DE2050361B - Verfahren zur Herstellung von Zitronen saure - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch Vergärung einer Hefe der Gattung Candida, die die Fähigkeit zur Akkumulation von Zitronensäure und zur Assimilierung von Kohlenwasserstoffen besitzt, in einem wäßrigen Nährmedium, welches als Hauptquelle für assimilierbaren Kohlenstoff wenigstens ein normales Paraffia mit etwa 9 bis 19 Kohlenstoffatomen enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Vergärung mit einem Inokulum einleitet, das aus einer aktiv wachsenden Kultur von Candida lipolytica ATCC Nr. 20 228 besteht, und den Hauptteil der Vergärung bei einem unter 4 liegenden pH-Wert durchführt.

Wegen ihrer leichten Assimilierbarkeit, ihres guten Geschmacks und ihrer geringen Toxizität ist die Zitronensäure eine der am häufigsten in der Lebensmittelindustrie und der pharmazeutischen Industrie eingesetzten Säuren. Sie wird in großem Maßstab als Ansäuerungsmittel in Getränken sowie als Antioxidans zur Unterdrückung des Ranzigwerdens in Fetten und Ölen verwendet. Sowohl die freie Säure als auch die Salze derselben werden als Puffer bei der Herstellung von Marmeladen, Gelees und Gelatinepräparaten sowie als Stabilisatoren in verschiedenen Lebensmittelprodukten benutzt.

Die Hauptmenge des W .'♦hedarfs an Zitronensäure wird mit Hilfe von Gärverfahren gedeckt, bei welchen im allgemeinen bestimmte Stämme von Aspergillus niger mit Kohlehydraten wie Melasse und Dextrose als Hauptquelle für assimilierbaren Kohlenstoff verwendet werden, wie beispielsweise in der französischen Patentschrift 1573 655 beschrieben wird. Obwohl diese Gärverfahren mit Aspergillus niger an sich durchaus brauchbar sind, weisen sie doch viele Schwierigkeiten auf. So neigen beispielsweise die Aspergillus niger-Kulturen nach einer gewissen Zeit der Zitronensäureproduktion zur Degeneration. Bei dem Verfahren muß außerdem die Zitronensäure in Form eines Salzes abgetrennt werden; letzteres muß dann angesäuert werden, damit die freie Säure ge-

wonnen werden kann. Weiterhin ist eine verhältnismäßig lange Zeitspanne, im allgemeinen mehr als 7 Tage, erforderlich, wenn große Mengen an Zitronensäure durch die Gärung erzeugt werden sollen. Die lange Gärdauer und die zusätzliche Verfahrensstufe,

is in welcher das Zitrat in die freie Säure umgewandelt wird, sind die Hauptkostenfaktoren bei der Produktion von Zitronensäure. Die Entwicklung eines rasch ablaufenden Gärverfahrens zur direkten Herstellung und Abtrennung von Zitronensäure wäre daher fur die einschlägige Industrie wichtig und interessant.

Aus der französischen Patentschrift 1 573 655 ist ferner bekannt, zur Herstellung von Zitronensäure bestimmte Penicillium-Stämme zu verwenden. Diese besitzen jedoch, ähnlich wie die Aspergillus-Stämme

den Nachteil, daß sie relativ langsam wachsen und dadurch die Fermentation relativ lange, d. h. zwischen 10 und 14 Tagen, dauert. Außerdem kann auch bei diesem Verfahren die reine freie Zitronensäure nicht direkt aus der Gärbrühe gewonnen werden, sondern sie muß zur Abtrennungvon Verunreinigungen zunächst in Form ihrer Calciumsalze ausgefällt werden.

Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch Fermentation wird in der französischen Patentschrift 1 584 227 beschrieben und besteht darin, daß man Arthrobacter-Bakterien verwendet. Auch hier erzielt man keine befriedigenden Ausbeuten, und die Zitronensäure kann nicht direkt aus der Gärbrühe durch einfaches Einengen derselben gewonnen werden. Es bedarf der Hilfe von Ionenaustauschharzen, Chromatographie oder Ausfällung.

In der belgischen Patentschrift 716 247, welche der französischen Patentschrift 1 571 551 entspricht, ist ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure beschrieben, bei welchem verschiedene Hefen der Gattung Candida verwendet werden, welche die Fähigkeit besitzen, Zitronensäure zu akkumulieren und Kohlenwasserstoffe zu assimilieren; die eigentliche Gärung wird bei einem pH-Wert von etwa 4 bis etwa 7,5 durchgeführt, und zwar so lange, bis sich erhebliche Mengen Zitronensäure in der Gärbrühe angesammelt haben. Auch bei diesem Verfahren fällt die Zitronensäure als Calciumzitrat an, welches dann, im allgemeinen mit Schwefelsäure, angesäuert werden muß, damit die gewünschte freie Zitronensäure gewonnen werden kann.

In der einschlägigen Literatur sind weitere Vertreter der Gattung Candida beschrieben, die in Medien, welche Kohlenwasserstoffe enthalten, Zitronensäure erzeugen; vgl. hierzu T. Tan a be, J.

O k a d a und H. O η ο, Agr. Biol. Chem., 30, S. 1175 (1966), E. J. Ny ns, J. P. A u qui er e, N. Chiang und A. L. Wi au x, Nature, 215, S. 177 (1967); M. J. Klug und A. J. Markovetz, Appl. Microbiol., 15, S. 690 (1967), J. Bacteriol., 93, 1847 (1967). Offensichtlich ist es jedoch bisher nicht möglich gewesen, freie Zitronensäure in solchen Kohlenwasserstoff-Systemen zu erzeugen. Eine charakteristische Eigenschaft der meisten Zitro-

nensäure akkumulierenden Stämme von Candida besteht darin, daß sich in der Gärbrühe mit den Zitraten mehrwertige Alkohole wie Erythrit, Arabit und Mannit gleichzeitig ansammeln. Ein Unterscheidungsmerkmal des erfindungsgemäßen Verfahreiis, welches in überlegener Weise die Herstellung von Zitronensäure erlaubt, gegenüber bekannten Verfahren bssteht darin, daß sich bei Verwendung des neuen Stammes Candida lipolytica ATCC 20 228 nur eine Nebenproduktion von geringen Mengen an Erythrit ergibt; Arabit und Mannit werden überhaupt nur in Spuren gebildet. Die höhere Konzentration der Zitronensäure, die bei dem niedrigen End-pH-Wert der Gärbrühe in freier Form vorliegt, und die geringen Mengen an nebenbei gebildeten Verunreinigungen machen es möglich, daß die Zitronensäure direkt aus der filtrierten Gärbrühe isoliert werden kann.

Nach dem erfindungsgemäßeii Verfahren wird die Zitronensäure durch aerobe Vergärung eines wäßrigen Nährmediums, welches als Hauptquelle für assimilierbare Kohlenstoff wenigstens ein normales Paraffin mit etwa 9 bis 19 Kohlenstoffatomen enthält, mit Hilfe eines bestimmten neuen Stammes der Gattung Candida in etwa 4 bis 7 Tagen, bei welchem die freie Säure dann direkt durch Konzentrierung der »5 filtrierten Gärbrühe gewonnen werden kann. Für das erfindungsgemäße aerobe Gärverfahren zur Herstellung von Zitronensäure wird der Stamm Candida lipolytica ATCC Nr. 20 228 in einem Nährmedium verwendet, welches wenigstens ein normales Paraffin mit 9 bis 19 Kohlenstoffatomen als Kohlenwasserstoff enthält. Der Kohlenwasserstoff liegt in inniger Mischung mit einer wäßrigen Phase vor, die eine assimilierbare Stickstoffquelle, Mineralien und andere übliche Nährstoffe enthält.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist während des Gärzyklus im allgemeinen keine Einstellung des pH-Wertes erforderlich; gegen das Ende des Gärprozesses, d. h. nachdem wenigstens die Hälfte bis Dreiviertel des Gärzyklus abgelaufen sind, fällt der pH-Wert der Gärbrühe auf etwa 2 bis 3. Bei einem Vergleich mit dem Stamm Candida lipolytica IFO-1437, welcher in der bereits erwähnten belgischen Patentschrift 716 247 genannt ist, mit dem neuen Stamm Candida lipolytica ATCC Nr. 20 228 ergibt sich, daß der letztere etwa fünf- bis zehnmal soviel Zitronensäure erzeugt. Zu keinem Zeitpunkt des Gärzyklus fällt der pH-Wert der Gärbrühe, die mit der bisher bekannten Art Candida lipolytica I FO-1437 geimpft worden ist, unter 3. Dagegen hat sich jetzt überraschenderweise gezeigt, daß der pH-Wert der Gärbrühe bei Verwendung des neuen Stammes ATCC Nr. 20 228 während des gesamten Gärzyklus nicht eingestellt werden muß und daß sich in dem EndpH-Bereich von etwa 2 bis 3 hohe Ausbeuten an Zitronensäure ansammeln. Die akkumulierte freie Zitronensäure wird direkt abgetrennt, indem man die filtrierte Gärbrühe nach Entfernung der Metallionen des Puffers konzentriert bzw. einengt.

Es konnte jetzt festgestellt werden, daß Candida lipolytica ATCC 20 228 die besondere Fähigkeit besitzt, Zitronensäure in Form der freien Säure bei der aeroben Vergärung des vorstehend genannten Mediums anzusammeln, wenn der pH-Wert bei der Vergärung niedrig gehalten wird, d. h. wenn die Zitronensäure bei ihrer Erzeugung nicht neutralisiert wird. Zur Zeit ist nur dieser Stamm von Candida lipolytica bekannt, der die direkte Kristallisation der Zitronensäure aus der kenzentrierten Gärbrühe gestattet. Alle öffentlich erhältlichen Stämme dieser Art wurden geprüft, u-ad es wurde festgestellt, daß keiner diese besondere Eigenschaft besitzt.

Um die Eigenschaften dieses Stammes voll ausnutzen zu können, ist es notwendig, daß die Vergärung bzw. die Fermentation bei einem niedrigen pH-Wert durchgeführt wird, d. h. daß die Zitronensäure bei ihrer Herstellung nicht neutralisiert wird. Es ist überraschend, entspricht jedoch den Tatsachen, daß Her Stamm Nr. 20 228 selbst bei pH-Werten von etwa 2 bis 3 oder darunter lebensfähig und ein starker Zitronensäure-Erzeuger bleibt. Am Anfang ist es notwendig, den pH-Wert bei etwa 4 bis 7 (im allgemeinen etwa 5 bis 6) zu halten, damit das Zellwachstum in Gang kommt. Sobald sich die Zellmasse entwickelt hat, läßt man den pH-Wert auf natürliche Weise absinken, indem man mit steigender Zitronensäureproduktion keinen Puffer oder eine andere Base, die mit dem gebildeten Produkt reagieren kann, zusetzt. Die Gärung ist im allgemeinen in 5 bis 7 Tagen abgeschlossen. Bevor noch die ersten beiden Tage vorüber sind, ist der pH-Wert schon unter 4 gesunken und fällt dann allmählich immer weiter bis auf den Endbereich von etwa 2 bis 3. Wie weiter vorn bereits gesagt, bedeutet dies, daß das Produkt in Form der freien Säure und nicht als Zitrat vorliegt, so daß es leicht abgetrennt werden kann.

Die anfängliche Einstellung des pH-Wertes kann durch Zugabe von Natronlauge oder einer anderen Base erfolgen. Am einfachsten ist es jedoch, eine begrenzte Menge eines Carbonates am Anfang zuzusetzen; dessen Pufferfähigkeit durch die gebildete Zitronensäure zum Zeitpunkt, zu dem sich die Zellmasse so weit entwickelt hat, daß sie als Inoculum für die Gärung verwendbar ist, verbraucht ist. Vorzugsweise setzt man dem Medium Calciumcarbonat als Puffer zu. Dieses reagiert mit der Zitronensäure, die sich während der Wachstumsstufe ansammelt, wodurch verhindert wird, daß der pH-Wert des Mediums zu sauer wird. Es ist allgemein bekannt, daß es in den Anfangsstufen der Hefeerzeugung zu einem Stillstand oder zu einer erheblichen Verringerung des Hefezellenwachstums kommt, wenn der pH-Wert des Mediums unter etwa 4,0 fällt. Es kann auch angenommen werden, daß ein Teil des bei der Reaktion von Zitronensäure mit Calciumcarbonat gebildeten Kohlendioxids am Stoffwechsel der Hefezellen teilnimmt und so deren Wachstum in dem Medium fördert. Außer Calciumcarbonat können auch Bariumcarbonat, Calciumoxid, Bariumoxid und andere bekannte Puffer-Substanzen verwendet werden.

Vorzugsweise verwendet man als hauptsächliche oder einzige Kohlenwasserstoffquelle bei der Gärung n-Hexadecan. Jedoch können auch andere normale Paraffine mit 19 Kohlenstoffatomen als Hauptkohlenstoffquelle verwendet werden.

Der Kohlenwasserstoff wird im allgemeinen in einer Konzentration von etwa 5 bis 9 Gewichtsprozent, bezogen auf das Medium, verwendet. Dieser Umstand ist jedoch nicht kritisch, und es ist durchaus möglich, den Kohlenwasserstoff in geringeren oder größeren Konzentrationen zu verwenden. Von den zur Verfügung stehenden anorganischen Stickstoffquellen kommen vor allem Stickstoffsalze wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Ammoniumnitrat in Frage. Auch zahlreiche organische Stickstoffquellen sind geeignet, so z. B. Weizenkleie, Sojabohnenmehl,

Harnstoff, Aminosäuren und Peptone. Es ist weiterhin aus der f^.^^^I^^^ ^

bekannt, daß Vitamine wie Biotin und Mineral- beute und ^"^

kationen und -anionen wie Natrium, Kalium, Kobalt, «^^^!^^^^ΑΙΚ^^

Phosphat und Sulfat für das Wachstum der Hefen Nr. 20 228 bleiben ein ^"£f ™^ ^

ebenfalls sehr günstig sind. Die meisten dieser Spuren- 5 eine hohe ^onraaiui^rodutoon erhaten wenn

vitamine und -mmeValien sind in Maisquellwasser der pH-Wert der ?**^ "*£"**>%* _^{bls 3}

sowie einigen Stickstoffquellen, z. B. Sojabohnenmehl oder sogar darunter fallt, nachdem de Vergärung

enthalten, s* daß es nicht notwendig ist, sie einzeln eingeleitet worden ist. Ganz anders als bei den _waßn-

dem Gärmedium zuzusetzen. Das Gärmedium enthält gen kohlehydrathaltigen Medien, diebei^der.Zitronen,

also übliche Quellen für assimilierbaren Stickstoff, xo säureproduktion.mit As_Perg.llus niger oder den bisher

Mineralien und andere Wachstumsfaktoren, die in bekannten Candida-Arten anfallen handek es ach

der wäßrigen Phase enthalten sind. Ein Medium, bei den blank filtrierten Kohlenwasserstoff-Garbruhen

das sich für die Zwecke der Erfindung als besonders gemäß der Erfindung um Produkte, deren Gehalt an

brauchbar erwiesen hat, ist eines, welches ein Ammo- Verunreinigungen niedrig ist und die fast farblos

niumsalz, Maisquellwasser und ein normales Paraffin 15 sind. Reine kristalline Zitronensäure kaim direkt _m

mit etwa 9 bis 19 Kohlenstoffatomen enthält. Die Ausbeuten von 50 bis 75% oder darüber durch em-

Kohlenwasserstoffkonzentration sollte wenigstens etwa faches Eindampfen im Vakuum gewonnen werden.

3 Gewichtsprozent, besser etwa 5 bis 20 Gewichts- Bei dem neuen erfindungsgemaßen Garverfahren

Prozent, bezogen auf das Medium, betragen, damit entfällt die Notwendigkeit einer kontinuierlichen pH-

dic Ausbeuten an Zitronensäure ausreichend hoch 20 Wert-Einstellung; durch die direkte Abtrennung e.ner

sind. Das mitverwendete Wasser hat im wesentlichen Zitronensäure mit hoher Reinheit und mit guter Aus-

die Aufgabe eines Mediums für die Stickstoff, Minera- beute ergeben sich außerdem erhebliche Einsparungen

lien und Wachstumsfaktoren liefernden Materialien, durch die Ausschaltung der Zwischenbenandlungs-

jedoch ist eine gewisse Menge Wasser auch notwendig, stufen der Salzbildung und der anschließenden Um-

um das Wachstum der Hefezellen zu unterhalten. 25 Wandlung der Salze in die freie Saure unter Verwendung

Obwohl es theoretisch möglich ist, den Kohlenwasser- von Mineralsäuren, Ionenaustauschern oder Elek-

stoff in sehr hohen Konzentrationen, z. B. von 50% trodialyse.

oder noch mehr zu verwenden, ergibt sich in der Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläute-

Praxis eine optimale Zitronensäureproduktion dann, rung des Verfahrens,

wenn die Kohlenwasserstoffkonzentrationen inner- 3a B e i s ρ i e 1 1
halb der vorstehend genannten Grenzen gehalten

werden. Eine Kartoffel-Dextrose-Agar-Schrägbodenkultur,

Die Gärung kann in beliebiger Weise unter An- welche Zellen von Candida lipolytica ATCC 20 228

wendung einer aeroben Inkubation durchgeführt enthält, wird in ein flüssiges Medium überführt,

werden; es ist jedoch vorteilhaft, eine kontrollierte 35 welches aus 3 g »NZ Amine YTT«, 34,7 g C₁₁-C_n,-

Belüftung durchzuführen, z. B. das Medium an der η-Paraffinen und 600 ml Leitungswasser besteht. Das

Luft zu rühren, oder Luft durch das Medium zu Medium wird zunächst 30 Minuten bei 120⁰C sterili-

blasen. Da der Kohlenwasserstoff in der wäßrigen siert. Die Candida-Zellen werden dann der aeroben

Phase nicht löslich bzw. mit dieser nicht mischbar Inkubation bei Raumtemperatur (27° C) 48 Stunden

ist, ist es ratsam, den Kohlenwasserstoff in fein- 40 lang unterworfen, wobei das Medium in Bewegung

dispergierter Form in dem wäßrigen Medium zu gehalten wird; um letzteres zu erreichen wird eine

halten, damit während der Vergärung zwischen dem Drehschüttelvorrichtung verwendet. Am Ende der

Kohlenwasserstoff und der wäßrigen Phase eine große Behandlungszeit wird ein 5%iges Inokulum des

Berührungsfläche vorhanden ist. Auf diese Weise Candida-Wachstums in ein wäßriges sterilisiertes

erreicht man einen optimalen Kontakt zwischen den 45 Nährmedium überführt, welches pro Liter Medium

Hefezellen, der wäßrigen Phase und dem Kohlen- 5,0 g Maisquellwasser, 4,0 g Ammoniumsulfat, 15,0 g

wasserstoff. Besonders günstig läßt sich das erfin- Calciumcarbonat und 155 g C^-C^-n-Paraffine ent-

dungsgemäße Verfahren als submerse Gärung unter hält. Das geimpfte Medium wird 48 Stunden bei einer

raschem Rühren der Mischung bei gleichzeitigem Ein- Temperatur von 26⁰C gerührt und dabei mit 29,71

leiten durch Luft, z. B. mit Hilfe von Düsen, durch- 50 Luft pro Stunde pro Liter Flüssigkeit belüftet. Wäh-

führen. Zur weiteren Verbesserung der Dispersion rend dieser 48stündigen Einieitungsperiode wird der

des Kohlenwasserstoffes kann es günstig sein, ein pH-Wert zur Erzielung einer optimalen Zellentwicklung

oberflächenaktives Mittel in dem Medium mitzuver- bei etwa 5 bis 6 gehalten, indem man Calciumcarbonat

wenden. zum Puffern in kleinen Teilmengen je nach Bedarf

Die üblichen Temperaturen, die allgemein zur 55 zusetzt. Diese begrenzte Puffermenge wird in dem

Züchtung von Hefen angewandt werden, z. B. etwa Maße verbraucht, wie die Zellmasse Zitronensäure

20 bis 37°C, können auch für das erfindungsgemäße erzeugt, so daß am Ende der 48stündigen Periode

Verfahren verwendet werden; vorzugsweise arbeitet dei pH-Wert bereits etwas unter 4 liegt und dann

man bei etwa 25 bia 29^c C bei einer Gärungsdauer rasch abfällt.

von 4 bis 7 Tagen. Die einleitende Wachstumsperiode 60 Eine Teilmenge von 5°/₀ dieses aktiven wachsenden

der Hefezellen zur Herstellung des Inokulums beträgt Inokulums wird dann in einen großen Gärbehälter

vorzugsweise 24 bis 48 Stunden. Im übrigen verlaufen überführt, der folgende Bestandteile pro Liter sterili-

die Züchtung und die Vergärung sowie die anschlie- siertes Medium enthält: 4,7 g Harnstoff, 0,001g

ßende Aufarbeitung der Gärbrühe auf Zitronensäure, Thiamin-Hydrochlorid, 180 g C_u-C_1?-n-Paraffine und

z. B. durch Zentrifugieren, Filtrieren, Einengen unter 65 0,375 g KH₂PO₄ (getrennt sterilisiert). Das Gär-

Vakuum usw., in üblicher bekannter Weise. medium wird 144 Stunden (6 Tage) mit 1725 Um-

Ein wesentliches Kennzeichen der Erfindung ist drehungen pro Minute gerührt, wobei 29,71 Luft

darin zu sehen, daß die freie Zitronensäure direkt pro Stunde pro Liter Flüssigkeit durchgeleitet werden;

7 8

man arbeitet bei einer Temperatur von 26⁰C. Die sieren wird das Medium mit Zellen von Candida Ausbeute an Zitronensäure-Monohydrat bei der lipolytica ATCC 20 228 geimpft und anschließend bei Gärung beträgt 225 g pro Liter. Schon am Anfang Raumtemperatur inkubiert. Die Gärung verläuft der 6-Tage-Periode stellt sich der pH-Wert von selbst unter Rühren unter submersen aeroben Bedingungen auf etwa 2 bis 3 ein, worauf keine weitere Einstellung s in 24 Stunden. Nach dieser Zeit liegt der pH-Wert notwendig ist. Am Ende der 6-Tage-Periode werden bei etwa 6,5. Der Gehalt des Mediums an Candidadie festen Substanzen und das Mycel abfiltriert; die Zellen wird bestimmt, indem man eine 15-ml-Probe filtrierte Gärbrühe wird unter Vakuum bei 45° C des Mediums bei 2000 g 15 Minuten zentrifugiert, auf 40° Baumo eingeengt. Die Zitronensäurekristalle, ■ Sobald eine Dichte von 0,5 ml Zellen pro 15 ml die sich beim Stehen über Nacht gebildet haben, wer- io Wachstumsmedium erreicht ist, wird die Zellsuspenden abzentrifugiert. Eine zweite und eine dritte sion als Inokulum für ein entsprechendes Gärmedium Ernte an Zitronensäure können erzielt werden, indem verwendet.

man die Mutterlaugen unter Vakuum auf 45° Baume Mehrere Milliliter dieses 24 Stunden alten Inokulums

bei 75 ⁰C einengt. Die Gesamtausbeute an freier werden dann zu einem wäßrigen sterilisierten Nähr-

Zitroneiisäure liegt bei etwa 50 Gewichtsprozent. 15 medium gegeben, welches pro Liter folgende Bestand-

Eine Restmenge an Produkt in den End-Mutterlaugen teile enthält: 4,7 g Harnstoff, 0,01 g Thiamin-Hydro-

kann schließlich gewonnen werden, indem man durch chlorid, 0,1 g MgSO₄ · 7H₂0,180 g C₁₄-C_le-n-Paraffine

Neutralisation mit Natriumhydroxid das Mono- und 0,75 g KH₂PO₄ (getrennt sterilisiert),

natriumsalz bildet und die Lösung unter Vakuum Das Gärmedium wurde 5 Tage bei 1725 Umdre-

einengt. 20 hungen pro Minute gerührt, wobei mit 29,7 1 Luft

Beispiel 2 ^pro Stunde P^ro Liter Lösung belüftet wurde. Die

Gärung wurde bei einer Temperatur von 25 ⁰C durch-

Das Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, geführt. Der pH-Wert fiel innerhalb der ersten 2 Tage

wobei man die C₁₄-C_ie-n-Paraffine in dem Gärmedium von etwa 6,5 auf etwa 2,5 und stabilisierte sich dann

durch n-Hexadecan ersetzt; die Ergebnisse sind ent- 25 von selbst auf 2,0 bis 2,5. Die festen Substanzen und

sprechend. Nach Abtrennung der freien Zitronensäure das Mycel wurden am Ende der 5-Tage-Periode

wird diie verbleibende Mutterlauge wieder mit Na- abfiltriert. Die filtrierte Brühe wurde im Vakuum bei

triumhydroxid neutralisiert und unter Vakuum einge- 45°C auf 40° Baumo eingeengt. Nach Zugabe von

engt; die noch enthaltene Zitronensäure wird so in Impfkristallen aus Zitronensäure kristallisierte beim

Form des Trinatriumsalzes gewonnen. 30 Stehen über Nacht freie Zitronensäure aus; die

. -ίο Kristalle wurden abzentrifugiert. Eine zweite und

Beispiel 5 _eme j^tte Ernte an Zitronensäure konnten gewonnen

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wird wiederholt, werden, indem man die Mutterlauge bei 75⁰C auf

jedoch wird in der Gärstufe an Stelle von C₁₄-C₁₆- 45° Baume weiter einengte. Die danach vorliegende

η-Paraffinen eine Mischung aus 28,9 g aller folgenden 35 Mutterlauge wurde schließlich mit Natriumhydroxid

Kohlenwasserstoffe verwendet: n-Decan, n-Nonan, neutralisiert und unter Vakuum eingeengt, so daß

n-Undecan, n-Tridecan, n-Pentadecan, n-Hexadecan man die restliche darin enthaltene Zitronensäure

und n-Octadecan. Es werden etwa die gleichen Ergeb- als Mononatriumsalz gewinnen konnte,

nisse erzielt, d. h., die Ausbeute an freier Zitronen- . -ic

säure liegt über 50%. Die zurückbleibende Mutter- 40 Beispiel 5

lauge wird anschließend auf einen pH-Wert von Die Arbeitsweise von Beispiel 4 wurde wiederholt,

8 bis 10 eingestellt, indem man eine ausreichende wobei jedoch die C₁₄-Cj_e-n-Paraffine durch eine

Menge Calciumchlorid zusetzt. Auf diese Weise wird Kohlenwasserstoffmischung, die aus η-Paraffinen mit

die gesamte noch enthaltene Zitronensäure in CaI- 9 bis 19 Kohlenstoffatomen bestand, ersetzt wurden,

ciumzitrat umgewandelt, welches durch Zentrifugieren 45 Nach 138stündiger Gärung konnte freie Zitronensäure

abgetrennt wird. in mehr als 50°/_oiger Ausbeute in der beschriebenen

Beispiel 4 Weise abgetrennt werden. Zu der zurückbleibenden

Mutterlauge wurde dann Kaliumhydroxid gegeben;

Man stellt ein flüssiges Nährmedium aus 150 g aus der unter Vakuum eingeengten Lösung konnte Cerelose, 15 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 4 g Natrium- 5° die restliche Zitronensäure als Monokaliumsalz ge-

chlorid und 1 Liter Wasser her. Nach dem Sterili- wonnen werden.

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch Vergärung einer Hefe der Gattung Candida, die die Fähigkeit zur Akkumulation von Zitronensäure und zur Assimilierung von Kohlenwasserstoffen besitzt, in einem wäßrigen Nährmedium, welches als Hauptquelle für assimilierbaren Kohlenstoff wenigstens ein normales Paraffin mit etwa 9 bis 19Kohlenstoffatomen enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vergärung mit einem Inokulum einleitet, das aus einer aktiv wachsenden Kultur von Candida lipolytica ATCC Nr. 20 228 besteht, und den Hauptteil der Vergärung bei einem unter 4 liegenden pH-Wert durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vergärung bei einem pH-Wert zwischen etwa 2 und 3 durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vergärung in etwa 4 bis 7 Tagen durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die gebildete Zitronensäure als freie Säure direkt aus der nitrierten Gärbrühe abtrennt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Inokulum von Candida lipolytica ATCC Nr. 20 228 ein solches verwendet, das durch etwa ein- bis zweitägiges Züchten in einem wäßrigen Nährmedium bei einem pH-Wert zwischen etwa 4 und 8 erhalten wurde.