DE19848129A1

DE19848129A1 - Verfahren zur Herstellung chiraler Carbonsäuren aus Nitrilen mit Hilfe einer Nitrilase oder Mikroorganismen, die ein Gen für die Nitrilase enthalten

Info

Publication number: DE19848129A1
Application number: DE19848129A
Authority: DE
Inventors: Marion Ress-Loeschke; Thomas Friedrich; Bernhard Hauer; Ralf Mattes; Dirk Engels
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1998-10-19
Filing date: 1998-10-19
Publication date: 2000-04-20
Also published as: HUP0104802A2; US6869783B1; CA2347521C; KR100715744B1; NO327857B1; AU6470899A; DK1123386T3; CZ20011382A3; EP1123386A1; ATE349517T1; EE05008B1; EE200100232A; CZ302494B6; JP2002527106A; NO20011912D0; ES2280125T3; JP4489298B2; CN100422319C; CN1331743A; IL142397A0

Abstract

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuresequenzen, die für ein Polypeptid mit Nitrilaseaktivität codieren, Nukleinsäurekonstrukte enthaltend die Nukleinsäuresequenzen sowie Vectoren enthaltend die Nukleinsäuresequenzen oder die Nukleinsäurekonstrukte. Die Erfindung betrifft weiterhin Aminosäuresequenzen, die durch die Nukleinsäuresequenzen codiert werden und Mikroorganismen enthaltend die Nukleinsäuresequenzen, die Nukleinsäurekonstrukte oder Vectoren enthaltend, die Nukleinsäuresequenzen oder die Nukleinsäurekonstrukte. DOLLAR A Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung chiraler Carbonsäuren aus den racemischen Nitrilen.

Description

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuresequenzen, die für ein Poly peptid mit Nitrilaseaktivität codieren, Nukleinsäurekonstrukte enthaltend die Nukleinsäuresequenzen sowie Vectoren enthaltend die Nukleinsäuresequenzen oder die Nukleinsäurekonstrukte. Die Erfindung betrifft weiterhin Aminosäuresequenzen, die durch die Nukleinsäuresequenzen codiert werden und Mikroorganismen ent haltend die Nukleinsäuresequenzen, die Nukleinsäurekonstrukte oder Vectoren enthaltend die Nukleinsäuresequenzen oder die Nukleinsäurekonstrukte.

Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung chiraler Carbonsäuren aus den racemischen Nitrilen.

Chirale Carbonsäuren sind gesuchte Verbindungen für die or ganischen Synthesechemie. Sie sind Ausgangsprodukte für eine Vielzahl von pharmazeutischen Wirkstoffen oder Wirkstoffen für den Pflanzenschutz. Chirale Carbonsäuren können zur klassischen Racematspaltung über Diastereomeresalze verwendet werden. So wird R-(-)- oder S-(-)-Mandelsäure beispielsweise zur Racematspaltung racemischer Amine eingesetzt. R-(-)-Mandelsäure wird außerdem als Zwischenprodukt bei der Synthese halbsynthetischer Antibiotika und einer Vielzahl landwirtschaftlicher Produkte genutzt wird.

Aus der Literatur sind eine Reihe verschiedener Synthesezugänge zu chiralen Carbonsäuren bekannt. So werden beispielsweise optisch aktive Aminosäuren technisch über fermentative Verfahren gewonnen. Von Nachteil dabei ist, daß für jede Aminosäure ein eigenes Verfahren entwickelt werden muß. Um eine möglichst breite Palette verschiedener Verbindungen herstellen zu können, werden deshalb chemische oder enzymatische Verfahren verwendet. Nach teilig bei den chemischen Verfahren ist, daß das Stereozentrum in der Regel in mehrstufigen, nicht breit anwendbaren Synthese umständlich aufgebaut werden muß.

Die enzymatische Synthese chiraler Carbonsäuren sind einer Reihe von Patenten oder Patentanmeldungen zu entnehmen. WO 92/05275 beschreibt die Synthese enantiomerer α-Hydroxy-α-alkyl- oder α-Alkylcarbonsäuren in Gegenwart biologischen Materials. In EP-B-0 348 901 wird ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven α-substituierten organischen Säuren mit Mikroorganismen der Gattungen Alcaligenes, Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Corynebacterium sp. Stamm KO-2-4, Acinetobacter, Bacillus, Mycobacterium, Rhodococcus und Candida beansprucht. Die Her stellung von L-α-Aminosäuren wird mit Mikroorganismen wird in EP-B-0 332 379 beansprucht.

Die Herstellung von α-Hydroxycarbonsäuren speziell die Her stellung von optisch aktiver Milchsäure oder Mandelsäure mit verschiedenen Mikroorganismen wie Mikroorgansimen der Gattungen Alcaligenes, Aureobacterium, Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Corynebacterium, Acinetobacter, Caseobacter, Bacillus, Myco bacterium, Rhodococcus, Brevibacterium, Nocardia, Variovorax, Arthrobacter und Candida oder mit Enzymen wird in den Schutz rechten EP-A-0 348 901 oder seinem US-Äquivalent US 5,283,193, EP-A-0 449 648, EP-B-0 473 328, EP-B-0 527 553 oder seinem US-Äquivalent US 5,296,373, EP-A-0 610 048, EP-A-0 610 049, EP-A-0 666 320 oder WO 97/32030 beschrieben.

Von Nachteil bei diesen Prozessen ist, daß sie häufig nur zu Produkten mit einer geringen optischen Reinheit führen und/oder daß sie nur mit geringen Raum-Zeit-Ausbeuten ablaufen. Dies führt zu wirtschaftlich unattraktiven Prozessen. Auch der Ver such durch Zugabe von Substanzen wie Sulfit, Disulfit, Dithionit, Hypophosphit oder Phosphit die Produktivität zu erhöhen (siehe EP-A-0 486 289) oder über die Verwendung von Mikroorganismen, die eine erhöhte Resistenz gegenüber α-Hydroxynitrilen aufweisen (siehe WO 97/32030), führt zu keiner nennenswerten Steigerung der Produktivität.

Es war daher die Aufgabe der Erfindung ein leichtes, kosten günstiges, breit anwendbares Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven, chiralen Carbonsäuren zu entwickeln, das die oben genannten Nachteile nicht aufweist.

Diese Aufgabe wurde durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von chiralen Carbonsäuren der allgemeinen Formel I

dadurch gekennzeichnet, daß man racemische Nitrile der all gemeinen Formel II

in Gegenwart einer Aminosäuresequenz, die codiert wird durch eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 darge stellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerier ten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz ableiten,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäure sequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 80% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist,

oder einem wachsenden, ruhenden oder aufgeschlossenen Mikro organismus, der entweder eine Nukleinsäuresequenz aus der oben genannten Gruppe oder ein Nukleinsäurekonstrukt, das eine Nukleinsäure aus der genannten Gruppe mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft, enthält, umsetzt und wobei min destens 25 mmol Nitril/h pro mg Protein oder 25 mmol Nitril/h pro g Trockengewicht zu den chiralen Carbonsäuren umgesetzt werden,
wobei die Substituenten und Variablen in den Formeln I und II folgende Bedeutung haben:
* ein optisch aktives Zentrum
R¹

, R²

, R³

unabhängig voneinander Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes C₁

-C₁₀

-Alkyl-, C₂

-C₁₀

-Alkenyl-, substituiertes oder unsub stituiertes Aryl-, Hetaryl-, OR⁴

oder NR⁴

R⁵

und wobei die Reste R¹

, R²

und R³

immer unterschiedlich sind,
R⁴

Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, ver zweigtes oder unverzweigtes C₁

-C₁₀

-Alkyl-, C₂

-C₁₀

-Alkenyl-, C₁

-C₁₀

-Alkylcarbonyl-, C₂

-C₁₀

-Alkenylcarbonyl-, Aryl-, Aryl carbonyl-, Hetaryl- oder Hetarylcarbonyl-,
R⁵

Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweig tes oder unverzweigtes C₁

-C₁₀

-Alkyl-, C₂

-C₁₀

-Alkenyl-, Aryl- oder Hetaryl-, gelöst.

R¹, R², R³ bezeichnen in den Verbindungen der Formeln I und II unabhängig voneinander Wasserstoff, substituiertes oder un substituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-, C₂-C₁₀-Alkenyl-, substituiertes oder unsubstituiertes Aryl-, Hetaryl-, OR⁴ oder NR⁴R⁵ und wobei die Reste R¹, R² und R³ immer unterschiedlich sind.

Als Alkylreste seien substituierte oder unsubstituierte ver zweigte oder unverzweigte C₁-C₁₀-Alkylketten wie beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, 1-Methylethyl, n-Butyl, 1-Methylpropyl-, 2-Methylpropyl, 1,1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, n-Hexyl, 1,1-Dimethylpropyl, 1,2-Dimethylpropyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1,1-Dimethyl butyl, 1,2-Dimethylbutyl, 1,3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1,1,2-Trimethylpropyl, 1,2,2-Trimethylpropyl, 1-Ethyl-1-methyl propyl, 1-Ethyl-2-methylpropyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl oder n-Decyl genannt. Bevorzugt sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, i-Propyl oder i-Butyl.

Als Alkenylreste seien verzweigte oder unverzweigte C₂-C₁₀-Alkenylketten wie beispielsweise Ethenyl, Propenyl, 1-Butenyl, 2-Butenyl, 3-Butenyl, 2-Methylpropenyl, 1-Pentenyl, 2-Pentenyl, 3-Pentenyl, 4-Pentenyl, 1-Methyl-1-butenyl, 2-Methyl- 1-butenyl, 3-Methyl-1-butenyl, 1-Methyl-2-butenyl, 2-Methyl-2- butenyl, 3-Methyl-2-butenyl, 1-Methyl-3-butenyl, 2-Methyl-3- butenyl, 3-Methyl-3-butenyl, 1,1-Dimethyl-2-propenyl, 1,2-Di methyl-1-propenyl, 1,2-Dimethyl-2-propenyl, 1-Ethyl-1-propenyl, 1-Ethyl-2-propenyl, 1-Hexenyl, 2-Hexenyl, 3-Hexenyl, 4-Hexenyl, 5-Hexenyl, 1-Methyl-1-pentenyl, 2-Methyl-1-pentenyl, 3-Methyl-1- pentenyl, 4-Methyl-1-pentenyl, 1-Methyl-2-pentenyl, 2-Methyl-2- pentenyl, 3-Methyl-2-pentenyl, 4-Methyl-2-pentenyl, 1-Methyl-3- pentenyl, 2-Methyl-3-pentenyl, 3-Methyl-3-pentenyl, 4-Methyl-3- pentenyl, 1-Methyl-4-pentenyl, 2-Methyl-4-pentenyl, 3-Methyl-4- pentenyl, 4-Methyl-4-pentenyl, 1,1-Dimethyl-2-butenyl, 1,1-Di methyl-3-butenyl, 1,2-Dimethyl-1-butenyl, 1,2-Dimethyl-2-butenyl, 1,2-Dimethyl-3-butenyl, 1,3-Dimethyl-1-butenyl, 1,3-Dimethyl- 2-butenyl, 1,3-Dimethyl-3-butenyl, 2,2-Dimethyl-3-butenyl, 2,3-Dimethyl-1-butenyl, 2,3-Dimethyl-2-butenyl, 2,3-Dimethyl- 3-butenyl, 3,3-Dimethyl-1-butenyl, 3,3-Dimethyl-2-butenyl, 1-Ethyl-1-butenyl, 1-Ethyl-2-butenyl, 1-Ethyl-3-butenyl, 2-Ethyl-1-butenyl, 2-Ethyl-2-butenyl, 2-Ethyl-3-butenyl, 1,1,2-Trimethyl-2-propenyl, 1-Ethyl-1-methyl-2-propenyl, 1-Ethyl-2-methyl-1-propenyl, 1-Ethyl-2-methyl-2-propenyl, 1-Heptenyl, 2-Heptenyl, 3-Heptenyl, 4-Heptenyl, 5-Heptenyl, 6-Heptenyl, 1-Octenyl, 2-Octenyl, 3-Octenyl, 4-Octenyl, 5-Octenyl, 6-Octenyl, 7-Octenyl, Nonenyl oder Dekenyl genannt. Bevorzugt sind Ethenyl, Propenyl, Butenyl oder Pentenyl.

Als Aryl- seien substituiertes und unsubstituiertes Arylreste, die 6 bis 20 Kohlenstoffatome im Ring oder Ringsystem ent halten genannt. Dabei kann es sich um aneinander kondensierte aromatische Ringe handeln oder um aromatische Ringe, die über Alkyl-, Alkylcarbonyl-, Alkenyl- oder Alkenylcarbonylketten, Carbonyl, Sauerstoff oder Stickstoff verbrückt sind. Die Arylreste können gegebenenfalls noch über eine C₁-C₁₀-Alkyl-, C₃-C₈-Alkenyl-, C₃-C₆-Alkinyl- oder C₃-C₈-Cycloalkylkette an das Grundgerüst gebunden sein. Bevorzugt sind Phenyl oder Naphtyl.

Als Hetaryl- seien substituierte oder unsubstituierte, einfache oder kondensierte aromatische Ringsysteme mit einem oder mehreren heteroaromatischen 3- bis 7gliedrigen Ringen, die ein oder mehrere Heteroatome wie N, O oder 5 enthalten können und gegebenenfalls über eine C₁-C₁₀-Alkyl-, C₃-C₈-Alkenyl- oder C₃-C₈-Cycloalkylkette an das Grundgerüst gebunden sein können, genannt. Beispiele für derartige Hetarylreste sind Pyrazol, Imidazol, Oxazol, Isooxazol, Thiazol, Triazol, Pyridin, Chinolin, Isochinolin, Acridin, Pyrimidin, Pyridazin, Pyrazin, Phenazin, Purin oder Pteridin. Die Hetarylreste können über die Heteroatome oder über die verschiedenen Kohlenstoffatome im Ring oder Ring system oder über die Substituenten an das Grundgerüst gebunden sein. Bevorzugt sind Pyridin, Imidazol, Pyrimidin, Purin, Pyrazin oder Chinolin.

Als Substituenten der genannten Reste von R¹, R² oder R³ kommen beispielsweise ein oder mehrere Substituenten wie Halogen wie Fluor, Chlor oder Brom, Thio, Nitro, Amino, Hydroxy, Alkyl, Alkoxy, Alkenyl, Alkenyloxy, Alkinyl oder weitere aromatischen oder weitere gesättigte oder ungesättigte nicht aromatische Ringen oder Ringsystemen in Frage. Bevorzugt sind Alkylreste wie C₁-C₆-Alkyl wie Methyl, Ethyl, Propyl oder Butyl, Aryl wie Phenyl, Halogen wie Chlor, Fluor oder Brom, Hydroxy oder Amino.

R⁴ bezeichnet in den Resten OR⁴ oder NR⁴R⁵ Wasserstoff, sub stituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unver zweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-, C₂-C₁₀-Alkenyl-, C₁-C₁₀-Alkylcarbonyl-, C₂-C₁₀-Alkenylcarbonyl-, Aryl-, Arylcarbonyl-, Hetaryl- oder Hetarylcarbonyl.

Als Alkylreste seien substituierte oder unsubstituierte ver zweigte oder unverzweigte C₁-C₁₀-Alkylketten wie beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, 1-Methylethyl, n-Butyl, 1-Methylpropyl-, 2-Methylpropyl, 1,1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, n-Hexyl, 1,1-Dimethylpropyl, 1,2-Dimethylpropyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1,1-Dimethyl butyl, 1,2-Dimethylbutyl, 1,3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl, 3, 3-Dimethylbutyl, 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1,1,2-Trimethylpropyl, 1,2,2-Trimethylpropyl, 1-Ethyl-1-methyl propyl, 1-Ethyl-2-methylpropyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Nonyl oder n-Decyl genannt. Bevorzugt sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, i-Propyl oder i-Butyl.

Als Alkenylreste seien verzweigte oder unverzweigte C₂-C₁₀-Alkenylketten wie beispielsweise Ethenyl, Propenyl, 1-Butenyl, 2-Butenyl, 3-Butenyl, 2-Methylpropenyl, 1-Pentenyl, 2-Pentenyl, 3-Pentenyl, 4-Pentenyl, 1-Methyl-1-butenyl, 2-Methyl- 1-butenyl, 3-Methyl-1-butenyl, 1-Methyl-2-butenyl, 2-Methyl-2- butenyl, 3-Methyl-2-butenyl, 1-Methyl-3-butenyl, 2-Methyl-3- butenyl, 3-Methyl-3-butenyl, 1,1-Dimethyl-2-propenyl, 1,2-Di methyl-1-propenyl, 1,2-Dimethyl-2-propenyl, 1-Ethyl-1-propenyl, 1-Ethyl-2-propenyl, 1-Hexenyl, 2-Hexenyl, 3-Hexenyl, 4-Hexenyl, 5-Hexenyl, 1-Methyl-1-pentenyl, 2-Methyl-1-pentenyl, 3-Methyl-1- pentenyl, 4-Methyl-1-pentenyl, 1-Methyl-2-pentenyl, 2-Methyl-2- pentenyl, 3-Methyl-2-pentenyl, 4-Methyl-2-pentenyl, 1-Methyl-3- pentenyl, 2-Methyl-3-pentenyl, 3-Methyl-3-pentenyl, 4-Methyl-3- pentenyl, 1-Methyl-4-pentenyl, 2-Methyl-4-pentenyl, 3-Methyl-4- pentenyl, 4-Methyl-4-pentenyl, 1,1-Dimethyl-2-butenyl, 1,1-Di methyl-3-butenyl, 1,2-Dimethyl-1-butenyl, 1,2-Dimethyl-2-butenyl, 1,2-Dimethyl-3-butenyl, 1,3-Dimethyl-3-butenyl, 1,3-Dimethyl- 2-butenyl, 1,3-Dimethyl-3-butenyl, 2,2-Dimethyl-3-butenyl, 2,3-Dimethyl-1-butenyl, 2,3-Dimethyl-2-butenyl, 2,3-Dimethyl- 3-butenyl, 3,3-Dimethyl-1-butenyl, 3, 3-Dimethyl-2-butenyl, 1-Ethyl-1-butenyl, 1-Ethyl-2-butenyl, 1-Ethyl-3-butenyl, 2-Ethyl-1-butenyl, 2-Ethyl-2-butenyl, 2-Ethyl-3-butenyl, 1,1,2-Trimethyl-2-propenyl, 1-Ethyl-1-methyl-2-propenyl, 1-Ethyl-2-methyl-1-propenyl, 1-Ethyl-2-methyl-2-propenyl, 1-Heptenyl, 2-Heptenyl, 3-Heptenyl, 4-Heptenyl, 5-Heptenyl, 6-Heptenyl, 1-Octenyl, 2-Octenyl, 3-Octenyl, 4-Octenyl, 5-Octenyl, 6-Octenyl, 7-Octenyl, Nonenyl oder Dekenyl genannt. Bevorzugt sind Ethenyl, Propenyl, Butenyl oder Pentenyl.

Als Alkylcarbonylreste seien substituierte oder unsubstituierte verzweigte oder unverzweigte C₁-C₁₀-Alkylcarbonylketten wie beispielsweise Methylcarbonyl, Ethylcarbonyl, n-Propylcarbonyl, 1-Methylethylcarbonyl, n-Butylcarbonyl, 1-Methylpropylcarbonyl-, 2-Methylpropylcarbonyl, 1,1-Dimethylethylcarbonyl, n-Pentyl carbonyl, 1-Methylbutylcarbonyl, 2-Methylbutylcarbonyl, 3-Methyl butylcarbonyl, 2,2-Dimethylpropylcarbonyl, 1-Ethylpropylcarbonyl, n-Hexylcarbonyl, 1,1-Dimethylpropylcarbonyl, 1,2-Dimethylpropyl carbonyl, 1-Methylpentylcarbonyl, 2-Methylpentylcarbonyl, 3-Methylpentylcarbonyl, 4-Methylpentylcarbonyl, 1,1-Dimethyl butylcarbonyl, 1,2-Dimethylbutylcarbonyl, 1,3-Dimethylbutyl carbonyl, 2,2-Dimethylbutylcarbonyl, 2,3-Dimethylbutylcarbonyl, 3,3-Dimethylbutylcarbonyl, 1-Ethylbutylcarbonyl, 2-Ethylbutyl carbonyl, 1,1,2-Trimethylpropylcarbonyl, 1,2,2-Trimethylpropyl carbonyl, 1-Ethyl-1-methylpropylcarbonyl, 1-Ethyl-2-methylpropyl carbonyl, n-Heptylcarbonyl, n-Octylcarbonyl, n-Nonylcarbonyl oder n-Decylcarbonyl genannt. Bevorzugt sind Methylcarbonyl, Ethyl carbonyl, n-Propylcarbonyl, n-Butylcarbonyl, i-Propylcarbonyl oder i-Butylcarbonyl.

Als Alkenylcarbonylreste seien verzweigte oder unverzweigte C₂-C₁₀-Alkenylcarbonylketten wie beispielsweise Ethenylcarbonyl, Propenylcarbonyl, 1-Butenylcarbonyl, 2-Butenylcarbonyl, 3-Butenylcarbonyl, 2-Methylpropenylcarbonyl, 1-Pentenylcarbonyl, 2-Pentenylcarbonyl, 3-Pentenylcarbonyl, 4-Pentenylcarbonyl, 1-Methyl-1-butenylcarbonyl, 2-Methyl-1-butenylcarbonyl, 3-Methyl- 1-butenylcarbonyl, 1-Methyl-2-butenylcarbonyl, 2-Methyl-2- butenylcarbonyl, 3-Methyl-2-butenylcarbonyl, 1-Methyl-3-butenyl carbonyl, 2-Methyl-3-butenylcarbonyl, 3-Methyl-3-butenylcarbonyl, 1,1-Dimethyl-2-propenylcarbonyl, 1,2-Dimethyl-1-propenylcarbonyl, 1,2-Dimethyl-2-propenylcarbonyl, 1-Ethyl-1-propenylcarbonyl, 1-Ethyl-2-propenylcarbonyl, 1-Hexenylcarbonyl, 2-Hexenylcarbonyl, 3-Hexenylcarbonyl, 4-Hexenylcarbonyl, 5-Hexenylcarbonyl, 1-Methyl-1-pentenylcarbonyl, 2-Methyl-1-pentenylcarbonyl, 3-Methyl-1-pentenylcarbonyl, 4-Methyl-1-pentenylcarbonyl, 1-Methyl-2-pentenylcarbonyl, 2-Methyl-2-pentenylcarbonyl, 3-Methyl-2-pentenylcarbonyl, 4-Methyl-2-pentenylcarbonyl, 1-Methyl-3-pentenylcarbonyl, 2-Methyl-3-pentenylcarbonyl, 3-Methyl-3-pentenylcarbonyl, 4-Methyl-3-pentenylcarbonyl, 1-Methyl-4-pentenylcarbonyl, 2-Methyl-4-pentenylcarbonyl, 3-Methyl-4-pentenylcarbonyl, 4-Methyl-4-pentenylcarbonyl, 1,1-Dimethyl-2-butenylcarbonyl, 1,1-Dimethyl-3-butenylcarbonyl, 1,2-Dimethyl-1-butenylcarbonyl, 1,2-Dimethyl-2-butenylcarbonyl, 1,2-Dimethyl-3-butenylcarbonyl, 1,3-Dimethyl-1-butenylcarbonyl, 1,3-Dimethyl-2-butenylcarbonyl, 1,3-Dimethyl-3-butenylcarbonyl, 2,2-Dimethyl-3-butenylcarbonyl, 2,3-Dimethyl-1-butenylcarbonyl, 2,3-Dimethyl-2-butenylcarbonyl, 2,3-Dimethyl-3-butenylcarbonyl, 3,3-Dimethyl-1-butenylcarbonyl, 3,3-Dimethyl-2-butenylcarbonyl, 1-Ethyl-1-butenylcarbonyl, 1-Ethyl-2-butenylcarbonyl, 1-Ethyl- 3-butenylcarbonyl, 2-Ethyl-1-butenylcarbonyl, 2-Ethyl-2-butenyl carbonyl, 2-Ethyl-3-butenylcarbonyl, 1,1,2-Trimethyl-2-propenyl carbonyl, 1-Ethyl-1-methyl-2-propenylcarbonyl, 1-Ethyl-2- methyl-1-propenylcarbonyl, 1-Ethyl-2-methyl-2-propenylcarbonyl, 1-Heptenylcarbonyl, 2-Heptenylcarbonyl, 3-Heptenylcarbonyl, 4-Heptenylcarbonyl, 5-Heptenylcarbonyl, 6-Heptenylcarbonyl, 1-Octenylcarbonyl, 2-Octenylcarbonyl, 3-Octenylcarbonyl, 4-Octenylcarbonyl, 5-Octenylcarbonyl, 6-Octenylcarbonyl, 7-Octenylcarbonyl, Nonenylcarbonyl oder Dekenylcarbonyl genannt. Bevorzugt sind Ethenylcarbonyl, Propenylcarbonyl, Butenylcarbonyl oder Pentenylcarbonyl.

Als Arylcarbonyl- seien substituiertes und unsubstituiertes Aryl carbonylreste, die 6 bis 20 Kohlenstoffatome im Ring oder Ring system enthalten genannt. Dabei kann es sich um aneinander kon densierte aromatische Ringe handeln oder um aromatische Ringe, die über Alkyl-, Alkylcarbonyl-, Alkenyl- oder Alkenylcarbonyl ketten, Carbonyl, Sauerstoff oder Stickstoff verbrückt sind. Bevorzugt sind Phenylcarbonyl oder Naphthylcarbonyl.

Als Hetaryl- seien substituierte oder unsubstituierte, einfache oder kondensierte aromatische Ringsysteme mit einem oder mehreren heteroaromatischen 3- bis 7gliedrigen Ringen, die ein oder mehrere Heteroatome wie N, O oder S enthalten können und gegebenenfalls über eine C₁-C₁₀-Alkyl-, C₃-C₈-Alkenyl- oder C₃-C₈-Cycloalkylkette an das Grundgerüst gebunden sein können, genannt. Beispiele für derartige Hetarylreste sind Pyrazol, Imidazol, Oxazol, Isooxazol, Thiazol, Triazol, Pyridin, Chinolin, Isochinolin, Acridin, Pyrimidin, Pyridazin, Pyrazin, Phenazin, Purin oder Pteridin. Die Hetarylreste können über die Heteroatome oder über die verschiedenen Kohlenstoffatome im Ring oder Ring system oder über die Substituenten an das Grundgerüst gebunden sein. Unter Hetarylcarbonylresten sind heteroaromatische Reste zu verstehen, die über einen Carbonylrest an das Grundgerüst ge bunden sind. Bevorzugt sind Pyridin, Imidazol, Pyrimidin, Purin, Pyrazin oder Chinolin.

Als Substituenten der genannten Reste von R⁴ kommen beispielsweise ein oder mehrere Substituenten wie Halogen wie Fluor, Chlor oder Brom, Thio, Nitro, Amino, Hydroxy, Alkyl, Alkoxy, Alkenyl, Alke nyloxy, Alkinyl oder weitere aromatischen oder weitere gesättigte oder ungesättigte nicht aromatische Ringen oder Ringsystemen in Frage. Bevorzugt sind Alkylreste wie C₁-C₆-Alkyl wie Methyl, Ethyl, Propyl oder Butyl, Halogen wie Chlor, Fluor oder Brom, Hydroxy oder Amino.

Bevorzugt ist für den Rest R⁴ Wasserstoff.

R⁵ bezeichnet im Rest NR⁴R⁵ Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-, C₂-C₁₀-Alkenyl-, Aryl- oder Hetaryl-, wobei die Alkyl-, Alkenyl-, Aryl- und Hetarylreste die oben genannte Bedeutung haben. Bevor zugt ist Wasserstoff oder C₁-C₁₀-Alkyl- wie Methyl, Ethyl oder Propyl.

Als Substituenten der genannten Reste von R⁵ kommen beispielsweise ein oder mehrere Substituenten wie Halogen wie Fluor, Chlor oder Brom, Thio, Nitro, Amino, Hydroxy, Alkyl, Alkoxy, Alkenyl, Alke nyloxy, Alkinyl oder weitere aromatischen oder weitere gesättigte oder ungesättigte nicht aromatische Ringen oder Ringsystemen in Frage. Bevorzugt sind Alkylreste wie C₁-C₆-Alkyl wie Methyl, Ethyl, Propyl oder Butyl, Aryl wie Phenyl, Halogen wie Chlor, Fluor oder Brom, Hydroxy oder Amino.

Weiter können zwei benachbarte Substituenten R⁴ oder R⁵ zusammen einen weiteren substituierten oder unsubstituierten aromatischen, gesättigten oder teilweise gesättigten Ring mit 5 bis 6 Atomen im Ring bilden, der ein oder mehrere Heteroatome wie O, N oder S enthalten kann.

Vorteilhaft bedeutet einer der Substituenten R¹, R² oder R³ in den Formeln I und II Aryl wie Phenyl. Weiterhin bedeutet einer der Substituenten R¹, R² oder R³ in den Formeln I und II bevorzugt Hydroxy und einer Wasserstoff oder Methyl.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhaft bei einem pH-Wert von 4 bis 11, bevorzugt von 4 bis 9 durchgeführt.

Weiterhin werden im Verfahren vorteilhaft von 0,01 bis 10 Gew.-% Nitril oder 0,01 bis 10 Gew.-% eines entsprechenden Aldehyds oder Ketons und 0,01 bis 10 Gew.-% Blausäure verwendet. Vorteilhaft wird das Verfahren mit einem Überschuß an Blausäure durchgeführt. Dies führt unter Umständen zu höheren als den angegebenen Blau säureanteilen. Je nach Nitril können unterschiedliche Mengen an Nitril in der Reaktion verwendet werden. Die geringsten Mengen an Nitril werden vorteilhaft bei Nitrilen (Cyanhydrine) verwendet (= Mengen zwischen 0,01 bis 5 Gew.-%), die im Gleichgewicht mit den entsprechenden Aldehyden und Blausäure stehen. Da der Aldehyd für die Mikroorganismen oder Enzyme in der Regel toxisch ist. Nitrile, die leicht flüchtig sind, werden ebenfalls vorteilhaft in Mengen zwischen 0,01 bis 5 Gew.-% eingesetzt. Bei höheren Cyanhydrin- bzw. Nitrilmengen läuft die Reaktion verzögert ab. Bei Nitrilen, die nur geringe oder nahezu keine Lösungsmittel eigenschaften haben oder Nitrilen, die sich nur in sehr geringen Mengen in wäßrigen Medium lösen, können vorteilhaft auch größere als die oben angegebenen Mengen eingesetzt werden. Zur Erhöhung des Umsatzes und der Ausbeute wird die Reaktion vorteilhafter weise unter kontinuierlicher Zugabe des racemischen Nitrils durchgeführt. Das Produkt kann nach Ende der Reaktion isoliert werden oder aber in einem Bypass kontinuierlich entfernt werden.

Unter den oben genannten, entsprechenden Aldehyden oder Ketonen sind Verbindungen zu verstehen, die nach Reaktion zwischen dem Aldehyd oder Keton und Blausäure ggf. unter Säurekatalyse das Nitril bilden. Die Reaktion zwischen Aldehyd und Blausäure führt zu Cyanhydrinen, die den Vorteil haben, daß sie mit Aldehyd und Blausäure im Gleichgewicht liegen. Durch die Gleichgewichtsein stellung des Cyanhydrins ist es möglich mit einem Enzym, das nur ein Enatiomer des Nitrils umsetzt, trotzdem zu 100% Ausbeute in der Theorie zu kommen, da das racemische Nitril ständig nach geliefert wird. Bei allen anderen Nitrilen wird das enzymatisch nicht umgesetzte Nitril (= "falsches" bzw. anderes Enantiomer) vorteilhaft über eine chemische Reaktion racemisiert und dem Ver fahren wieder zugeführt, um eine theoretische Ausbeute von 100% erreichen zu können, verworfen oder aufgereinigt und chemisch unter Erhalt des Stereozentrums verseift.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhaft bei einer Temperatur zwischen 0°C bis 80°C, bevorzugt zwischen 10°C bis 60°C, besonders bevorzugt zwischen 15°C bis 50°C durchgeführt.

Unter racemischen Nitrilen im erfindungsgemäßen Verfahren sind Nitrile zu verstehen, die aus einem 50 : 50 Gemisch der beiden Enantiomere oder aus einem beliebigen anderen Gemisch mit einer Anreicherung eines der beiden Enantiomere im Gemisch bestehen.

Unter chiralen Carbonsäuren sind im erfindungsgemäßen Verfahren zu verstehen, die eine Enantiomerenanreicherung zeigen. Bevorzugt werden im Verfahren Enantiomerenreinheiten von mindestens 90%ee, bevorzugt von min. 95%ee, besonders bevorzugt von min. 98%ee, ganz besonders bevorzugt min. 99%ee erreicht.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Umsetzung einer großen Vielzahl von racemischen Nitrilen zu den chiralen Carbon säuren. Im Verfahren lassen sich mindestens 25 mmol Nitril/h × mg Protein oder mindestens 25 mmol Nitril/h × g Trockengewicht der Mikroorganismen umsetzen, bevorzugt mindestens 30 mmol Nitril/h × mg Protein oder mindestens 30 mmol Nitril/h × g Trockengewicht, besonders bevorzugt mindestens 40 mmol Nitril/h × mg Protein oder mindestens 40 mmol Nitril/h × g Trockengewicht, ganz besonders bevorzugt mindestens 50 mmol Nitril/h × mg Protein oder min destens 50 mmol Nitril/h × g Trockengewicht.

Für das erfindungsgemäße Verfahren können wachsende Zellen ver wendet werden, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Nuklein säurekonstrukte oder Vektoren enthalten. Auch ruhende oder aufge schlossene Zellen können verwendet werden. Unter aufgeschlossenen Zellen sind beispielsweise Zellen zu verstehen, die über eine Behandlung mit beispielsweise Lösungsmitteln durchlässig gemacht worden sind, oder Zellen die über eine Enzymbehandlung, über eine mechanische Behandlung (z. B. French Press oder Ultraschall) oder über eine sonstige Methode aufgebrochen wurden. Die so erhaltenen Rohextrakte sind für das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft geeignet. Auch gereinigte oder angereinigte Enzyme können für das Verfahren verwendet werden. Ebenfalls geeignet sind immobili sierte Mikroorganismen oder Enzyme, die vorteilhaft in der Reak tion Anwendung finden können.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten chiralen Carbon säuren lassen sich vorteilhaft aus der wäßrigen Reaktionslösung über Extraktion oder Kristallisation oder über Extraktion und Kristallisation gewinnen. Hierzu wird die wäßrige Reaktionslösung mit einer Säure wie einer Mineralsäure (z. B. HCl oder H₂SO₄) oder einer organischen Säure angesäuert vorteilhaft auf pH-Werte unter 2 und anschließend mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert. Die Extraktion kann zur Erhöhung der Ausbeute mehr fach wiederholt werden. Als organische Lösungsmittel können prinzipiell alle Lösungsmittel verwendet werden, die mit Wasser gegebenenfalls nach Zugabe von Salzen eine Phasengrenze zeigen. Vorteilhafte Lösungsmittel sind Lösungsmittel wie Toluol, Benzol, Hexan, Methyltertiärbutylether oder Essigester.

Nach Einengen der organischen Phase können die Produkte in der Regel in guten chemischen Reinheiten, das heißt größer 90% chemische Reinheit, gewonnen werden. Nach Extraktion kann die organische Phase mit dem Produkt aber auch nur zum Teil eingeengt werden und das Produkt auskristallisiert werden. Dazu wird die Lösung vorteilhaft auf eine Temperatur von 0°C bis 10°C abgekühlt. Die Kristallisation kann auch direkt aus der organischen Lösung erfolgen. Das auskristallisierte Produkt kann nochmals in im gleichen oder in einem anderen Lösungsmittel zur erneuten Kristallisation aufgenommen werden und nochmals kristallisiert werden. Durch die anschließende mindestens einmalige Kristalli sation kann die Enantiomerenreinheit des Produktes je nach Lage des Eutektikum weiter gesteigert werden.

Die chiralen Carbonsäuren können jedoch auch direkt nach Ansäuern mit einer Säure auf einen pH-Wert vorteilhaft unter 2 aus der wäßrigen Reaktionslösung auskristallisiert werden. Vorteilhaft wird dazu die wäßrige Lösung unter Erwärmen eingeengt und in ihrem Volumen um 10 bis 90%, bevorzugt 20 bis 80%, besonders bevorzugt 30 bis 70% reduziert. Vorzugsweise wird die Kristalli sation unter Kühlung durchgeführt. Temperaturen zwischen 0°C bis 10°C sind für die Kristallisation bevorzugt. Aus Kostengründen ist die direkte Kristallisation aus der wäßrigen Lösung bevor zugt. Ebenfalls bevorzugt wird eine Aufarbeitung der chiralen Carbonsäuren über ein Extraktion und gegebenenfalls anschließen der Kristallisation.

Bei diesen bevorzugten Aufarbeitungsarten läßt sich das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens in Ausbeuten von 60 bis 100%, bevorzugt von 80 bis 100%, besonders bevorzugt von 90 bis 100% 1 bezogen auf das für die Reaktion eingesetzte Nitril isolieren. Das isoliert Produkt zeichnet sich durch eine hohe chemische Reinheit von < 90%, bevorzugt < 95% besonders bevorzugt von < 98% aus. Weiterhin haben die Produkt eine hohe Enantiomeren reinheit, die durch die Kristallisation weiter gesteigert werden kann.

Die so gewonnenen Produkte eignen sich als Ausgangsmaterial für organischen Synthesen zur Herstellung von Pharmaka oder Agro chemikalien oder zur Racematspaltung.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine isolierte Nuklein säuresequenz, die für ein Polypeptid mit Nitrilaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 darge stellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerier ten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz ableiten,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäure sequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 darge stellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 95% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzy matische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist.

Unter Homologe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 sind beispielsweise Allelvarianten zu ver stehen, die mindestens 95% Homologie auf der abgeleiteten Amino säureebene, bevorzugt mindestens 97% Homologie, ganz besonders bevorzugt mindestens 98% Homologie über den gesamten Sequenzbe reich aufweisen. Über Teilbereiche der Sequenzen können die Homologien vorteilhaft höher liegen. Die von SEQ ID NO: 1 abge leitete Aminosäuresequenz ist SEQ ID NO: 2 zu entnehmen. Allel varianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei die enzymatische Aktivität der abgeleiteten synthetisierten Proteine für das Einbringen eines oder mehrerer Gene in einen Organismus jedoch erhalten nicht wesentlich reduziert sein sollte. Die Erfindung betrifft damit auch Aminosäuresequenzen, die durch die oben dargestellte Gruppe von Nukleinsäuresequenzen kodiert werden. Vorteilhaft betrifft die Erfindung Aminosäuresequenzen, die durch die Sequenz SEQ ID NO: 1 kodiert werden.

Weiterhin sind unter Homologe der SEQ ID NO: 1 beispielsweise pilzliche oder bakterielle Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzel strang-DNA oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA- Sequenz zu verstehen. Homologe der SEQ ID NO: 1 besitzen auf DNA-Ebene eine Homologie von mindestens 60%, bevorzugt von mindestens 70%, besonders bevorzugt von mindestens 80%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 90% über den gesamten in SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Bereich.

Außerdem sind unter Homologe der SEQ ID NO: 1 Derivate wie bei spielsweise Promotorvarianten zu verstehen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen vorgeschalten sind, können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) verändert sein, ohne daß aber die Funktio nalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirk samere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.

Unter Derivaten sind auch Varianten zu verstehen, deren Nukleo tidsequenz im Bereich von -1 bis -200 vor dem Startkodon oder 0 bis 1000 Basenpaare nach dem Stopkodon so verändert wurden, daß die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert, bevorzugt erhöht wird.

Vorteilhaft läßt sich die SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen aus Bakterien, bevorzugt aus gram-negativen Bakterien, besonders bevorzugt aus Bakterien der Gattung Alcaligenes, ganz besonders bevorzugt aus Bakterien der Gattung und Art Alcaligenes faecalis über dem Fachmann bekannte Methoden isolieren.

SEQ ID No: 1 oder seine Homologen oder Teile dieser Sequenzen lassen sich beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Pilzen oder Bakterien isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen. Zur Hybridisierung werden vor teilhaft kurze Oligonukleotide der konservierten Bereiche bei spielsweise aus dem aktiven Zentrum, die über Vergleiche mit an deren Nitrilasen oder Nitrilhydratasen in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen bei spielsweise die Schmelztemperaturen für DNA : DNA-Hybride ca 10°C niedriger als die von DNA : RNA-Hybriden gleicher Länge.

Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nuklein säure Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Puffer lösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 × SSC, 50% Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA : DNA-Hybride bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA : RNA-Hybride liegen die Hybridisierungs bedingungen vorteilhaft bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit ein er Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C- Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Unter dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt sind die Nitrilasegen Sequenz SEQ ID No. 1 und seine Homologen zu ver stehen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteil hafterweise zur Erhöhung der Genexpression funktionell verknüpft wurden. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vor handen sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so daß die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Nukleinsäurekonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Sequenz SEQ ID No. 1 oder seine Homo logen inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wird die natürliche Regulati onssequenz so mutiert, daß keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird. Das Nukleinsäurekonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor ent halten, die eine erhöhte Expression der Nucleinsäuresequenz er möglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatori sche Elemente oder Terminatoren. Die erfindungsgemäßen Nuklein säuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt ent halten sein. Im Konstrukt können noch weitere Marker wie Anti biotikaresistenzen oder Auxotrophien komplementierende Gene gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Ver fahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacI^q-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-P_R- oder im λ-P_L-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. In diesem Zusammenhang sind auch die Promotoren der Pyruvatde carboxylase und der Methanoloxidase aus beispielsweise Hansenula vorteilhaft. Es können auch künstliche Promotoren für die Regu lation verwendet werden.

Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirts organismus vorteilhafterweise in einen Vektor wie beispielsweise einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, das eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Diese Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pA- CYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-B1, λgt11 oder pBdCI, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1, pIL2 oder pBB116, in Hefen 2 µM, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHlac⁺, pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam- New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden.

Vorteilhafterweise enthält das Nukleinsäurekonstrukt zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3' und/oder 5' Terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.

Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann bei spielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugs weise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflus sen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulato rischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der Nukleinsäure bestehen.

Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.

Als Wirtsorganismen für die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder dem Nukleinsäurekonstrukt kommen prinzipiell alle pro karyontischen oder eukaryontischen Organismen in Frage. Vorteil hafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden gram positive oder gram-negative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familie Enterobacteriaceae oder Nocardiaceae, besonders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudomonas oder Rhodococcus verwendet. Ganz besonders bevorzugt ist die Gattung und Art Escherichia coli.

Der Wirtsorganismus gemäß der Erfindung enthält dabei vorzugs weise mindestens ein proteinisches Agenz zur Faltung der von ihm synthetisierten Polypeptide und insbesondere der in dieser Erfindung beschriebenen Nukleinsäuresequenzen mit Nitrilase aktivität und/oder die dieses Agenz codierenden Gene, wobei dieses Agenz in einer Menge vorliegt, die größer ist als die, die der Grundmenge des betrachteten Mikroorganismus entspricht. Die für dieses Agenz codierenden Gene sind im Chromosom oder in extrachromosomalen Elementen wie zum Beispiel Plasmiden ent halten.

Beispiele Beispiel 1 Reinigung der Nitrilase aus Alcaligenes faecalis 1650 1. Herstellung der Zellen

Alcaligenes faecalis 1650 wurde bei 30°C für die Dauer von 8 Stunden in Kulturmedium A unter Schütteln kultiviert.

Kulturmedium A

Hefextrakt	5 g/l
Pepton	3,5 g/l
CH₃CO₂NH₄	5 g/l
KH₂PO₄	5 g/l
MgSO₄	0,2 g/l
FeSO₄	0,03 g/l
NaCl	1 g/l
Butyronitril	1 g/l

Mit 200 ml dieser Vorkultur wurde ein 101-Fermenter mit 81 frischem Medium A beimpft. Der pH, die Temperatur, der Luftstrom und die Rührgeschwindigkeit lagen bei 7,2; 30°C, 300 l/h und 300 upm. Nach 22 Std. wurden 81 g Naßzellmasse gewonnen. Das ent spricht einem Zelltrockengewicht von 3,8 g/l und einer optischen Dichte bei 600 nm von 8.

2. Bestimmung der enzymatischen Aktivität gegenüber Mandelo nitril

Die Zellen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben gewonnen und in 10 mM Na/K-Phospatpuffer, pH 7,2 zweimal gewaschen. 40 mg Zell trockengewicht wurden in 20 ml 10 mM Na/K-Phospatpuffer, pH 6,8, resuspendiert und die Reaktion durch Zugabe von 8,3 mM Mandelo nitril gestartet. Die Reaktion wurde unter Schütteln bei 40°C durchgeführt. Die Kinetik der Racematspaltung wurde durch Proben entnahme und anschließender Zellabtrennung mit Hilfe der Hoch leistungsflüssigkeitschromatographie (ODS Hypersil) verfolgt. Da bei wurde Mandelonitril, Benzaldehyd, Mandelsäureamid und Mandel säure bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 [Umsetzung von Mandelonitril (= Mandelsäurenitril) zu Mandelsäure, Batch] dar gestellt. Die Bildungsgeschwindigkeit von Mandelsäure beträgt 41,3 U/g Zelltrockengewicht bei einem Umsatz von 30%, wobei 1 U definiert ist als 1 µmol Mandelsäure, das pro Minute bei 40°C gebildet wird.

3. Bestimmung der enzymatischen Selektivität gegenüber Mandelonitril

Die Zellen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben gewonnen und in 10 mM Na/K-Phospatpuffer, pH 7,2 zweimal gewaschen. 40 mg Zell trockengewicht wurden in 20 ml 10 mM Na/K-Phospatpuffer, pH 6,8, resuspendiert und die Reaktion durch Zugabe von 8,3 mM Mandelo nitril gestartet. Die Reaktion wurde unter Schütteln bei 30°C durchgeführt. Die Kinetik wurde durch Probenentnahme und an schließende Zellabtrennung mit Hilfe der Hochleistungsflüssig keitschromatographie (Nucleodex β-PM) verfolgt. Dabei wurde S-(+)- und R-(-)-Mandelsäure bestimmt. Die optische Reinheit der gebildeten R-(-)-Mandelsäure (ee_R-MS) betrug 98% bei 50% Umsatz. Die Selektivität des Enzyms (= E) lag bei 50% Umsatz bei 499.

4. Reinigung

In allen Puffern war während der Reinigung - falls nicht anders angegeben - 10 mM DTT anwesend.

Schritt 1 Zellaufschluß

Die Zellen aus je zwei 101-Fermentationen wurden wie in Bei spiel 1 beschrieben gewonnen, abzentrifugiert und zweimal mit 1 l 0,1 M Tris/HCl-Puffer, pH 7,2 gewaschen. Die Ausbeute betrug ca. 162 g Zellfeuchtmasse. Je 81 g Zellfeuchtmasse wurden in 160 ml 0,1 M Tris/HCl-Puffer, pH 7,2, resuspendiert und viermal in einem Menton-Gaulin bei 750 bar aufgeschlossen. Das Homogenat wurde dann für 30 min bei 30.000 g zentrifugiert und das Pellet ver worfen. Der Überstand (140 ml) hatte eine Restaktivität von 73% wie in Tab. 1 dargestellt.

Schritt 2 Ionenaustauschchromatographie

Der Überstand wurde mit Puffer A (20 mM Tris/HCl, pH 8,5) auf 400 ml verdünnt und nochmals bei 23000 g für 20 min zentri fugiert. 350 ml wurden dann auf eine Q-Sepharose Säule (Durch messer 5 cm, Höhe 22 cm, Volumen 432 ml, Q-Sepharose Fast Flow von Pharmacia) in Puffer A aufgetragen. Bei einem Fluß von 20 ml/min wurde zunächst mit 10% Puffer B (wie Puffer A mit 1 M NaCl) gewaschen (gesamtes Auftrags- und Waschvolumen entsprach 1,5 l). Im Verlauf von 90 min wurde linear das Verhältnis bis zu 60% B gesteigert. Von 91 bis 120 min wurde dann mit 100% Puffer B gewaschen. Es wurden 100 40 ml-Fraktionen gesammelt. Die Nitrilase eluierte zwischen den Fraktionen 50 und 60. Die Fraktionen wurden vereinigt und durch Ultrafiltration über eine 10 kDa Membran (Amicon) auf ein Volumen von 10 ml aufkonzentriert.

Schritt 3 Molekularsiebchromatographie

Das Konzentrat aus der Ionenaustauschchromatographie (Schritt 2) wurde in zwei Portionen zu je 5 ml durch Molekularsiebohromato graphie (Superdex 200 prep. grade, Pharmacia, Trennbereich 10 bis 600 kDa, 2,6 cm Durchmesser, 60 cm Höhe, 325 ml Volumen) weiter gereinigt. Die Detektion erfolgte bei 280 nm. Die Säule war in 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, 5 mM DTT und 150 mM NaCl äquili briert und wurde mit einem Fluß von 1,5 ml/min betrieben. Es wurden 40 Fraktionen gesammelt. Die Nitril-verseifende Aktivität befand sich in den Fraktionen 3 bis 5.

Schritt 4 Ionenaustauschchromatographie

Die vereinigten Fraktionen aus der Molekularsiebohromatographie (Schritt 3) wurden durch Ionenaustauschchromatographie über eine Mono Q Säule (Säulenvolumen 1 ml, Mono Q HR515, Pharmacia) weiter gereinigt. Als Puffer A diente 20 mM Tris/HCl, pH 8,5, 5 mM DTT, als Puffer B der gleiche Puffer wie in A mit 1 M NaCl. Die Fluß geschwindigkeit betrug 1 ml/min. Die auf eine Leitfähigkeit von ca. 6 mS/cm verdünnte Wertfraktion aus der Molekularsiebohromato graphie (ca. 100 ml) wurde direkt auf die Mono Q Säule gegeben und das Protein so adsorbiert. Die Säule wurde nach dem Auftrag mit 5% Puffer B gewaschen. Die Säule wurde in 30 min mit einem Gradienten von 5% bis 40% B eluiert, gefolgt von 100% B für 10 Minuten. Die Elution der Nitrilase erfolgte in Fraktion 17 und 18 des Gradienten.

Die Schritte 1-4 der Reinigung werden in Tabelle I wieder gegeben.

Tabelle I

Reinigungsschema

Die Wertfraktionen (= WF, Tabelle I) der Molekularsiebohromato graphie (Schritt 3) und Ionenaustauschchromatographie über Mono Q (Schritt 4) sind über SDS-PAGE aufgetrennt worden wie in Fig. 2 dargestellt.

Schritt 5 Reversed-Phase (RP)-Hochflüssigkeitschomatographie

Die Wertfraktion (Fraktion 17 und 18) der Mono Q Chromatographie (Schritt 4) wurde durch RP-Chromatographie auf Homogenität überprüft und zur Vorbereitung einer Trypsinspaltung weiter gereinigt. Zur Trennung wurde eine Säule (3 cm) von Abimed an einem Hewlett-Packard Gerät (HP 1090) eingesetzt. Als Laufmittel diente Puffer A: Wasser mit 0,1% TFA und Puffer B: Acetonitril mit 0,1% TFA. Injektionsvolumen 0,1 ml, Flußgeschwindigkeit 0,5 ml/min. Der Elutionsgradient hatte folgenden Verlauf:

Die Nitrilase eluierte zwischen 12 und 13 Minuten. Im SDS-PAGE entspricht das einer 37 kDa-Bande. Diese Bande wurde ansequen ziert. Es wurde der Sequenzer "494 Procise Protein Sequenzer" der Firma Applied Biosystems verwendet. Die so erhaltene N-terminale Sequenz von 39 Aminosäuren wird im Folgenden mit SEQ ID NO: 3 bezeichnet. Die Sequenz ist in der beigefügten Liste der Sequen zen aufgeführt und lautet: Met Gln Thr Arg Lys Ile Val Arg Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala Ser Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr Ile Glu Leu Ala Arg Gln Ala Arg Asp Glu Gly.

Herstellung tryptischer Peptide

Die Probe aus der Mono Q Chromatographie (Schritt 4) wurde wie folgt vorbehandelt: das Protein (ca. 0,6 mg) wurde durch 12,5% TCA gefällt und das Pellet dreimal mit 1 ml Ether/Ethanol (1 : 1) gewaschen. Das Pellet wurde in 0,2 ml 6 M Guanidin HCl, 25 mM Tris/HCl, pH 8,5 gelöst. Zu dieser Lösung wurden 2,6 µl einer 1 M DTT-Lösung zur Reduktion der Disulfitbrücken gegeben. Die Probe wurde eine Stunde in Dunkelheit geschüttelt. Danach wurde das Protein mit 1,5 µl einer 4-Vinylpyridinlösung (35%) für 2 Stun den in Dunkelheit umgesetzt. Die Reaktion wurde durch Inkubation für 1 Stunde mit 2,6 µl einer 1 M DTT-Lösung beendet. Das vinyl pyrrilidierte Enzym wurde wie oben beschrieben durch RP-HPLC gereinigt. Die Retentionszeit betrug nun zwischen 10 und 11 Minuten. Die Wertfraktion, identifiziert durch ihr Molekular gewicht, wurde gesammelt und auf 0,02 ml aufkonzentriert. Dazu wurden 0,01 ml Acetonitril und 0,1 M Tris/HCl, pH 8,5 ad 0,2 ml gegeben. Zur Korrektur des pH-Wertes wurden noch ca. 0,05 ml 0,1 M NaOH zugesetzt. Die Probe (0,3 mg geschätzte Proteinmenge) wurde mit 0,032 ml einer 1 mg/ml Trypsinlösung in 0,1 M Tris/HCl, pH 8,5, 5% Acetonitril, versetzt und über Nacht bei 37°C in kubiert. Der Verdau wurde mit 0,01 ml Essigsäure gestoppt und dann zentrifugiert. Der Überstand wurde durch RP-HPLC auf C18 getrennt. (Laufsystem: Puffer A: Wasser, 0,1% TFA, Puffer B: Acetonitril, 0,1% TFA). Peptide (Detektion 205 nm und 280 nm) wurden gesammelt und sequenziert. Es wurde der Sequenzer "494 Procise Protein Sequenzer" der Firma Applied Biosystems ver wendet. Die interne Peptidsequenz von 21 Aminosäuren wird im folgenden mit SEQ ID NO: 4, die interne Peptidsequenz von 11 Aminosäuren mit SEQ ID NO: 5 bezeichnet. SEQ ID NO: 4 und 5 sind in der beigefügten Liste der Sequenzen aufgeführt und lauten:
SEQ ID NO: 4
Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys Ile Ala Ser Val Ala Ile Ser His Pro Gln
SEQ ID NO: 5
Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys

6. Aktivität der gereinigten Nitrilase gegenüber Mandelonitril

Die Aktivität der gereinigten Nitrilase gegenüber Mandelonitril wurde wie in Beispiel 2 beschrieben untersucht. Die spezifische Aktivität des gereinigten Proteins gegenüber Mandelonitril lag bei 12.380 U/g Protein.

Beispiel 2 Klonierung der Nitrilase aus Alcaligenes faecalis 1650

Aus den in Beispiel 1 dargestellten Peptidsequenzen SEQ ID NO: 3 und 4 wurden Nukleotidsonden abgeleitet und synthetisiert. Von der SEQ ID NO: 3, der N-terminalen Peptidsequenz, war die ab geleitete Nukleotidsonde ein 23 mer, 64 mal degeneriert (in der Sequenz der Nukleotidsonde wird A, C, G oder T durch N ersetzt; A oder G durch R; C oder G durch 5). Durch den hohen Prozentan teil an GC der in der Literatur beschriebenen Stämme Alcaligenes (Wada et al., 1992, Nucl. Acids Res., 20, 2111-2118) waren im Falle des Glutamins und des Isoleucins die Auswahl der dritten Position des Codons vorgegeben. Die Nukleotidsonde, die im Folgenden mit SEQ ID NO: 6 bezeichnet wird, stellt den 5'-Primer für die nachfolgende PCR dar, wobei S = C oder G und N = A, C, G oder T bedeutet, und lautet:
SEQ ID NO: 6
5'-ATGCAGACNAGNAARATCGTSCG-3'

Von SEQ ID NO: 4, der internen Peptidsequenz, wurde ein 20 mer als Nukleotidsonde abgeleitet, 256 mal degeneriert (in der Sequenz der Nukleotidbasen wird A, C, G oder T durch N ersetzt; A oder G durch R; C oder G durch S). Durch den hohen Prozen tanteil an GC der Stämme Alcaligenes war im Falle des Lysins die Auswahl der dritten Position des Codons vorgegeben. Diese Nukleotidsonde stellt den 3'-Primer für die nachfolgende PCR dar und wird im Folgenden mit SEQ ID NO: 7 bezeichnet. Sie ist in der beigefügten Liste der Sequenzen aufgeführt und lautet:
SEQ ID NO: 7
5'-TNGCSACNGANGCRATCTTG-3'

Mit Hilfe dieses Primerpaars, SEQ ID NO: 6 und 7, wurde die PCR an chromosomaler DNA aus Alcaligenes faecalis 1650 durchgeführt. Die Isolierung chromosomaler DNA erfolgte nach Zelllyse mit Lysozym und Proteinase K-Behandlung nach der dem Fachmann be kannten klassischen Methode (Ausubel, F. M. et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons).

Unter Verwendung der Pwo-Polymerase beinhaltete die PCR eine De naturierung für 3 min bei 95°C; 35 Zyklen mit einer Denaturierung für 1 min bei 95°C, einer Primeranlagerung für 1 min 30 sec bei 58°C und eine Polymerisation für 1 min 30 sec bei 72°C; und einer Abschlußpolymerisation für 5 min bei 72°C.

Unter diesen Bedingungen wurde aus der chromosomalen DNA aus Alcaligenes faecalis 1650 ein etwa 1 kb großes Fragment ampli fiziert. Zur Klonierung des PCR-Produktes wurde an die bereits erwähnten Primer je eine XbaI-Restriktionsschnittstelle und zwei zusätzliche Nukleotide angehängt (5'-AATCTAGA bzw. 5'-ATTCTAGA) und die PCR-Reaktion unter den oben genannten Bedingungen wieder holt. Erneut wurde ein etwa 1 kb-großes Fragment amplifiziert, das nach Reinigung und XbaI-Verdau in analog verdauten pUCl8 ligiert wurde. Nach Transformation von E. coli JM109 und Isolierung des resultierenden Plasmids wurde die DNA durch Sequenzierung und anschließenden genomischen Southern Blot verifiziert. Die molekularbiologischen und mikrobiologischen Methoden zur Isolierung des kompletten Nitrilase-Gens (nit) erfolgte nach den dem Fachmann bekannten klassischen Methoden. Die komplette Nitrilase-Sequenz ist in SEQ ID NO: 1 dargestellt.

Beispiel 3 Homologie mit anderen Proteinen, Identifizierung der homologen Sequenz

Der Vergleich mit Sequenzen aus der Proteindatenbank SWISSPROT zeigte, daß das Nitrilasegen in dieser Erfindung 11 bis 96% Homologie zu bekannten Nitrilasen auf Aminosäureebene besitzt. Die höchste Sequenzhomologie wurde zu der Arylacetonitril spezifischen Nitrilase aus Alcalignes faecalis JM3 (Nagasawa et al., Eur. J. Biochem. 1990, 194, 765-772) gefunden. Die beiden Nitrilasegene weisen eine Identität von 93,2% auf Nukleotidebene über einen Bereich von 1071 bp auf. Die abgeleitete Aminosäure sequenz weist eine Identität von 96,1% über einen Bereich von 356 Aminosäuren auf. Die geringste Homologie von 11,4% über einen Bereich von 534 Aminosäuren wurde zu der Nitrilase aus Rhodococcus erythropolis SK92 (EP-A-0 719 862) gefunden.

Beispiel 4 Heterologe Expression der Nitrilase in E. coli

Zur Klonierung in den Expressionsvektor pJOE2702 wurde das nit- Gen amplifiziert. Dabei wurde als 5'-Primer für die PCR die o. g. SEQ ID NO: 3 ausgewählt, wobei an das 5'-nit-Ende eine mit dem Translationsstart überlappende Ndel-Schnittstelle angefügt wurde. Dieser Primer wird im Folgenden als SEQ ID NO: 8 bezeichnet und ist in der beigefügten Liste der Sequenzen aufgeführt. Als 3'-Primer wurde ein 24 mer aus dem 3'-Bereich des nit-Gens aus gewählt, bei dem eine an das Stopcodon angrenzende BamHI-Schnitt stellen angefügt wurde. Er wird im Folgenden als SEQ ID NO: 9 bezeichnet und ist in der nachfolgenden Liste der Sequenzen auf geführt.
5'-TTAATCATATGCAGACAAGAAAAATCGTCCG-3' (= SEQ ID NO: 8)
5'-AAGGATCCTCAAGACGGCTCTTGCACTAGCAG-3' (= SEQ ID NO: 9)

Unter Verwendung der Pwo-Polymerase beinhaltete die PCR eine De naturierung für 3 min bei 94°C; 25 Zyklen mit einer Denaturierung für 1 min bei 93°C, einer Primeranlagerung für 1 min 30 sec bei 55°C und einer Polymerisation für 1 min 30 sec bei 72°C bzw. einer Abschlußpolymerisation für 5 min bei 72°C. Das erhaltene PCR- Fragment wurde gereinigt, mit NdeI/BamHI verdaut und in analog verdauten Vektor pJOE2702 (Volffet al., 1996, Mol. Microbiol., 21(5), 1037-1047) integriert. Das resultierende Plasmid wurde mit pDHE 19.2 bezeichnet und ist in Fig. 3 dargestellt. Durch die Integration über die NdeI/BamHI-Schnittstellen steht das nit-Gen in dem Plasmid pDHE19.2 unter Transkriptionskontrolle des in pJOE2702 enthaltenen Promotors rha_P, der aus dem positiv regulier ten L-Rhamnose-Operon rhaBAD in E. coli (Egan & Schleif, 1994, J. Mol. Biol., 243, 821-829) stammt. Die Transkriptionstermination des nit-Gens und die Translationsinitiation erfolgen ebenfalls über Vektorsequenzen. Daneben enthält das Plasmid noch ein Gen, das die Ampicillin-Resistenz Ap^R verleiht.

Die heterologe Expression der Nitrilase wurde bei dem das Plasmid pDHE19.2 enthaltenden Stamm E. coli JM109 gezeigt. Zu diesem Zweck wurde der Stamm JM109 (pDHE19.2) im Kulturmedium TB bei 37°C mit 100 µg/ml Ampicillin (Tartof, Hobbs 1987) unter Schütteln angezogen. Bei einer OD₆₀₀ von 1,7 wurde die Kultur 1 : 200 in frisches TB-Medium, das zur Induktion der Nitrilase 0,2% (w/v) L-Rhamnose enthielt, überimpft und bei 30°C unter Schütteln kulti viert. Nach 8 Stunden wurden die Zellen geerntet, mit 10 mM Na/K- Phosphatpuffer, pH 7,2, gewaschen, in demselben Puffer ent sprechend einer OD₆₀₀ von 10 resuspendiert und nach Ultraschall behandlung aufgeschlossen.

Beispiel 5 Bestimmung der Nitrilase-Aktivität des rekombinaten Stamms E. coli JM109 (pDHE19.2) 1. Herstellung der Zellen

E. coli JM109 (pDHE19.2) wurde bei 37°C für die Dauer von 6 Stunden in TB-Medium + 100 µg/ml Ampicillin unter Schütteln kultiviert. Bei einer OD₆₀₀ von 4 wurde mit 100 ml dieser Vor kultur ein 10l-Fermenter mit 81 frischem TB-Medium + 100 µg/ml Ampicillin + 2 g/l L-Rhamnose beimpft. Der pH, die Temperatur, der Luftstrom und die Rührgeschwindigkeit lagen bei 7,2, 30°C, 300 l/h und 400-650 upm. Nach 16 Stunden wurden die Zellen ge erntet. Zu diesem Zeitpunkt betrug die optische Dichte bei 600 nm 18, was einem Zelltrockengewicht von 7,8 g/l entsprach.

2. Bestimmung der spezifischen Aktivität gegenüber Mandelonitril

Die Zellen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben gewonnen und in 10 mM Na/K-Phospatpuffer, pH 7,2 gewaschen. 2 mg Zelltrocken gewicht wurden in 1 ml 10 mM Na/K-Phospatpuffer, pH 7,2, re suspendiert und die Reaktion durch Zugabe von 8,3 mM Mandelo nitril gestartet. Die Reaktion wurde unter Schütteln bei 40°C durchgeführt. Die Kinetik wurde über Probenentnahme und anschlie ßende Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (ODS Hypersil) verfolgt. Dabei wurde Mandelonitril, Benzaldehyd, Mandelsäureamid und Mandelsäure bestimmt. Die Bildungsgeschwindigkeit von Mandel säure beträgt 403 U/g Zelltrockengewicht bei einem Umsatz von 30%, wobei 1 U definiert ist als 1 µmol Mandelsäure, das pro Minute bei 40°C gebildet wird.

Beispiel 6 Synthese von R-Mandelsäure über Verseifung von Mandelonitril mit Hilfe von E. coli JM109 (pDHE19.2) in Suspension

In einem Volumen von 11 10 mM Na/K-Phosphatpuffer, pH 7,2, der den Stamm E. coli JM109 (pDHE19.2) in einer Konzentration von 2 g/l enthielt, wurde bei 40°C unter Rühren mit einem Blattrührer über 10 Stunden Mandelonitril in einer Konzentration von 1,3 g/l zudosiert. Die Dosierung wurde über den Nitril-Verbrauch regu liert. Die Bildungsgeschwindigkeit von R-Mandelsäure wurde wie in Beispiel 5 beschrieben verfolgt. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt.

Beispiel 7 Gewinnung von R-Mandelsäure über Extraktion aus dem Reaktionsansatz der Mandelonitril-Verseifung durch E. coli JM109 (pDHE19.2) in Suspension

Der in Beispiel 6 erhaltene, wässrige Reaktionsansatz an Mandel säure wurde von den Zellen über Zentrifugation befreit, mit einer Säure auf pH 2 gestellt und dreimal mit Methyltertiärbutylether (MTBE) extrahiert. Nach Abdampfen des organischen Lösungsmittels des Mandelsäureextraktes wurden die so erhaltenen, weißen Mandel säurekristalle rückgelöst und auf chemische und optische Reinheit über Hochleistungsflüssigkeitschromatographie untersucht. Die chemische Reinheit lag bei 99%, die optische Reinheit der R-Mandelsäure bei 97,4% ee.

Beispiel 8 Gewinnung von R-Mandelsäure über Kühlungs-Kristalli sation aus dem Reaktionsansatz der Mandelonitril-Ver seifung durch E. coli JM109 (pDHE19.2) in Suspension

Der in Beispiel 6 erhaltene, wässrige Reaktionsansatz an Mandel säure wurde von den Zellen über Zentrifugation befreit, unter Er wärmung und Rührung auf 40% des Ausgangsvolumens aufkonzentriert und mit einer Säure auf pH 2 gestellt. Durch Abkühlung im Eisbad wurde die Mandelsäure auskristallisiert und die so erhaltenen, weißen Mandelsäurekristalle über eine Nutsche abgesaugt und ge trocknet. Die Kristalle wurden rückgelöst und über Hochleistungs flüssigkeitschromatographie auf chemische und optische Reinheit untersucht. Die chemische Reinheit lag bei 99,1%, die optische Reinheit der R-Mandelsäure lag bei 99,8% ee.

Beispiel 9 Umsetzung verschiedener Nitrile

Mit dem E. coli Stamm (siehe Beispiel 6) oder mit dem Ausgangs stamm Alcaligenes wurden verschieden Nitrile umgesetzt. Die Alcaligenes-Zellen wurden in 400 ml Alcaligenes-Medium (siehe oben Medium A) bei 30°C und 160 Upm für 16 Stunden (= h) ange zogen. Die Zellernte erfolgte durch Zentrifugation (30 min. 4°C und 5000 Upm). Je 150 µl einer Zellsuspension wurden pro Well in eine Mikrotiterplatte pipetiert. Die Platte wurde anschließend zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und die Zellpellets zweimal mit Na₂HPO₄ (1,42 g/l in Finnaqua, pH 7,2) gewaschen. An schließend wurde die Substratlösung (150 µl) zupipettiert und die Zellen erneut resuspendiert. Je eine 12-er Reihe der Mikrotiter platte wurde mit einem Substrat versetzt. Als Kontrolle wurde eine Reihe mit der Substratlösung ohne Zellen genommen (= Leer wert).

Die Mikrotiterplatten wurden bei 30°C und 200 Upm für 2 Stunden im Schüttelinkubator belassen. Danach wurden die Zellen abzentri fugiert und im Überstand die entstandene Menge an NH₄-Ionen mit Hilfe der Biomek-Geräts bestimmt. Die Messung erfolgte bei 620 nm gegen eine Eichkurve, die mit verschiedenen NH₄OH-Lösungen er stellt wurden war (siehe Fig. 5). Als Substrate wurden Mandelo nitril (= 1), 2-Phenylpropionitril (= 2), 2-Phenylbutyronitril (= 3), Benzylcyanid (= 4), 4-Chlorbenzylcyanid (= 5), 4-Brom benzylcyanid (= 6), Propionitril (= 7), 2-Methylbutyronitril (= 8, 2-Cyanobutan), Geranonitril (= 9), Valeronitril (= 10), 3-Cyanpyridin (= 11), 3-Biphenyl-2-hydroxy-butyronitril (= 12), 4-Flourbenzylcyanid (= 13,4-Fluorophenylacetronitril) und α-(3-Heptyl)-nitro-triacetonitril (= 14) verwendet. Die Substrate wurden 0,2 molar in Methanol angesetzt und von dieser Stammlösung ausgehend mit Na₂HPO₄ (1,42 g/l in Finnaqua, pH 7,2) auf 10 mM verdünnt. Die Zellsuspensionen wurden auf 2 g/l Biotrockenmasse standardisiert. Tabelle II gibt die Mittelwerte einer Mikrotiter plattenreihe bei der Umsetzung wieder.

Tabelle II

Umsetzung verschiedener Nitrile mit Nitrilase 1650

Fig. 6 gibt die Ergebnisse der Umsetzung als Aktivitätswerte wieder.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit Nitrilaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dar gestellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz ableiten,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäure sequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 95% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist.

2. Aminosäuresequenz codiert durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1.

3. Aminosäuresequenz nach Anspruch 2, codiert durch die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Sequenz.

4. Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuresequenz mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft ist.

5. Vector enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 4.

6. Mikroorganismus enthaltend mindestens eine Nukleinsäure sequenz gemäß Anspruch 1 oder mindestens ein Nukleinsäure konstrukt gemäß Anspruch 4.

7. Mikroorganismus nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Mikroorganismus um ein Bakterium der Gattungen Escherichia, Pseudomonas oder Alcaligenes handelt.

8. Verfahren zur Herstellung von chiralen Carbonsäuren der all gemeinen Formel I
dadurch gekennzeichnet, daß man racemische Nitrile der all gemeinen Formel II
in Gegenwart einer Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 2 oder 3 oder einem wachsenden, ruhenden oder aufgeschlossenen Mikroorganismus gemäß Anspruch 6 oder 7 umsetzt und wobei mindestens 25 mmol Nitril/h pro mg Protein oder 25 mmol Nitril/h pro g Trockengewicht zu den chiralen Carbonsäuren umgesetzt werden,
wobei die Substituenten und Variablen in den Formeln I und II folgende Bedeutung haben:
* ein optisch aktives Zentrum
R¹, R², R³ unabhängig voneinander Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-, C₂-C₁₀-Alkenyl-, substituiertes oder unsubstituiertes Aryl-, Hetaryl-, OR⁴ oder NR⁴R⁵ und wobei die Reste R¹, R² und R³ immer unterschiedlich sind,
R⁴ Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-, C₂-C₁₀-Alkenyl-, C₁-C₁₀-Alkylcarbonyl-, C₂-C₁₀-Alkenyl carbonyl-, Aryl-, Arylcarbonyl-, Hetaryl- oder Hetaryl carbonyl-,
R⁵ Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₁₀-Alkyl-, C₂-C₁₀-Alkenyl-, Aryl- oder Hetaryl-.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß einer der Substituenten R¹, R² oder R³ OR⁴ bedeutet.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß einer der Substituenten R¹, R² oder R³ Aryl- bedeutet.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 8 bis 10, dadurch gekenn zeichnet, daß das Verfahren in wäßriger Reaktionslösung bei einem pH zwischen 4 bis 11 durchgeführt wird.

12. Verfahren nach den Ansprüchen 8 bis 11, dadurch gekenn zeichnet, daß im Verfahren 0,01 bis 10 Gew.-% Nitril oder 0,01 bis 10 Gew.-% eines entsprechenden Aldehyds oder Ketons und 0,01 bis 10 Gew.-% Blausäure umgesetzt werden.

13. Verfahren nach den Ansprüchen 8 bis 12, dadurch gekenn zeichnet, daß das Verfahren bei einer Temperatur zwischen 0°C bis 80°C durchgeführt wird.

14. Verfahren nach den Ansprüchen 8 bis 13, dadurch gekenn zeichnet, daß die chirale Carbonsäure über Extraktion oder Kristallisation oder Extraktion und Kristallisation in Aus beuten von 60 bis 100% aus der Reaktionslösung gewonnen wird.

15. Verfahren nach den Ansprüchen 8 bis 14, dadurch gekenn zeichnet, daß die chirale Carbonsäure eine optische Rein heit von mindestens 90% ee besitzt.