DE2264763B2 - Verfahren zur herstellung von citronensaeure - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure und deren Salze aus Kohlenwasserstoffe durch Fermentation unter Verwendung von Hefen.

Citronensäure findet in der Lebensmittelindustrie, Pharmazie, Kosmetik und anderen Industriezweigen in großen Mengen Verwendung. Ihre industrielle Gewinnung durch mikrobielle Fermentation beschränkte sich bisher auf die Verwendung von Schimmelpilzen und kohlenhydrathaltigen Rohstoffen. Zwar wurden in den letzten Jahren in Veröffentlichungen und Patentschriften in zunehmendem Maße die Möglichkeiten des Einsatzes einzelliger Mikroorganismen, wie Hefen oder Bakterien, sowie die Verwendung von Kohlenwasserstoffen als Rohmaterial zur Herstellung von Citronensäure beschrieben. Für eine Herstellung im industriellen Maßstab sind jedoch diese Verfahren in der Praxis den herkömmlichen Verfahren mit Aspergillus und Kohlenhydraten als Substrat noch unterlegen. Dafür sind hauptsächlich die folgenden Gründe zu nennen:

Bei nahezu allen beschriebenen Verfahren sind die Citronensäure-Konzentrationen in der Fermentationssuspension noch verhältnismäßig niedrig, und dadurch wird die Aufarbeitung mitunter unrationell.

Neben Citronensäure wird Iso-Citronensäure, z. T. in beträchtlichen Mengen, gebildet, die unter großtechnischen Bedingungen nur mit größten Schwierigkeiten von der Citronensäure zu trennen ist. Es ist bekannt, daß Candida oleophila mit guter Ausbeute in hochprozentigen Kohlenhydrat-Lösungen in relativ kurzen Gärzeiten Citronensäure anreichert (siehe DT-OS 18 12 710). Versuche mit η-Paraffinen als Substrat erlaubten zwar den Einsatz von etwa 10% η-Paraffin im Gärmedium mit einer Säureausbeute von 120 bis 140%, bezogen auf das eingesetzte Paraffin-Gewicht, jedoch erwies die Analyse ein Säuregemisch von 50 bis 60 Teilen Citronensäure und 40 bis 50 Teilen Iso-Citronensäure.

Weiterhin wurden Versuche unternommen, die Beiproduktion von Iso-Citronensäure zu unterdrücken. Diese Versuche resultierten jeweils nur in einer mehr oder minder starken Verschiebung des Verhältnisses Citronensäure : Iso-Citronensäure, in keinem Fall jedoch in einer vollständigen Ausschaltung der Iso-Citronensäure-Ausscheidung.

Überraschenderweise ist es nun gelungen, die Iso-Citronensäure-Ausscheidung ganz zu unterbinden, wenn man eine Hefe-Mutante, die bei einer hohen Konzentration von Fluoracetat zum Wachstum befähigt ist, herstellt und diese Mutante in einem wäßrigen Nährmedium mit mindestens einem η-Paraffin mit 9 bis 20 Kohlenstoffatomen unter Zusatz einer die Atmungskettenphosphorylierung entkoppelnden Verbindung fermentiert, bis sich Citronensäure in hoher Konzentration im Medium angesammelt hat und diese aus der Nährlösung gewinnt.

Diese Erfindung ermöglicht, erstmals für die großtechnische Citronensäure-Produktion Kohlenwasserstoffe als preisgünstige Rohstoffe einzusetzen. Dies ist bei der zunehmenden Verknappung der Kohlenhydrate von erstrangiger wirtschaftlicher Bedeutung. Da als Nebenprodukt keine Iso-Citronensäure gebildet wird, ergeben sich keine über den jetzigen Stand der Technik hinausgehenden Schwierigkeiten zur Herstellung reiner kristalliner Citronensäure.

Um die Bildung von unerwünschten Begleitstoffen, insbesondere der Iso-Citronensäure, bei der Fermentation von Kohlenwasserstoffen mittels Hefen zu vermeiden, wurden die Regulationsvorgänge in den Hefezellen mit einfachen Mitteln dahingehend beeinflußt, daß bei Verwertung von Kohlenwasserstoffen große Mengen von Citronensäure, jedoch keine Iso-Citronensäure, ausgeschieden werden. Dieses Ziel wird mit dem gleichzeitigen Einsatz einer gegenüber einer hohen Konzentration von Fluoracetat resistenten Hefe-Mutante und eines die Atmungskettenphosphorylierung entkoppelnden Agens erreicht. Durch den erfindungsgemäßen Einsatz der gegenüber einer hohen Konzentration von Fluoracetat resistenten Hefe-Mutante erübrigt sich ein Zusatz des Aconitase-Hemmstoffes zum Fermentationsmedium, was aus preislichen und gesundheitlichen Gründen sehr vorteilhaftist.

Bei vergleichenden Versuchen über den für die Steigerung der Citronensäure-Ausbeute günstigsten Konzentrationsbereich des Aconitase-Hemmstoffes, z. B. Mono-Fluoracetat, konnte überraschenderweise festgestellt werden, daß Hefestämme mit geringerem Citronensäurebildungsvermögen schon bei einer geringeren Konzentration an Monofluoracetat im Wachstum gehemmt werden als solche mit höherer Citratproduktion. Diese Beobachtung wurde als Prinzip für das Verfahren zur Anreicherung citronensäureausscheidender Mikroorganismen ausgenutzt.

Nach der Mutationsauslösung mit den üblichen bekannten mutagenen Agentien wie z. B. Nitrit,

l-Methyl-3-nitro-l-nitroso-guanidin, UV- oder Röntgenstrahlen, wird die behandelte Zellsuspension in ein Glucose-Mineralmedium geimpft und im Verlauf der anschließenden, mehrtägigen Inkubation bei 28° C mit steigenden Konzentrationen an Aconitase-Hemmstoffen bzw. Citronensäureantimetaboliten oder deren Vorstufe, wie halogenierte Mono-, Di- und Tricarbonsäuren, deren Salze oder Amide, insbesondere Monofluoracetat, bis zu einer Endkonzentration von 5 · 10-² Mol/l versetzt.

Während dieser Zeit tritt eine starke Anreicherung von Mutanten mit hoher Citronensäureausscheidung ein, die anschließend nach Ausplattieren auf Vollmedium-Platten nach dem üblichen Verfahren isoliert werden können. Diese Anreicherungstechnik bietet eine «5 erhebliche Ersparnis an Zeit und Arbeitsaufwand und erhöht die Chance der Entdeckung geeigneter Mutanten beträchtlich, da als Alternative nur die Untersuchung einer Vielzahl von abgeimpften Kolonien in Fermentationsversuchen in Frage käme, wobei die erwünschten Mutanten nur einen äußerst geringen Prozentsatz der insgesamt vorhandenen Zellen nach Mutationsauslösung darstellen.

Mittels dieser Technik gelang es, Mutanten der Hefe C. oleophila zu isolieren, die sich gegenüber dem Ursprungsstamm durch eine stark erhöhte Citronensäureausscheidung in Kohlenhydratmedien auszeichneten.

Bei Einsatz dieser Mutanten in n-Paraffingärmedien stellte sich heraus, daß hier nicht nur ebenfalls die Ausbeute an Citronensäure erhöht war, sondern auch der Prozentsatz an gleichzeitig gebildeter Iso-Citronensäure von ca. 40% der Gesamtsäure beim Ursprungsstamm auf 0,5 bis 5% je nach Mutantenstamm zurückgegangen war.

Wurde bei Einsatz dieser Mutanten in der Fermentation nach 24stündigem Wachstum in n-Paraffin-Nährmedium ein Entkoppler, beispielsweise 2,4-Dinitrophenol bis zu einer Konzentration von 10~² bis IO-⁷ Mol/l zugegeben, so resultierte eine rasche und starke Citronensäure-Bildung, und Iso-Citronensäure wurde nicht mehr gebildet.

Die Fermentation war bei Einsatz von insgesamt 10Gew.-% Kohlenwasserstoffen nach ca. 85 Stunden beendet. Iso-Citronensäure konnte auch durch enzymatische Bestimmung mit Isocitrat-Dehydrogenase nicht nachgewiesen werden. Wie sich dünnschichtchromatographisch feststellen ließ, wird als einzige Säure Citronensäure ins Medium ausgeschieden.

Für das erfindungsgemäße Verfahren zur fermentativen Herstellung von Citronensäure wird die nach dem beschriebenen Selektionsverfahren gewonnene Hefemutante mit einer genetisch fixierten, verminderten Aconitase-Aktivität, von einem Schrägagarröhrchen in ein für die Zellvermehrung geeignetes flüssiges Medium geimpft und unter Rühren oder Schütteln 24 Stunden kultiviert. Mit einer solcherart zubereiteten Zellsuspension wird eine weitere Vorkultur beimpft, die zumindest ein n-Paraffin der Kettenlänge von 9—20 Kohlenstoffatomen enthält. Diesem Medium kann außerdem ein Kohlenhydrat als zusätzliche Kohlenstoffquelle in geringer Konzentration zugesetzt werden. Die Fermentation wird in einem wäßrigen Medium durchgeführt, das für den Organismus geeignete Kohlenstoff-, Stickstoff-, Vitamin- und Spurenelementquellen sowie Nährsalze enthält.

Als Kohlenstoffquellen können Kohlenhydrate oder kohlenhydrathaltige Materialien dem Medium zugesetzt werden, jedoch muß die Nährlösung erfindungsgemäß zumindest einen Kohlenwasserstoff, vorzugsweise ein η-Paraffin mit 9 bis 20 Kohlenstoffatomen oder ein n-Paraffingemisch geeigneter Zusammensetzung als Hauptkohlenstoffquelle enthalten. Die Konzentration an n-Paraffinen soll 5—20 Volumenprozent, bezogen auf das Kulturmedium, betragen.

Die Versorgung der Zellen mit Stickstoff kann durch verschiedene anorganische oder organische stickstoffhaltige Verbindungen erfolgen, die einzeln oder im Gemisch zweier oder mehrerer Verbindungen dem Medium zugesetzt werden. Es können z. B. folgende Stickstoff quellen verwandt werden: Ammoniak, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat, Harnstoff, Aminosäure, Peptone, Hefeextrakte, Fischmehl, Maiseinweichwasser u. a. Diese Stoffe werden in einer solchen Konzentration verwendet, daß der Gehalt des Fermentationsmediums an assimilierbarem Stickstoff für eine ca. 24stündige Zellvermehrung ausreichend ist.

Vitamine, wie z. B. Thiaminhydrochlorid oder Nikotinsäure, können der Nährlösung einzeln in geeigneter Konzentration oder durch komplexe Vitaminquellen wie Hefeextrakt, Corn steep powder u. a. zugeführt werden. Ebenso können wichtige Spurenelemente wie Eisen, Zink, Kobalt u. a. durch synthetische Spurenelementlösungen oder natürliche Quellen geboten werden.

Als Nährsalze dienen anorganische Verbindungen wie Dinatriumhydrogenphosphat, Dikäliumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Manganchlorid oder Mangansulfat, Calciumchlorid oder Natriumchlorid.

Die Kultivierung des Hefestammes während der Hauptfermentation erfolgt unter aeroben Bedingungen, die entweder durch Schütteln des Kulturgefäßes oder im üblichen Submersverfahren durch Rühren und Luftzufuhr hergestellt werden. Die zugeführte Luftmenge beträgt etwa das 15- bis 120fache des Volumens des Mediums pro Stunde.

Die Züchtung wird vorteilhaft bei einem pH-Wert zwischen 2 und 8,0 und in einem Temperaturbereich von 20 bis 35°C durchgeführt.

Nach 24stündiger Kultivierung ist das Wachstum der Hefe abgeschlossen. Zu diesem Zeitpunkt wird der Zellsuspension ein entkoppelndes Agens zugesetzt, und während der folgenden Fermentationszeit reichert sich Citronensäure, jedoch keine Iso-Citronensäure, rasch und mit beträchtlicher Ausbeute im Medium an.

Je nach der eingesetzten Kohlenwasserstoffkonzentration ist die Fermentation innerhalb 2 bis 5 Tage beendet, und die Citronensäure als solche oder in Form ihrer Alkali- oder Erdalkalisalze kann nach den üblichen Aufbereitungsmethoden aus der Kulturlösung gewonnen werden.

Als Entkoppler kann erfindungsgemäß jede Substanz verwendet werden, die die Eigenschaft hat, bei Mikroorganismen die oxydative Phosphorylierung ohne Beeinflussung des Elektronentransportsystems der Atmungskette zu hemmen oder vollständig zu unterbinden. Pentachlorphenol, 2,4-Dinitrophenol, 4,5,6,7-tetrachlor-2-(trifluormethyl)benzimidazol,Mesoxalonitril- /p(trifluormethoxy)phenol/-hydrazon oder Dicumarin sind Beispiele solcher Substanzen.

Die vorliegende Erfindung gestattet durch Vermeidung von Iso-Citronensäurebildung auf wirtschaftliche Weise, Citronensäure aus Paraffin fermentativ zu gewinnen. Die erhaltenen Ausbeuten bewegen sich in einer Größenordnung von ca. 150%, bezogen auf eingesetztes Paraffin, die allen anderen Verfahren, z. B.

solchen mit Kohlenhydraten als Substrat, überlegen sind. Durch die hierbei erzielten hohen Citronensäurekonzentrationen im Fermentationsmedium ist somit eine rationelle Aufbereitung gewährleistet.

Beispiel 1 A) Gewinnung geeigneter Mutanten

Candida oleophila ATCC Nr. 20 177 wurde von einem Schrägagarröhrchen in 25 ml Glucose-Mineral-Medium (1% Glucose, 0,05% KH₂PO₄, 0,02% MgSO₄ · 7 H₂O, 0,025% MnSO₄ · 4 H₂O, 0,2% NH₄Cl, 0,05% Hefeextrakt, 0,1% NaHCO₃) geimpft und 48 Stunden bei 28° C geschüttelt. Mit dieser Vorkultur wurde eine zweite Glucose-Mineral-Kultur so beimpft, daß die Anfangs-Zellkonzentration ca. 1 · 10⁷/ml betrug. Nach 15stündiger Inkubation unter Schütteln bei 28⁰C waren die Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase und hatten eine Konzentration von ca. 8 · 10⁷/ml erreicht. 5 ml der wachsenden Kultur wurden mit 0,05 ml l-Nitroso-3-nitro-methyl-guanidin-Lösung (50 mg/ml) versetzt und weitere 2 Stunden geschüttelt. In dieser Zeit wurden 99,9% der Hefezellen abgetötet. Die Reaktion wurde durch Abzentrifugieren und Waschen der Zellen mit 0,9%iger NaCl-Lösung abgestoppt. Anschließend wurden die Zellen in Vollmedium (5% Glucose, 0,5% Pepton, 0,3% Hefeextrakt, 0,3% Malzextrakt) suspendiert und bei 28° C geschüttelt.

Während der folgenden 5tägigen Bebrütung wurden die Zellen täglich in frisches Vollmedium mit steigenden Mengen an Mono-Fluoracetat bis zu einer Endkonzentration von 1 Mol/l übertragen. Die Zellsuspension wurde anschließend in geeigneter Verdünnung auf Vollmedium-Platten ausgespatelt. Die überlebenden Zellen wuchsen innerhalb 2 Tagen zu Kolonien heran und wurden nun durch Stempelübertragung auf Glucose-Mineral-Agar-Platten mit unterschiedlichen Konzentrationen an Fluoracetat abgeimpft. Nach 2tägiger Inkubation wurden die Platten mit einer Zellsuspension des Ursprungstammes (ca. 10⁷ Zellen/ml in Glucose-Mineral-Lösung) besprüht und weitere 2 Tage inkubiert.

Auf den Platten mit einer Fluoracetat-Konzentration von 10-¹ Mol/l kamen die Wildtyp-Zellen nicht mehr zum Wachstum; vorhergewachsene, stark citronensäureausscheidende Mutanten konnten jedoch an einem sie umgebenden Hof von Satellitenkolonien des Ursprungsstammes erkannt und an der entsprechenden Stelle von der Vollmediumplatte abgeimpft und isoliert werden.

B) Fermentation

Die nach dem unter A) beschriebenen Verfahren isolierte Mutante AC 7 des Ursprungsstammes Candida oleophila ATCC Nr. 20 177 wurde von einem Schrägagarröhrchen mit Hefe-Malzextrakt-Pepton-Glucose-Agar in 50 ml eines flüssigen Mesiums der gleichen Zusammensetzung geimpft und 24 Stunden bei 28° C geschüttelt. Die gut gewachsene Kultursuspension wurde daraufhin in 500 ml des folgenden Mediums überführt: 0,05% KH₂PO₄, 0,02% MgSO₄ · 7 H₂O, 0,025% MnSO₄ · 4 H₂O, 0,25% NH₄Cl, 0,05% Corn steep powder, 2% (Vol.) n-Dodecan, 1% CaCO₃. Nach 48stündiger Kultivierung wurde mit dieser Vorkultur eine zweite Vorkultur mit 51 Gesamtvolumen beimpft und in einem Fermentergefäß unter Rühren und Luftzufuhr weitere 24 Stunden kultiviert. Mit 21 der so erhaltenen Zellsuspension erfolgte die Animpfung von 301 des nachfolgend aufgeführten Fermentationsmediums:

0,05% KH₂PO₄
ίο 0,02% MgSO₄ · 7 H₂O

0,025% MnSO₄ · 4 H₂O

0,25% NH₄Cl

0,05% Corn steep powder

8,0% CaCO₃
ι j 10,0% (Gew/Vol.) n-Dodecan

Die Fermentation wurde in einem 50-1-Fermentergefäß bei 28° C mit einer Rührerdrehzahl von 600 U/min und einem Luftdurchfluß von 0,7 1/I/min durchgeführt.

Nach 24stündiger Kultivierung war eine maximale Zellzahl von ca. 8 · 10⁸AnI erreicht.

Zu diesem Zeitpunkt wurde dem Ansazt 1 · 10-⁴MoI 2,4-Dinitrophenol/l Medium zugegeben. Nach insgesamt 4tägiger Fermentationsdauer betrug die Citronen-Säurekonzentration im Medium 128 g/l. Iso-Citronensäure war nicht nachweisbar.

Die Citronensäure konnte nach Zusatz von Salzsäure zum Medium und Abfiltrieren der Hefezellen durch ausfällung mit Calciumhydroxid und anschließende Filtration als Tricalciumcitrat aus dem Medium isoliert und nach Umsetzung mit Schwefelsäure aus dem eingeengten Filtrat kristallin gewonnen werden.

Beispiel 2

Das Fermentationsverfahren wurde nach der in Beispiel 1 angegebenen Methode wiederholt, jedoch wurde statt Dodecan 10% (Gew/Vol.) eines n-Paraffingemisches (8% n-Decan, 41% n-Undecan, 38% n-Dodecan, 12% n-Tridecan, 1% n-Tetradecan) und statt CaCO₃ 10% NaHCO₃ eingesetzt. Die erhaltene Citronensäureausbeute entsprach ungefähr derjenigen in Beispiel 1, nämlich 131 g CS/1. Iso-Citronensäure trat wiederum nicht auf.

Zur Aufbereitung wurden die Hefezellen abfiltriert und das Filtrat mit Natronlauge alkalisch gemacht. Nach Einengung dieser Lösung unter vermindertem Druck konnte daraus Trinatriumcitrat direkt kristallisiert werden.

Beispiel 3

Das Fermentationsverfahren wurde gemäß Beispiel 1 wiederholt, jedoch unterblieb die Zugabe von 2,4-Dinitrophenol. Nach 4tägiger Gärung betrug die Citronensäurekonzentration im Fermentationsmedium 114 g/l.

Außerdem konnten 4,5 g/l Iso-Citronensäure nachgewiesen werden.

Gemäß der Erfindung eignen sich insbesondere Mutanten der bereits genannten Candida oleophila ATCC 20 177, besonders die Mutante AC 7, DSM 343 (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen, Göttingen), sowie Mutanten, gewonnen nach Beispiel 1 aus den ursprünglichen Stämmen der Candida lipolytica, ATCC 8661,8662 und 9773.

Claims (6)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Citronensäure aus Kohlenwasserstoffen durch aerobe Fermentation unter Verwendung einer Hefe-Mutante, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Hefe-Mutante, die bei einer hohen Konzentration von FluoraCetat zum Wachstum befähigt ist, herstellt und diese Mutante in einem wäßrigen Nährmedium mit mindestens einem η-Paraffin mit 9—20 Kohlenstoffatomen unter Zusatz einer die Atmungskettenphosphorylierung entkoppelnden Verbindung fermentiert, bis sich Citronensäure in hoher Konzentration im Medium angesammelt hat und diese aus der Nährlösung gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Entkoppler 2,4-Dinitrophenol verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Entkoppler nach 24 Stunden und in einer Konzentration von 1 · 10~² bis 1 · 10~⁵ Mol/l dem Medium zugesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die η-Paraffine in Mengen von 5 bis 20 Volumenprozent, bezogen auf das Kulturmedium, eingesetzt werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Hefe-Mutante der Gattung Candida oleophila, die bei einer hohen Konzentration von Fluoracetat zum Wachstum befähigt ist, hergestellt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Hefe-Mutante der Gattung Candida lipolytica, die bei einer hohen Konzentration von Fluoracetat zum Wachstum befähigt ist, hergestellt wird.