind geeignete Aconitase-Hemmstoffe bzw. Citronensäureantimetabolite bzw. deren Vorstufen, beispielsweise halogenierte Mono-Di und Tricarbon-Säuren, deren Salze oder Amide, insbesondere Monofluoracetat. Die Konzentration soll vorzugsweise 5 χ ΙΟ-⁵ Mol/l Fermentationslösung betragen.

Als Entkoppler kann erfindungsgemäß jede Substanz verwendet werden, die die Eigenschaft hat, bei Mikroorganismen die oxydative Phosphorylierung ohne Beeinflussung des Elektronentransportsystems der Atmungskette zu hemmen oder vollständig zu unterbinden. Pentachlorphenol, 2,4-Dinitrophenol, 4,5,6,7-tetrachlor-2-(trifluormethyl)benzimidazol, Mesoxalonitril-/p (trifluormethoxy)phenol/-hydrazon oder Dicumarin sind Beispiele solcher Substanzen. Der Entkoppler wird bis zu einer Konzentration von 10~² bis 10~⁷ Mol/l dem Fermentationsmedium zugegeben.

Die vorliegende Erfindung gestattet durch Vermeidung von 'so-Citronensäurebildung auf wirtschaftliche Weise, Citronensäure aus Paraffin fermentativ zu gewinnen. Die erhaltenen Ausbeuten bewegen sich in einer Größenordnung von ca. 110% bezogen auf eingesetztes Paraffin, die allen anderen Verfahren, z. B. solchen mit Kohlenhydraten als Substrat, überlegen sind. Durch die hierbei erzielten hohen Citronensäurekonzentrationen im Fermentationsmedium ist somit eine rationelle Aufbereitung gewährleistet.

Beispiel 1

Candida oleophila ATCC No. 20 177 wurde von einem Schrägagarröhrchen mit Hefe-Malzextrakt-Pepton-Glucose-Agar in 50 ml eines flüssigen Mediums der gleichen Zusammensetzung geimpft und 24 Stunden bei 28⁰C geschüttelt. Diesv? Zellsuspension wurde daraufhin in 500 ml des folgenden Mediums überführt:

0,05% KH₂PO₄,0,02% MgSO₄ · 7 H₂O,
0,025% MnSO₄ · 4 H₂O,
0,25% NH₄Cl, 0,05% Corn steep powder,
2% (VoI-.) n-Dodecan, 1 % CaCO₃.

Nach 48stündiger Belüftung wurde diese Vorkultur 10%ig in 100 ml des nachfolgend aufgeführten Fermentationsmediums übertragen:

0,050/o KH₂PO₄

0,02% MgSO₄ · 7 H₂O

0,025% MnSO₄ · 4 H₂O

0,25% NH₄Cl

0,05% Corn steep powder

8,0% CaCO₃

10,0% (Gew.-/Vol,-) n-Dodecan

Die Fermentation erfolgte im 1-l-Rundkolben unter Schütteln bei 28°C.

Folgende Zusätze wurden nach Beginn der Fermentation in das Medium gegeben:

nach 15 Stunden 5 χ ΙΟ"⁵Mol/l Fluoracetat
nach 24 Stunden 1 χ 10~⁴ Mol/l 2,4-Dinitrophenol

Die Citronensäurekonzentration im Medium betrug nach 4tägiger Inkubation 107 g/l, Iso-Citronensüure war nicht nachweisbar.

Beispiel 2 -^s

Der im Beispiel 1 angegebe-sie Versuch wurde wiederholt, jedoch ohne Zugabe von 2,4-Dinitrophenol. Es wurden 98 g/l Citronensäure und 6 g/l Iso-Citronensäure erhalten. ι ο

Beispiel 3

Der im Beispiel 1 angegebene Versuch wurde wiederholt, jedoch ohne Zugabe von Fluoracetat, ι .ι

Nach 4tägiger Fermentation betrug die Konzentration an Citronensäure im Medium 79 g/l, die an iso-Citronensäure 28 g/l.

Beispiel 4

Der im Beispiel 1 angegebene Versuch wurde wiederholt; es wurde jedoch dem Medium weder Fluoracetat noch 2,4-Dinitrophenol zugesetzt. Es wurden nach 4tägiger Fermentationsdauer folgende Konzentrationsverhältnisse erhalten:
72,5 g/I Citronensäure,
50,5 g/l Iso-Citronensäure.

Außer der in den Beispielen genannten Hefe Candida oleophila sind auch die Hefen der Candida lipolytica Stämme ATCC 8661, 8662 und 9773 geeignet. Erfindungsgemäß können alle Hefen eingesetzt werden, die fähig sind, Citronensäure zu produzieren und in Gegenwart von Aconitase-Hemmstoffen bzw. Citronensäureantimetaboliten oder deren Vorstufen zu wachsen.

Die im folgenden beschriebenen Versuche wurden in 300 ml Schüttelkolben mit seitlichen Schikanen auf einer Inkubations-Rundschüttelmaschine bei 28°C durchgeführt. Das Füllvolumen pro Kolben betrug 50 ml, die Fermentationsdauer 3 Tage (bei Einsatz von 6% Hexadecan). Das Fermentationsmedium wurde entsprechend der im Beispiel 1, Absatz 2 der DT-OS 21 15 514 beschriebenen Zusammensetzung zubereitet.

Zur Ermittlung der günstigsten Konzentrationen von Aconitase-Hemmstoff (Monofluoracetat) und von Entkoppler (2,4-Dinitrophenol) für jeden Hefestamm wurden die Versuche mit verschiedenen Konzentrationsniveaus dieser Verbindungen durchgeführt.

Tabelle

Versuch

Hefestamm

Fluoracetat η. 15 Std. (Mol/l) 2,4-DN-P n. 24 Std. Ci-S
(Mol/l) (mg/ml)

iso-Ci-S (mg/m!)

C. lipolytica ATCC 8661

Pichia halophila IFO 0947

Debaryomyces IFO 0064 1 · 10-⁵
1 ·10-⁴

1 ·10-⁵

1 · ΙΟ-¹·

1 ·10-5
1 ·ίο-"

23,0

15,4

3,6

0,7

2,1 2,0

2a

1,6
0,5

0,2
0,1

Die Ergebnisse der Versuche A 6 mit C. lipolytica ATCC 8661, B 7 mit Pichia halophila IFO 0947 und C mit Debaryomyces spec. IFO 0064 zeigen, daß durch Zusatz geeigneter Konzentrationen an Aconitase-Hemmstoff und Entkoppler zu citronensäurebildenden Hefen und bei Einsatz von η-Paraffin als Kohlenstoffquelle die Ausscheidung von Isocitronensäure im Medium vollständig unterbunden und Citronensäure in guten Ausbeuten erhalten werden kann. Die geeigneten Konzentrationen der zuzusetzenden Verbindungen sind bei Verwendung verschiedener Hefestämme leicht durch Versuchsreihen in Schattelkolben zu ermitteln.
Die Versuche zeigen außerdem, daß das Verfahren der Erfindung auch wirtschaftlich ist durch die gute Raum-Zeit-Ausbeute, die gegenüber den vergleichbaren Versuchen der DT-OS 21 15 514 (Beispiel 1 und 2) um ca. 50% höher liegt. Dies ist für die Realisierbarkeit eines industriellen Produktionsprozesses von entscheidender Bedeutung.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Citronensäure durch aerobes Fennentieren einer Citronensäure produzierenden Hefe in einem wäßrigen Nährmedium mit mindestens einem η-Paraffin mit 9—20 Kohlenstoff-Atomen in Gegenwart eines Aconitase-Hemmstoffes oder dessen Vorstufe und durch die Gewinnung der Citronensäure, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Fermentation ein die Atmungsketten-Phosphorylierung entkoppelndes Agens eingesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Entkoppler 2,4-DinitrophenoI verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1—2, dadurch gekennzeichnet, daß der Entkoppler nach 24 Stunden und in einer Konzentration von 1 χ ΙΟ"² bisl χ 10~⁵MoI/l dem Medium zugesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1—3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Hefe der Gattung Candida oleophila verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1—4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Hefe der Gattung Candida lipolytica verwendet wird.