PT620857E - Sintese de 2-hidroxi-acidos homoquirais - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "SÍNTESE DE 2-HIDROXI-ÁCIDOS HOMOQUIRAIS"

Esta invenção diz respeito a síntese quiral; mais particularmente, diz respeito à síntese de certos 2-hidroxi-ácidos homoquirais usando desidrogenases de ácido 2-oxo-carboxílico como agentes catalíticos versáteis competentes em várias circunstâncias na preparação de ambos os isómeros (R) e (S) no grupo alfa-hidroxi. A síntese de 2-hidroxi-ácidos quirais é de importância considerável, uma vez que estes compostos são intermediários sintéticos versáteis que podem ser convertidos numa variedade de compostos com retenção da quiralidade no C-2, incluindo epóxidos, ésteres de alquilo, ésteres de hidrazinilo, a-N-alquoxiamino-ésteres e α-amino-ésteres. Em geral, as reacções envolvendo substituição nucleofílica na posição 2 são optimamente realizadas via os correspondentes 2-triflato ésteres que são gerados in situ e reagem directamente com o nucleófílo escolhido. A disponibilidade dos 2-hidroxi-ácidos e -ésteres quirais que possuem um grupo funcional pró-quiral adicional na cadeia lateral, oferece enorme potencial para a síntese de compostos contendo dois ou mais centros quirais. Com este objectivo, o grupo hidroxilo ou C-2 é esperado fornecer um elemento de controlo interno, facilitando transformações estereosselectivas do grupo funcional pró-quiral. No caso de compostos β,γ-insaturados, a expoxidação irá dar acesso a intermediários do tipo Sharpless, e a desidroxilação irá produzir polióis que podem ter utilidade na síntese de hidratos de carbono. No caso do compostos 4-oxo, a redução diastereosselectiva da cetona irá proporcionar quer sin- quer anti-l,3-dióis, dependendo da escolha das condições. A química oferece, tanto nas suas formas mais tradicionais como cada vez mais via reacções catalisadas por enzimas, métodos com potencial para a síntese dos compostos de particular interesse.

Os 2-hidroxi-ácidos e -ésteres são entidades sintéticas valiosas e têm sido despendidos vários esforços no desenvolvimento de métodos para a preparação dos mesmos na forma quiral e exemplos de métodos químicos e enzimáticos são em baixo descritos. As limitações principais dos procedimentos químicos são técnicas, uma vez que todas as transformações chave envolvem o uso de reagentes sensíveis à água a baixa temperatura. Com a excepção da redução da enona, a quiralidade do produto resulta num sentido estequiométrico, quer a partir de um auxiliar quiral (controlo de substrato), quer a partir de um reductor quiral volumoso (controlo de reagente). A redução assimétrica de 2-ceto-ésteres usando o borano potássio quiral 9-0-DIPGF-9-BBNH (Brown H. C., et al, J. Org. Chem., (1986), 5J_, 3396) requer uma quantidade estequiométrica do agente redutor complexo e geralmente só proporciona acesso a 2-hidroxi-ésteres de configuração absoluta (S). A hidroxilação de enolatos deoxazolidona quiral com oxidantes de oxaziridina (Evans, D.A., et al, J. Am. Chem. Soc., (1985) 101,4346) requer que, com vista a obter 2-hidroxi-ésteres homoquirais, esta resolução cromatográfica da imida 2-hidróxi seja empreendida antes da metanólise. Este procedimento confere fracos rendimentos no caso de derivados impedidos (por exemplo, R representa Pr, Bu1). O uso de derivados da valina proporciona uma via complementar para (S)-2-hidroxi-ésteres. A carboxilação de α-alquoxicarbaniões quirais (Chan P. C. M. & Chung J. M., Tet. Lett., (1990), 31, 1985) requer uma quantidade estequiométrica do agente redutor dispendioso (S)-BINAL-H e disposição de resíduos de estanho perigosos após a fase de transmetalação. O uso de (R)-BINAL-H na primeira fase proporciona uma via complementar para (R)-2-hidroxi-ácidos. A redução enantiosselectiva de enonas catalisada por oxazaborolidinas quirais, (Corey, E.J. & Bakshi, R.K., Tet. Lett., (1990), 31, 611) obtém quiralidade de uma fonte catalítica em contraste com os métodos anteriores. A possibilidade de utilização dos antípodas ópticos do agente catalítico proporciona uma via complementar para a série enantiomérica oposta. Uma sequência de quatro conversões químicas é necessária com vista a transformar o álcool quiral inicialmente formado no 2-hidroxi-éster com as implicações óbvias de custo e rendimento. O uso publicado de enzimas encontradas na formação de a-hidroxi-ácidos quirais incluem vias com base na (R) oxinitrilase e lipase. A síntese catalisada por (R)-oxinitrilase de cianidrinas quirais por hidrólise (Zeigler, T., et al., Synthesis, (1990), 575) dá somente acesso a (R)-2-hidroxi-ácidos. Uma preparação isenta de água altamente tóxica de cianeto de -4- hidrogénio é necessária para a reacção enzimática, o que origina enantiosselecção variável até valores tão baixos como 74%. A resolução de 2-hidroxi-ésteres racémicos catalisada por lipase de Pseudomonas flourescens (Kalaritis P., et al., J. Org. Chem., (1990), 55, 812) é um de vários exemplos de resolução de isómeros cinética enzimática. Este método é inerentemente imperfeito uma vez que os rendimentos de um enantiómero particular estão limitados a um máximo de 50% a partir das resoluções do substrato assimétrico. Na prática, a percentagem de conversão tem de ser cuidadosamente controlada com vista a alcançar elevadas purezas ópticas que posteriormente reduzem o rendimento.

Pode também ser feita referência à EP-A-347374, que está relacionada com a produção de enantiómeros do ácido 2-hidroxi-4-fenil-butírico pela redução estereoespecífica do ácido 2-oxo-4-fenil-butírico usando certas enzimas desidrogenase do lactato, e à EP-A-371408, que está relacionada com pérolas biocatalisadoras, que podem ser usadas, por exemplo, na conversão do ácido oxo-4-fenilbutírico em ácido 2(R)-hidroxi-4-fenilbutírico.

Desde 1950, uma série de trabalhadores têm investigado a redução de ácidos 2-oxo-carboxílicos catalisada por S-LDH. Para estes estudos, têm sido usadas enzimas isoladas de uma variedade de fontes naturais, incluindo as obtidas de tecidos de mamíferos (por exemplo, músculo e carne de coração de coelho) e bactérias (por exemplo, Bacillus stearothermophilus). Embora estas enzimas exibam pequenas variações nas sequências de aminoácidos na periferia do esqueleto da proteína, aqueles resíduos dentro e em redor do local activo, responsáveis pela catálise da inter-conversão do 2-oxo-ácido/2-hidroxi-ácido, são conservados. Para um dado 2-oxo-ácido, uma dada actividade de enzima pode ser examinada por espectroscopia de UV e quantificada em termos da constante de Michaelis, Km, e da regeneração catalítica, Kcat. A base para este procedimento do ensaio é a forte absorvância a 340 nm do cofactor NADH reduzido comparada com a do cofactor NAD+ oxidado e a diminuição de absorvância com a concentração de NADH. A diminuição de absorvância, que é directamente proporcional à concentração de NADH, pode ser usada para estimar a razão de redução enzimática. Esta técnica é limitada por vários factores incluindo a pureza da enzima, em que a presença de outras actividades de enzima pode conduzir à oxidação do NADH e a suposição que a oxidação da actividade de NADH correlaciona-se com a formação do produto esperado.

Aproximadamente cinquenta 2-oxo-ácidos têm sido descritos na literatura como exibindo actividade mensurável contra S-LDH como determinado seguindo o curso da oxidação de NADH. O requisito chave de uma redução biocatalítica química é uma pureza isomérica bastante elevada e elevado rendimento químico que são desconhecidos para a maioria das reacções descritas na literatura e assim a sua utilidade numa reacção química continua por ser demonstrada. Para uso numa redução biocatalítica industrial, devem ser satisfeitos critérios adicionais, tal como a eficácia de custo sobre outros métodos, que é geralmente observado como uma combinação do tumover do substrato pela enzima e a sua durabilidade.

Dos cinquenta compostos observados, somente em alguns casos -6- têm sido realizadas experiências à escala preparativa, com vista a caracterizar o produto 2-hidroxi-ácido e para estabelecer a enantiosselectividade da redução. Para estas reacções, uma quantidade catalítica de NADH é usada em conjunção com um sistema regenerador, necessitando duma segunda enzima, geralmente a desidrogenase do formato (FDH), que utiliza NAD+ na oxidação do ião formato até dióxido de carbono tal como descrito por Shaked Z. & Whitesides G.M. (J. Am. Chem. Soc., (1980), 102, 7104).

Este método proporciona (S)-2-hidroxi-ácidos em bons rendimentos químicos e elevadas purezas ópticas, tal como indicado para os seis substratos na Tabela 1 em baixo. A entrada 10 serve para ilustrar a redução de um substrato mostrando uma reactividade somente 0,3% da reactividade do piruvato. Esta reacção particular é limitada pela necessidade do activador alostérico frutose 1,6-bofosfato (FBF) e leva 10,5 dias a terminar. Isto compara-se a um tempo de reacção típico de 1-3 dias noutros casos.

Com vista a obter 2-hidroxi-ácidos com configuração absoluta-(R), a redução de 2-oxo-ácidos catalisada por R-LDH tem também sido investigada. Estudos recentes (Simon, E. S., et ab, Appl. Biochem. Biotechnol., (1989), 22, 169 e Kim M. J. & Kim J. K., J. Chem. Soc. Chem. Commun., (1991), 326) têm-se concentrado em R-LDH de Leuconostoc mesenteroides (LM-R-LDH) e de Staphvlococcus epidermidis (SE-R-LDH). Somente nove compostos têm sido mostrados como exibindo actividade mensurável e destes somente os quatro compostos mostrados na Tabela 2 em baixo têm sido reduzidos numa escala preparativa. O uso de desidrogenases de ácido 2-oxo-carboxílico como agente catalítico para reduções quirais tem até à data sido restringido a somente uma variedade limitada de substratos de ácido 2-oxo-carboxílico. Compostos adicionais têm sido submetidos a certos ensaios espectrofotométricos e inferido que eles são reduzidos por actividade enzimática. O sucesso destas reacções é deixado à interpretação não à análise. Os compostos investigados como substratos têm tido tendência para antecipar os limites de possibilidade de redução útil com desidrogenase de ácido 2-oxo-carboxílico. A formação directa do 2-hidroxi-ácido homoquiral pôde ser realizada usando a desidrogenase de ácido 2-oxo-carboxílico se a especificidade a substrato for suficientemente extensa para vencer a limitação observada da taxa de regeneração necessária para um processo de qualquer coisa mais do que curiosidade académica.

Os resultados das determinações de actividade de enzima com os substratos em questão não foram particularmente encoraj antes para o uso das enzimas numa escala preparativa tal como o muito baixo tumover 0,6% - 3% do substrato natural do piruvato que, quando obtido, era esperado comprometer o sucesso da conversão química em termos de tempo, rendimento, pureza enantiomérica e eficiência de custo. A verificação da aptidão destas enzimas desidrogenase de lactato foi simplesmente como uma das inúmeras possibilidades sem particular expectativa de um resultado com qualquer utilidade comercial, mas simplesmente para auxiliar o desenho por mutagénese local dirigida de posteriores agentes catalíticos mais úteis. Estas enzimas foram assim examinadas sem incentivo real, mas, não obstante, foi verificado que um processo útil podia ser obtido a partir deste início muito pouco prometedor. A presente invenção fornece um processo para a produção de um ácido 2-hidroxi-carboxílico homoquiral ou sal do mesmo correspondendo à seguinte fórmula geral:

OH

em que R representa um dos seguintes:

O

em que R' representa uma cadeia alquilo linear ou ramificada ou fenilo opcionalmente substituído na posição para com metilo, metoxi, nitro ou amino; e R" representa hidrogénio, metilo, halogéneo ou fenilo opcionalmente substituído na posição para com metilo, metoxi, nitro ou amino; e M representa hidrogénio ou uma porção formadora de sal; caracterizado por compreender a redução de um ácido 2-ceto-carboxílico correspondente ou sal do mesmo usando uma desidrogenase de ácido (R)- ou (S)-2-oxo-carboxílico, sendo o ácido 2-ceto-carboxílico ou sal do mesmo e a respectiva desidrogenase os listados a seguir, em que "BS-S-LDH" representa a desidrogenase de (S)-lactato-de Bacillus stearothermophilus e "SE-R-LDH" representa a desidrogenase de (R)-lactato de Staphvlococcus epidermidis:

-9- Otfa OAX CO,Na

ONa OXX C02Na

BS-S-LDH

SE-R-LDH

O

BS-S-LDH

Ph C02Na

O

SE-R-LDH

Ph COzNa

C02Na

BS-S-LDH

CCzMa

SE-R-LDH -10- 0 fí f|*C02K BS-S-LOH Qtfa O I II 'Yv^NcO^a BS-S-LDH ONa 0 1 I SE-R-LDK XV/^-^N>'C02Na ONa 0 li BS-S-LDK ONa 0 SE-R-LDH ONa 0 li ?h^S^^C02 Na BS-S-LOE CNa 0 Ί II 1 Ph^^s/^CCjNa SE-R-LCH 1 j -11 -

De preferência, a redução de acordo com a presente invenção é realizada em combinação com uma reacção de reciclação de NADH.

Relativamente à fórmula geral em cima definida, a porção formadora de sal, M, pode representar sódio ou potássio e/ou o grupo alquilo, R', pode ter até 6 átomos de carbono nos casos preferidos.

Como será apreciado a partir do precedente, foram agora identificados substratos de ácido 2-oxo-carboxílico para redução enantios-selectiva usando desidrogenase do lactato obtida de Bacillus stearothermophilus (BS-S-LDH; Genzyme Biochemicals) e Staphvlococcus epidermidis (SE-R-LDH; Sigma Chemical). As reduções têm sido levadas a cabo numa escala preparativa para permitir o isolamento e caracterização de 2-hidroxi-ácidos e possuindo configuração absoluta quer (S) quer (R) na posição 2.

Os seguintes compostos foram agora preparados por redução usando a enzima desidrogenase do lactato obtida de Bacillus stearothermophilus e adicionalmente para alguns compostos usando a enzima desidrogenase do lactato obtida de Staphvlococcus epidermidis que produz a esterioquímica alternativa (R).

Compostos preparados por redução com LDH.

OH

12-

ο ΟΗ

‘C02H 13 -13-

A redução de 2-ceto-ácidos catalisada por BS-S-LDH, precursores para os compostos 1, 2, 3, 6, 8, 10 e 14, tem sido realizada numa escala preparativa (1-15 mMol) usando a combinação padrão formato/desidrogenase do formato para ciciar o cofactor NADH in situ. Os compostos 4, 5, 7, 9,11, 13 e 15 foram também preparados por redução usando a SE-R-LDH. Em cada reacção o pH óptimo foi mantido por adição periódica de ácido clorídrico diluído. A estereoselectividade de cada redução foi determinada por análises de RMN e de GC capilar do derivado de Mosher (+)-MPTA, (Dale, J.A., et al., J. Org. Chem., (1969), 34,2543) por comparação com um padrão racémico. Este é o protocolo da literatura padrão para análises quirais de derivados de 2-hidroxi-ácido e é suficientemente sensível para detectar < 0,5% do diastereómero menos abundante.

Os derivados de Mosher foram preparados por esterificação do 2-hidroxi-ácido, seguido de acilação com (+)-MTPA-Cl.

Para todas as reduções enzimáticas, os substratos apresentavam-se na forma de sais de sódio ou potássio devido à solubilidade e estabilidade melhorada sobre o ácido livre. A preparação de uma variedade estruturalmente diversa de derivados de (S) e (R)-2-hidroxi-4-oxo-ácido como mostrado pelos compostos 6 a 13 acima apresenta oportunidades para introdução de quiralidade adicional por redução da função cetona pró-quiral. A redução por hidreto dos grupos 4- - 14- carbonilo permite a síntese estereosselectiva de butirolactonas 2-hidroxi substituídas. O resultado destas experiências ilustra que uma vasta variedade de sais de diceto-ácidos pode ser rapidamente convertido em qualquer uma das quatro lactonas diastereoméricas dependendo da escolha das condições usadas para redução enzimática (S ou R-LDH) e química (sin- ou anti-selectiva).

Composto 17 O 2,4-dioxopentanoato, o material de partida para os compostos 6 e 7, foi preparado como o sal dissódico pela condensação de Claisen de acetona e oxalato de dietilo, seguido de tratamento com dois equivalentes de hidróxido de sódio aquoso, com rendimentos de 77% e 89%, respectivamente.

Os sais dissódicos dos materiais de partida dioxoácido para os compostos 8, 9, 10, 11, 12 e 13 foram preparados usando um processo de dois passos baseado no trabalho de Meister, A., Breenstein, J. P., (J. Biol. Chem., (1948), 175, 573), usando oxalato de dietilo e a metilcetona apropriada. As recuperações foram comparáveis às obtidas com o procedimento similar usado para a síntese de 2,4-dioxopentanoato acima descrito. O 2-oxo-4-fenil-butanoato, o material de partida para os compostos 14 e 15, o (E)-2-oxo-3-pentanoato, material de partida para os compostos 1 e 4 e o 3-metil-2-oxo-3-butenoato, o material de partida para os compostos 2 e 5, foram todos preparados como os sais de sódio. O método usou a adição a baixa temperatura de 1 equivalente do reagente de Grinard apropriado a oxalato de -15- dietilo, seguido de hidrólise controlada com 1 equivalente de hidróxido de sódio. Os rendimentos das reacções em duas fases mostram-se em baixo.

Produto Rendimento de Éster a Rendimento de Sal de

Partir dos Originais Sódio a Partir do Éster

O (E)-2-oxo-4-fenil-3-butenoato, o material de partida para o composto 3, foi preparado como sal de potássio pela condensação aldólica de benzaldeído e ácido pirúvico, atingindo um rendimento de 72%. Este procedimento de síntese foi aplicado à condensação de álcool de ácido pirúvico e benzaldeídos para-substituídos permitindo a preparação dos seguintes potenciais substratos: o

em que X representa Me, MeO ou NO2. -16- Síntese de ácido (E)-(S)-2-hidroxi-4-fenil-3-butenóico (Composto 3)

Uma solução de (E)-2-oxo-4-fenil-3-butenoato de potássio (214 mg, 0,1 mmol) e formato de sódio (156 mg, 2,3 mmol) em tampão Tris (5 mM, pH ajustado a 6,0 com HC1 2 M; 50 ml) foi desoxigenada fazendo borbulhar azoto através dela durante 30 minutos. NADH (14 mg, 0,02 mMol), ditiotreitol (5 μΐ de uma solução aquosa 1 M), desidrogenase de formato (10 mg, 5 U) e desidrogenase de S-lactato (Bacillus stearothermophilus. Genzyme; 5 mg de pó liofilisado = 0,7 mg de proteína, 300 U) foram adicionados sucessivamente à solução à temperatura ambiente sob azoto. A mistura foi agitada sob azoto durante 47 horas, com adição periódica de HC1 diluído (0,2 M, 3,4 ml) a partir de uma bureta para manter o pH na gama de 6,0 - 6,2. Após acidificação até pH 2 e saturação com cloreto de sódio, a mistura foi filtrada sob gravidade. O filtrado foi submetido a um processamento por acetato de etilo normal (4 x 50 ml) com salmoura (50 ml) para proporcionar o composto do título (3) como um sólido branco amorfo (151 mg, 85%). Este material era puro por ^-RMN; a recristalização a partir de éter/acetato de etilo proporcionou um sólido branco analiticamente puro, p.f. 135-6 °C, [cx]27d = +91,0° (c - 1,875, MeOH) δ (270 MHz, dé-acetona) 7,49-7,44 e 7,38-7,22 (5H, 2m, Ph), 6,84 (1H, dd, J 1,6 e 15,9 Hz, C-4-H), 6,43 (1H, dd, J 5,5 e 15,9 Hz C-3-H) e 4,86 (1H, dd, J 1,6 e 5,5 Hz, C-2-H).

As análises de RMN do derivado de Mosher indicaram uma mistura de diastereómeros numa razão de 100:1, correspondendo a um excesso enantiomérico (ee) > 98% para o ácido (S)-2-hidroxi-4-fenil-3-butenóico. -17- A substituição de (E)-2-oxo-4-fenil-3-butenoato por moléculas análogas com substituições na posição demonstrou redução por enzima com Me, MeO e NO2.

Com substituição com Me e MeO, foi obtida conversão completa após 36 horas e 48 horas, respectivamente, com rendimentos isolados de 38% e 25%. As análises da reacção foram realizadas por 'H-RMN demonstrando a viabilidade dos substratos. Síntese de ácido ('SVrEV2-hidroxi-3-pentenóico (Composto 1) A desidrogenase de (S)-lactato de Bacillus stearothermophilus (Genzyme, pó liofilisado; 2000 U) e a desidrogenase de formato (Boehringer; 5 U) foram adicionadas a uma solução desoxigenada de (E)-2-oxo-3-pentenoato de sódio (136 mg, 1,0 mmol) em tampão Tris-HCl (5 mM pH 6; 20 ml) contendo formato de sódio (82 mg, 1,2 mM), NADH (7 mg, 0,01 mM) e ditiotreitol (0,002 mM). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 48 horas, com adição periódica de HC1 0,2 M (3,4 ml) para manter um pH de 6,0-6,2. Acidificação até pH 2, seguida de saturação com sal, filtração, e processamento por acetato de etilo (3 x 20 ml) com salmoura (20 ml) deu o produto 2-hidroxi-ácido como um óleo incolor espectroscopicamente puro (114 mg, 98%). δ (270 MHz, dó-acetona) 6,03-5,98 (1H, m, C-4-H), 5,58 (1H, ddq, J 1,5 6,2 e 15,2 Hz, C-3-H) e 4,71-4,67 (1H, m inc. 3J 6,2 Hz, C-2), 1,78-1,74 (3H, m inc. 3J 6,6 Hz, C-4-H3).

As análises de 'H-RMN do derivado de Mosher do éster de metilo -18- correspondente indicaram uma mistura de diastereómeros numa razão de 98,5:1,5, correspondendo a um excesso enantiomérico > 97% para o composto do título. Síntese do ácido (R)-(E)-2-hidroxi-3-pentenóico (Composto 4)

Usando o método geral anterior para o composto 1, com a substituição de S-LDH por R-LDH de Staphilococcus epidermidis (1000 unidades, 62 mg), o pH da reacção foi mantido a 7,5. O composto do título foi produzido na reacção a 100% e deu um espectro de RMN idêntico ao do composto 1. O rendimento isolado foi 92%. As análises de !H-RMN do derivado de Mosher correspondente indicaram um excesso enantiomérico > 98% para o composto do título. O resultado foi confirmado usando medidas de GC capilar. Síntese de ácido ('SV2-hidroxi-3-metil-3-butenóico (Composto 2) A desidrogenase de (S)-lactato de Bacillus stearothermophilus (Genzyme, pó liofilisado; 1200 U) e a desidrogenase de formato (Boehringer; 5 U) foram adicionadas a uma solução desoxigenada de 3-metil-2-oxo-butenoato de sódio (136 mg, 1 mmol) em tampão Tris-HCl (5 mM pH 6; 67 ml) contendo formato de sódio (190 mg, 2,8 mmol), NADH (14 mg, 0,02 mmol) e ditiotreitol (0,007 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente sob azoto durante 76 horas, com adição periódica de HC1 0,2 M (3,0 ml) para manter um pH de 6,0-6,2. Acidifícação até pH 2, seguida de saturação com sal, filtração, e processamento por acetato de etilo (5 x 20 ml) com salmoura (20 ml) deu o produto 2-hidroxi-ácido como um sólido branco espectroscopicamente puro (76 mg, 66%). δ 5,21-5,20 (1H, m, 1H de C=CH2), 5,11-5,10 (1H, m, 1H de C=CH2) 4,69 (1H, brs, C-2-H), 1,82-1,81 (1H, m C-3-CH3).

As análises de *H-RMN do derivado de Mosher do éster de metilo correspondente indicaram uma mistura de diastereómeros numa razão de 200:1, correspondendo a um excesso enantiomérico > 99% para o composto do título. Síntese de ácido (R)-2-hidroxi-3-metil-3-butenóico (Composto 5)

Usando o método geral anterior para o composto 2, com a substituição de S-LDH por R-LDH de Stanhilococcus epidermidis (1000 unidades, 62 mg), o pH da reacção foi mantido a 7,5. O composto do título foi produzido na reacção a um rendimento de 65% e deu um espectro de RMN idêntico ao do composto 2. As análises de ^-RMN do derivado de Mosher correspondente indicaram um excesso enantiomérico > 99% para o composto do título. Este resultado foi confirmado usando medidas de GC capilar. Síntese de 2-hidroxi-4-oxo pentanoato de fSVmetilo (Composto 6)

Uma solução do sal dissódico de ácido 2,4-dioxopentanóico (2,61 g, 5 mmol) e formato de sódio (1,53 g, 22,5 mmol) em tampão Tris (5 mM pH ajustado a 6,0 com HC1 2 M; 100 ml) foi desoxigenada por borbulhamento através de azoto durante 30 minutos. NADH (106 mg, 0,15 mmol), ditiotreitol (1 μΐ de uma solução aquosa 1 M), desidrogenase de formato (75 mg, 37,5 U) e desidrogenase de S-lactato (Bacillus stearothermophilus. Genzyme; 25 mg de pó liofilisado ξ 3,5 mg de proteína, 1500 U) foram adicionados sucessivamente à solução à temperatura ambiente sob azoto. A mistura foi agitada sob azoto durante 72 horas, com adição periódica de HC1 (0,5 M, 19 ml) a partir de uma bureta para manter o pH na gama de 6,0 - 6,2. Após acidificação até pH 2, a água foi removida por evaporação rotativa a 40°C, seguida de evaporação até 0,5 mm Hg (~0,65 mbar). O resíduo foi directamente tratado com metanol anidro (75 ml), ortoformato de trimetilo (75 ml) e ácido p-tolueno-sulfónico (0,57 g, 3 mmol). Após agitação durante 3 horas, uma solução de bicarbonato de sódio (0,50 g, 6 mM) em água (2 ml) foi adicionada para temperar a reacção. Manteve-se a agitação durante 15 minutos e então a mistura foi seca (MgS04) e filtrada através de uma almofada de Celite, lavando com acetato de etilo (75 ml) através dela.

Após concentração do filtrado in vacuo. o resíduo foi triturado com acetato de etilo (60 ml) e a mistura filtrada através de uma almofada de gel de sílica (Merck 9385), lavando com acetato de etilo (3 x 20 ml) através dela. O filtrado foi concentrado para deixar um óleo âmbar (1,67 g) cujas análises de ’H RMN indicaram uma mistura do composto do título e do correspondente acetal dimetílico numa razão de ça. 1:5. O óleo foi directamente tratado com acetona (Aldrich qualidade HPLC; 80 ml) e p-tolueno-sulfonato de piridínio (50 mg, 0,2 mmol). Após agitação durante uma hora, foi adicionado bicarbonato aquoso (0,5 ml) para temperar a reacção.

Após secagem (MgS04), filtração e concentração do filtrado in vacuo, a cromatografia em coluna (gasolina/acetato de etilo, 1:1) deu o composto do título como um óleo amarelo-claro (1,07 g, 49%). δ (270 MHz, CDCI3) 4,41 (1H, dd, J 4,2 e 6,2 Hz, C-2-H), 3,68 (3H, s, C02CH3), 2,94-2,77 (2H, m, C-3-H2), 2,11 (3H, s, C-5-H3).

As análises de 'H-RMN do derivado de Mosher correspondente indicaram que tinha sido obtido produto homoquiral (> 99% de ee) com um valor de [a]24D de -11,6° (c=3,35, Me2CO). Síntese de 2-hidroxi-4-oxopentanoato de (RVmetilo (Composto 7)

Uma solução do sal dissódico de ácido 2,-4-dioxopentanóico (0,52 g, 3 mmol) e formato de sódio (0,24 g, 3,5 mmol) em tampão Tris (5 mM; pH corrigido para 7,5 com HC1 2 M;. 20 ml) foi desoxigenada fazendo borbulhar azoto através dela durante 30 minutos. NADH (28 mg, 0,04 mmol), ditiotreitol (2 ml de uma solução aquosa 1 M), desidrogenase de formato (20 U) e desidrogenase de R-lactato (Staphvlococcus epidermidis. Sigma; 500 U) foram adicionados sucessivamente à temperatura ambiente sob azoto. A mistura foi agitada sob azoto durante 69 horas, com adição periódica de HC1 diluído (0,5 M, 2,6 ml) a partir de uma bureta para manter o pH na gama de 6,0 - 6,2. Após acidificação até pH 2, a água foi removida por evaporação rotativa a 40°C, seguida de evacuação até 0,5 mm Hg (~0,65 mbar). O resíduo foi submetido a metanólise usando metanol (15 ml), ortoformato de trimetilo (15 ml) e TsOH (100 mg, 0,53 mmol) durante 5,5 horas. A mistura foi concentrada sob uma corrente de azoto e transacetilada com PPTS (10 mg) e acetona (20 ml) durante 1,5 horas. O composto do título foi obtido como um óleo amarelo-claro (0,23 g, 53%), contendo propriedades espectroscópicas idênticas ao enantiómero (S) (composto 6). As análises de *H-RMN do derivado de Mosher correspondente indicaram que tinha sido obtido produto homoquiral (> 99% de ee) com uma [cc]24d de +11,3° (c=2,2, Me2CO). Síntese de ácido (SV2-hidroxi-5-metil-4-oxo-hexanóico (Composto 8)

Uma solução do sal dissódico de ácido dimetil-2,4-dioxopentanóico (404 mg, 2 mmol) e formato de sódio (320 mg, 4,6 mmol) em tampão Tris (5 mM pH ajustado a 6,0 com HC1 2 M) foi desoxigenada fazendo borbulhar azoto através dela durante 30 minutos. NAD (2 mol %), ditiotreitol (10 μΐ de uma solução aquosa 1 M), desidrogenase de formato (10 U) e desidrogenase de S-lactato (Bacillus stearothermophilus. Genzyme; 600 U) foram adicionados à solução à temperatura ambiente sob azoto. A mistura foi agitada sob azoto durante 60 horas, com adição periódica de HC1 (0,5 M, 2,6 ml) a partir de uma bureta para manter o pH na gama de 6,0 - 6,2. Após ter sido observada completa redução, a mistura reaccional foi acidificada até pH 2 e saturada com cloreto de sódio, a mistura foi submetida a extracção com acetato de etilo normal e lavagem com salmoura. O composto do título foi isolado como um sólido branco com recuperação de 72% (0,23 g) δ (270 MHz, dó-acetona) 4,53 (1H, dd, J 5,3 e 6,2 Hz, C-2-H), 2,98-2,85 (2H, m, C-3-H2), 2,67 (1H, septeto, J 7,0 Hz, C-5-H), (1,06 (6H, d, J 7,0 Hz, C-5-Me2). O ponto de fusão do composto do título foi 66-68°C com um valor de [a]24D (c=2,24, Me2CO) de -14,8. As análises de 'H-RMN do derivado de Mosher correspondente indicaram um excesso enantiomérico > 99% para o composto do título. Síntese de ácido ÍR)-2-hidroxi-5-metil-4-oxo-hexanóico (Composto 9)

Usando o método geral anterior para o composto 8, com a substituição de S-LDH por R-LDH de Staphilococcus epidermidis (500 unidades, 25 mg), o pH da reacção foi mantido a 7,5 durante as 60 horas da reacção. O composto do título foi recuperado seguindo a extracção com acetato de etilo, como um sólido branco com rendimento de 75% (0,24 g) contendo propriedades espectroscópicas idênticas à do enantiómero (S) (composto 8). O composto do título deu um ponto de fusão de 67-68°C com um valor de [a]24D (c=2,08, Me2CO) de 14,2°. As análises de *H RMN de derivado de Mosher correspondente indicaram um excesso enantiomérico > 99% para o composto do título. Síntese de ácido (SV2-hidroxi-4-oxo-4-fenilbutanóico (Composto 10)

Usando o método geral para o composto 8, com ácido fenil-2,4-dioxopentanóico (472 mg, 2 mmol) e desidrogenase de S-lactato (Bacillus stearothermonhilus. Genzyme, 300 unidades, 5 mg), a pH 6, foi observada completa redução após 44 horas. O composto do título foi recuperado como um sólido branco com rendimento de 69% (0,27 g). δ (270 MHz, d6-acetona) 8,06 (2H, m, Ar), 7,68-7,62 (1H, m, Ar), 7,57-7,51 (2H, m, Ar), 4,73 (1H, m, C-2-H), 3,50 (2H, d, J 5,3 Hz, C-3-H2). As análises do material obtiveram um ponto de fusão de 132-134°C e um valor de [a]24D (c=2,08, Me2CO) de -1,6°. As análises de 'H RMN do derivado de Mosher correspondente indicaram um excesso enantiomérico > 99% para o composto do título. Síntese de ácido (RV2-hidroxi-4-oxo-4-fenilbutanóico (Composto 11)

Usando o método geral para o composto 8, com a substituição de S-LDH por R-LDH de Staphilococcus epidermidis (500 unidades, 25 mg), ácido fenil-2,4-dioxopentanóico (472 mg, 2,0 mmol), foi observada completa redução em 43 horas enquanto se mantinha o pH a 7,5. O composto do título foi recuperado, seguindo a extracção por acetato de etilo, como um sólido branco com rendimento de 52% (0,20 g) contendo propriedades espectroscópicas idênticas às do enantiómero (S) (composto 10). O composto do título deu um -24- ponto de fusão de 128-131°C e um valor de [a]24 (c=2,58, Me2CO) de 1,5°. As análises de 'H-RMN do derivado de Mosher correspondente indicaram um excesso enantiomérico > 96% de ee para o composto do título. Síntese de ácido (S)-2-hidroxi-4-oxodecanóico (Composto 12)

Usando o método geral para o composto 8 com ácido 2,4-dioxodecanóico (0,97 g, 4,0 mmol) e desidrogenase de S-lactato (Bacillus stearothermophilus, Genzyme, 600 unidades) com desidrogenase de formato (10 unidades), foi obtida completa redução em 55 horas. O composto do título foi obtido como um sólido branco com rendimento de 72% (0,58 g). δ (270 MHz, cU-acetona) 4,55 (1H, dd, J 4,6 e 6,9 Hz, C-2-H), 2,96-2,79 (2H, m, C-3-H2), 2,53-2,48 (2H, m, C-5-H2), 1,57-1,49 (2H, m, C-6-H2), 1,34-1,17 (6H, m, C-7, 8, 9-H2), 0,88 (3H, t, J 6,6 Hz, C-10-H3). As análises do produto revelaram um ponto de fusão de 69-70°C e um valor de [a]24 de -9,3° (c=2,39, acetona). As análises de 'H RMN do derivado de Mosher correspondente indicaram um excesso enantiomérico > 99% para o composto do título. Síntese de ácido (R)-2-hidroxi-4-oxodecanóico (Composto 13)

Usando o método geral para o composto 8 com a substituição de S-LDH por R-LDH de Staphilococcus epidermidis (250 unidades), ácido 2,4-dioxodecanóico (0,244 g, 1,0 mmol), foi obtida completa redução em 48 horas, enquanto se mantinha um pH de 7,5. O composto do título foi recuperado seguindo a extracção por acetato de etilo, a rendimento de 65% (0,13 g) contendo propriedades espectroscópicas idênticas às do enantiómero (S) (composto 12). As análises do produto revelaram um ponto de fusão de 69-71°C e um valor de [a]24 de 9,4° (c=2,05, acetona). As análises de *H RMN do derivado de Mosher correspondente indicaram um excesso enantiomérico > 99% de ee para o composto do título. Síntese de ácido (S)-2-hidroxi-4-fenil butanóico (Composto 14)

Uma solução de 2-oxo-4-fenil butanoato de sódio (2,0 g, 10 mmol) e formato de sódio (0,82 g, 12 mmol) em tampão Tris (5 mM; pH ajustado a 6,0 com HC1 2 M; 250 ml) foi desoxigenada fazendo borbulhar azoto através dela durante 30 minutos. NADH (0,35 g, 0,5 mmol), ditiotreitol (25 μΐ de uma solução aquosa 1 M), desidrogenase de formato de levedura (Boehringer, 50 mg, 33 U) e desidrogenase de S-lactato de Bacillus stearothermophilus. (Genzyme; 96 mg de pó liofilisado ξ 13 mg de proteína, 5600 U) foram adicionados sucessivamente à solução à temperatura ambiente sob azoto. A mistura foi agitada suavemente sob azoto a 35-40°C durante 94 horas, com adição periódica de HC1 diluído para manter o pH numa gama de 6,0-6,2. Após acidificação até pH 3 e saturação com cloreto de sódio, a mistura foi submetida a processamento por acetato de etilo normal (3 x 200 ml) com salmoura (200 ml) para deixar um sólido branco (1,7 g, recuperação de 94% com material de partida residual < 10%). A recristalização a partir de tetraclorometano deu ácido (S)-2-hidróxi-4-fenil-butanóico como um sólido branco amorfo (1,40 g, 77%). δ (270 MHz, CDCI3), 7,32-7,17 (5H, m Ph), 4,27 (1H, dd, J 3,9 e 8,0 Hz, C-2-H), 2,83-2,74 (2H, m, C-4-H2) e 2,25-1,95 (2H, m, C-3-H2). O composto do título deu um ponto de fusão 111,5-114°C e um valor de [a]22D de 8,3° (c=2,02, EtOH).

As análises de ]H RMN e CGC do derivado de Mosher do éster de metilo correspondente indicaram que tinha sido obtido produto homoquiral (>99% de ee). -26- Síntese de ácido (RV2-hidroxi-4-fenil butanóico (Composto 15)

Uma solução de 2-oxo-4-fenil-butanoato de sódio (601 mg, 3,0 mmol) e formato de sódio (0,34 g, 5 mmol) em tampão Tris (5 mM; pH ajustado a 7,5 com HC1 2 M), NADH (43 mg, 0,06 mM), ditiotreitol (7,5 μΐ de uma solução aquosa 1 M), desidrogenase de formato de levedura (Boehringer, 20 mg, 10 U) e desidrogenase de R-lactato de Staphvlococcus epidermidis, (Sigma; 31 mg, 500 U) foram adicionados sucessivamente à solução à temperatura ambiente sob azoto. A mistura foi agitada sob azoto durante 77 horas, com adição periódica de HC1 diluído (0,5 m; 3,9 ml) para manter o pH na gama de 7,4-7,6. Após acidificação até pH 2 e saturação com cloreto de sódio, a mistura foi filtrada sob gravidade. O filtrado foi submetido processamento por acetato de etilo normal (4 x 70 ml) com salmoura (70 ml) para proporcionar ácido (R)-2-hidroxi-4-fenil-butanóico (7) como um sólido branco amorfo (513 mg, 95% contendo propriedades espectroscópicas idênticas ao enantiómero (S) (composto 14). O composto do título deu um ponto de fusão de 113-115°C e um valor de [a] D (c=2,21, EtOH) de -8,4°. As análises de 'H-RMN e GC capilar do derivado de Mosher do éter metílico correspondente indicaram que tinha sido obtido produto homoquiral (>99% ee). Síntese de fenil-lactonas diasterioisoméricas (Compostos 16 e 17) A investigação da utilidade sintética dos compostos 4-oxo (como ilustrado por aqueles aqui descritos como compostos 6 -11) foi exemplificada -27-

com a redução por hidreto dos compostos 10, ácido (S)-2-hidroxi-4-oxo-4-fenilbutanóico e o correspondente éster metílico. O seguinte esquema ilustra as três vias de redução usadas e a razão dos compostos 16 e 17 obtida juntamente com o rendimento total.

16 17

^OH/X

Ph O

OH

Condições de redução Proporções relativas Rendimento Total (a) NaBH4/Na0H/H20 2 : 3 79% (b) 3 eq DIBAL-H/THF -78°C 50 : 1 65% metil éster do composto 10 (c) i) Me4 N+ (AcO)3 BH' 1 : 6 90% AcOH/MeCN-20°C ii) NaOH/H20 O reagente (a) utilizando boro-hidreto de sódio em álcali aquoso, seguido de acidificação até pH 2 e extracção, produziu uma mistura de ambos os compostos lactona diastereoisométricos 16 e 17. Estes compostos foram separados por cromatografia em coluna e determinados os seguintes dados espectroscópicos.

Dados espectroscópicos: 16 Vmax (película) 3422 br e 1776 cm'1; δ ((CD3)2CO) 7,42-7,34 (5H, m Ph), 5,72-5,68 (1H, m, C-4-H), 5,25 (1H, d, J 4,8 Hz, 0-H), 4,57-4,50 (1H, m, C-2-H), 2,67-2,46 (2H, m, C-3-3H2); ôc 176,3 (C-l), 140,2; 128,9; 128,4; 125,7 (Ph), 78,9; 67,4 (C-2 e C-4) e 39,2 (C-3); m/z 178 (M+; 6%), 134 (89%), 105 (39%) e 92 (100%), 17 Vmax (Nujol) 3369 br e 1762 cm·1; δ ((CD3)2CO) 7,45-7,35 (5H, m, Ph), 5,43 (1H, dd, J 5,4 e 10,9 Hz, C-4-H), 5,12 (1H, d, J 5,5 Hz), 4,78 (1H, ddd, J 5,5, 8,1 e 11,2 Hz), 3,01 (1H, ddd, J 5,3, 8,1 e 12,3 Hz, C-3-H) e 2,18-2,05 (1H, m, C-3-H); ôc 176,45; (C-l), 139,5; 128,8; 128,7; 126,1 (Ph), 76,8; 68,7 (C-2 e C-4) e 40,15 (C-3): m/z 178 (M+; 12%), 134 (68%) e 92 (100%). A atribuição da estereoquímica relativa a estes produtos foi feita com base em medidas de *H RMN, em particular um aumento de N.O.E. de 4% entre o hidrogénio do metino C-2 e sinais aromáticos do composto 16 que estava ausente do espectro do composto 17.

Excelente selectividade sin foi observada para a redução diastereosselectiva de derivados da β-hidroxi-cetona usando o reagente (b) e alcançando directamente na reacção 98% de rendimento do isómero requerido. O uso de éster de metilo permitiu a inversão desta selectividade quando combinada com o reagente (c) antes do tratamento sequencial com álcali aquoso e ácido diluído para efectuar a hidrólise do éster e lactonisação. O rendimento do composto 17 por este processo foi 86% puro comparado com os enantiómeros opostos do composto 16 directamente na reacção. -29-

Tabela 1: Reduções à escala preparativa de 2-oxo-ácidos usando S-LDH

Substrato Fonte de Rendimento Pureza Referência S-LDH Químico % Óptica %ee a 0 co2h RM 52 >97 0 H,C 11 — co2h RM 99 >99 0 h3c JL_ co2h BS 88 >99 0 RM 97 >99 H3C^NSns^'^>,^C02H 0 BS 89 >99 h3c\^^· co2h 0 -co2h RM 94 >99 0 co2h ' BS 89 >99 0 pb 11 \/ co2h RM 96 >99 0 Pb II ^ co2h BS 99 >99 b CiÍ3 >^—co2h 1 CH3 BS 86 >99 1 2 3 2 3 2 3 2 3 3 NADH regenerado usando glucose-6-fosfato e desidrogenase de glucose-6-fosfato FBP incluído na mistura reaccional RM = Músculo de Coelho (na sigla inglesa) BS = Bacillus stearothermophilus -30-

Referência 1 Hirschbein B. L. & Whitesides G. M. J. Am. Chem. Soc., (1982), 104, 4458

Referência 2 Kim M. J. & Whitesides G. M J. Am. Chem. Soc., (1988), 110,2959

Referência 3 Bur D., et al.

Can, J. Chem., (1989), 67, 1065

Tabela 2: Reduções à escala preparativa de 2-oxo-ácidos usando R-LDH

Referência

Fonte de Rendimento Pureza Substrato S-LDH Químico % Óptica %ee

1 2 1 2 2 2 LM = Leuconostoc mesenteroides SE = Staphvlococcus epidermidis

Referência 1 Simon E. S., Playnte R. & Whitesides G. M.

Appl. Biochem. Biotechnol., (1989), 22, 169

Referência 2 Kim M. J. & Kim J. Y. J. Chem. Soc. Chem. Commun., (1991), 326

Tabela 3: Reduções à escala preparativa de substratos de LDH actuais

Substrato Enzima Rendimento Pureza Químico % Óptica % ee

-32-

a) após derivação de ácido a éster de metilo.

Tabela 4:

Desvios químicos (δ) de 'H-RMN dee (R)-derivados de Mosher preparados a partir dos compostos 1-15

OH co2h OMTPA R, S-diastereoisomero C02Me 1,2,3,6,8,10,12,14

OH A OMTPA R, R- diastereoisomero co2h * R ^ ' C02Me 4,5,7,9,11,13,15

MTPA OIIc OMe ph -34-

derivados do 2-hidroxi-ácido Desvios químicos de 1h-nmr (270 MH2, CDC1-) CO, Mea CF,C- 3-Mea R,S R, R R,S R,R OH 3,76 3,79 3,55 3,65 j: ^co2h 1,4 OH s 3, 77 3,81 3,56 3, 66 c02H 2,5 OH 1 3,7 S 3,82b 3,60 3 > 70 b lí" co2h Pn 3 0 OH 3,75 3, 80 3,54 3, 64 co2h 6,7 3,75 3 ,79 3, 52 3,64 o OH 'V^^^VSC02H S,9 0 OH 3,78 3,83 3,53 3,64 Fh co2h 10,11 0 OH 1 JL 3 ? 7 5 3,79 3, 52 3,64 ^ ^co2h 12,13 OH 1 3 ,71 3,74 3,59 3, 6S 14 , 15 -35- a Correlação de desvios químicos com configuração absoluta em C-2: em todos os casos o sinal para o diastereómero R,R aparece para campos mais baixos relativamente ao sinal para o diastereoisómero R,S. b Medido a partir do espectro de RMN de padrão racémico.

Lisboa, 6 de Outubro de 2000

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 USBOA

Claims (2)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para a produção de um ácido 2-hidroxi-carboxílico homoquiral ou sal do mesmo correspondendo à seguinte fórmula geral: R OH

   C02M em que R representa um dos seguintes: R

   em que R' representa uma cadeia alquilo linear ou ramificada ou fenilo opcionalmente substituído na posição para com metilo, metoxi, nitro ou amino; e R" representa hidrogénio, metilo, halogéneo ou fenilo opcionalmente substituído na posição para com metilo, metoxi, nitro ou amino; e M representa hidrogénio ou uma porção formadora de sal; caracterizado por compreender a redução de um ácido 2-ceto-carboxílico correspondente ou sal do mesmo usando uma desidrogenase de ácido (R)- ou (S)-2-oxo-carboxílico, sendo o ácido 2-ceto-carboxílico ou sal do mesmo e a respectiva desidrogenase os listados a seguir em que "BS-S-LDH" representa a desidrogenase de (S)-lactato de Bacillus stearothermophilus e "SE-R-LDH" representa a desidrogenase de (R)-lactato de Staphvlococcus epidermidis: -2-

   -3-

   -4-
2. 2. Um processo tal como reivindicado na reivindicação 1, em que a redução é realizada em combinação com uma reacção de reciclação de NADH. Lisboa, 6 de Outubro de 2000

   Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA