DE2015076B2 - Als tolypomycin rb (b-2847 rb) bezeichnetes antibiotikum und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Description

CH₃ CH₃

CH₃COO
CH₃O. I

OH OH

Y CH₃ O

J HO OH

NH Il ·

y\_Hj

H,C

OH

mit der Elementaranalyse

C 61,42+1%, H 6,85±ö,5%, N 3,31 ±0,5%; spezifischen Drehung

[«]? = +133,4° ±13° (C= 1,0. Äthanol)

= +257° ±26° (C =1,0, Chloroform);

einem Molekulargewicht von etwa 830, bestimmt nach der Dampfdruckmethode, einem Ultrayiolett- und sichtbaren Absorptionsspektrum in Äthanol gemäß Fig. 1 mit folgenden signifikanten Absorptionsmaxima:

Es wurde gefunden, daß durch Reduktion der Antibiotika Tolypomycin Y und R (vgl. holländische Patentanmeldung 68 02 679, offengelegt am 26.8.1968, dort jedoch noch als B-2847 X und B-2847 R bezeichnet) mit einem bestimmten Reduktionsmittel ein neues Antibiotikum erhalten wird, das eine geringere Toxizität und erhöhte Stabilität hat. Dieses neue Antibiotikum ist zur Unterscheidung von den bekannten Ausgangsprodukten als Tolypomycin RB (B-2847 RB) bezeichnet worden.

Gegenstand der Erfindung ist demgemäß das als Tolypomycin RB (B-2847 RB) bezeichnete Antibiotikum mit antimikrobischer Aktivität gegenüber gram-positiven Bakterien, welches sich durch die Formel

CH₃COO
CH₃O

'. Äthanol

35

40

"224±2ΐη_μ (E₁ ¹I = 446 ±45) 240±2πΐμ(Ε!* =426 ±40) 301 ±2 πΐμ (EH= 197 ±20) 420±2ηΐμ(Ε!1 = 203 ±20),

45

einem Infrarotabsorptionsspektrum, gemessen in Chloroform, mit signifikanten Absorptionsmaxima bei folgenden Wellenzahlen:

3490 (mittel), 3000 (mittel), 1715 (mittel), 1670 (stark), 1625 (stark), 1565 (Schulter), 1530 (sehr stark), 1465 (sehr stark), 1385 (stark), 1370 (stark), 1325 (stark), 1280 (stark), 1240 (sehr stark). 1160 (stark), 1095 (stark), 1065 (stark), 1020 (Schulter), 1003 (mittel), 973 (stark), 945 (mittel), 920 (mittel), 898 (mittel), 885 (Schulter)cm-';
wiedergeben läßt.

2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Tolypomycin RB nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibiotikum Tolypomycin Y (B-2847 Y) und/oder Tolypomycin R (B-2847 R), erhältlich durch Züchtung von Streptomyces tolypophorus ATCC-21177, mit Natriumborhydrid oder Natriumdithionit bei einer Temperatur von etwa 5 65 bis 3O⁰C in einem organischen Lösungsmittel oder einem Gemisch eines organischen Lösungsmittels mit Wasser reduziert werden und das Tolypomycin mit der Elementaranalyse
C 61,42 ± 1 %, H 6,85 ± 0,5%, N 3,31 ± 0,5%;

spezifischen Drehung

[«]? = +133,4° ±13° (C= 1,0, Äthanol)

= +257° ± 26° (C = 1,0, Chloroform);

einem Molekulargewicht von etwa 830, bestimmt nach der Dampfdruckmethode, einem Ultraviolett- und sichtbaren Absorptionsspektrum in Äthanol gemäß Fig. 1 mit folgenden signifikanten Absorptionsmaxima:

/ S¹""¹224 ±2 πΐμ (EJ* = 446 ±45) 240±2ΐΏμ(Εί1 = 426±40) 301±2ηΐμ(Ε!1 = 197 ±20) 420±2πΐμ(Ε|* = 203 ±20),

einem Infrarotabsorptionsspektrum, gemessen in Chloroform, mit signifikanten Absorptionsmaxima bei folgenden Wellenzahlen:

3490 (mittel), 3000 (mittel), 1715 (mittel), 1670 (stark), 1625 (stark), 1565 (Schulter), 1530 (sehr stark), 1465 (sehr stark), 1385 (stark), 1370 (stark),

1325 (stark), 1280 (stark), 1240 (sehr stark), 1160 (stark), 1095 (stark), 1065 (stark), 1020 (Schulter), 1003 (mittel), 973 (stark), 945 (mittel), 920 (mittel), 898 (mittel), 885 (Schulter)cm - ·;
wiedergeben läßt (vgl. F i g. 2).

Tolypomycin RB zeigt eine positive Farbreaktion gegenüber Eisen(IIl)-chlorid-KaIiurnferricyanitreagens (1:1) und ist löslich in Methanol, Äthanol, n-Bu'anol, Aceton, Chloroform, Äthylacetat, Diäthyläther und Benzol, schwer löslich in Wasser und unlöslich in n-Hexan.

Die Konstitution des beanspruchten Antibiotikums war am Anmeldetag noch nicht bekannt Es wurde daher in den ursprünglich eingereichten Anmeldungsunterlagen und in der DT-OS 20 15 076 als Antibiotikum B-2847 RB bezeichnet Von den aus »Tetrahedron letters« (1969), Seiten 97-100, bekannten Reduktionsprodukten Tolypomycin R und 16,17-Dihydrotolypomycin Y unterscheidet sich das erfindungsgemäße Antibiotikum im UV-Spektrum, wie die folgenden Gegenüberstellungen zeigen:

Tolypomycin RB

•'224± 2 πΐμ (Ej* = 446±45)
240±2ηΐμ(Ε!* = 426 ±40)
301 ±2ηΐμ(Ε|* = 197 ±20)
420±2rr^(E!;*_m = 203 ±20)

Tolypomycin R
;.rr"232±2ii^(EJl = 426±40)

31Ο±2ηΐμ(Ε!* = 184±20)

420 bis 460 ηΐμ (EJl = etwa 80)

16.17-Dihydrotolypomycin Y

;. ^Γ·'232ηΐμ(Ε!* = 235)
245 πΐμ (Schulter)
290 ΐημ (E¹Z = 269)
335ηΐμ(Εί* = 142,5).

Die Antibiotika Tolypomycin Y und Tolypomycin R, die als Ausgangsmaterialien für das Verfahren gemäß der Erfndung verwendet werden, können durch Kultivierung von Streptomyces tolypophorus ATCC-21177 in der in der holländischen Patentschrift 68 02 679 beschriebenen Weise hergestellt werden. Obige Kultur ist gemäß Erklärung der ATCC seit dem 13.2.1968 ohne Einschränkungen und unwiderruflich verfügbar.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden die Antibiotika Tolypomycin Y und/oder Tolypomycin R der Reduktion mittels Natriumborhydrid oder Natriumdithionit bei einer Temperatur von etwa 5 bis 30° C in einem organischen Lösungsmittel, in dem die Ausgangsmaterialien gelöst werden können, oder ein Gemisch von Wasser mit einem solchen organischen Lösungsmittel unterworfen, wobei das Antibiotikum Tolypomycin RB erhalten wird.

Das auf diese Weise gebildete Antibiotikum Tolypomycin RB kann aus dem Reaktionsgemisch isoliert und unter Ausnutzung seiner physikalisch-chemischen Eigenschaften gereinigt werden, beispielsweise unter Ausnutzung der Löslichkeitsunterschiede zwischen Antibiotikum und den Verunreinigungen, des Unterschiedes im Verteilungskoeffizienten zwischen zwei Flüssigphasen oder des Unterschiedes in der Adsorptionsfähigkeit.

Das Antibiotikum Tolypomycin RB hat die folgenden biologischen Eigenschaften:

1. Antibiotisches Spektrum

Die antimikrobischen Wirkungen von Tolypomycin RB gegen verschiedene Mikroorganismen sind in Tabelle 1 zusammengestellt Die Versuche werden bei gewöhnlichen Bakterien 20 Stunden bei 37°C auf Bouillonagar und bei säurefesten Bakterien 48 Stunden ίο bei 37° C auf Glycerin-Bouillonagar durchgeführt

Tabelle 1

Mikroorganismus

Hemmende Mindestkonzentration (Mikrogramm/Milli-Iiter)

20 Escherichia coli	50-100
Proteus vulgaris	50
Staphylococcus aureus 209p	0.01 -0,005
Staphylococcus aureus Terajima	0,01 -0,005
Staphylococcus aureus Heatley	0,005
2$ Bacillus subtilis	1.0
Bacillus cereus	1,0
Bacillus brevis	0.05
Mycobacterium avium	>100
Mycobacterium avium (resistent	>100
30 gegen Streptomycin)
Mycobacterium smegmatis	20-50
Mycobacterium phlei	100
Mycobacterium sp. ATCC 607	>100

35 Wie die Werte in Tabelle 1 deutlich zeigen, hat das Antibiotikum Tolypomycin RB eine starke antibiotische Wirkung gegen grampositive Bakterien.

2. Akute Toxizität

Antibiotikum Tolypomycin RB hat bei der Maus die folgenden LD₅O- Werte:

> 1000 mg/kg (intraperitoneal, Beobachtungsdauer 7 Tage)

etwa 500 bis 750 mg/kg (intravenös, Beobachtungsdauer 7 Tage).

Die Eigenschaften des neuen Antibiotikums sind deutlich verschieden von den Eigenschaften der Antibiotika Tolypomycin Y und R, unter anderem in bezug auf das Ultraviolettspektrum, das Infrarotspektrum und die spezifische Drehung.

Therapeutische Tests, bei denen die Antibiotika infizierten Tieren oral verabreicht wurden, zeigten, daß Tolypomycin RB im wesentlichen ebenso wirksam ist wie Tolypomycin Y und R.

Tolypomycin RB zeichnet sich ferner durch eine geringere Toxizität bei Säugetieren und erhöhte Stabilität in wäßriger Lösung im Vergleich zu Tolypomycin Y und Tolypomycin R aus.

Pyrogene oder eiterbildende Staphylokokken pflegen scnarf umgrenzte Läsionen beispielsweise in Form von Abszessen und dergleichen zu bilden, die häufig in der Haut auftreten. Diese Staphylokokken sind die Ursache von Furunkeln und Karbunkeln und anderen üblichen Wundinfektionen. Tolypomycin RB gemäß der Erfindung ist wertvoll in pharmazeutischen Zubereitungen für die örtliche Behandlung dieser Infektionsart bei Säugetieren (Hunde, Katzen, Menschen usw.). Eine

brauchbare Zubereitung für die örtliche Anwendung bei einer Infektion, die auf Staphylococcus aureaus zurückzuführen ist, wird beispielsweise wie folgt hergestellt: In Ig Wollfett werden 10 bis 20 mg Tolypomycin RB gleichmäßig eingearbeitet. Das Gemisch wird dann gleichmäßig mit weißem Petrolatum in einer solchen Menge gemischt, daß 10 g einer Salbe erhalten werden. Diese Salbe wird einmal täglich oder in Abhängigkeit von dem jeweiligen Fall mehrmals täglich unter leichtem Einreiben örtlich in einer Menge aufgetragen, die genügt, die Wunde oder den zu behandelnden Bereich zu bedecken.

I.

Bestimmung der Stabilität des Tolypomycins RB nach Lagerung

Jeweils 10 mg von Tolypomycin Y, R und RB werden in 1 ml Äthanol gelöst, worauf jede Lösung mit einem Phosphatpuffer eines pH-Wirts von 7,0 auf 100 ml verdünnt wird. Die Lösungen werden 24 Stunden bei 20⁰C stehengelassen, worauf die verbliebende antimikrobische Wirkung unter Verwendung von Staphylococcus aureus abgeschätzt wird. Dabei ergeben sich folgende Ergebnisse:

Tolypomycin Y Tolypomycin R Tolypomycin RB

Verbleibende antimikrobielle
Wirksamkeit

28% 33%

84%

Die Lagerstabilität wird nach folgender Beziehung bestimmt:

Verbleibende antimikrobielle Wirksamkeit antimikrobielle Wirksamkeit nach der Lagerung antimikrobielle Wirksamkeit vor der Lagerung

100.

Tabelle

II.

Vergleich des beanspruchten Antibiotikums mit bekannten Produkten

Antibiotikum

EDso*') (mg/kg) (mg/kg)

Chemotherapeutischer Index*³)

Tolypomycin RB
Tolypomycin Y
Tolypomycin R
Rifamycin SV
Chloramphenicol
Erythromycin

·') Mittlere effektive Dosis gegen Staphylococcus aureus bei oraler Vergabe an der infizierten Maus. *2) LDm bei der Maus bei intraperitonealer Vergabe. *³) Quotient aus mittlerer effektiver Dosis/LDw.

22	>1000	< 0,022
14,5	330	0,044
14	390	0,036
85	625	0.136
139	1300	O,iO53
115	490	0.2347

Aus der Tabelle folgt, daß Tolypomycin RB einen wesentlich niedrigeren chemotherapeutischen Index als bekannte Antibiotika aufweist Daraus folgt, daß Tolypomycin RB als chemotherapeutisches Mittel eine bessere Wirkung als die bekannten Antibiotika hat

Beispiel 1

Zu einer Lösung von 5.0 g Antibiotikum Tolypomycin Y in 1000 ml Athyiacetat werden 400 ml Wasser gegeben. Während das Gemisch bei Raumtemperatur gerührt wird, werden 2£ g Natriumborhydrid nach und nach zugesetzt Das Reaktionsgemisch wird 25 Minuten gerührt and dann mit 2n-Salzsäure neutralisiert Die Äthylacetatschicht wird isoliert und mit_ Wasser gewaschen. Nach Dehydratisierung wird die Äthylacetatschicht unter vermindertem Druck eingeengt Der erhaltene Rückstand wird in 30 ml Aceton gelöst Die Lösung wird mit 150 ml η-Hexan gemischt wobei sich eine Fällung bildet Die Fällung wird abfiltriert, wobei 3,0 g eines rohren Puivers erhalten werden.

Επε Lösung von 1,0 g des rohen Pulvers in 10 ml Äthylacetat wird durch eine Säule gegeben, die mit 20 g Kieselgel gefüllt ist Die Säule wird mit 400 ml eines Gemisches von Äthylacetat und Aceton (Volumenverhältnis 4:1) eluiert. Das Eluat wird zur Trockene eingedampft und der Rückstand in 5 ml Benzol gelöst Zur erhaltenen Lösung werden 50 ml η-Hexan gegeben, wobei 0,8 g Tolypomycin RB in Form eines gelben Puivers erhalten werden.

0,6 g des Pulvers werden der Dünnschichtchromatographie an_ Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches von Äthylacetat und Aceton (Volumenveriiäiöiis 1 :1) als Entwickler unterworfen. Die gelbe Zone bei einem Rf-Wert von etwa 0,65 wird mit iOOml Athyiacetat extrahiert Der Extrakt wird eingeengt und mit η-Hexan versetzt Hierbei werden 0,4 g Tolypomycin RB als gelbes Pulver erhalten.

Beispiel 2

Zu einer Lösung von 3Θ0 mg Antibiotikum Tolypomycin Y in 30 ml Aceton werden bei Raumtemperatur allmählich !OmI einer 10%igen wäßrigen Lösung tob

803

Natriumdithionit (Na₂S₂O₄ · 2H₂O) gegeben. Das Gemisch wird 15 Minuten gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit 30 ml Benzol extrahiert. Die Benzolschicht wird mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck eingeengt.

Der erhaltene Rückstand wird der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel, das 2% Oxalsäure enthält, unter Verwendung eines Gemisches von Äthylacetat, das 1% Oxalsäure enthält, und Aceton (Volumenverhältnis 1 :1) als Entwickler unterworfen. Die gelbe Zone bei einem Rf-Wert von etwa 0,5 wird mit 100 ml Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird auf etwa 1 ml eingeengt. Zum Konzentrat werden 20 ml n-Hexan gegeben, wobei 30 mg Tolypomycin RB als gelbes Pulver erhalten werden.

Beispiel 3

Zu einer Lösung von 500 Gew.-Teilen Tolypomycin R in 100 000 Gew.-Teilen Äthylacetat werden 40 000 Raumteile Wasser gegeben. Während das Gemisch bei Raumtemperatur gerührt wird, werden 250 Gew.-Teile Natriumborhydrid allmählich zugesetzt. Das Gemisch wird 20 Minuten gerührt, worauf die Äthylacetatschicht isoliert und mit 2 η-Salzsäure neutralisiert und anschließend mit Wasser gewaschen wird. Nach Dehydratisierung wird die Äthylacetatschicht unter vermindertem Druck eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird in 2000 Raumteilen Benzol gelöst. Die Lösung wird mit 20 0OC Raumteilen η-Hexan gemischt, wobei 340 Gew.-Teile Tolypomycin RB gebildet werden.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

9095077

f *

803

Claims (1)

1. Patentansprüche;

   % Als Tolypomycin RB (B-2847 RB) bezeichnetes Antibiotikum mit antimikrobischer Aktivität gegenüber gram-positiven Bakterien, welches sich durch die Formel

   RB aus dem Reaktionsgemisch auf übliche Weise abgetrennt und gereinigt wird.

   3. Antibiotische Zubereitung, bestehend aus Antibiotikum Tolypomycin RB nach Anspruch I in Verbindung mit pharmazeutisch unbedenklichen Träger- und/oder Hilfsstoffen.