JP2004511249A - 組合せる酵素システムを使用するα−ヒドロキシカルボン酸の製造 - Google Patents

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パンタリオン, デイビッド ピー.
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Abstract

経済的及び便宜的な方法は、電子供与体の再利用のために、電子供与体と酵素/基板システムとの組合せの中で、アミノ酸デアミナーゼを使用して、対応するα−アミノカルボン酸又はそれらの塩を酸化させて、さらに、D−又はL−乳酸塩脱水素酵素を使用して、製造された、対応するα−ケトカルボン酸又は塩を還元させることからなる、対掌体の高精度での精製でα−ヒドロキシカルボン酸又はそれらの塩類の調整を示している。生成されるα−ヒドロキシカルボン酸、水和物及びそれらの塩類は、キラルな化合物、特に調合薬の調整での価値のあるコンポーネント及び中間体である。この発明も、α−ヒドロキシカルボン酸、水和物及びそれらの塩類の製造でのα−アミノカルボン酸、水和物及びそれらの塩類、並びに、組合せる酵素システムの使用に関する。

Description

【0001】
(発明の分野)
本発明は、α−アミノカルボン酸からα−ヒドロキシ中心の対掌体の高い精度の精製でα−ヒドロキシルボン酸のR−又はS−の異性体の一方を合成する、経済的、便宜的、用途の広い方法に関する。アミノ酸デアミナーゼ(AAD、さらに、アミノ酸酸化酵素、AAOとして参照される)、乳酸塩脱水素酵素(LDH)、電子供与体、及び、電子供与体を再利用するための酵素/基板システムの組合せる酵素システムによって変換は触媒される。本発明は、さらに、α−アミノカルボン酸、水和物及びそれらの塩類、並びに、α−ヒドロキシカルボン酸、水和物及びそれらの塩類の製造で組合せる酵素システムの使用に関する。
【0002】
(発明と先行技術との背景)
キラルのα−ヒドロキシ(さらに、2−ヒドロキシとして時々参照される)カルボキシエステル、酸及びそれらの塩類が、有用なキラルの化合物の種類、特に調合薬にしばしば変換される、用途の広い合成中間体であるので、キラルのα−ヒドロキシ(さらに、2−ヒドロキシとして時々参照される)カルボキシエステル、酸及びそれらの塩類の合成は、相当に重要である。α−ヒドロキシカルボキシエステル、酸、それらの塩類のキラルは、α位置、例えば、エポキシド、アルキルエステル、ヒドラジニルエステル、α−N−アルコキシアミノエステル、α−アミノエステルでの立体化学の保持によって、又は、α位置に求核性の置換を含む反応で,例えば、適切な求核分子と対応するα−トリフレートエステルの反応で立体化学の変換によって、他のキラルの機能性を得られるかもしれない。
【0003】
分子中に付加的なキラル支持の官能基を所有する、キラルのα−ヒドロキシカルボキシエステル、酸、水和物及びそれらの塩類の有効性は、付加的なキラルの中心を含んでいる化合物の合成のためにさらに可能性を提示する。α位置での水酸基がキラル支持の官能基の立体化学な変換を促進して、内部制御要素を提供する、多数の例がある。例えば、β−γ−不飽和化合物のエポキシ化は、シャープレスタイプの中間体にアクセスを与え、β−γ−不飽和化合物の脱水は、炭水化物合成で有効性を持っている多価アルコールを製造し、及び、4−オキソ化合物のジアステレオ選択的な還元は、条件の選択に依存して、syn−又はanti−1,3−ジオールの一方を提供する。α−ヒドロキシカルボキシエステル、酸、水和物及びそれらの塩類が、価値のある合成実体であるので、多くの努力が、キラルの形成の調整のための方法の開発及び従来の化学薬品と下記に示される最近の酵素の方法との両方の例に消費された。
【0004】
重要な変換が、比較的反応しなく、立体化学に敏感な中心で非常に極性の化合物で水に敏感な試薬及び低温の使用を一般に含んでいるので、α−アミノカルボン酸又はそれらの塩類からα−ヒドロキシカルボン酸又はそれらの塩類を直接製造する従来の化学的方法の例は、ほとんどない。ニトロ化及び加水分解によるD−アミノカルボン酸の脱アミノ反応(WinitzM., et al. J. Am. Chem. Soc. 1956, 78, 2423)は、L−形状のα−ヒドロキシカルボン酸へのアクセスを提供することができるが、制限のある有効性の高価な出発材料の使用を要求する。出発材料(kunz H., et al. Tet. Lett. 1987, 28, 1873)としてより容易に利用可能及び安価なL−アミノカルボン酸の使用は、数工程(数週間の反応時間)を要求し、多数の副生成物を形成する可能性があり、D−ヒドロキシカルボン酸誘導体だけの適度な生成だけになる。
【0005】
α―ケトカルボン酸又はエステルからα−ヒドロキシカルボン酸を合成する方法の多くの例がある、しかしながら、特に出発材料が非対称の中心を欠くので、これらの方法もそれらの一般的な有効性で制限されている、さらに、比較的高価及び制限のある有効性である。エノン還元を例外として、生成物のキラルは、いくつかの合成の工程を要求するキラルの補助物(基板コントロール)の化学量論の使用又は大容量及び高価なキラルの還元剤(試薬コントロール)のいずれかから発生する。例えば、キラルの9−ボラビシクロ[3.3.1]ノナン(9−BBN)誘導体(Brown H. C. et. al. J. Org. Chem. 1986 51, 3396)を使用するα−ケトエステルの非対称の還元は、化学量論の多量のこれらの複雑な還元剤を必要とする。オキサゾリドンオキシダントを有するキラルのオキサゾリドンエノレートのヒドロキシル化(Evans, D. A. et al. J. Am. Chem Soc., 1985, 102, 4346)は、α−ヒドロキシイミド中間体のクロマトグラフィーの溶液が付加的なソルボリシス工程に先立って試みられることを必要とし、妨害されたα−ケトカルボン酸が使用される場合、低収率となる。キラルのα―アルコキシカルバニオンのカルボキシル化(Chan C. M. et. al. Tet. Lett. 1990, 31, 1985)は、化学量論の量の高価な還元剤(R)−又は(S)−BINAL−Hを要求し、金属交換反応段階の後に危険な錫残留物の処分を必要とする。上記の方法とは対照的に、エノンのエナンチオ選択の還元は、触媒量だけのキラルのオキサザボロリジンを使用して、達成することができる、(Coney. G. J. et. al. Tet. Lett., 1990, 31, 611)、しかしながら、4つの化学変換の配列は、明白なコスト及び含有物の生成で、α−ヒドロキシエステルに変換するために、最初に形成されたキラルのアルコールを必要とする。
【0006】
キラルのα−ヒドロキシカルボン酸を製造する酵素の方法は、さらに、前駆体としてケトンのカルボキシエステル又は酸に依存する。また、精製された又は分離された還元酵素によって触媒作用が及ぼされる(例えば、 Ghisalba, O. et.al. U. S. Patent No. 5,098,841; Wandrey, C. et. al. U. S. Patent No. 4,326,031; 及び Casey, G. et al. U. S. Patent No. 5,686,275)。出発原料としてα−アミノカルボン酸又はそれらの塩類を利用する、公表された方法はない。これらは酵素還元方法は、一般的に電子供与体、典型的に還元されたピリジン・ヌクレオチド又はフラビン・ヌクレオチド、及び、その再生の効率的なシステムの付加、つまり、別の酵素の付加及びその基板の付加を要求する。エノン還元で、これらの方法が、さらに、触媒量だけのキラルの還元剤(これらの場合、酵素及びその共同因子)を要求する長所を持ち、キラル支持の基板からキラルのα−ヒドロキシカルボン酸を製造する可能性がある。
【0007】
これらの生体触媒の方法が、実際的であるならば、それらは他の方法に関して有効なコストであるに違いなく、得られる生成物は高い異性体の精製及び化学的生成で製造されるに違いない。これらの要因は、一般に、酵素システムの耐久性、特異性及び基板回転変換の割合の機能である。その使用される酵素の由来は、これらの酵素の反応の特性及び効能に重要である。それらが異なる由来、例えば、異なる微生物から分離されたならば、同じ型の酵素さえ、反応特異性、基板特異性、立体特異性のような構造の要因と、Michaelis−Menten(ミカエリス−メンテン)の定数(K)及び禁止定数(K)のような運動の要因との両方によって異なる。例えば、Lactobacillus confusus(ラクトバシルルス コンフスス) からのD−乳酸塩脱水素酵素は、α−ケトバレン酸塩、α−ケトカプリン酸塩及びα−ケト−β−メチルバレン酸塩を還元するだけでなく、ピルビン酸塩、α−ケトブチル酸塩及びフェニルピルビン酸塩を変換するが、一方、Staphylococcus epidermidis(S. epidermidis)からのD−乳酸塩脱水素酵素が、α−ケト−β−メチルバレン酸塩又は2−オキソアジピン酸塩だけでなく、ピルビン酸塩、フェニルピルビン酸塩及びα−ケトブチル酸塩を変換する。個々の酵素/基板システムの態様は、各場合に関してテストされ、いくつか参照されるけれど、一般化によって予想することができず、その結論を指摘することができない(例えば、ヨーロッパ 特許 0 024 547)。これらの酵素の変換の文献の中で報告された多数の記述(それらのうちのいくらかは下記に引用される)があるが、それらは低い収率に慣習的に帰着した。また、それらの一般的な有効性は下記に実証される。
【0008】
(R)−オキシニトリラーゼは、(R)−α−ヒドロキシカルボン酸にアクセスを与えるために、後に加水分解される、キラルのシアノヒドリンの合成に触媒作用を及ぼす(Zeiglar, T., et al., Synthesisi 190, 575)。シアン化水素の高い有毒の水なしの調整は、R−異性体だけの74%の収率として低く種々のエナンチオ選択性を与える酵素の反応のために必要になる。その(S)−オキシニトリラーゼの使用は、Current Chemistry, Vol. 200, Springer Verlag, Berlin(1999), 193−226のトピックに一般に記述される。
【0009】
酵素の運動の溶液の例は、キラルのα−ヒドロキシエステル(Kalaritis P., et al., J. Org. Chem. 1990, 55, 812)を与えるPseudomonas fluorescens(シュードモナス フルオレスセンス)リパーゼによって触媒作用を及ぼされたもの、並びに、キラルのα−ヒドロキシ酸を与えるグリコレート酸化酵素及びD−乳酸塩脱水素酵素(Adam W. et al., Tetrahedron Asymmetry 1998, 9, 351)によって触媒作用が及ぼされたものを含んでいる。特別の対掌体の収率が、非相称の基板の溶液の中で、最大50%まで制限されているので、これらの方法は、本質的に欠陥がある。実際上、高い光学の精製を達成するためにパーセント変換を注意深くコントロールしなければならないので、収率はさらに引き下げられる。
【0010】
多くの研究者は、哺乳類組織(例えば、ウサギの筋肉及び豚と牛の心臓、Kim, M.−J. et al. J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 2959)並びにバクテリア(例えば、Baccillus stearothermophilus, Luyten, M. A. et. al. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 6800)から得られたそれらを含む様々な由来から分離されたS−乳酸塩脱水素酵素(S−LDH又はL−LDH)によって触媒作用が及ぼされたα−オキソカルボン酸の還元を調査した。多数のα−オキソカルボン酸は、NADH酸化のコースに続くことにより決定されるようなS−LDHに対する測定可能な活動を示すとして文献に記述されたが、ある場合のみ、調整の規模の実験は、完全に特徴づけられた生成物のα−ヒドロキシカルボン酸、及び、確立された還元のエナンチオ選択性で実行された。基板として調査された化合物は、さらに、α−オキソカルボン酸脱水素酵素を有する還元の可能な有用な境界を予想する傾向がある。これらの反応の一般的な有効性は、したがって、解釈に従う。完全に特徴づけられた時、これらの方法の大部分は、よい化学的な収率及び高い光学的な精製で、(S)−α−ヒドロキシカルボン酸を提供する。しかしながら、いくつかの基板の反応性は制限されて、1,6−ビスホスフェート(FBP)のようなアロステリック活性剤の使用を必要としてもよく、完成に移るために1週以上かかる。これは、1−3日の典型的な反応時間に相当する。
【0011】
(R)配置を有するα−ヒドロキシカルボン酸を得るために、触媒作用がR−LDH又はD−LDHによって及ぼされたα−オキソカルボン酸の還元も研究された。この酵素は、大規模に分離することができる(Hummel, W. et. al. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1983, 18, 75)。最近の研究は、Leuconostoc mesenteroides(LM−R−LDH)とStaphylococcus epidermidis(SE−R−LDH)からのR−LDHに注目した(Simon, et al., Appl. Biotechnol. 1989, 22, 169 及び Kim M. J. et. al. Chem. Soc. Chem. Commun. 1991, 326)。α−オキソカルボン酸基板の制限のある数だけが、測定可能な活動を示すと示された。また、調整の規模で還元された。
【0012】
精製された還元酵素又は分離された還元酵素を使用するとき、以前に言及されたように、補酵素の酵素の再生用の効率的なシステム、つまり、別の酵素及びその基板が要求される。これらの反応については、触媒量のNADHが、別の酵素、通常、蟻酸エステル脱水素酵素(FDH)(二酸化炭素への蟻酸エステルイオンの酸化でのNADを利用する)を要求して、典型的には再生するシステムと共に使用される(Shaked Z. et. al. J. Am. Chem. Soc. 1980, 102, 7105)。ヤマザキとマエダは、NADH及びStreptococcus faecalis(ステレプトココクス ファエカリス)からのベンゾイル蟻酸エステル脱水素酵素の援助でベンゾイル蟻酸からのR−(−)−マンデル酸の合成のためのバッチ及び連続的な方法(Agricol. Biol. Chem. 1986, 50, 2621 及び 3213)を説明する。ヨーロッパ特許 0 024 547は、さらに、酵素薄膜リアクター中で、対応するα−ヒドロキシカルボン酸の中への水可溶α−ケトカルボン酸の連続的な酵素変換の方法ついて記述する。その変換は、分子量がポリエチレングリコールに結合することにより増加させられたNAD(H)が存在する状態で、並びに、蟻酸エステル脱水素酵素及び蟻酸エステルによる同時のNADH再生を有する乳酸塩脱水素酵素が存在する状態で行なわれる。
【0013】
前駆体としてα−ケトカルボン酸を使用して、さらに、還元に制限されるが、立体特異性の微生物学の変換によるキラルのヒドロキシカルボン酸の製造も利用された。一方の完全な微生物、例えば、菌類(例えば、Mucor(ムコア), Geotrichum(ゲオトリチュム), Saccharomyces(サクカロミケス), Candida(カンジダ))又はバクテリア(例えば、Proteus(プロテウス), Pseudomonas(シュードモナス))又はそれらの抜粋は、生体触媒として使用された。これらの場合の基板の還元も、基板に特有の脱水素酵素によって達成される。電子共与体も、このプロセスのために必要になり、例えば、炭水化物(例えば、グルコース)、蟻酸エステル、エタノール、水素又は電気化学のセルの陰極であるが、一般に補酵素、例えば、還元されたニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド(NADH)及び還元されたニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド・リン酸(NAPDH)のようなピリジン・ヌクレオチドによって、又は、還元されたフラビン・モノヌクレオチド(FMNH)及び還元されたフラビン・アデニン・ジヌクレオチド(FADH)のような還元されたフラビン・ヌクレオチドによって提供される。還元された補酵素は、自然又は合成媒介(例えば、フェルドキシン、ビオロゲン)によって、競合する電子受容体が形成される一連の酵素触媒作用が及ぼされた工程で、又は、電子移動によって製造されて、通常、順番にある。しかしながら、媒介から電子を直接受理することができるいくつかの還元酵素が知られている。しかしながら、これらのシステムの全ては、まだ、出発原料のα−ケトカルボン酸のコスト及び有効性によって制限されている。
【0014】
出発原料のα−ケトカルボン酸のコスト及び化学的有効性が禁じることができるので、α−ケトカルボキシ酸の製造用の有望な方法は、対応するケトカルボン酸(Massad, G. et. al. J. of Bact., 1995, 177, No. 20,5878)及び逆(Pantaleone, D. et al. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2001, 11: 795; Galkin, Andrey, et al. Appl. Environ. Microbiol., 1997, 63, No. 12,4651)への容易に利用可能及び安価なL−アミノカルボン酸を変換するアミノ酸デアミナーゼ又は酸化酵素(例えば、L−アミノ酸: 酸素オキシドリダクターゼ; EC 1.4.3.2)の利用である。アミノ酸酸化酵素は、典型的にはそれらは営利上利用可能ではないが、由来(表1で示されるように)の数で研究され、分離された。
【0015】
【表1】
Figure 2004511249
【0016】
【表2】
Figure 2004511249
【0017】
【表3】
Figure 2004511249
【0018】
【表4】
Figure 2004511249
アミノ酸デアミナーゼの活動は、したがって、抜粋又は全体のセルでほとんど研究された。乳酸塩脱水素酵素で、化合物の制限のある数だけが、様々な由来からのアミノ酸デアミナーゼの基板として測定可能な活動を持っていることが実証された、また、それらは、アミノ酸デアミナーゼ(例えば、当然、生成するα−アミノカルボン酸だけが、文献に記述された)を有する酸化の可能な境界を予想する傾向がある。生成物のケトカルボン酸はめったに完全に特徴づけられない、代わりに、有色の鉄コンプレックスの構成の観察によりコース又は反応に続くことにより通常推論される。反応は基板の類似及び特異性に関して広く可変であり、例えば、バクテリアで見つかった型のアミノ酸酸化酵素の類似及び特異性は、動物セル及び蛇毒で見つけられた型のフラビン・アミノ酸酸化酵素と異なる。さらに、それらは、調整の規模でまだ実行されていない。さらに、これらの反応の成功はしたがって、解釈に従う。
【0019】
これらの酵素システムが、各酵素の基板の特異性は充分に広かった、及び、方法が実際的に役に立つのに各酵素の回転率が充分に大きかったことが組合せれるならば、原料として、安価及び容易に利用可能なL−α−アミノカルボン酸又はそれらの塩類を使用して、ホモキラルのα−ヒドロキシカルボン酸の直接の構成が実行される。上述したように、α−ヒドロキシカルボン酸又はそれらの塩類の酵素の製造に関係のある先行技術の基板として、L−α−アミノカルボン酸及びそれらの塩類は、記述されなかった、それに応じて、そのような酵素の生体内変化中の適応性及び振る舞いに関して調査されていなかった。
【0020】
本発明は、共同因子としてNADHとアミノ酸デアミナーゼ及びL−乳酸塩脱水素酵素又はD−乳酸塩脱水素酵素の組合せる酵素システムを使用して、α−アミノカルボン酸、水酸化物、及び、それらの塩類のエナンチオ選択性の酵素の酸化並びに還元によって、エナンチオメリカリィな純粋なD−及びL−α−ヒドロキシカルボン酸、水酸化物、及び、それらの塩類の生成の効率的な方法を示す。3つめの酵素システムは、共同因子を再生成するために蟻酸エステル脱水素酵素でギ酸の酸化を利用する。
【0021】
(発明の詳細な説明)
本発明の1つの態様は、キラルのα−ヒドロキシカルボン酸又はそれらの塩類の生成の原料として、安価及び容易に利用可能なα−アミノカルボン酸又はそれらの塩類の使用を考慮に入れる方法を提供する。方法は、アミノカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類が、L−アミノ酸デアミナーゼを有する、対応するα−ケトカルボン酸又はそれらの塩類に脱アミノされ、続いて、共同因子/電子供与体として牛の心臓、ウサギの筋肉、豚の心臓又は豚の筋肉からのL−乳酸塩脱水素酵素又はNAD(H)を有するSpaphylococcus epidermidis, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus leichmannii, 又はBacillus stearothermophilusからのD−乳酸塩脱水素酵素のいずれかを使用する、目的のα−ヒドロキシカルボン酸又はそれらの塩類に還元されることに特徴づけられる。酵素の共同因子/電子供与体を再生成するために、3つめの酵素システムは、蟻酸エステル脱水素酵素でギ酸の酸化を利用する。両方のバッチ又は連続的な反応方法が、可能である。
【0022】
本発明の別の態様は、α−ヒドロキシカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類の製造での、α−アミノカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類、並びに、組合せる酵素システムの使用に関する。
【0023】
また、本発明の別の態様は、α−アミノカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類からα−ヒドロキシカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類を生成する方法の使用に関する。
【0024】
(発明の好ましい具体例の詳細な説明)
本発明は、L−及びD−α−ヒドロキシカルボン酸又はそれらの塩類の両方の生成の原料として、安価及び容易に利用可能なL−α−アミノカルボン酸又はそれらの塩類の使用を考慮に入れる方法を提供する。基板のアミノカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類が、電子供与体の存在下で、酵素L−アミノ酸デアミナーゼを有する、対応するα−ケトカルボン酸又はそれらの塩類に脱アミノされ、得られた生成物が、L−乳酸塩脱水素酵素又はD−乳酸塩脱水素酵素のいずれかを使用して、続いて目的のα−ヒドロキシカルボン酸又はそれらの塩類に還元される。酵素の電子供与体/共同因子を再生成するために、3つめの酵素/基板システムは、蟻酸エステル脱水素酵素でギ酸の酸化を利用する。この発明の方法は、α−アミノカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類が高い収率で対応するα−ヒドロキシカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類へ変換されることを可能とする、したがって、α−ヒドロキシカルボン酸及びそれらの塩類の製造の有用なコスト有効な方法である。
【0025】
α−ケトカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類へのα−アミノカルボン酸、水酸化物及び塩類の変換を処理することができる限り、様々なアミノ酸酸化酵素は使用することができる。発明の方法で使用可能な酵素の例は、表1で示され、L−アミノ酸デアミナーゼ(例えば、L−アミノ酸酸化酵素)、フェニルアラニン酸化酵素、フェニルアラニン脱水素酵素及びそれらの組合わせを含んでいる。大腸菌の中でクローンされたL−アミノ酸デアミナーゼの使用が好まれる。他の由来、例えば、豚の腎臓、蛇毒、Proteus mirabilis, Proteus rettgeri, Providencia alcalifaciens, Morganella morganiiからのL−アミノ酸デアミナーゼは、使用することができる。しかし、L−AAD遺伝子の多重コピークローンを運ぶ大腸菌は、はるかに高い特定活動という長所を有する。
【0026】
α−ヒドロキシカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類へのα−ケトカルボン酸、水酸化物及び塩類の変換を処理することができる限り、様々なα−ケト酸脱水素酵素は使用することができる。発明の方法で使用可能な還元酵素の例は、L−又はD−乳酸塩脱水素酵素、L−又はD−マンダ酸塩脱水素酵素、L−又はD−ヒドロキシイソカプロ酸塩脱水素酵素、L−又はD−ベンゾイル蟻酸塩脱水素酵素)及びそれらの組合わせを含んでいる。L−乳酸塩脱水素酵素及びD−乳酸塩脱水素酵素の一方の使用が好まれる。他の由来、例えば、Bacillus stearothermophilusからの乳酸塩脱水素酵素が使用される、しかし、他の微生物からの乳酸塩脱水素酵素と比較して、Staphylococcus epidermidis, Leuconostoc mesonteroides, 又はLactobacillus leichmannii からのD−LDH及び牛の心臓からのL−LDHは、使用される基板、広い基板特異性及び得られる生成物に関して、高い特定の活動(ユニット/mgの変換された基板又はmin/mgの蛋白質で形成されたμmolの生成物) によって識別される、また、得られる生成物は、高い程度に対掌体で精製されている。この記述の情況で、表現’’高い程度の対掌体の精製’’は、問題の対掌体が、別の対掌体との混合物で少なくとも95%(ee)の対掌体の超過で存在する、好ましくは98%(ee)を越えることを意味する。α−ケト酸脱水素酵素としてStaphylococcus epidermidis, Leuconostoc mesonteroides, 又はLactobacillus leichmanniiからのD−LDH及び基板としてα−オキソカルボン酸の使用は、さらに、生成物の高い収率にし、生成物のD−α−ヒドロキシカルボン酸の高い収率にする。したがって、その使用は、酵素の変換が大規模で行なわれる場合、大きな重要性及び相当な経済的利点である方法の全面的な費用を引き下げる。これらの理由のため、酵素のためのこれらの由来が好ましい。基板が最初にL−アミノ酸酸化酵素で酸化され、得られる生成物が牛の心臓からの酵素L−乳酸塩脱水素酵素で還元されるアナログの方法で、L−α−ヒドロキシカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類の調整での同じ利点が観察される。
【0027】
Staphylococcus epidermidis, Leuconostoc mesenteroides, 又はLactobacillus leichmanniiからのD−乳酸塩脱水素酵素又は牛の心臓からのL−乳酸塩脱水素酵素のために使用された電子共与体は、NADにD−又はL−LDHによって酸化された、還元された形(NADH)で、好ましくは補酵素ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドである。補酵素の再生のために、NADHを再利用する酵素及び基板からなる酵素/基板システム、例えば、蟻酸エステル脱水素酵素(FDH)/蟻酸エステルシステム;アルコール脱水素酵素(ADH)/エタノール、イソプロピルアルコール、シクロヘキサノールシステム;グルコース脱水素酵素(GDH)/グルコースシステム;又は、同様なシステムは使用される。製造でのように、これらのシステムは、CO/H−CO−とアセトアルデヒドをそれぞれ生成する。蟻酸、例えば、アルカリ金属蟻酸エステル、例えば、カリウム又はナトリウム蟻酸エステルの塩が、蟻酸エステル由来として使用される蟻酸エステル脱水素酵素/蟻酸エステル(FDH)システムが好ましい。本発明の方法を行なうための適切な蟻酸エステル脱水素酵素は、例えば、Candida boidinii (カンジダ ボイジニイ)又はPseudomonas oxalacticus(シュードモナス オキサラクチクス)から分離することができる。脱水素酵素は、蟻酸エステル脱水素酵素及びα−ケト酸脱水素酵素の活動の比率が1:1と1:100の間にある量に適切に加えられる。
【0028】
広範囲のアミノカルボン酸又はそれらの塩類は、酵素変換(L−又はD−LDH)のために使用された条件の選択に依存するL−又はD−ヒドロキシカルボン酸又はそれらの塩の一方に、容易に変換されてもよい。発明の好ましい化合物は、下記構造式を有するα−アミノカルボン酸塩、水和物又はそれらの塩である。
【0029】
【化2】
Figure 2004511249
ここで、Rは、水素、又は、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、ホスホニル、スルホニル、チオアセチル、チオプロピオニル、フェニル、C−Cのシクロアルキル、チエニル、ヒドロキシル、ナフチル、ピリジニル、アミノ、アミノアルキルチオ、カルボキシアルキルチオ、カルボキシアミノアルキルチオ、グアニジノ、ニトログアニジノ、ウレイド、アミノオキシ、グアニジノオキシ、OH、C−Cのアルコキシ、ベンジルオキシ、3−(2,3−ベンゾピロール)、3−(5−ヒドロキシ−2,3−ベンゾピロール)、3−(5−フルオロ−2,3−ベンゾピロール)、3−(ベンゾチオフェン)、メチルイミダジル、アミド、3−アントラニロイル、N−(3−ヒドロキシ−4−ピリドン)、リボシルアデノシンアルキルチオ、C−Cのアルキルチオ、ベンジルチオ、p−メトオキシベンジルチオ、フェニルチオ、カルバンチオイル、システエインジスルフィデ、アルキルセレノ、アルキルスルホン、アルキルスルホキシデ、アルキルスルホキシミル、ビニル、アリール、プロパルギルからなる群から選択された1以上の置換基で置換された直鎖状又は分技状C−Cのアルキルであり、かつ、
、R、R、R及びRは、独立して、水素、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、メチル、ヒドロキシ、C−Cのアルコキシ、ベンゾロキシ、ホスホニル及びベンゾイルからなる群から選択されるものである。
【0030】
この発明の使用を通じて、例えば、L−フェニルアラニンは、L−又はD−フェニルラクト酸に変換され、L−2−アミノ−4−メチルバレリン酸は、L−又はD−2−ヒドロキシ−4−メチルバレリン酸に変換され、L−2−アミノ−3−メチルバレリン酸は、L−又はD−2−ヒドロキシ−3−メチルバレリン酸に変換され、L−2−アミノ−3−メチルブチル酸は、L−又はD−2−ヒドロキシ−3−メチルブチル酸に変換され、L−2−アミノバレリン酸は、L−又はD−2−ヒドロキシバレリン酸に変換され、L−2−アミノブタン酸は、L−又はD−2−ヒドロキシブタン酸に変換され、L−ノルバリンは、L−又はD−2−ヒドロキシペンタン酸に変換され、L−ノルレウシンは、L−又はD−2−ヒドロキシヘキサン酸に変換され、L−バリンは、L−又はD−3−メチル−2−ヒドロキシブタン酸に変換され、L−ロイシンは、L−又はD−4−メチル−2−ヒドロキシペンタン酸に変換され、L−t−ブチルアラニンは、L−又はD−4,4−ジメチル−2−ヒドロキシペンタン酸に変換され、L−セリンは、L−又はD−3−ヒドロキシ−2−ヒドロキシプロピオン酸に変換され、L−ホモフェニルアラニンは、L−又はD−2−ヒドロキシ−4−フェニルブタン酸に変換され、L−1−ナフチルアラニンは、L−又はD−3−(1−ナフチル)−2−ヒドロキシプロピオン酸に変換され、L−2−ナフチルアラニンは、L−又はD−3−(2−ナフチル)−2−ヒドロキシプロピオン酸に変換され、L−チロシンは、L−又はD−p−ヒドロキシフェニル−2−ヒドロキシプロピオン酸に変換され、L−p−F−フェニルアラニンは、L−又はD−p−F−フェニル−2−ヒドロキシプロピオン酸に変換され、L−グルタミン酸は、L−又はD−α−ヒドロキシグルタン酸に変換され、L−2−アミノアジピン酸は、L−又はD−2−ヒドロキシアジピン酸に変換され、L−シトルリンは、L−又はD−2−ヒドロキシ−5−ウレイドバレリン酸に変換され、L−ホモシトルリンは、L−又はD−2−ヒドロキシ−6−ウレイドノヘキサン酸に変換され、L−システインは、L−又はD−メルカプト−2−ヒドロキシプロピオン酸に変換され、L−トリプトファンは、L−又はD−インドール−3−(2−ヒドロキシ)プロピオン酸に変換された。適切に、反応するα−アミノカルボン酸、例えば、フェニルアラニンは、それらの塩類、例えば、フェニルアラニン塩酸塩、又は、同種のものの形をして使用される。
【0031】
多数の型の反応容器は、発酵用容器、攪拌されたリアクター、固定ベッド・リアクター、流体にされたベッド・リアクター又は薄膜リアクター(Hartmeier参照、’’Immobilisierte Biokatalysatoren’’、Berlin 1986の要約)のように使用することができる。空気散布は、基板としてOの中で供給する反応容器に付けられる。バッチ方法で、発酵用容器は、基板のα−アミノカルボン酸の水溶液、例えば、好ましくはカリウム又はナトリウム塩の形態をして供給される。しかしながら、基板の濃度は、最大可能な濃度の50〜100%までになるべきであり、それは、2000mmol/lを超えなければよく、好ましくは20〜1000mmol/lであり、特に好ましくは約100−500mMである。これは、デアミナーゼ酵素及びα−ケト酸脱水素酵素の活動の比率が1:0.1〜1:100までである量で有利に使用されるP. myxofaciensからのアミノ酸デアミナーゼでO下で攪拌される間に培養される。その後、発酵用容器に、0.01〜10mM、好ましくは約0.1mMの濃度で補酵素NAD(H)、それぞれ望ましくて、100〜1200mM、好ましくは約300mMの濃度で、NADHを再利用する補酵素、例えば、アルコール脱水素酵素、蟻酸エステル脱水素酵素、及び、エタノール又は蟻酸エステルの水溶液が、変換が完了するまで、Staphylococcus epidermidis, Leuconostoc mesenteroides, 又はLactobacillus leichmanniiからのD−乳酸塩脱水素酵素、又は、牛の心臓からL−乳酸塩脱水素酵素と供給される。酵素は、NADHを再利用する酵素及び基板に特有の脱水素酵素の活動の比率が1:0.1〜1:10までである量で有利に使われる。分子量を増加させるためにポリエチレングリコールに結合されたNADの使用はされてもよいが、要求された補酵素は、0.01〜10mM、好ましくは約0.1mMの濃度で、分子量が増加させられていないNADの形、例えば、在来のNAD(H)をして使用される。蟻酸エステルイオン又はエタノールの濃度は、蟻酸エステルのために100〜6000mmol/lであり、好ましくは300〜2000 mmol/lである。酵素反応には慣習的として、反応混合物は、pH6〜9、たとえば、pH7.5である。反応温度は、20℃〜40℃であり、好ましくは室温付近である。酵素の酸化を防ぎ、かつ、COから運転を助けるために、反応は、Nで行われる。生成物は、酸、例えば、塩酸のような鉱物の酸及び同種のものの付加によって反応混合物から結晶化される。発明の好ましい方法は、上述されるように、発酵用容器のようなバイオリアクターの中で酵素の変換が以下のように行なわれることです。a)蟻酸エステル脱水素酵素又はアルコール脱水素酵素の溶液からなる反応混合物を含んでいる、好ましくは蟻酸エステル脱水素酵素は、Staphylococcus epidermidis, Leuconostoc mesenteroides, 又はLactobacillus leichmanniiからのD−乳酸塩脱水素酵素又は牛の心臓からのL−乳酸塩脱水素酵素、及び、例えば、0.01〜1mM、好ましくは約1mMの濃度でニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド(NAD(H))である。b)基板のα−アミノカルボン酸水溶液が供給される。基板のアミノカルボン酸水溶液は、例えば、塩酸塩又はナトリウム塩の形で、500mMまでの濃度で、例えば、20〜500mM、好ましくは50〜200mMの濃度で、及び、蟻酸エステル、例えば、カリウム又はナトリウム蟻酸エステル、又は、それぞれエタノール、100〜1200mM、好ましくは約300mMの濃度である。c)形成された化合物がイオン交換又は溶解力のある抽出によって分離される。その方法は、含むことができ、本質的になることができ、又は、上述された工程からなることができ、また、使用された材料を含むことができ、本質的になることができ、又は、それらの状態からなることができる。
【0032】
現在の基板で決定される酵素活動の結果は、特に、時間、収率、対掌体の精製及びコスト有効性に関して化学の変換の成功を危ぶませると予想される基板の70/100%の予想外に高い変換として調整の規模の酵素の使用で有望である。生成物の構成は、酸化した共同因子NADと比較して、還元された共同因子NADHの340nmに、強い吸光度を有すること、及び、NADHの濃度と吸光度の減少により測定することができる。NADHの濃度に正比例する吸光度の減少は、酵素の反応の比率を評価するために使用されてもよい。他の酵素活動の存在が、NADHの活動の酸化に結びついてもよく、技術は、酵素の精製を含むいくつかの要因だけに制限されてもよく、予期された生成物の構成に相互に関連する。
【0033】
形成されたα−ヒドロキシカルボン酸は、既知のやり方のろ過から得るられる/分離される。例えば、異なる酸性の強さを最大限に利用する基礎的なイオン交換器による手段によって、反応しないα−アミノカルボン酸及びα−ケトカルボン酸からα−ヒドロキシカルボン酸を分けることによって、行うことができる。塩類の異なる可溶性、特に、カルシウム塩は、多くの場合に、再結晶によって分離を可能にする。与えられた場合では、適切な溶剤を有する抽出による分離のために極性の差に近づくことができる。
【0034】
α−ヒドロキシカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類の特性及び還元されたそれぞれのものの立体化学は、α−ヒドロキシカルボン酸のエステル化によって調整された(+)−MPTA Mosher誘導体のNMR及び毛管GCの分析によって決定され、(+)−MTPA−Clとのアシル化によって続け(Dale, J. A., et al. J. Org. Chem., (1969), 34, 2543)、また、ラセミ化合物の標準と比較する。交互に、キラルで、逆層の高機能液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)分析によって、α−ヒドロキシカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類の特性及び還元されたそれぞれのものの立体化学を決定することができる。これらはα−ヒドロキシカルボン酸誘導体のキラルの分析用の標準の文献のプロトコルであり、また、小さなジアステレオ異性体の0.5%未満を検知するように充分に敏感である。エナンチオメリカリィの純粋なキラルのヒドロキシカルボン酸、水酸化物及びそれらの塩類は、調整での、抑制剤、調合薬、治療の代理剤として、また、前駆体/中間体として価値がある。
【0035】
次の例において、発明の方法は、D−フェニル乳酸へのL−フェニルアラニンの変換、D−2−ヒドロキシ−4−メチルペンタン酸へのL−ロイシンの変換、及び、D−2−ヒドロキシペンタン酸へのL−ノルバリンの変換に関してより詳細に説明される。次の例は、例の制限に限定されず、本発明を例証するように意図される。もし他の方法で示していなければ、全部分及びパーセンテージが重量による。これらの酵素は、蛋白質フレームワークの周囲にアミノ酸配列の小さな変化を展示することができるが、α−オキソカルボン酸/α−ヒドロキシカルボン酸相互変換の触媒作用の原因である活性部位中の、及び、その活性部位のまわりのそれらの残留物は、通常保存される。与えられたα―オキソカルボン酸、与えられた酵素活動は、UV分光学によって検知され、K及び触媒現象の回転置換、kcatで特徴づけられてもよい。
【0036】
実施例1
L−アミノ酸酸化酵素遺伝子の分離及び操作
P.myxofaciensからのアミノ酸デアミナーゼ遺伝子は、公表されたP、mirabilis DNA 配列に設計されたプライマー(表2参照)を使用して、全体のセルPCRによって分離された。連結反応は、Panvera(パンベラ)(Madison, WI)からのタカラバイオケミカルDNA連結反応キットを使用して実行された。PCRは、Perkin Elmer(パーキン エルマー)からのTaq又はUltma DNA重合酵素を備えたPerkin Elmer 9600 Thermal Cycler(パーキン エルマー 9600 サーマル サイクラー)で標準条件を使用して、実行された(Norwalk, CT)。オリゴヌクレオチドは、応用のバイオケミカル 300 B DNAシンセサイザーを使用して調整された。
【0037】
【表5】
Figure 2004511249
実施例2
L−アミノ酸酸化酵素のためのスクリーニング研究
酸素消費は、次亜硫酸塩で0点調整されたHansatech(ハンサテック)装置(Norwalk, England)からのオキシグラフシステムの中でクラークタイプO電極を使用して測定された。アミノ酸基板(10.0mM)は、酵素を加えるに先立って、合計990μlで、2分間、30℃で、50mMのリン酸カリウムバッファー、pH 7.5の中で培養された。反応は、10μlの酵素(104mgの蛋白質)を加えることにより始められ、また、さらに3分間、O消費が測定された。L−フェニルアラニンは、参照基板として使用された。また、線形の割合は決定され、100%に設定された。バッファーのみのブランクの割合が引かれた後、他のすべてのアミノ酸は、L−フェニルアラニンと比較された。
【0038】
実施例3
乳酸塩脱水素酵素のためのスクリーニング研究
乳酸塩脱水素酵素は、分子装置からのSpectraMax 250 microplate(スペクトラマクス 250 マイクロプレート)リーダで25℃で多くのケト酸基板上でスクリーニングされた(Sunnyvale, CA)。反応は、100mMのリン酸カリウムバッファー、pH7.0で、30mMのケト酸+0.6mMのNADHへ10μlの薄められた酵素を加え、また、340nmでNADHの酸化をモニタリングすることによって実行された。ピルビン酸塩は、参照基板として使用された。また、酵素の活動は決定され、100%に設定された。他のすべてのケト酸は、バッファーのみのブランク上の背景活動に合わせて調節した後にピルビン酸塩と比較された。
【0039】
実施例4
L−アミノ酸デアミナーゼ(L−AAD)の存在下でD−フェニル乳酸(D−PLA)の製造
デアミナーゼ反応は、L−フェニルアラニン(100mmol)を含んでいる、500mlに脱イオン化された水に大腸菌(L−アミノ酸デアミナーゼ用の遺伝子の多重コピークローンを運んでいた)を100g(ウェトセルペレット)加えることにより、全体のセル生体内変化によって行なわれた。反応は、1v.v.mの比率でシステムの中に放射された酸素で32℃でpH7.5−8で2リットルの密閉された発酵用容器で急速に混合された。脱アミノ反応は、溶解された酸素が、酸素フローが閉じられたポイント(〜1時間)が上昇を開始するまで、継続する。脱水素反応反応は、ナトリウム蟻酸エステル(100 mmol)、メルカプトエタノール(1 mmol)、ジチオトレイトール(1 mmol)、トリス−CI(25 mmol)、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド(1 mmol)、S. epidermidis(3800ユニット)からのD−乳酸塩脱水素酵素及びC. boidinii(380ユニット)からの蟻酸エステル脱水素酵素を含んでいる溶液を500ml加えることにより開始された。反応は、0.05v.v.mで放射された窒素で室温で行なわれた。また、pHは、1N HClで7.5に維持された。32時間後、D−PLAの滴定濃度は、9.24g/Lであり、総計は、L−フェニルアラニンから58.1%で産出された。
【0040】
実施例5
L−AADセルの除去後のD−フェニル乳酸(D−PLA)の製造
デアミナーゼ反応は、L−フェニルアラニン(100mmol)を含んでいる、500mlに脱イオン化された水に大腸菌(L−アミノ酸デアミナーゼ用の遺伝子の多重コピークローンを運んでいた)を100g(ウェトセルペレット)加えることにより、全体のセル生体内変化によって行なわれた。反応は、1v.v.mの比率でシステムの中に放射された酸素で32℃でpH7.5−8で2リットルの密閉された発酵用容器で急速に混合された。脱アミノ反応は、溶解された酸素が、酸素フローが閉じられたポイント(〜1時間)が上昇を開始するまで、継続する。L−AADセルは、20分間、8000x Gで遠心分離によって除去され、上澄み液は、2リットルの発酵用容器へ注がれ、約22℃に調節された。脱水素反応反応は、ナトリウム蟻酸エステル(100 mmol)、メルカプトエタノール(1 mmol)、ジチオトレイトール(1 mmol)、トリス−CI(25 mmol)、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド(1 mmol)、S. epidermidis(3800ユニット)からのD−乳酸塩脱水素酵素及びC. boidinii(380ユニット)からの蟻酸エステル脱水素酵素を含んでいる溶液を500ml加えることにより開始された。反応は、0.05v.v.mで放射された窒素で室温で行なわれた。また、pHは、1N HClで7.5に維持された。31.75時間後、D−PLAの滴定濃度は、13.59g/Lであり、総計は、L−フェニルアラニンから88.9%で産出された。
【0041】
実施例6
D−2−ヒドロキシ−4−メチルペンタン酸の製造
デアミナーゼ反応は、L−ロイシン(100mmol)を含んでいる、500mlに脱イオン化された水に大腸菌(L−アミノ酸デアミナーゼ用の遺伝子をクローンされた)を100g(ウェトセルペレット)加えることにより、全体のセル生体内変化によって行なわれた。反応は、1v.v.mの比率でシステムの中に放射された酸素で32℃でpH7.5−8で2リットルの密閉された発酵用容器で急速に混合された。脱アミノ反応は、溶解された酸素が、酸素フローが閉じられたポイント(〜1.5時間)が上昇を開始するまで、継続する。L−AADセルは、20分間、8000x Gで遠心分離によって除去され、上澄み液は、2リットルの発酵用容器へ注がれ、〜22℃に調節された。脱水素反応反応は、ナトリウム蟻酸エステル(100 mmol)、メルカプトエタノール(1 mmol)、ジチオトレイトール(1 mmol)、トリス−CI(25 mmol)、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド(1 mmol)、S. epidermidis(3800ユニット)からのD−乳酸塩脱水素酵素及びC. boidinii(380ユニット)からの蟻酸エステル脱水素酵素を含んでいる溶液を500ml加えることにより開始された。反応は、0.05v.v.mで放射された窒素で室温で行なわれた。また、pHは、1N HClで7.5に維持された。44時間後、100mlの酸が加えられ、D−2−ヒドロキシ−4−メチルペンタン酸の滴定濃度は、7.2g/Lであり、総計は、L−ロイシンから60.0%で産出された。
【0042】
実施例7
L−2−ヒドロキシ−4−メチルペンタン酸の製造
デアミナーゼ反応は、L−ロイシン(100mmol)を含んでいる、500mlに脱イオン化された水に大腸菌(L−アミノ酸デアミナーゼ用の遺伝子をクローンされた)を100g(ウェトセルペレット)加えることにより、全体のセル生体内変化によって行なわれた。反応は、1v.v.mの比率でシステムの中に放射された酸素で32℃でpH7.5−8で2リットルの密閉された発酵用容器で急速に混合された。脱アミノ反応は、溶解された酸素が、酸素フローが閉じられたポイント(〜1.5時間)が上昇を開始するまで、継続する。L−AADセルは、20分間、8000x Gで遠心分離によって除去され、上澄み液は、2リットルの発酵用容器へ注がれ、〜22℃に調節された。脱水素反応反応は、ナトリウム蟻酸エステル(100 mmol)、メルカプトエタノール(1 mmol)、ジチオトレイトール(1 mmol)、トリス−CI(25 mmol)、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド(1 mmol)、ウサギの筋肉(3800ユニット)からのL−乳酸塩脱水素酵素及びC. boidinii(380ユニット)からの蟻酸エステル脱水素酵素を含んでいる溶液を500ml加えることにより開始された。反応は、0.05v.v.mで放射された窒素で室温で行なわれた。また、pHは、1N HClで7.5に維持された。44時間後、8mlの酸が加えられ、L−2−ヒドロキシ−4−メチルペンタン酸の滴定濃度は、1.4g/Lであり、総計は、L−ロイシンから10.6%で産出された。
【0043】
実施例8
D−2−ヒドロキシペンタン酸の製造
デアミナーゼ反応は、L−ノルバリン(100mmol)を含んでいる、500mlに脱イオン化された水に大腸菌(L−アミノ酸デアミナーゼ用の遺伝子をクローンされた)を100g(ウェトセルペレット)加えることにより、全体のセル生体内変化によって行なわれた。反応は、1v.v.mの比率でシステムの中に放射された酸素で32℃でpH7.5−8で2リットルの密閉された発酵用容器で急速に混合された。脱アミノ反応は、溶解された酸素が、酸素フローが閉じられたポイント(3時間)が上昇を開始するまで、継続する。L−AADセルは、20分間、8000x Gで遠心分離によって除去され、上澄み液は、2リットルの発酵用容器へ注がれ、〜22℃に調節された。脱水素反応反応は、ナトリウム蟻酸エステル(100 mmol)、メルカプトエタノール(1 mmol)、ジチオトレイトール(1 mmol)、トリス−CI(25 mmol)、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド(1 mmol)、S. epidermidis(3800ユニット)からのD−乳酸塩脱水素酵素及びC. boidinii(380ユニット)からの蟻酸エステル脱水素酵素を含んでいる溶液を500ml加えることにより開始された。反応は、0.05v.v.mで放射された窒素で室温で行なわれた。また、pHは、1N HClで7.5に維持された。44時間後、89mlの酸が加えられ、D−2−ヒドロキシペンタン酸の滴定濃度は、7.96g/Lであり、総計は、L−ノルバリンから73.4%で産出された。

Claims (18)

  1. L−アミノ酸デアミナーゼ又は酸化酵素を使用して、α−アミノカルボン酸、水和物又はそれらの塩を酸化することからなり;
    そして、続いて、脱水素酵素を使用して、それらの生成物を還元する、キラルのα−ヒドロキシカルボン酸、水和物又はそれらの塩の製造方法。
  2. 基板濃度は、約1mMから5Mまでの間の範囲にある、請求項1に記載の方法。
  3. 前記脱水素酵素は、L−乳酸塩脱水素酵素(EC# 1.1.1.28)又はD−乳酸塩脱水素酵素(EC# 1.1.1.27)である、請求項1に記載の方法。
  4. 前記脱水素酵素は、牛の心臓、ウサギの筋肉、豚の心臓、豚の筋肉、Staphylococcus epidermidis(スタフィロココカス エピデルミディス)、Leuconostoc mesenteroides(レウコノストック メセンテロイデス)、Lactobacillus leichmannii(ラクトバシルルス レイカマンニイ)及びBacillus stearothermophilus(バシルルス ステアロサーモフィルス)からなる群から選択される由来のL−又はD−乳酸塩脱水素酵素である、請求項1に記載の方法。
  5. 前記L−アミノ酸デアミナーゼ又は酸化酵素の由来は、Proteus myxofaciens(プロテウス ミクソファシエンツ)、Proteus rettgeri(プロテウス レットトゲリ)、Cellulomonas cellulans AM8(セルルロモナス セルルランス AM8)、Bacillus carotarum 2Pfa(バシルルス カロタルム 2Pfa)、Proteus vulgaris(プロテウス ブルガリス)、Proteus mirabilis(プロテウス ミラビリス)、Morganella morganii(モルガネルラ モルガニイ)、Pseudomonas sp. P−501(シュードモナス sp. P−501)、Providencia sp. PCM 1298(プロビデンシア sp. PCM 1298)、Providencia alcalifacients(プロビデンシア アルカリファシエンツ)、Corynebacterium(コリネバクテリウム)、Calloselasma rhodostoma(カルロセラスマ ロードストマ)、Crotalus terrificus terrificus(クロタルス テルリフィクス テルリフィクス)、Crotalus adamanteus(クロタルス アダマンテウス)、Crotalus atrox(クロタルス アトロックス)、Agkistrodon piscivorus piscivorus(アグキストロドン ピスシボルス ピスシボルス)、Trimeresurus mucrosquamantus(トリメレスルス ムクロスクアマンツス)、Ophiophagus hannah(オピオファグス ハンナフ)、Naja naja kaouthia(ナジャ ナジャ カオウシア)、Synechococcus PCC 7942(シネチョココクス PCC 7942)、Synechococcus PCC 6301(シネチョココクス PCC 6301)、Anacystis nidulans(アナシスチス ニズランス)、Amphiora crassissima(アンフィオラ クラスシスシマ)、Gymnogongrus flabelliformis(ジンノゴングルス フラベルリフォーミス)、Chlamydomonas reinhardtii(クラミドモナス レインハルドチイ)、Pleurochrysis(プレウロクリシス)、Neisseria meningitidis(ネイスセリア メニンジチディス)、Trichoderma viride Y244−2(トリコデルマ ビリデ Y244−2)及びNeurospora crassa(ネウロスポラ クラスサ)からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
  6. 前記L−アミノ酸デアミナーゼ又は酸化酵素の由来は、大腸菌であり、当該大腸菌は、L−アミノ酸デアミナーゼのために遺伝子でクローンされている、請求項1に記載の方法。
  7. 前記キラルのα−ヒドロキシカルボン酸塩は、ナトリウム又はカリウムの塩である、請求項1に記載の方法。
  8. 前記キラルのα−ヒドロキシカルボン酸は、置換された又は置換されていない(2R)−又は(2S)−2−ヒドロキシアルカン酸である、請求項1に記載の方法。
  9. 前記キラルのα−ヒドロキシカルボン酸は、(2R)−又は(2S)−2−ヒドロキシブタン酸、(2R)−又は(2S)−2−ヒドロキシペンタン酸、(2R)−又は(2S)−2−ヒドロキシヘキサン酸、(2R)−又は(2S)−2−ヒドロキシ−3−メチルペンタン酸、(2R)−又は(2S)−2−ヒドロキシ−4−ペンタン酸、(2R)−又は(2S)−2,3−ジヒドロキシプロパン酸、(2R)−又は(2S)−2,4−ジヒドロキシプロパン酸、(2R)−又は(2S)−3−クロロ−2−ヒドロキシプロパン酸、(2R)−又は(2S)−2−ヒドロキシ−3−メルカプトプロパン酸、(2R)−又は(2S)−2−ヒドロキシ−4−チオメチルブタン酸、(2R)−又は(2S)−フェニル酸、(2R)−又は(2S)−p−ヒドロキシフェニル酸、(2R)−又は(2S)−2−ヒドロキシ−4−フェニルブタン酸、(2R)−又は(2S)−2−ヒドロキシ−3−インドリルプロパン酸、(2R)−又は(2S)−3−メチル−2−ヒドロキシブタン酸、(2R)−又は(2S)−4−メチル−2−ヒドロキシペンタン酸、(2R)−又は(2S)−4,4−ジメチル−2−ヒドロキシペンタン酸、(2R)−又は(2S)−3−ヒドロキシ−2−ヒドロキシプロピオン酸、(2R)−又は(2S)−2−ヒドロキシ−4−フェニルブタン酸、(2R)−又は(2S)−3−(2−ピリジル)−2−ヒドロキシプロピオン酸、(2R)−又は(2S)−3−(3−ピリジル)−2−ヒドロキシプロピオン酸、(2R)−又は(2S)−3−(4−ピリジル)−2−ヒドロキシプロピオン酸、(2R)−又は(2S)−3−(1−ナフチル)−2−ヒドロキシプロピオン酸、(2R)−又は(2S)−3−(2−ナフチル)−2−ヒドロキシプロピオン酸、(2R)−又は(2S)−p−ヒドロキシフェニル−2−ヒドロキシプロピオン酸、(2R)−又は(2S)−p−F−フェニル−2−ヒドロキシプロピオン酸、(2R)−又は(2S)−α−ヒドロキシグルタン酸、(2R)−又は(2S)−2−ヒドロキシアジピン酸、(2R)−又は(2S)−2−ヒドロキシ−5−ウレイドバレン酸、(2R)−又は(2S)−2−ヒドロキシ−6−ウレイドノヘキサン酸、(2R)−又は(2S)−メルカプト−2−ヒドロキシプロピオン酸、(2R)−又は(2S)−インドール−2−ヒドロキシプロピオン酸及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
  10. 下記構造式を有するα−アミノカルボン酸塩、水和物又はそれらの塩は、
    Figure 2004511249
    ここで、Rは、水素、又は、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、ホスホニル、スルホニル、チオアセチル、チオプロピオニル、フェニル、C−Cのシクロアルキル、チエニル、ヒドロキシル、ナフチル、ピリジニル、アミノ、アミノアルキルチオ、カルボキシアルキルチオ、カルボキシアミノアルキルチオ、グアニジノ、ニトログアニジノ、ウレイド、アミノオキシ、グアニジノオキシ、OH、C−Cのアルコキシ、ベンジルオキシ、3−(2,3−ベンゾピロール)、3−(5−ヒドロキシ−2,3−ベンゾピロール)、3−(5−フルオロ−2,3−ベンゾピロール)、3−(ベンゾチオフェン)、メチルイミダジル、アミド、3−アントラニロイル、N−(3−ヒドロキシ−4−ピリドン)、リボシルアデノシンアルキルチオ、C−Cのアルキルチオ、ベンジルチオ、p−メトオキシベンジルチオ、フェニルチオ、カルバンチオイル、システエインジスルフィデ、アルキルセレノ、アルキルスルホン、アルキルスルホキシデ、アルキルスルホキシミル、ビニル、アリール、プロパルギルからなる群から選択された1以上の置換基で置換された直鎖状又は分技状C−Cのアルキルであり、かつ、
    、R、R、R及びRは、独立して、水素、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、メチル、ヒドロキシ、C−Cのアルコキシ、ベンゾロキシ、ホスホニル及びベンゾイルからなる群から選択されるものである、請求項1に記載の方法。
  11. 95%以上の対掌体の精製で、前記キラルのα−ヒドロキシカルボン酸塩の調整を含んでいる、請求項1に記載の方法。
  12. 還元工程は、電子供与体を再利用するための電子供与体と酵素/基板システムとを組合せて達成される、請求項1に記載の方法。
  13. 前記電子供与体は、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドであり、電子供与体を再利用するための前記酵素/基板システムが、蟻酸エステル脱水素酵素/蟻酸エステルである、請求項12に記載の方法。
  14. バッチ方法である、請求項1に記載の方法。
  15. 連続的方法である、請求項1に記載の方法。
  16. 酸化工程は、全体のセルで実行される、請求項1に記載の方法。
  17. 反応容器又は発酵用容器の中で下記のように実行される、請求項1に記載の方法。
    a)酸素散布を有し;
    b)L−アミノ酸デアミナーゼ(酸化する酵素)及びα−アミノカルボン酸のために遺伝子でクローンされた大腸菌の溶液からなる反応混合物を含み;
    c)蟻酸エステルイオン(共同基板)、メルカプトエタノール、ジチオトレイトール(酸化防止剤)、トリス−CI(バッファー)、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド(電子供与体)、D−乳酸塩脱水素酵素(還元する酵素)、及び、蟻酸エステル脱水素酵素(電子供与体の再生/再利用のための酵素/基板システム)の水溶液を与え;
    d)形成された化合物は、イオン交換又は溶解力のある抽出によって分離される。
  18. α−ヒドロキシカルボン酸、水和物及びそれらの塩類の製造のための組合せる酵素システムのための基板としてα−アミノカルボン酸、水和物及びそれらの塩類の使用。
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