FR2822460A1 - Procede de preparation enantioselectif d'acides carboxyliques optiquement actifs par hydrolyse enzymatique de nitriles - Google Patents

Procede de preparation enantioselectif d'acides carboxyliques optiquement actifs par hydrolyse enzymatique de nitriles Download PDF

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Abstract

La présente invention a pour objet un procédé de préparation énantiosélectif d'acides carboxyliques par hydrolyse de nitriles racémiques ou d'un mélange de l'aldéhyde correspondant avec l'acide cyanhydrique HCN, sous l'action d'un polypeptide à activité nitrilase.

Description

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PROCEDE DE PREPARATION ENANTIOSELECTIF D'ACIDES CARBOXYLIQUES OPTIQUEMENT ACTIFS PAR HYDROLYSE
ENZYMATIQUE DE NITRILES.
La présente invention a trait à un procédé de préparation énantiosélectif d'acides carboxyliques optiquement actifs.
L'invention concerne notamment la préparation des acides ahydroxycarboxyliques, notamment d'acides chloromandéliques optiquement actifs, en particulier de R-acides, par hydrolyse enzymatique de nitriles racémiques.
L'invention vise plus particulièrement, la préparation de l'acide (R)-2chloromandélique
Il est connu selon EP-A-0 348 901 de préparer des acides carboxyliques asubstitués optiquement actifs, à partir de nitriles ou d'amides a-substitués racémiques, à l'aide de certains microorganismes du groupe constitué par les genres Alcaligenes, Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Corynebacterium, Acinetobacter, Bacillus, Mycobacterium, Rhodococcus, ainsi que par une levure, à savoir Candida. Ce document décrit la préparation de l'acide R (-)-mandélique par hydrolyse du mandélonitrile racémique par une préparation soit d'Alcaligenes faecalis, souche ATCC 8750, soit de Pseudomonas vesicularis, souche ATCC 11426, soit de Candida tropicales, souche ATCC 20311.
Par ailleurs, on a décrit dans EP-A-449 648 ou US-A-5 296 373, un procédé de production de l'énantiomère acide, R (-)-mandélique substitué à partir d'un mandélonitrile substitué racémique, par mélange avec une préparation d'une bactérie Rhodococcus, souche HT 29-7 (FERM BP-3857) qui assure l'hydrolyse stéréosélective du groupe nitrile du racémique afin, apparemment, d'éviter les inconvénients de la séparation d'autres substances optiquement actives obtenues après hydrolyse par les microorganismes proposés dans EP-A- 0348901.
On a proposé selon US 5 223 416 de préparer l'acide R (-) mandélique optiquement actif et dérivé, par hydrolyse enzymatique du mandélonitrile racémique, en utilisant une préparation de bactéries similaire à celle de EP-A-0 348 901 ou d'autres genres bactériens tels que Aureobacterium, Caseobacter, Brevibacterium et Nocardia. Le but du procédé revendiqué est de remédier aux inconvénients de la mise en oeuvre du procédé selon EP-A-348 901 sur le mandélonitrile racémique ou des mandélonitriles substitués racémiques, qui
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n'assurerait pas une hydrolyse stéréospécifique directe en acide R (-)mandélique ou ses dérivés.
On a utilisé dans EP-A-0 610 048, une réaction similaire, des microorganismes du genre Gordona, tels que Gordona terras MA-1 (FERM BP- 4535).
Il est décrit dans EP-A-0 596 812 une séquence d'ADN codant pour un polypeptide ayant une activité nitrilase, capable d'hydrolyser les nitriles en carboxylates, cette séquence provenant d'une autre bactérie, à savoir Comamonas, notamment Comamonas testoteronii, ainsi que des polypeptides exprimés par cette séquence et possédant une activité nitrilase.
Ce brevet décrit aussi les microorganismes recombinants contenant une telle séquence de façon à exprimer en quantité importante de tels polypeptides, et notamment un recombinant E. coli, de même que les procédés permettant d'obtenir de tels recombinants.
L'activité nitrilase qui a ainsi pu être obtenue s'est révélée très intéressante pour l'hydrolyse spécifique de dinitriles en carboxylates ou dicarboxylates.
Ce document n'enseigne cependant pas l'utilisation des préparations d'enzymes nitrilases obtenues, pour une hydrolyse énantiosélective.
Il est également décrit dans WO 99/64607 une séquence d'ADN codant pour un polypeptide ayant une activité nitrilase. Cette séquence provient d'une autre bactérie, à savoir Alcaligenes, notamment Alcaligenes faecalis.
Le polypeptide décrit qui a la séquence d'acides aminés SEQ ID n 2 ci-annexée est codé par une séquence de nucléotides SEQ ID no1, également annexée.
Ce document décrit aussi les microorganismes recombinants contenant une telle séquence de façon à exprimer en quantité importante, de tels polypeptides. Ce document n'enseigne cependant pas l'utilisation des préparations d'enzymes nitrilases obtenues pour une hydrolyse énantiosélective.
Un objectif de la présente invention est de fournir un procédé permettant d'hydrolyser le chloromandélonitrile racémique en acide R (-)-chloromandélique avec un rendement très élevé.
Un autre objectif de l'invention est de fournir un tel procédé permettant d'obtenir de façon plus générale, une hydrolyse enzymatique stéréosélective, et notamment énantiosélective, d'un certain nombre de nitriles initialement sous forme racémique.
Il a maintenant été trouvé et c'est ce qui constitue l'objet de la présente invention un procédé de préparation d'un acide carboxylique a-substitué
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optiquement actif caractérisé par le fait qu'il consiste à effectuer l'hydrolyse d'un nitrile a-substitué racémique ou d'un mélange d'acide cyanhydrique et de l'aldéhyde correspondant, en présence d'un polypeptide à activité nitrilase résultant de l'expression de la séquence de nucléotides SEQ ID n 3, puis à récupérer l'acide carboxylique a-substitué optiquement actif ainsi obtenu.
La caractéristique du procédé de l'invention est de mettre en oeuvre, pour effectuer l'hydrolyse énantiosélective d'un nitrile, un polypeptide à activité nitrilase codé par la séquence de nucléotides SEQ ID no3 qui comprend la séquence d'acides aminés SEQ ID n 4.
Dans le présent texte de l'invention, on entend par acide carboxylique a-substitué optiquement actif , un acide organique comprenant au moins 3 atomes de carbone et dont l'atome de carbone situé en position a par rapport au groupe carboxylique porte trois substituants différents.
L'un des groupes portés par l'atome de carbone situé en position a est de préférence un groupe hydroxyle, un atome d'halogène ou un groupe méthyle.
On entend par nitrile a-substitué , un composé organique comprenant un groupe nitrile et ayant en position a, un atome de carbone porteur de trois substituants différents.
Plus précisément, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'un acide carboxylique optiquement actif par hydrolyse enzymatique stéréosélective - soit d'un a-hydroxynitrile racémique correspondant à la formule (1) :
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dans ladite formule (1) : - Ri représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, - R, différent de Ri, représente un groupe hydrocarboné ayant de 1 à 20 atomes de carbone qui peut être un groupe aliphatique acyclique saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié ; un groupe carbocyclique ou hétérocyclique saturé, insaturé ou aromatique, monocyclique ou polycyclique ; un groupe aliphatique saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, porteur d'un substituant cyclique.
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- soit d'un mélange d'acide cyanhydrique HCN avec un aldéhyde de formule (11) :
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dans ladite formule (11), R a la même signification que dans la formule (1),
Le substrat intervenant dans le procédé de l'invention répond plus particulièrement, à la formule (1) dans laquelle R représente un groupe aliphatique acyclique, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié.
Plus précisément, R représente un groupe alkyle linéaire ou ramifié ayant de 1 à 20 atomes de carbone.
La chaîne hydrocarbonée peut être éventuellement interrompue par un hétéroatome (par exemple, oxygène, azote ou soufre) ou par un groupe fonctionnel dans la mesure où celui-ci ne réagit pas et l'on peut citer en particulier un groupe tel que notamment-CO-.
La chaîne hydrocarbonée peut être éventuellement porteuse de un ou plusieurs substituants dans la mesure - où ils ne réagissent pas dans les conditions réactionnelles et l'on peut mentionner notamment un atome d'halogène, un groupe nitro ou un groupe trifluorométhyle.
Dans les composés répondant à la formule (1), R peut représenter un groupe carbocyclique, monocyclique. Le nombre d'atomes de carbone dans le cycle peut varier largement de 3 à 8 atomes de carbone mais il est de préférence égal à 5 ou 6 atomes de carbone.
Le carbocycle peut être saturé ou comprenant 1 ou 2 insaturations dans le cycle, de préférence de 1 à 2 doubles liaisons.
Comme exemples préférés de groupes R, on peut citer le groupe cyclopentyl, le groupe cyclohexyl, le groupe cyclohéxène-yle.
Le groupe R peut être également carbocyclique, polycyclique, de préférence bicyclique ce qui signifie qu'au moins deux cycles ont deux atomes de carbone en commun. Dans le cas des groupes polycycliques, le nombre d'atomes de carbone dans chaque cycle varie entre 3 et 6 : le nombre total d'atomes de carbone étant égal de préférence à 7.
Chaque cycle peut être saturé ou comprendre selon la taille du cycle, une ou deux insaturations.
Comme exemples préférés de groupes R, on peut citer le groupe bicyclo [4, 1, 0] heptane-yle, bicyclo [2, 2, 1] heptane-yie, bicyclo [3, 1, 1] heptane-yle, bicyclo [3, 2, 0] heptane-yle, le groupe norborn-5-ène-2-yle.
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Le groupe R peut représenter un groupe carbocyclique aromatique, monocyclique ayant de préférence 6 atomes de carbone dans le cycle.
Comme exemples préférés, on peut citer un groupe phényle, tolyle, xylyle.
Le groupe R peut représenter un groupe carbocyclique partiellement aromatique, polycylique comprenant au moins deux carbocycles dont l'un seul d'entre eux est aromatique et formant entre eux des systèmes ortho-condensés, ortho-et péri-condensés.
Comme exemples, on peut citer le groupe tétrahydronaphtalène.
Le groupe R peut représenter un groupe aromatique polycyclique ayant de 12 à 24 atomes de carbone : les cycles pouvant former entre eux des systèmes ortho-condensés, ortho-et péri-condensés.
Comme exemples préférés, on peut citer le groupe naphtyl.
Dans la formule générale (1), R peut également représenter un groupe hétérocyclique, saturé, insaturé ou aromatique comportant de 3 à 7 atomes, de préférence 5 ou 6 atomes dans le cycle dont 1 ou 2 hétéroatomes tels que les atomes d'azote, de soufre et d'oxygène.
R peut aussi représenter un groupe hétérocyclique polycyclique défini comme étant soit un groupe constitué par au moins 2 hétérocycles aromatiques ou non contenant au moins un hétéroatome dans chaque cycle et formant entre eux des systèmes ortho-ou ortho-et péri-condensés ou soit un groupe constitué par au moins un carbocycle aromatique ou non et au moins un hétérocycle aromatique ou non formant entre eux des systèmes ortho-ou ortho-et péricondensés.
A titre d'exemples de groupes R de type hétérocyclique, on peut citer entre
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autres, les groupes furyle, pyrrolyl, thiényle, isoxazolyle, furazannyle, isothiazolyl, imidazolyl, pyrazolyl, pyridyle, pyridazinyle, pyrimidinyle, pyrannyle et les groupes quinolyle, naphtyridinyle, benzopyrannyle, benzofurannyle, indolyle.
Il est également possible de partir d'un substrat résultant de l'enchaînement d'un groupe aliphatique saturé ou insaturé et/ou d'un carbocycle saturé, insaturé ou aromatique et/ou d'un hétérocycle saturé, insaturé ou aromatique.
On vise en particulier les substrats de formule (1) dans laquelle R représente un groupe aliphatique saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, porteur d'un substituant cyclique. Par cycle, on entend de préférence, un cycle carbocyclique ou hétérocyclique, saturé, insaturé ou aromatique, de préférence cycloaliphatique ou aromatique notamment cycloaliphatique comprenant 6 atomes de carbone dans le cycle ou benzénique.
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Le groupe aliphatique acyclique peut être relié au cycle par un lien valentiel, un hétéroatome (de préférence, un atome d'oxygène) ou un groupe fonctionnel et des exemples sont donnés ci-dessus.
Comme exemples plus spécifiques, on peut citer les groupes cyclo-ou arylalkyles ayant de 6 à 20 atomes de carbone et l'on peut citer notamment les
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groupes cyclohexylméthyle, cyclohexylbutyle, benzyle, 2-phényléthyle, [ (2-butyl)- 4-phényl]-2-éthyle, styryle, a-phénylcyclohexylméthyle, phénoxyméthyle, phénoxyéthyle.
Comme exemples d'enchaînements de cycles, on peut mentionner entre autres, les groupes biphényle, 1, 1'-méthylènebiphényle, 1, 1'isopropylidènebiphényle, 1, 1'-carboxybiphényle, 1, 1'-oxybiphényle, 1, 1'aminobiphényle.
Il est à noter que si le groupe R comprend un cycle quelconque, il est possible que ce cycle porte un substituant. La nature du substituant est quelconque dans la mesure où il n'interfère pas au niveau du produit désiré. Les substituants portés le plus souvent par le cycle sont un ou plusieurs groupes alkyle ou alkoxy ayant de 1 à 12 atomes de carbone, un atome d'halogène, de préférence un atome de chlore, un groupe haloalkyl ayant de 1 à 12 atomes de carbone, de préférence un groupe trifluorométhyle, un groupe hydroxyle ou thiol, un groupe nitro, un groupe amino.
Il est également possible selon l'invention que le substrat de départ présente deux ou plus de deux groupes fonctionnels réactifs. Il est alors possible de préparer un acide di-ou polycarboxylique.
Parmi les substrats de formule (1), on préfère mettre en oeuvre ceux qui répondent à la formule (1) dans laquelle : - Ri représente un atome d'hydrogène, - R représente : . un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, substitué ou non, ayant de 1 à
10, de préférence, de 1 à 6 atomes de carbone, . un groupe alkoxy, linéaire ou ramifié, substitué ou non, ayant de 1 à
10, de préférence, de 1 à 6 atomes de carbone, . un groupe alcényle linéaire ou ramifié, substitué ou non ayant de 2 à
10, de préférence, de 2 à 6 atomes de carbone, . un groupe cycloalkyl ayant de 3 à 6 atomes de carbone, . un groupe aryle ayant de 6 à 12 atomes de carbone, de préférence un groupe phényle ou naphtyl, un groupe alkylaryl ayant de 7 à 12 atomes de carbone, de préférence un groupe benzyle ou un groupe phényléthyle,
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. un groupe aryloxy ayant de 6 à 12 atomes de carbone, . un hétérocycle, saturé, insaturé ou aromatique, à base d'oxygène, d'azote et/ou de soufre, et contenant 5 ou 6 atomes
L'invention vise plus particulièrement, la préparation des acides mandéliques optiquement actifs à partir des a-hydroxynitriles répondant à la formule (la) :
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dans ladite formule (la) : - X, en position ortho, méta ou para et représente : . un atome d'hydrogène, . un atome d'halogène, . un groupe alkyle linéaire ou ramifié, ayant de 1 à 4 atomes de carbone, . un groupe alkoxy ou thioéther linéaire ou ramifié ayant de 1 à 4 atomes, . un groupe hydroxyle, . un groupe thiol, . un groupe amino, . un groupe nitro, . un groupe phényle, . un groupe phénoxy.
Dans la formule (la), X représente de préférence un atome d'halogène et plus préférentiellement un atome de chlore.
On met en oeuvre un nitrile racémique qui est de préférence, un chloromandélonitrile, de préférence le 2-chloromandélonitrile, qui peut être remplacé par un mélange de l'aldéhyde correspondant avec l'acide cyanhydrique HCN.
Conformément au procédé de l'invention, on effectue l'hydrolyse en mettant en contact le nitrile racémique ou le mélange de l'aldéhyde correspondant et de l'acide cyanhydrique avec un polypeptide à activité nitrilase tel que précédemment défini.
Dans un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, on met en contact le nitrile racémique, ou le mélange de l'aldéhyde correspondant et de l'acide cyanhydrique, avec une souche E. Coli recombinante comprenant la séquence
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codante SEQ ID no3 et plus préférentiellement une souche E. Coli recombinante contenant le plasmide décrit dans la figure 1.
La séquence SEQ ID n 3 susceptible d'exprimer un polypeptide possédant une activité nitrilase et comprenant la séquence SEQ ID no4 provient d'une
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mutagénèse de la souche Alcaligenes, et de préférence de Alcaligenes faecalis.
Le polypeptide utilisé dans le procédé de l'invention est donc obtenu par mutagénèse du gène NitB de la souche Alcaligenes, de préférence Alcaligenes faescalis (ATCC 8750).
Le gène muté est dénommé NitB*.
Le polypeptide de l'invention diffère du polypeptide produit par la souche sauvage Alcaligenes faescalis en ce sens que l'alanine en position 160 est remplacée par la glycine et la cystéine en position 162 est remplacée par l'asparagine.
On obtient le polypeptide à partir d'un gène muté obtenu par mutagénèse ponctuelle dirigée du gène sauvage NitB.
Deux mutations ponctuelles (substitution d'Ala-160 par Gly et de Cys-162 par Asn) ont été introduites par mutagenèse dirigée selon des conditions standards de PCR, (polymerase chain reaction) [Roche Molecular Biochemical, PCR Application Manual, 2nd édition, 1999] en utilisant l'ADN de la nitrilase native (NitB) d'Alcaligenes faecalis comme matrice.
Le gène muté NitB* est introduit dans un plasmide d'expression
Comme exemples de plasmides susceptibles d'être utilisés, on peut mentionner, entre autres, pBAD système d'expression, pSE280, pSE380 et
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pSE420, pLEX (Invitrogen, Carlsbad CA) ; pPROTet. E et pPROLar. A122 (Clontech, Paolo Alto CA) ; pQE système d'expression (Qiagen, Hilden, Germany) ; pMAL, IMPACT-TWIN et IMPACT-CN, plasmides d'expression (New England BioLabs, Beverly MA).
L'introduction du gène muté dans le plasmide est effectuée d'une manière connue.
L'Homme du Métier peut se reporter à WO 99/64607 précité, pour trouver les moyens lui permettant de réaliser la construction de la souche recombinante qui porte le gène NitB*, correspondant au gène NitB muté.
On peut aussi utiliser les méthodes décrites notamment par J. Sambrook and DW Russell [Molecular Cloning, a laboratory Manual Volumes 1,2 and 3, 3rd édition, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press].
La taille du gène doit être rendue compatible avec le plasmide capable de l'accepter.
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Le plasmide est d'abord préparé en vue de la ligation. Il est ouvert par incubation avec une enzyme de restriction et afin d'empêcher sa refermeture, il est traité par une phosphatase alcaline.
Le gène est introduit dans le plasmide en utilisant la DNA ligase. La ligation du gène avec le plasmide est obtenu en mélangeant le produit de PCR obtenu précédemment avec le plasmide linéarisé et déphosphaté et de la ligase.
Le mélange est incubé à basse température (10-20 OC).
Le plasmide recombinant est ensuite séparé, du milieu réactionnel par exemple par dialyse. Si nécessaire, il peut être purifié par extraction et précipitation.
Puis, il est introduit dans le microorganisme hôte.
Le microorganisme hôte couramment utilisé est une bactérie, par exemple, Escherichia Coli mais l'on peut également mettre en oeuvre une levure, par exemple Saccharomyces, Pichia ou un champignon, par exemple Aspergillus,.
On choisit préférentiellement les souches E. Coli. On peut se référer au tableau des souches les plus couramment utilisées pour la production de protéines recombinantes donné par Wingfield [Current Protocols in Protein
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Science, John Wiley & Sons, Inc (1997)]. On peut mentionner les souches d'E.
Coli K 12, largement décrites dans la littérature, DH5a (CLONESH, référence produit C1021-1), BL21 (Novagen, référence produit (69386-1) et W (ATCC9637).
Le plasmide recombinant peut être introduit dans le microorganisme selon les méthodes connues aussi bien par des méthodes chimiques : transformation avec Cadiz (J. Sambrook and DW Russell Molecular Cloning, a laboratory Manual Volumes 1,2 and 3,3rd edition, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press) ou par des méthodes physiques, notamment par électroporation (Electroporation Protocols for Microorganisms, edited by JA Nickoloff in Methods in Molecular Biology, vol. 47,1995, Humana Press Inc).
On peut introduire le plasmide recombinant dans le microorganisme, par exemple, selon le protocole suivant. Le microorganisme hôte, de préférence, E.
Coli, est cultivé de manière classique, en milieu liquide comprenant par exemple : extrait de levure, tryptone, chlorure de sodium. (milieu LB commercialisé par Difco).
Puis, le microorganisme est rendu perméable par simple incubation à basse température (par exemple 0OC), en présence de chlorure de calcium (par exemple 50 mM). Après incubation au froid pendant en général 1 heure, les plasmides sont mis en contact avec les microorganismes, pendant une trentaine de minutes à 0 C. On effectue ensuite un choc thermique, par exemple à une
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température de 37 C à 42OC, pendant 30 à 60 secondes, puis la culture est relancée.
On obtient des clones de microorganismes ayant acquis un plasmide recombinant.
Toutefois, on préfère utiliser l'électroporation. Le microorganisme hôte, de préférence, E. Coli, est cultivé de manière classique, en milieu liquide puis les cellules sont rendues compétentes par traitement avec de l'eau refroidie (4OC) et ensuite du glycérol (par exemple à 10 %). On mélange les cellules avec le plasmide recombinant et l'on applique une tension par exemple 2,5 Kvolts durant 0,3 à 0,5 secondes et l'on relance la culture.
On sélectionne la souche E Coli recombinante par leur résistance aux antibiotiques (tétracycline, streptomycine) qui sont introduits dans le milieu de culture.
On obtient l'inoculum qui est utilisé pour ensemencer un milieu de fermentation comprenant une source de carbone (glucose ou saccharose), une source d'azote minéral (par exemple sulfate d'ammonium) ou organique (notamment casaminoacides, thiamine-HO), sels minéraux (par exemple, sulfate de magnésium, chlorure de calcium) du tryptophane et des antibiotiques.
On effectue la fermentation aux environs de 37OC, pendant 10 à 24 heures.
On sépare la biomasse d'une manière classique par exemple par centrifugation et l'on récupère le culot cellulaire qui contient notamment le polypeptide ayant l'activité nitrilase.
Dans un autre mode de mise en oeuvre de l'invention on peut tout d'abord exprimer le polypeptide ayant l'activité nitrilase précitée et le recueillir, par exemple par lyse cellulaire, suivie, éventuellement, d'une opération de séparation et/ou de purification et/ou de concentration.
Dans une forme de réalisation préférée d'une telle variante, on peut prévoir de stabiliser ledit polypeptide, soit encore intégré au microorganisme d'expression, soit sous forme séparée, par différents moyens de stabilisation, notamment par réticulation, ou par immobilisation, typiquement dans une matrice de polymère naturel ou synthétique, par exemple une matrice polyacrylamide.
Conformément au procédé de l'invention, on effectue l'hydrolyse du nitrile racémique, en présence de l'enzyme constituée par le polypeptide tel que défini.
De préférence, le procédé d'hydrolyse selon l'invention est utilisé dans des conditions permettant d'obtenir rapidement un maximum d'acide optiquement actif, de préférence dans une durée inférieure à 24 heures, de préférence entre 4 et 20 heures, de façon à permettre à l'enzyme d'exercer son activité.
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Dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de l'invention, la masse réactionnelle comprend jusqu'à 1 molli de substrat.
Les microorganismes exprimés en poids de cellules sèches sont présents à raison de 1 à 40 g/l, de préférence, de 5 à 30 g/l.
De façon avantageuse, l'hydrolyse est mise en oeuvre à un pH situé avantageusement entre 7 et 9.
Afin d'obtenir le pH souhaité, on peut se référer à ce qui est décrit dans la littérature, notamment dans l'ouvrage de Rex. M. C. Davison et al, [Data for Biochemical Research, 3ème édition, Oxford Science Publication, 1986, p. 432].
Dans le procédé de l'invention, on fait appel aux moyens classiques utilisés, en particulier à un tampon borate.
Le pH désiré est ajusté avec de la soude ou un tampon de bicarbonate de sodium à la concentration adéquate pour obtenir le pH voulu à la température de fonctionnement.
D'un point de vue pratique, le procédé de l'invention est simple à mettre en oeuvre.
Dans le milieu tamponné amené au pH adéquate, on introduit sous agitation, le substrat, et l'enzyme sous forme isolée ou apportée par les cellules du microorganisme, de préférence, E. Coli recombinant.
Figure img00110002
On chauffe à une température variant avantageusement entre 10 C et 70OC, de préférence, entre 20 oC et 40OC.
On maintient la température pendant une durée variant le plus souvent entre 4 heures et 20 heures.
En fin de réaction, on obtient l'acide carboxylique optiquement actif.
Il est récupéré d'une manière classique selon les techniques couramment utilisées.
On peut, éventuellement, procéder à une extraction de l'acide carboxylique optiquement actif finalement obtenu, de préférence après élimination des éléments et corps bactériens, par exemple par filtration.
Cette extraction peut être effectuée de préférence à l'aide d'un solvant, notamment le tert-butylméthyléther, selon une technique connue de l'homme du métier.
Le procédé de l'invention est très intéressant car il permet d'obtenir par
Figure img00110003

hydrolyse du mélange racémique (R-2-chtoromandétonitrite, t'acide )-2- chloromandélique avec un bon rendement et une très bonne pureté optique
Les exemples figurant ci-après sont présentés à titre illustratif et ne sauraient en aucun cas limiter la présente invention.
<Desc/Clms Page number 12>
Figure img00120001
Description des annexes : La séquence SEQ ID n 1 annexée représente la séquence de nucléotides de la nitrilase sauvage NitB d'Alcaligenes faecalis publiée par M. Kobayashi et al, [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993,90, 247-251].
La séquence SEQ ID no2 est la séquence d'acides aminés correspondante.
La séquence SEQ ID no3 représente la séquence de nucléotides de la nitrilase mutée NitB* d'Alcaligenes faecalis.
La séquence SEQ ID n 4 est la séquence d'acides aminés correspondante.
L'alanine en position160 a été remplacée par la glycine et la cystéine en position 162 a été remplacée par l'asparagine.
La figure 1 annexée représente le plasmide utilisé pour la production de l'activité enzymatique de la nitrilase. Ptrp : promoteur tryptophane ; RBScil : le site de fixation du ribosome provenant du phage , ; nitB* : gène muté de la nitrilase ; Tc : gène résistance à la tétracycline, T : terminator de transcription ; ORI : origine de réplication.
Les techniques mises en oeuvre sont les techniques utilisées classiquement par l'Homme du métier dans le domaine de la biologie moléculaire et la microbiologie. On peut se référer notamment aux auteurs tels que Ausubel et al, [Current Protocols in Molecular Biology, John Willey and Sons, New York (1987)], Maniatis et al [Molecular Cloning : a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)], Coligan et al [Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Inc (1997)].
Exemple 1 :
Obtention du gène NitB* :
Deux mutations ponctuelles (substitution d'Ala-160 par Gly et de Cys-162 par Asn) ont été introduites par mutagenèse dirigée selon des conditions standards de PCR, en utilisant l'ADN de la nitrilase native d'Alcaligenes faecalis comme matrice.
Deux amorces complémentaires portant lesdites mutations ont été synthétisées : 5'-ccagcagttcaggccaccga-3'et 5'-tcggtgcctgaactgctgg-3'.
Les caractères en gras indiquent les points de mutation.
<Desc/Clms Page number 13>
Figure img00130001
Le mutant du gène NitB a été obtenu après trois PCR.
Les deux premières PCR ont permis d'obtenir les fragments allant de 1 o 492 et de 472 > 1071 avec les deux mutations : gcc (Ala)- ggc (Gly) et tgc (Cys) aac(Asn).
Ces deux fragments ont servi de matrice pour la troisième PCR afin d'amplifier la séquence complète avec les amorces contenant le début et la fin de la séquence de l'ADN natif.
On obtient la séquence du gène NitB* dans les conditions réactionnelles suivantes :
Figure img00130002

- 0, 2 ug de NitB sauvage comme matrice, - 0, 5 uM de chaque dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), - 0, 5 uM de chaque amorce, - 1 unité de vent DNA polymerase dans 100 mi (volume total) de 1X ThermoPol tampon dont la composition est la suivante : 10 mM KCI, 10 mM (NH4) 2SO4, 20 mM Tris (trihydroxyméthylaminométhane)-HCI pH 8, 8, 2 mM MgSO4 et 0. 1 % Triton X-100 (polyéthylèneglycol p-isoctylphényléther).
On isole le gène muté NitB* en le déposant sur du gel agarose.
On sépare les fragments d'ADN muté par électrophorèse.
On isole le fragment contenant NitB* et l'on l'extrait du gel d'une manière classique (traitement Nal et purification sur colonne).
Introduction du gène NitB* dans un plasmide :
Le gène NitB* est introduit dans le plasmide en utilisant la DNA ligase.
La ligation du gène avec le plasmide est obtenu en mélangeant le produit de PCR avec le plasmide préalablement digéré avec les enzymes de restriction (rapport molaire 1 : 3), 1 l de T4 DNA ligase et 2 l de 10 x tampon de ligation dont la composition est la suivante : 660 mM Tris (trihydroxyméthylaminométhane)-HCI pH 7,5, 50 mM MgCb, 10 mM dithioérythrol et 10 mM ATP.
Le volume total est ajusté à 20 ml avec de l'eau stérile et le mélange est incubé durant la nuit à 16OC.
Le mélange de ligation est en suite dialysé pendant 1 h.
Introduction du plasmide recombinant dans E. Coli :
1 l du mélange précédemment séparé est introduit dans 40 sur de cellules électro-compétentes d'E. coli en appliquant 2,5 kvolts de capacitance et 200 Q de resistance.
<Desc/Clms Page number 14>
Figure img00140001
Après le choc électrique, on ajoute 1 ml du milieu riche (SOC contenant bactotryptone 2 g/100 ml, extrait de levure 0, 5 g/100 ml, NaCI 10 mM, KCI 2,5 mM, MgCh 10 mM, glucose 0.4 %) et on incube à 37 oC, pendant 1 h et ensuite, on étale sur les boites de Pétri contenant le milieu LB comprenant de l'agar et des antibiotiques.
Exemple 2 :
Culture de la souche exprimant l'enzyme NitB* :
La souche recombinante E. Coli contenant la séquence codante SEQ ID no3 et portée par le plasmide représenté dans la figure 1, est cultivée en aérobie dans le milieu décrit ci dessous à 30"C pendant 24 heures.
Le milieu de culture permettant la production de la nitrilase est le milieu M9 additionné de : - Glucose 4 g - Casamino acides 4 g - Thiamine, HCI 0, 010 g - MgS04, 7 H2O 0,1 mmol - CaCt2, 2 H20 0,1 mmol - Streptomycine 0,05 g - Tétracycline 0, 012 g - Eau distillée 1 litre - pH 6,8
Le milieu est ensemencé à 1 % avec une préculture composée d'un milieu LB additionné des antibiotiques indiqués ci-dessus et incubée 17 heures à 30OC.
La biomasse obtenue est de 1,5 gll exprimée en cellules sèches.
Les cellules obtenues sont lavées par de l'eau physiologique.
Exemple 3 :
Synthèse de l'acide (R)-2-chloromandélique :
Les cellules obtenues selon le mode d'obtention décrit dans l'exemple 2 sont suspendues dans un tampon Borate 100 mM pH 8,5 à une concentration cellulaire comprise entre 10 et 40 g de matières sèches par litre.
A 35OC, le 2-chloromandélonitrile est ajouté par pulse jusqu'à ce que les cellules n'aient plus une activité suffisante.
Après complète hydrolyse du substrat, les cellules sont séparées par centrifugation ; le surnageant est acidifié et l'acide formé extrait avec du tertbutylméthyléther (MTBE).
<Desc/Clms Page number 15>
Le solvant organique est évaporé et le solide obtenu analysé par chromatographie liquide sur colonne chirale [colonne Chiracel OF 250 x 4,6 mm ;
Figure img00150001

Daicel chemical industries LTD ; é ! uant heptane/isopropano !/TFA 90/10/0, 1 (% v/v)].
Les résultats sont présentés ci-dessous : On obtient 85 % d'acide (R)-2-chloromandélique et 15 % de 2-chloromandélamide.
L'acide (R)-2-chloromandélique a une pureté optique de 94 %.

Claims (3)

    REVENDICATIONS 1-Procédé de préparation d'un acide carboxylique a-substitué optiquement actif caractérisé par le fait qu'il consiste à effectuer l'hydrolyse d'un nitrile asubstitué racémique ou d'un mélange d'acide cyanhydrique et de l'aldéhyde correspondant, en présence d'un polypeptide à activité nitrilase résultant de l'expression de la séquence de nucléotides SEQ ID no3, puis à récupérer l'acide carboxylique a-substitué optiquement actif ainsi obtenu.
  1. 2-Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que l'on effectue l'hydrolyse enzymatique stéréosélective : - soit d'un a-hydroxynitrile racémique correspondant à la formule (1)
    Figure img00160001
    dans ladite formule (1) : - Ri représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, - R, différent de Ri, représente un groupe hydrocarboné ayant de 1 à 20 atomes de carbone qui peut être un groupe aliphatique acyclique saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié ; un groupe carbocyclique ou hétérocyclique saturé, insaturé ou aromatique, monocyclique ou polycyclique ; un groupe aliphatique saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, porteur d'un substituant cyclique.
    - soit d'un mélange d'acide cyanhydrique HCN avec un aldéhyde de formule (II) :
    Figure img00160002
    dans ladite formule (11), R a la même signification que dans la formule (1), 3-Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que le groupe R caractérisant l'a-hydroxynitrile (1) ou l'aldéhyde correspondant (II) représente : . un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, substitué ou non, ayant de 1 à 10, de préférence, de 1 à 6 atomes de carbone, . un groupe alkoxy, linéaire ou ramifié, substitué ou non, ayant de 1 à 10, de préférence, de 1 à 6 atomes de carbone,
    <Desc/Clms Page number 17>
    Figure img00170001
    . un groupe alcényle linéaire ou ramifié, substitué ou non ayant de 2 à 10, de préférence, de 2 à 6 atomes de carbone, . un groupe cycloalkyl ayant de 3 à 6 atomes de carbone, . un groupe aryle ayant de 6 à 12 atomes de carbone, de préférence un groupe phényle ou naphtyl, . un groupe alkylaryl ayant de 7 à 12 atomes de carbone, de préférence un groupe benzyle ou un groupe phényléthyle, . un groupe aryloxy ayant de 6 à 12 atomes de carbone, . un hétérocycle, saturé, insaturé ou aromatique, à base d'oxygène, d'azote et/ou de soufre, et contenant de 5 ou 6 atomes.
    4-Procédé selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisé par le fait que le groupe Ri caractérisant l'a-hydroxynitrile (1) ou l'aldéhyde correspondant (II) représente un atome d'hydrogène.
    5-Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que l'a- hydroxynitrile répond à la formule (la) :
    Figure img00170002
    dans laquelle : - X, en position ortho, méta ou para et représente : . un atome d'hydrogène, . un atome d'halogène, . un groupe alkyle linéaire ou ramifié, ayant de 1 à 4 atomes de carbone, . un groupe alkoxy ou thioéther linéaire ou ramifié ayant de 1 à 4 atomes, . un groupe hydroxyle, . un groupe thiol, . un groupe amino, . un groupe nitro, . un groupe phényle, . un groupe phénoxy.
    <Desc/Clms Page number 18>
    Figure img00180001
  2. 6-Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que l'ochydroxynitrile répond à la formule (la) dans laquelle X représente un atome d'halogène et de préférence, un atome de chlore.
    7-Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que l'acide carboxylique préparé est un acide R-chloromandélique, et de préférence l'acide (R)-2-chloromandélique, obtenu à partir du chloromandélonitrile correspondant, ou du mélange de l'aldéhyde chloromandélique correspondant avec l'acide cyanhydrique.
    8-Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le polypeptide utilisé comprend la séquence d'acides aminés SEQ ID no4.
    9-Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le polypeptide utilisé est obtenu par mutagénèse du gène NitB de la souche Alcaligenes, de préférence, Alcaligenes faecalis.
    10-Procédé selon l'une des revendications 1 et 9, caractérisé par le fait que polypeptide mis en oeuvre diffère du polypeptide produit par la souche sauvage Alcaligenes faescalis en ce sens que l'alanine en position 160 est remplacée par la glycine et la cystéine en position 162 est remplacée par l'asparagine.
    11-Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé par le fait que que le nitrile, ou le mélange de l'aldéhyde correspondant avec l'acide cyanhydrique, est mis en contact avec un système d'expression convenable, notamment une bactérie, une levure ou un champignon, contenant la séquence codante SEQ ID no3.
    12-Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que que ledit système d'expression est une souche E. Coli recombinante contenant la séquence codante SEQ ID n 3.
    13-Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que que la souche E. Coli recombinante contient le plasmide décrit dans la figure 1.
    14-Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que le polypeptide à activité nitrilase est préalablement exprimé et recueilli, notamment par lyse cellulaire, avant d'être utilisé pour l'hydrolyse.
    <Desc/Clms Page number 19>
    Figure img00190001
  3. 15-Procédé selon la revendication 14, caractérisé par le fait que le polypeptide à activité nitrilase, une fois exprimé et recueilli, est soumis à une opération de séparation et/ou de purification et/ou de concentration.
    16-Procédé selon l'une des revendications 14 et 15, caractérisé par le fait que le polypeptide obtenu est stabilisé par réticulation ou par immobilisation dans une matrice de polymère naturel ou synthétique, de préférence, une matrice polyacrylamide.
    17-Procédé selon l'une revendications 1 à 16, caractérisé par le fait que l'étape d'hydrolyse est conduite en une durée inférieure à 24 heures, de préférence, entre 4 et 20 heures.
    18-Procédé selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé par le fait que l'étape d'hydrolyse est réalisée à un pH situé entre 7 et 9, à une température variant entre 10 C et 70OC, de préférence, entre 20 oC et 40OC.
    19-Procédé selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé par le fait que l'étape d'hydrolyse est suivie d'une étape d'élimination des éléments et corps bactériens, notamment par filtration.
    20-Procédé selon l'une des revendications 1 à 19, caractérisé par le fait que l'acide optiquement actif obtenu est soumis de plus à une étape d'extraction, de préférence à l'aide d'un solvant, notamment le tert-butylméthyléther (MTBE).
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