EP1025255A1 - Procede de preparation d'un benzamide substitue - Google Patents

Procede de preparation d'un benzamide substitue

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Publication number
EP1025255A1
EP1025255A1 EP98951543A EP98951543A EP1025255A1 EP 1025255 A1 EP1025255 A1 EP 1025255A1 EP 98951543 A EP98951543 A EP 98951543A EP 98951543 A EP98951543 A EP 98951543A EP 1025255 A1 EP1025255 A1 EP 1025255A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
group
formula
substituted
substituted benzonitrile
atom
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP98951543A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Laurent Chasseau
Catherine Jourdat
Dominique Petre
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rhodia Chimie SAS
Original Assignee
Rhodia Chimie SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhodia Chimie SAS filed Critical Rhodia Chimie SAS
Publication of EP1025255A1 publication Critical patent/EP1025255A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes

Definitions

  • the present invention relates to a process for the preparation of a substituted benzamide, preferably a halogenated benzamide.
  • the invention relates more particularly to the preparation of 2,6-difluorobenzamide, by biological hydrolysis.
  • 2,6-difluorobenzamide is a known intermediate product for the preparation of insecticide products, in particular diflubenzuron (cf. GB-A- 1 324 293).
  • benzamide is obtained by hydrolysis of benzonitrile, under the action of bacteria of the genus Brevibacterium in the sense of Bergey.
  • the activity of the strain R 312 is specific to aliphatic nitriles: the activity is therefore low on benzonitrile (60 ⁇ ml / h.mg of enzyme) which makes it incompatible with industrial exploitation, in because of a productivity, very insufficient.
  • 2,6-difluorobenzamide could be hydrolyzed under the action of an enzyme produced in particular by bacteria of the genus Brevibacterium and more particularly the strain R 312 and its mutant A4.
  • the subject of the present invention is a process for the preparation of a substituted benzamide by enzymatic hydrolysis of a substituted benzonitrile, characterized in that the substituted benzonitrile is subjected to hydrolysis in the presence of a tetrameric enzyme of structure ⁇ ⁇ 2, having at least 50% homology, preferably greater than 80%, with the following amino acid sequence: - chain ⁇
  • valine V
  • leucine L
  • isoleucine I
  • proline P
  • phenylalanine F
  • tyrosine Y
  • tryptophan W
  • serine S
  • threonine T
  • cysteine C
  • methionine M
  • asparagine N
  • glutamine Q
  • aspartate D
  • glutamate E
  • lysine K
  • substituted used in the present text means that in the starting substrate of the benzonitrile type, at least one of the 5 hydrogen atoms of the aromatic ring is replaced by an atom other than a hydrogen atom.
  • It may in particular be a halogen, carbon, oxygen or nitrogen atom.
  • 2,6-difluorobenzonitrile can be prepared by biological hydrolysis, in a completely satisfactory manner.
  • the hydrolysis of a substituted benzonitrile is carried out in the presence of an enzyme having the amino acid sequence defined above. It is possible according to the invention to use both the cells of microorganisms comprising the enzyme as preparations of the acellular enzyme but in this case, it is necessary to carry out the extraction of the enzyme ce which can lead to additional production costs.
  • enzyme in the present text, both the cells expressing the enzyme and the isolated enzyme will be designated.
  • the cells are involved rather than the isolated enzyme.
  • the enzyme as defined can come from microorganisms of the genus Brevibacterium and more specifically from the strain Brevibacterium R 312 or its mutant Brevibacterium sp A4.
  • strains R 312 and its mutant A4 are known and described in particular in FR-A-2 294 999 and the thesis of Nicolas Bernet presented at the ijkelles obviouslye agronomique de adjoin on June 30, 1989. They are deposited at the Centralbureau voor Shimmelcultures at Netherlands under numbers CBS 71773 for R 312 and CBS LMD 792 for A4
  • the mutant is characterized by the fact that this strain has lost the ability to hydrolyze most of the amides while retaining the same hydratasic nitrile activity as the wild strain Brevibacterium sp. R 312.
  • the Brevibacterium strain is obtained by culture in a medium comprising a carbon source such as glucose, phosphates, ammonium, magnesium and ferrous ions.
  • the medium can be enriched with a source of organic nitrogen such as yeast extract or peptones.
  • the invention applies preferably to the hydrolysis of 2,6-difluorobenzonitrile but it is also possible to use in the process of the invention other substrates of substituted benzonitrile type more particularly corresponding to formula (I) next :
  • Ri represents a hydrogen atom; a halogen atom, preferably a fluorine, chlorine or bromine atom or a haloalkyl group, preferably perfuoroalkyl or any other R group,.
  • R2 identical to or different from R-
  • n is an equal number from 1 to 4.
  • the substrates which are preferred in the implementation of the process of the invention and which are halogenated benzonitriles correspond more particularly to the formula (la)
  • R- ⁇ represents a halogen atom, preferably a fluorine, chlorine or bromine atom; a haloalkyl group, preferably perfuoroalkyle,.
  • n is an equal number from 1 to 4.
  • R1 and R2 may represent a halogen atom but also a haloalkyl group preferably having from 1 to 12 carbon atoms and from 1 to 7 halogen atoms.
  • Preferred groups are perhaloalkyl groups, preferably perfluoroalkyl groups having from 1 to 5 carbon atoms and preferably from 1 to 7 halogen atoms.
  • haloalkyl groups As more specific examples of haloalkyl groups, mention may be made of a fluoroalkyl group such as fluoromethyl, difluoromethyl, trifluoromethyl, fluoroethyl, 1, 1, 1 -trifluoroethyl, pentafluoroethyl, fluoropropyl, fluorobutyl, trifluoroamyl.
  • a fluoroalkyl group such as fluoromethyl, difluoromethyl, trifluoromethyl, fluoroethyl, 1, 1, 1 -trifluoroethyl, pentafluoroethyl, fluoropropyl, fluorobutyl, trifluoroamyl.
  • the trifluoromethyl group is preferred.
  • the groups R ⁇ and R 2 and in the formula (la) the group R2 can take other meanings as symbolized by R.
  • the group R can be of any nature insofar as it does not interfere with the hydrolysis reaction.
  • the compounds preferably used are those which correspond to formula (I) or (la) in which R- ⁇ represents a fluorine or chlorine atom or a trifluoromethyl group and R 2 , identical or different from R ⁇ represents an atom hydrogen; a fluorine or chlorine atom or a trifluoromethyl group.
  • the preferred substrates are 2,6-diflurobenzonitrile and m-trifluoromethylbenzonitrile.
  • the hydrolysis of a substituted benzonitrile preferably 2,6-difluorobenzonitrile, is carried out in the presence of the enzyme as defined.
  • reaction is carried out in an aqueous buffered medium.
  • reaction mass comprises up to 3 mol / l of benzonitrile substrate.
  • the microorganisms expressed by weight of dry cells are present in an amount of 1 to 50 g / l, preferably from 2 to 10 g / l.
  • the reaction medium is buffered: the pH advantageously varying between 6 and 8, and more preferably it is around 7.
  • the desired pH is adjusted with sodium hydroxide or a sodium bicarbonate buffer to the appropriate concentration to obtain the desired pH at operating temperature.
  • the method of the invention is simple to implement.
  • the substrate and the enzyme are introduced, with stirring, in an isolated form or provided by the microorganism cells.
  • the temperature is maintained for a period most often between 4 hours and 20 hours.
  • the benzamide substituted preferably halogen, is obtained in precipitated form.
  • the advantage of the process of the invention is that it makes it possible to obtain a benzamide according to a hydrolysis process which does not produce salts and which makes it possible to achieve good productivity.
  • the microorganism Brevibacterium sp. A4 is cultivated in the following medium allowing the production of nitrile hydratase:
  • Aqueous solutions of the various components are prepared separately and sterilized by autoclaving with the exception of the iron and thiamine solutions which are sterilized by filtration (Milllipore membrane, type HA, 0.45 ⁇ m).
  • Brevibacterium sp.A4 contain this basic medium and are supplemented with Difco ⁇ yeast extract and glucose.
  • the cultures of Brevibacterium sp.A4 are carried out in Erlenmeyer flasks filled to one fifth of their volume so as to ensure good aeration of the culture media. These are subjected to agitation on an oscillating table of
  • gelatinized dishes with Columbia medium are inoculated from a stock of cells in liquid nitrogen.
  • a first preculture is carried out from the dishes in 50 ml of medium.
  • the second crop is sown. It will be in an exponential growth phase fifteen hours later.
  • Regulation takes place by opening the air inlet valve with constant agitation.
  • the maximum valve opening is set at 1.5 wm to avoid problems with excess ventilation.
  • the cells are centrifuged, washed with physiological water or with 20% glycerol physiological water and again centrifuged. Cells can be frozen in two different ways.
  • the cells are taken up in 0.1 mol phosphate buffer, also distributed in eppendorf tubes and then stored at -30 ° C.
  • the cell pellet can be frozen directly in liquid nitrogen and stored in the freezer at -80 ° C.
  • the agitation is increased to 500 rpm to suspend it and to break the large crystals.
  • the cell suspension is added and the stirring is fixed at 500-600 rpm.
  • the reactor is closed during the experiment.
  • the container used is a perfectly stirred reactor with a stirring system comprising blades and counter blades.
  • the temperature is regulated by a thermostatically controlled bath.
  • the amide in powder form at different concentrations is initially introduced into a 0.1 mol / l phosphate buffer, pH 7, to which 5.3 g / l of Brevibacterium sp.A4 dry cells are added.
  • the activity of the Brevibacterium strain is little affected in the presence of high concentrations of reaction product (DFBZ).
  • the strain or enzyme is brought into contact with DFBN (500 to 900 mmol / l), 1 hour at 30 ° C., with stirring.
  • the m-trifluoromethylbenzonitrile is added to the phosphate buffer at the rate of 300 mmol / l.
  • the stirring is fixed at 500-600 rpm.
  • the temperature of the reaction is 30 ° C.

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Abstract

La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un benzamide substitué de préférence d'un benzamide halogéné. L'invention vise plus particulièrement la préparation du 2,6-difluorobenzamide, par hydrolyse biologique. L'invention fournit un procédé de préparation d'un benzamide substitué par hydrolyze enzymatique d'un benzonitrile substitué qui est caractérisé par le fait que l'on soumet le benzonitrile substitué à une hydrolyse en présence d'une enzyme tétramérique de structure α2 β2 présentant une séquence définie d'acides aminés.

Description

PROCEDE DE PREPARATION D'UN BENZAMIDE SUBSTITUF.
La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un benzamide substitué de préférence d'un benzamide halogène. L'invention vise plus particulièrement la préparation du 2,6-difluorobenzamide, par hydrolyse biologique.
Le 2,6-difluorobenzamide est un produit intermédiaire connu pour la préparation de produits insecticides, en particulier de diflubenzuron (cf. GB-A- 1 324 293).
La préparation du 2,6-difluorobenzamide selon une voie de synthèse chimique pose problème. En effet, l'hydrolyse du 2,6-difluorobenzonitrile s'effectue en milieu très acide, notamment en présence d'acide sulfurique concentré à 60 %. En dehors du fait que les rendements ne sont pas très élevés car ne dépassant pas 80 %, ce procédé ne donne pas satisfaction car il coproduit une quantité importante de sel qui le rend polluant et qui induit une purification difficile et onéreuse. De plus, une étape de neutralisation s'avère nécessaire en raison de la quantité importante d'acide sulfurique mise en oeuvre. Par ailleurs, on a décrit selon FR-A-2 294 999, un procédé d'hydrolyse d'amides par hydrolyse biologique. Ainsi, le benzamide est obtenu par hydrolyse du benzonitrile, sous l'action de bactéries de genre Brevibacterium au sens de Bergey. Il est à noter que l'activité de la souche R 312 est spécifique des nitriles aliphatiques : l'activité est donc faible sur le benzonitrile (60 μml/h.mg d'enzyme) ce qui la rend incompatible avec une exploitation industrielle, en raison d'une productivité, très insuffisante.
Contre toute attente, il a été trouvé que le 2,6-difluorobenzamide pouvait être hydrolyse sous l'action d'une enzyme produite en particulier par les bactéries du genre Brevibacterium et plus particulièrement la souche R 312 et son mutant A4.
Précisément, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un benzamide substitué par hydrolyse enzymatique d'un benzonitrile substitué caractérisé par le fait que l'on soumet le benzonitrile substitué à une hydrolyse en présence d'une enzyme tétramérique de structure αι< β2, ayant au moins 50 % d'homologie, de préférence, supérieure à 80 %, avec la séquence d'acides aminés suivantes : - chaîne α
MSVTIDHTTENAAPAQAPVSDRAWALFRALDGKGLVPDGYVEGWKKTFEEDFSPRRGAEL60 VARAWTDPEFRQLLLTDGTAAVAQYGYLGPQGEYIVAVEDTPTLKNVIVCSLCSCTAWP 119 ILGLPPTWYKSFEYRARWREPRKVLSEMGTEIASDIEIRVYDTTAETRYMVLPQRPAG 178 TEGWSQEQLQEIVTKDCLIGVAIPQVPTV 207
- chaîne β
MDGVHDLAGVC 3TOKVPHTVNADIGPTFΗAEWEHLPYSLJV1FAGVAELGAFSVDEVRYV 58 VERMEPRHY MTPYYERYVIGVATLMVEKGILTQDELESLAGGPFP 104 LSRPSESEGRPAPVEΓΠTFEVGQRVRVRDEYVPGHIRMPAYCRGRVGTI 153 SHRTTEKWPFPDAIGHGRNDAGEEPTYHVKFAAEELFGSDTDGGSVWDLFEGYLEPAA 212
Dans le présent texte, les abréviations des acides aminés correspondent à celles couramment utilisées dans ce domaine technique et notamment à celles mentionnées dans l'ouvrage de Albert L. Lehinger et al, Principes de Biochimie, 2ème édition, Médecine-Sciences Flammarion, p. 113.
Elles signifient plus précisément : glycine ≈ G, alanine = A, valine = V, leucine = L, isoleucine = I, proline = P, phénylalanine = F, tyrosine = Y, tryptophane = W, serine = S, thréonine = T, cystéine = C, méthionine = M, asparagine = N, glutamine = Q, aspartate = D, glutamate = E, lysine = K, arginine = R, histidine = H.
Le terme "substitué" utilisé dans le présent texte, signifie que dans le substrat de départ de type benzonitrile, au moins l'un des 5 atomes d'hydrogène du cycle aromatique est remplacé par un atome autre qu'un atome d'hydrogène.
Il peut s'agir en particulier d'un atome d'halogène, de carbone, d'oxygène ou d'azote.
Selon la présente invention, le 2,6-difluorobenzonitrile peut être préparé par hydrolyse biologique, de manière tout à fait satisfaisante.
Compte tenu du fait que dans l'état de la technique, l'hydrolyse enzymatique du benzonitrile apparaissait comme difficile, il était à craindre que le 2,6- difluorobenzonitrile ne s'hydrolyse pas biologiquement.
Il ne pouvait en aucun cas, être prédit qu'il serait possible d'effectuer l'hydrolyse du 2,6-difluorobenzonitrile et que les résultats d'hydrolyse seraient très nettement supérieurs.
Conformément au procédé de l'invention, on effectue l'hydrolyse d'un benzonitrile substitué de préférence, du 2,6-difluorobenzonitrile en présence d'une enzyme ayant la séquence d'acides aminés définie ci-dessus. Il est possible selon l'invention de mettre en oeuvre aussi bien les cellules de micro-organismes comprenant l'enzyme que des préparations de l'enzyme acellulaire mais dans ce cas, il est nécessaire d'effectuer l'extraction de l'enzyme ce qui peut conduire à un surcoût de production. Par "enzyme", on désignera dans le présent texte, aussi bien les cellules exprimant l'enzyme que l'enzyme isolée.
D'une manière préférée, on fait intervenir les cellules plutôt que l'enzyme isolée.
L'enzyme tel que défini peut provenir de micro-organismes du genre Brevibacterium et plus précisément de la souche Brevibacterium R 312 ou de son mutant Brevibacterium sp A4.
Les souches R 312 et son mutant A4 sont connues et décrites notamment dans FR-A-2 294 999 et la thèse de Nicolas Bernet présentée à l'Ecole nationale supérieure agronomique de Montpellier le 30 Juin 1989. Elles sont déposées au Centralbureau voor Shimmelcultures au Pays Bas sous les numéros CBS 71773 pour R 312 et CBS LMD 792 pour A4
Le mutant est caractérisé par le fait que cette souche a perdu l'aptitude à hydrolyser la plupart des amides tout en conservant la même activité nitrile hydratasique que la souche sauvage Brevibacterium sp. R 312. La souche Brevibacterium est obtenue par culture dans un milieu comprenant une source de carbone telle que le glucose, des phosphates, des ions ammonium, magnésium et ferreux. Le milieu peut être enrichi avec une source d'azote organique telle que de l'extrait de levure ou des peptones.
On ne sortira pas également du cadre de la présente invention, en immobilisant l'enzyme ou la souche, par exemple sur un support tel que la silice, par agrégation ou dans un gel.
La technique d'immobilisation sur support est connue de l'Homme du métier et l'on peut se référer notamment à à l'ouvrage " Immobilization of Enzymes and
Cells" édité par Gordon F. Bickerstaff
L'invention s'applique préférentiellement à l'hydrolyse du 2,6- difluorobenzonitrile mais il est également possible de mettre en oeuvre dans le procédé de l'invention d'autres substrats de type benzonitrile substitué répondant plus particulièrement à la formule (I) suivante :
CN
dans ladite formule (I) :
. Ri représente un atome d'hydrogène ; un atome d'halogène, de préférence, un atome de fluor, chlore ou brome ou un groupe halogénoalkyle, de préférence perfuoroalkyle ou tout autre groupe R, . R2 identique ou différent de R-|, représente un atome d'hydrogène ; un atome d'halogène, de préférence, un atome de fluor, chlore ou brome ou un groupe halogénoalkyle, de préférence perfuoroalkyle ou tout autre groupe R, . au moins l'un de Ri et R2 est différent d'un atome d'hydrogène, . n est un nombre égal de 1 à 4. Les substrats qui sont préférés dans la mise en oeuvre du procédé de l'invention et qui sont des benzonitriles halogènes répondent plus particulièrement à la formule (la)
CN
dans ladite formule (la) :
. R-\ représente un atome d'halogène, de préférence, un atome de fluor, chlore ou brome ; un groupe halogénoalkyle, de préférence perfuoroalkyle, . R2 identique ou différent de R-|, représente un atome d'hydrogène ; un atome d'halogène, de préférence, un atome de fluor, chlore ou brome ou un groupe halogénoalkyle, de préférence perfuoroalkyle ou tout autre groupe R,
. n est un nombre égal de 1 à 4.
Dans la formule (I) et (la), il y a présence d'un ou de plusieurs groupes R-| et R2, qui peuvent être en position ortho-, para- ou meta par rapport au groupe nitrile. Les groupes R^ et R2 sont préférentiellement en position ortho par rapport au groupe nitrile.
Ri et R2 peuvent représenter un atome d'halogène mais également un groupe halogénoalkyle ayant de préférence de 1 à 12 atomes de carbone et de 1 à 7 atomes d'halogène. Les groupes préférés sont des groupes perhalogénoalkyle, de préférence perfluoroalkyle ayant de 1 à 5 atomes de carbone et de préférence de 1 à 7 atomes d'halogène.
Comme exemples plus particuliers de groupes halogénoalkyle, on peut citer un groupe fluoroalkyle tel que fluorométhyle, difluorométhyle, trifluorométhyle, fluoroéthyle, 1 ,1 ,1 -trifluoroéthyle, pentafluoroéthyle, fluoropropyle, fluorobutyle, trifluoroamyle. Le groupe trifluorométhyle est préféré.
Dans la formule (I), les groupes R^ et R2 et dans la formule (la) le groupe R2 peut prendre d'autres significations telles que symbolisées par R. Le groupe R peut être d'une nature quelconque dans la mesure où il ne gêne pas la réaction d'hydrolyse.
On peut citer par exemple, un groupe hydroxyle : un groupe alkyle ou alkoxy ayant de 1 à 6 atomes de carbone, de préférence, de 1 à 4 atomes de carbone ; un groupe amino ou un groupe amino substitué par un ou deux groupes alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone, de préférence, de 1 à 4 atomes de carbone.
Les composés mis en oeuvre préférentiellement sont ceux qui répondent à la formule (I) ou (la) dans lesquelles R-\ représente un atome de fluor ou de chlore ou un groupe trifluorométhyle et R2, identique ou différent de R^ représente un atome d'hydrogène ; un atome de fluor ou de chlore ou un groupe trifluorométhyle.
Comme exemples de substrats répondant à la formule (I) ou (la) susceptibles d'être mis en oeuvre dans le procédé de l'invention, on peut citer entre autres :
- l'o-hydroxybenzonitrile, - le p-hydroxybenzonitrile,
- l'o-méthoxybenzonitrile,
- le p-méthoxybenzonitrile,
- l'o-bromobenzonitrile,
- l'o-chlorobenzonitrile, - le p-chlorobenzonitrile,
- le m-chlorobenzonitrile,
- le m-trifluorométhylbenzonitrile
- le 2,6-dichlorobenzonitrile,
- le 2,6-difluorobenzonitrile, - le p-méthylbenzonitrile,
- le p-aminobenzonitrile.
Parmi les composés répondant à la formule (I) ou (la), les substrats préférés sont le 2,6-diflurobenzonitrile et le m-trifluorométhylbenzonitrile.
Conformément au procédé de l'invention, on réalise l'hydrolyse d'un benzonitrile substitué, de préférence, du 2,6-difluorobenzonitrile en présence de l'enzyme telle que définie.
La réaction s'effectue en milieu aqueux tamponné. Dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de l'invention, la masse réactionnelle comprend jusqu'à 3 mol/1 de substrat benzonitrile.
Les micro-organismes exprimés en poids de cellules sèches sont présents à raison de 1 à 50 g/l, de préférence, de 2 à 10 g/l. Le milieu de la réaction est tamponné : le pH variant avantageusement entre 6 et 8, et plus préférentiellement il se situe aux environs de 7.
Afin d'obtenir le pH souhaité, on peut se référer à ce qui est décrit dans la littérature, notamment dans l'ouvrage de Rex. M. C. Davison et al, Data for Biochemical Research, 3ème édition, Oxford Science Publication, 1986, p. 432. Dans le procédé de l'invention, on fait appel aux moyens classiques utilisés, en particulier au tampon phosphate comprenant de 1 à 500 mmol d'ions PO^ par litre de solution obtenu notamment à partir d'hydrogénophosphate de sodium et de potassium.
Le pH désiré est ajusté avec de la soude ou un tampon de bicarbonate de sodium à la concentration adéquate pour obtenir le pH voulu à la température de fonctionnement.
D'un point de vue pratique, le procédé de l'invention est simple à mettre en oeuvre.
Dans le milieu tamponné amené au pH adéquate, on introduit sous agitation, le substrat, et l'enzyme sous forme isolée ou apportée par les cellules de micro-organisme.
On chauffe à une température variant avantageusement entre 10°C et 40°C, de préférence entre 10°C et 30°C.
On maintient la température pendant une durée variant le plus souvent entre 4 heures et 20 heures.
En fin de réaction, on obtient le benzamide substitué de préférence halogène sous forme précipitée.
Il est récupéré d'une manière classique selon les techniques classiques de séparation liquide/solide, de préférence, par filtration. On peut si souhaité effectuer une purification à l'aide d'un solvant organique approprié.
L'avantage du procédé de l'invention est qu'il permet d'obtenir un benzamide selon un procédé d'hydrolyse qui ne produit pas de sels et qui permet d'atteindre une bonne productivité.
Les exemples qui suivent, illustrent l'invention sans toutefois la limiter. Dans les exemples, les abréviations ont la signification suivante : - DFBN = 2,6-difluorobenzonitrile - DFBZ = 2,6-diflurorobenzamide
- CS = cellules sèches.
Exemple 1 Production des cellules
Le micro-organisme Brevibacterium sp. A4 est cultivé dans le milieu suivant permettant la production de la nitrile hydratase :
- Tampon (Na2HPθ4/KH2Pθ4) pH 7 50 mmol/l
- FeSθ4, 7H2θ 0,01 g/l - MgSO H2O 0,5 g/l
- Chlorhydrate de thiamine 0,002 g/l - Glucose 10 g/l
- NH4CI 5 g/l
Des solutions aqueuses des différents composants sont préparées séparément et stérilisées par autoclavage à l'exception des solutions de fer et de thiamine qui sont stérilisées par filtration (membrane Milllipore, type HA, 0,45μm).
Les milieux préparés pour la culture haute densité cellulaire de
Brevibacterium sp.A4 contiennent ce milieu de base et sont additionnés d'extrait de levure Difco© et glucose. Les cultures de Brevibacterium sp.A4 sont effectuées dans des erlenmeyers remplis au cinquième de leur volume de façon à assurer une bonne aération des milieux de culture. Ceux-ci sont soumis à une agitation sur table oscillante de
150 rpm à 28°C (5 cm d'amplitude).
Tout d'abord, des boîtes gélosées avec un milieu Columbia (Difco) sont ensemencées à partir de stock de cellules dans l'azote liquide. Une première préculture est réalisée à partir des boîtes dans 50 ml de milieu. Environ vingt heures plus tard, la deuxième culture est ensemencée. Celle-ci sera en phase exponentielle de croissance quinze heures plus tard.
Pour obtenir des quantités de cellules plus importantes, leur production a été effectuée en fermenteur de 2 litres. Les paramètres de culture qui ont été fixés sont les suivants : - pH 7
- régulation de la pression partielle en oxygène : 50%
La régulation s'effectue par l'ouverture de la vanne d'arrivée d'air à une agitation constante. Le maximum d'ouverture de vanne est réglé sur 1 ,5 wm pour ne pas poser des problèmes d'excès d'aération.
- agitation : 300 rpm au départ (augmentation en cours de fermentation).
- Température : 28°C. Récupération des cellules :
Les cellules sont centrifugées, lavées à l'eau physiologique ou à l'eau physiologique glycérolée 20% et de nouveau centrifugées. Les cellules peuvent être congelées de deux manières différentes.
- les cellules sont reprises par du tampon phosphate 0,1 mol, distribuées également dans des tubes eppendorf puis stockées à -30°C.
- le culot cellulaire peut être congelé directement dans l'azote liquide et stocké dans le congélateur à -80°C.
Evaluation du poids sec :
Une quantité de cellules d'un volume donné de culture, qui a été lavée puis suspendue dans de l'eau distillée, est chauffée à 100°C pendant une nuit dans un four pasteur pour enlever toute trace d'eau. On obtient le poids sec des cellules du volume considéré.
Exemple 2 :
Production de 2.6-difluorobenzamide
Le tampon phosphate 0,1 mol pH 7 préparé selon Rex. M. C. Davison et al, Data for Biochemical Research, 3ème édition, Oxford Science Publication, 1986, p. 432, est ajouté dans le réacteur.
Le DFBN liquide à 35°C est rajouté, cristallise dans le milieu en se collant au fond du réacteur.
On augmente l'agitation à 500 rpm pour le mettre en suspension et pour casser les gros cristaux.
Au temps t≈O, la suspension cellulaire est ajoutée et l'agitation est fixée à 500-600 rpm.
Le réacteur est fermé pendant l'expérience.
Le récipient utilisé est un réacteur parfaitement agité avec un système d'agitation comprenant pales et contre-pales. La régulation de température se fait grâce à un bain thermostaté.
Les conditions opératoires et résultats sont répertoriés dans le tableau (I) : Tableau (I):
La meilleure activité est obtenue pour une concentration en cellules sèches de 2,5 g/l ou 5 g/l pour une durée de réaction de 6 heures. Pour atteindre une concentration en amide de 1 ,5 mol sur 6 heures dans un milieu à pH contrôlé, 5 g/l de cellules sèches sont nécessaires.
Exemple 3 : Influence du produit de la réaction
L'amide sous forme de poudre à différentes concentrations, est initialement introduit dans un tampon phosphate 0,1 mol/l, pH 7, auquel est ajouté 5,3 g/l de cellules sèches de Brevibacterium sp.A4.
L'activité d'hydrolyse du DFBN (815 mmol initialement) en présence de 0.5, 1 , 2, 3 ou 4 mol/l de DFBZ est mesurée sur 1 heure à 30°C et est présentée dans le tableau (II).
Tableau (II)
L'activité de la souche Brevibacterium est peu affectée en présence de concentrations élevées en produit de la réaction (DFBZ).
Exemple 4 :
Activité de l'enzvme isolé
La souche ou enzyme est mise en contact avec le DFBN (500 à 900 mmol/l), 1 heure à 30°C, sous agitation.
Les activités sont présentées dans le tableau (III) :
Tableau (III)
Exem le 5 ;
Production de 3-trifluorométhylbenzamide Le tampon phosphate 0,1 mol pH 7 préparé selon Rex. M. C. Davison et al,
Data for Biochemical Research, 3ème édition, Oxford Science Publication, 1986, p. 432, est ajouté dans un tube.
Le m-trifluorométhylbenzonitrile est ajouté dans le tampon phosphate à raison de 300 mmol/l. Au temps t=0, la suspension cellulaire (volume réactionnel final = 1 ml) est ajoutée et l'agitation est fixée à 500-600 rpm. La tempéature de la réaction est de 30°C.
En 1 heure, avec 2 g/l de cellules sèches, le nitrile est totalement hydrolyse en amide.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Procédé de préparation d'un benzamide substitué par hydrolyse enzymatique d'un benzonitrile substitué caractérisé par le fait que l'on soumet le benzonitrile substitué à une hydrolyse en présence d'une enzyme tétramérique de structure α β , ayant au moins 50 % d'homologie, de préférence, supérieure à 80 %, avec la séquence d'acides aminés suivantes :
- chaîne α
MSVTDHTTEN PAQAPVSDRAWALFRALDGKGLVPDGYVEGWKKTFEEDFSPRRGAEL60 VARAWTDPEFRQLLLTDGTAAVAQYGYLGPQGEYIVAVEDTPTLKNVIVCSLCSCTAWP 119 ILGLPPT YKSFEYRAR WREPRKVLSEMGTEIASDIEIRVYDTTAETRYMVLPQRPAG 178 TEGWSQEQLQEIVTKDCLIGVAIPQVPTV 207
- chaîne β MDGVHDLAGVQGFGKVPHTVNADIGPTFHAEWEHLPYSLMFAGVAELGAFSVDEVRYV 58 VERMEPRHYMMTPYYERYVIGVATLMVEKGILTQDELESLAGGPFP 104
LSRPSESEGRPAPVETTTFEVGQRVRVRDEYVPGHIRMPAYCRGRVGT1 153 SHRTTEKWPFPDAIGHGRNDAGEEPTYHVKFAAEELFGSDTDGGSVWDLFEGYLEPAA 212
2 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que le benzonitrile substitué répond à la formule (I) suivante :
CN
dans ladite formule (I) :
. Ri représente un atome d'hydrogène ; un atome d'halogène, de préférence, un atome de fluor, chlore ou brome ou un groupe halogénoalkyle, de préférence perfuoroalkyle ou tout autre groupe R,
. R identique ou différent de R^ représente un atome d'hydrogène ; un atome d'halogène, de préférence, un atome de fluor, chlore ou brome ou un groupe halogénoalkyle, de préférence perfuoroalkyle ou tout autre groupe R, . au moins l'un de R-| et R est différent d'un atome d'hydrogène, . n est un nombre égal de 1 à 4.
3 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que le benzonitrile substitué est un benzonitrile halogène répondant à la formule (la) suivante : dans ladite formule (la) :
. Ri représente un atome d'halogène, de préférence, un atome de fluor, chlore ou brome ; un groupe halogénoalkyle, de préférence perfuoroalkyle, . R2 identique ou différent de R^ représente un atome d'hydrogène ; un atome d'halogène, de préférence, un atome de fluor, chlore ou brome ou un groupe halogénoalkyle, de préférence perfuoroalkyle ou tout autre groupe R, . n est un nombre égal de 1 à 4.
4 - Procédé selon l'une des revendications 2 et 3 caractérisé par le fait que le benzonitrile substitué répond à la formule (I) ou (la) dans laquelle l'un ou les groupes R^ et R2, sont en position ortho, para ou meta par rapport au groupe nitrile mais de préférence, en position ortho.
5 - Procédé selon l'une des revendications 2 et 3 caractérisé par le fait que le benzonitrile substitué répond à la formule (I) ou (la) dans laquelle R-| et R2 représentent un atome d'halogène et/ou un groupe halogénoalkyle ayant de préférence de 1 à 12 atomes de carbone et de 1 à 7 atomes d'halogène.
7 - Procédé selon l'une des revendications 2 et 3 caractérisé par le fait que le benzonitrile substitué répond à la formule (I) ou (la) dans laquelle R-| et R2 représentent un groupe perhalogénoalkyie, de préférence perfluoroalkyle ayant de 1 à 5 atomes de carbone et de préférence de 1 à 7 atomes d'halogène.
8 - Procédé selon l'une des revendications 2 et 3 caractérisé par le fait que le benzonitrile substitué répond à la formule (I) ou (la) dans laquelle R1 et R2 représentent un groupe halogénoalkyle, de préférence, un groupe fluoroalkyle tel que fluorométhyle, difluorométhyle, trifluorométhyle, fluoroéthyle, 1 ,1 ,1- trifluoroéthyle, pentafluoroéthyle, fluoropropyle, fluorobutyle, trifluoroamyle.
9 - Procédé selon l'une des revendications 2 et 3 caractérisé par le fait que le benzonitrile substitué répond à la formule (I) ou (la) dans laquelle R1 et R2 représentent un groupe halogénoalkyle, de préférence, un groupe trifluorométhyle. 10 - Procédé selon l'une des revendications 2 et 3 caractérisé par le fait que le benzonitrile substitué répond à la formule (I) ou (la) dans laquelle R représente un groupe hydroxyle : un groupe alkyle ou alkoxy ayant de 1 à 6 atomes de carbone, de préférence, de 1 à 4 atomes de carbone ; un groupe amino ou un groupe amino substitué par un ou deux groupes alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone, de préférence, de 1 à 4 atomes de carbone.
11 - Procédé selon l'une des revendications 2 et 3 caractérisé par le fait que le benzonitrile substitué répond à la formule (I) ou (la) dans laquelle R-| représente un atome de fluor ou de chlore ou un groupe trifluorométhyle et R2, identique ou différent de R^ représente un atome d'hydrogène ; un atome de fluor ou de chlore ou un groupe trifluorométhyle.
12 - Procédé selon l'une des revendications 2 et 3 caractérisé par le fait que le benzonitrile substitué est le 2,6-difluorobenzonitrile, le m- trifluorométhylbenzonitrile.
13 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisé par le fait que l'enzyme provient de micro-organismes du genre Brevibacterium.
14 - Procédé selon la revendication 13 caractérisé par le fait que l'enzyme provient de la souche Brevibacterium R 312 ou Brevibacterium sp A4.
15 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 14 caractérisé par le fait que l'hydrolyse du benzonitrile substitué est effectuée à un pH variant entre 6 et 8, de préférence, situé aux environs de 7.
16 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 15 caractérisé par le fait que l'hydrolyse du benzonitrile substitué est effectuée dans un milieu tamponné, de préférence phosphate.
17 - Procédé selon la revendication 16 caractérisé par le fait que la température de la réaction d'hydrolyse est comprise entre 10°C et 40°C, de préférence entre 10°C et 30°C.
18 - Benzamide halogène obtenu selon le procédé décrit dans l'une des revendications 1 à 17. 19 - 2,6-difluorobenzamide obtenu par hydrolyse du 2,6-difluorobenzonitrile selon le procédé décrit dans l'une des revendications 1 à 17.
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