DE19527054A1 - Verfahren zur Charakterisierung der Glycosylierung von Glycoproteinen sowie zur in-vitro Bestimmung der Bioverfügbarkeit von Glycoproteinen - Google Patents
Verfahren zur Charakterisierung der Glycosylierung von Glycoproteinen sowie zur in-vitro Bestimmung der Bioverfügbarkeit von GlycoproteinenInfo
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Description
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Charakterisierung
der Glycosylierung von Glycoproteinen sowie ein in-vitro Verfahren zur Bestim
mung der Bioverfügbarkeit von Glycoproteinen, das auf der "hypothetischen La
dungszahl" (im folgenden "Z" genannt) basiert und sowohl für endogene Glyco
proteine als auch exogene Glycoproteine eingesetzt werden kann.
Exogene Glycoproteine sind in diesem Zusammenhang z. B. rekombinante, aus
Säugerzellen gewonnene therapeutische Glycoproteine (wie z. B. Interleukin 2,
Erythropoietin, Gewebsplasminogen-Aktivator oder Antithrombin III). Diese Sub
stanzen haben in den letzten Jahren ein erhebliches Interesse bei wissenschaft
lichen, pharmazeutischen und behördlichen Institutionen geweckt.
Endogene Glycoproteine sind in diesem Zusammenhang humane oder nicht
humane (z. B. bovine) Serumglycoproteine (wie z. B. humanes α₁-saures Glyco
protein, humanes Transferrin oder bovines Fetuin, aber auch Glycoproteine an
derer Spezies, wie z. B. Hühner-Ovomucoid oder Schweine-Thyroglobulin.
Die Erforschung, Entwicklung und Produktion therapeutischer Glycoproteine
sowie ihre behördliche bzw. klinische Zulassung erfordert eine aufwendige Analy
tik im Hinblick auf die in vivo-Halbwertszeit, biologische Sicherheit, Produkt-De
finition und Chargenkonsistenz.
In dieser Hinsicht spielt bislang vor allem der Anteil an Sialinsäure- (N-Acetyl
neuraminsäure, Neu5Ac) als Parameter eine wichtige Rolle, da man davon aus
geht, daß das Vorhandensein bzw. Fehlen von Neu5Ac die Zirkulations-Halb
wertszeit eines Glycoproteins im Blut bzw. seine Clearance entscheidend mitbe
stimmt. Die exakte Untersuchung der Kohlenhydrat-Seitenketten eines Glycopro
teins erfordert allerdings eine sehr aufwendige und komplexe Analyse, die ein
hohes Maß an Expertise und instrumenteller Infrastruktur verlangt (wie z. B. GC-
MS, FAB-MS und hochauflösende ¹H-NMR-Spektroskopie).
Vor allem die für die Zulassung therapeutischer Glycoproteine (z. B. EPO) ver
antwortlichen Behörden verlangen auf Sicherheitsgründen immer noch die sehr
aufwendige, zeitraubende, teure aber recht ungenaue Ermittlung der therapeuti
schen Wirksamkeit des Glycoproteins in Tierexperimenten (in-vivo Assay). Vor
teilhafterweise sollte jedoch ein in-vitro Assay zur Verfügung stehen, der zum
einen einfach und zuverlässig durchzuführen ist und zum anderen den berechtig
terweise hohen Ansprüchen der Zulassungsbehörden genügt.
In Bezug auf die Durchführung von Zusatzbestimmungen ist es bereits in gewis
sem Maße gelungen, die langwierigen und teuren Methoden der Glyco-Analytik
durch standardisierbare chromatographische Verfahren zu ersetzen (Hermentin et
al. (1992) Anal. Biochem. 203, 281-289; idem., ibid., (1992) 206, 419-429).
Bislang gab es jedoch keinen Parameter, der den Anforderungen der Zulas
sungsbehörden als Ersatz für einen in-vivo Assay für die Bioverfügbarkeit eines
Glycoproteins genügt hätte.
Der vorliegenden Erfindung lag somit das technische Problem zugrunde, ein in
vitro Verfahren bereitzustellen, das geeignet ist, den Glycosylierungsgrad eines
Glycoproteins so einfach und zuverlässig zu bestimmen, daß das Verfahren ge
eignet ist, die bekannten in-vivo Verfahren z. B. zur Bestimmung von Bioverfüg
barkeit und Chargenkonsistenz zu ersetzen.
Die Lösung dieses technischen Problems erfolgt durch die Bereitstellung der in
den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen.
Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß Z hervorragend und gut repro
duzierbar mit der in in-vivo Verfahren gefundenen Bioverfügbarkeit/biologischen
Aktivität eines Glycoproteins korreliert.
Wegen der guten Reproduzierbarkeit und der analytischen Genauigkeit kann Z
vorteilhafterweise auch in einem Verfahren zur Bestimmung der Chargenkonsi
stenz eingesetzt werden.
Die vorliegenden Untersuchungen lassen den Schluß zu, daß durch Z der
"Glycosylierungs-Status" charakterisiert wird. Daher kann mittels der Bestimmung
von Z die Glycosylierung auf einfachem Wege verglichen werden.
Unter dem "Glycosylierungs-Status" eines Glycoproteins versteht man im Zu
sammenhang mit der vorliegenden Erfindung die Zusammensetzung des Glycan-
Pools aus bi- tri- und tetraantennären Glycanen und ihrem jeweiligen Sialylie
rungsgrad (dem Gehalt an gebundener N-Acetylneuraminsäure) sowie dem Ge
halt an Sulfat- oder Phosphat-Gruppen.
Unter der Bioverfügbarkeit eines Glycoprotein-Therapeutikums versteht man die
Fähigkeit des Therapeutikums, seine biologische Aktivität bzw. therapeutische
Wirksamkeit in vivo zu entfalten. Demnach werden die Bioverfügbarkeit und die
biologische Aktivität maßgeblich vom in vivo-Clearance-Verhalten, also der Ent
fernung des Therapeutikums aus der Blutzirkulation bestimmt. Beispielsweise ist
für EPO bekannt, daß es bei einem Fehlen der in den N-glycosidischen Zucker
ketten endständig gebundenen N-Acetylneuraminsäure sehr schnell über den so
genannten "asialo-Rezeptor" in der Leber aus der Blutzirkulation entfernt wird
und somit seine biologische Wirksamkeit nicht entfalten kann.
Die Z eines therapeutischen Glycoproteins korreliert überraschender Weise mit
der in vivo-Halbwertszeit des Glycoproteins und stellt somit einen völlig neuen
Meßparameter dar, der es erlaubt, das für das therapeutische Glycoprotein von
Charge zu Charge zu erwartende Clearance-Verhalten auf sehr einfache Art und
Weise im voraus abzuschätzen. Infolgedessen ermöglicht Z auch eine Aussage
über die für das Glycoprotein von Charge zu Charge zu erwartende biologische
Sicherheit und seine therapeutische Wirksamkeit. Daher kann man bei Ermittlung
von Z eines therapeutischen Glycoproteins von Charge zu Charge z. B. auf die
sehr aufwendige, zeitraubende, teure und recht ungenaue Ermittlung der thera
peutischen Wirksamkeit des Glycoproteins in Tierexperimenten (in-vivo Assay)
verzichten. Dies ermöglicht zudem einen neuen und erheblichen Beitrag zur Re
duktion von Tierexperimenten und somit zu einem verbesserten Tierschutz.
Gleichzeitig stellt die Z ein besonders geeignetes Maß für die Chargenkonsistenz
dar.
Überraschend und von besonderem Wert ist auch die Tatsache, daß man bei
endogenen Glycoproteinen, also z. B. bei einem humanem Serumglycoprotein,
bei welchem die Glycosylierung etwa mit einer Erkrankung variiert, die Z als einen
diagnostischen Meßparameter definieren kann, der mit der Krankheit korreliert
und der somit eine Aussage über die Schwere der Erkrankung zuläßt. Dies gilt
etwa bei Entzündungserkrankungen, beispielsweise für die "akute Phase Glyco
proteine", wie z. B. α₁-saures Glycoprotein, von welchem bekannt ist, daß sich die
Glycosylierung mit dem Auftreten einer Entzündung ändert (De Graaf et al. (1993)
J. Exp. Med. 177, 657-666). Dies ist ebenfalls der Fall bei Tumorerkrankungen,
bei welchen dich der Gehalt an Protein gebundener Sialinsäure (und somit die
Glycocylierung) mit dem Fortschreiten der Tumorerkrankung verändert
(Shahangian et al. (1991) Clin. Chem. 37, 200-204).
Beispielsweise läßt sich durch die Bestimmung der Z eines tumorassoziierten
Glycoproteins eines Tumorpatienten eine Aussage über das Stadium der Tumor-
Erkrankung machen, ausgehend von der Feststellung, daß sich während des Tu
morwachstums die Sialylierung ändert (Shanhangian et al., Clin. Chem. 37
(1991), 200).
Kürzlich wurden in einem Sonderband des Glycokonjugate J. (Band 12, Nr. 3,
Juni 1995) eine Reihe von Artikeln publiziert, die belegen, daß sich die Glycosy
lierung bestimmter Glycoproteine mit einer Erkrankung ändert. So eignet sich
z B. α-Fetoprotein für die Früherkennung von Hepatocarcinoma (Aoyagi, ibid.,
S. 194), Blutgruppen-verwandte zirkulierende Kohlenhydrat-Antigene als Tumor
marker (⌀rntoft und Bech, ibid., S. 200), α₁-Proteinase-Inhibitor und Haptoglobin
zur Diagnose von Ovarial-Carcinoma (Turner et al., ibid., S. 211), Transferrin für
die Charakterisierung von Cerebrospinalflüssigkeit, zur Diagnose von heimlichem
Alkoholmißbrauch und des "carbohydrate deficient glycoproteine syndrome" (De
Jong et al., ibid., S. 219) sowie Glycoformen des α₁-sauren Glycoproteins für die
Diagnose von Entzündungen und Krebs (Mackiewicz & Mackiewicz, ibid., S. 241).
Bei all diesen und weiteren Diagnosen kann Z vorteilhafterweise zur Bestimmung
des Erkrankungsstadiums eines Patienten herangezogen werden.
Wesentlich für die Erfindung ist die Erkenntnis, daß die Verteilung der ladungs
mäßig einheitlichen Glycangruppen, insbesondere solcher unterschiedlichen Sia
lylierungsgrades (asialo bis pentasialo), ein entscheidendes Merkmal für die Bio
verfügbarkeit eines Glycoproteins und die Chargenkonsistenz ist. Es ist dabei er
findungswesentlich, daß die ladungsgemäß einheitlichen Glycangruppen entspre
chend ihrer Ladung, insbesondere ihres Sialysierungsgrades, gewichtet werden.
Zusammengefaßt werden diese gewichteten Anteile in der Z.
Die Z eines Glycoproteins läßt sich sehr gut und genau bestimmen, z. B. durch
die Verwendung eines optimierten und standardisierten chromatographischen
Verfahrens, wie es kürzlich beschrieben wurde (Hermentin et al. (1992) Anal.
Biochem., 203, 281-289).
Die Z eines Glycoproteins wird dadurch bestimmt, daß man
- a) den Glycan-Pool des Glycoproteins in an sich bekannter Weise entweder auf chemischem Wege z. B. (mittels Hydrazinolyse) oder auf enzymatischem Wege (z. B. mittels PNGase F) freisetzt und isoliert,
- b) denselben in an sich bekannter Weise mittels Ionenaustausch-Chromato graphie (bevorzugt mittels HPAE-PAD) primär nach Ladung auftrennt,
- c) die prozentualen Flächenanteile der ladungsmäßig getrennten Peak- bzw. Glycangruppen in an sich bekannter Weise bestimmt,
- d) die prozentualen Flächenanteile der Peak- bzw. Glycangruppen im neutralen (asialo-, as), monosialo- (MS), disialo- (DiS), trisialo- (TriS), tetrasialo- (TetraS) und pentasialo (PentaS)-Bereich mit null (asialo) bzw. 1 (MS) bzw. 2 (DiS) bzw. 3 (TriS) bzw. 4 (TetraS) bzw. 5 (PentaS) multipliziert und
- e) über die jeweils erhaltenen Produkte aufsummiert.
Im Hinblick auf die Bestimmung von Z können die Asn-verknüpften Zuckerketten
der Glycoproteine in an sich bekannter Weise prinzipiell auf zwei Arten freigesetzt
werden - nämlich entweder auf chemischem Wege (z. B. mittels Hydrazinolyse)
oder enzymatisch (z. B. mittels N-Glycanase bzw. PNGase F). Das enzymatische
Verfahren erfordert von Fall zu Fall zu optimierende Reaktionsbedingungen -
etwa einen voranzustellenden tryptischen Verdau des Glycoproteins oder den Zu
satz eines geeigneten Detergenz. Und auch die Hydrazinolyse erfordert speziel
les Know-how, wenn man die Nebenreaktionen minimieren möchte. Sie kann je
doch heute mit einem Gerät der Fa. Oxford GlycoSystems (dem GlycoPrep 1000)
vollautomatisch durchgeführt werden.
In der HPAEC werden die N-Glycane primär nach Ladung, d. h., nach der Anzahl
ihrer Sialinsäure-Reste aufgetrennt (Hermentin et al. (1992) Anal. Biochem. 203,
281-289), weshalb sie sich für die Bestimmung der Z von Glycoproteinen in vor
züglicher Weise eignet.
So wurde gefunden, daß sich beim Mapping der N-Glycan-Pools von Glycoprotei
nen mittels HPAE-PAD die Glycane gleicher Ladung - das sind in der Regel
Glycane mit der gleichen Anzahl an Neu5Ac-Resten - meist in deutlich voneinan
der getrennte Peakgruppen zusammenfassen lassen. Dies wird am Beispiel des
Glycan-Pools von rhu IL-4R (CHO) beispielhaft dargestellt (Fig. 1). Bewährt hat
sich dabei die Verwendung zweier internaler Standards, von denen der eine (S1 =
z. B. LNnT oder LNFP-V, Oxford GlycoSystems) vor den einzelnen Peaks des
Glycan Pools und der andere [S2 = (Neu5Ac)3] nach den einzelnen Peaks des
Glycan-Pools eluiert, so daß dich die detektierten Glycane stets im RT-Bereich
zwischen den beiden Standards befinden und sich ihre Gesamtpeakfläche, die
100% entspricht, mit Hilfe der Chromatographie-Auswertesoftware leicht ermitteln
läßt. Die Gesamtpeakfläche erhält man somit durch Integration und Summation
der Peaks, die sich zwischen den Retentionszeiten der beiden Standards S1 und
S2 befinden. Auf demselben Wege lassen sich auch die ladungsmäßig getrenn
ten Peakgruppen mit 0, 1, 2, 3, 4 und 5 negativen Ladungen integrativ
zusammenfassen und ihre jeweilige Peakgruppenfläche "F" als prozentualen An
teil der Gesamtpeakfläche des Glycan-Pools errechnen. Dabei wird für sämtliche
Glycane der gleiche Responsefaktor angenommen.
Die Berechnung der hypothetischen Ladungszahl Z erfolgt nach Gleichung I:
Z = F(as) * 0 + F(MS) * 1 + F(DiS) * 2 + F(TriS) * 3 + F(TetraS) * 4 +
F(PentaS) * 5 (I)
wobei F(as), F(MS), F(DiS), F(TriS), F(TetraS) und F(PentaS) jeweils
den prozentualen Anteil der Peakgruppenfläche im asialo-, monosialo
disialo-, trisialo-, tetrasialo- bzw. pentasialo-Bereich darstellt, bezogen auf
die Peakflächen = 100%.
Auf diese Weise erhält man für ein Glycoprotein, welches überwiegend tetraan
tennäre tetrasialo-(C4-4*)-Strukturen aufweist, wie z. B. rekombinantes Erythro
poietin, eine Z von etwa 400. Analog erhält man für ein Glycoprotein, welches
überwiegend triantennäre trisialo-(C3-3*)-Strukturen aufweist, wie z. B. bovines
Fetuin, eine Z von etwa 300 und für ein Glycoprotein, welches überwiegend
biantennäre disialo-(C2-2*)-Strukturen aufweist, wie z. B. humanes Antithrombin
III, eine Z von etwa 200. Für ein Glycoprotein, welches beispielsweise nur asialo-
Strukturen aufweist, wie z. B. Rinder-Pankreas-Ribonuclease B, oder sogenannte
"trunkated forms" (Rumpfstrukturen) aufweist, wie z. B. Hühner-Ovomucoid, erhält
man eine Z von etwa 0.
In analytischer Hinsicht ist es wünschenswert, den aus einem Glycoprotein isolier
ten Glycan-Pool zunächst chromatographisch nach dem Grad der Sialylierung
aufzutrennen, bevor dann je nach Bedarf weitere Trennmethoden zum Einsatz
kommen. Dies kann mittels Anionen-Austauschersäulen erfolgen, wie etwa
GlycopacTM DEAE (Waters), Mono QTM (Pharmacia), Gen-PakTM FAX
(Waters) oder mittels der HPAEC (high-pH anion-exchange chromatography) an
pellicularen Anionenaustauscher-Harzen (CarboPak PA-1TM oder CarboPak PA-
100TM, Dionex) (Lee und Rice (1994) in: "Glycobiology - A Practical Approach",
Kapitel 3C, S. 127-163, IRL Press, Herausgeber: Fukuda und Kobata).
Kürzlich wurde gezeigt, daß die "high-pH anion-exchange chromatography with
pulsed amperometric detection" (HPAE-PAD) die Kriterien für eine schnelle,
kostengünstige und vor allem gut reproduzierbare chromatographische Methode
zur strukturellen Zuordnung der Oligosaccharid-Ketten von Glycoproteinen in vor
züglicher Weise erfüllt (Hermentin et al. (1992) Anal. Biochem. 203, 281-289;
Hermentin et al. (1992) Anal. Biochem. 206, 419-429). Bei diesem Verfahren er
folgt die Trennung der Oligosaccharide unter alkalischen Bedingungen an einer
Anionenaustauscher-Säule (CarboPac PA-1 oder CarboPac PA-100 der Fa.
Dionex). Dieses Verfahren trennt die vom Glycoprotein isolierten N-Glycane zu
nächst nach ihrer Ladung und ermöglicht so eine Aussage über die Zusammen
setzung des N-Glycan-Pools aus neutralen (asialo) sowie mono-, di-, tri- und te
trasialo-Stukturen (also N-Glycanen mit null bis vier negativ geladenen Neura
minsäure-Resten). Die Vermessung der Zucker erfolgt sehr selektiv und sensitiv -
und ohne Derivatisierung der Glycane - durch gepulste amperometrische Detek
tion an einer Goldelektrode.
Die Bestimmung von Z wurde in zahlreichen Experimenten mit rhu IL-4R (einem
therapeutischen Glycoprotein der Behringwerke AG) beispielhaft validiert. Dabei
konnte gezeigt werden, daß die hypothetische Ladungszahl als ein neuer, aussa
gekräftiger, verläßlicher und charakteristischer Parameter für die Protein-Glyco
sylierung angesehen werden kann.
Im folgenden finden sich verschiedene Beispiele für die Bestimmung von Z aus
den erhaltenen HPAE-PAD-Chromatogrammen. Hierzu wurden die Glycane aus
verschiedenen Glycoproteinen in an sich bekannter Weise entweder mittels
automatisierter Hydrazinolyse (unter Verwendung des GlycoPrep 1000TM, Oxford
GlycoSystems, OGS) oder auf enzymatischem Wege (mittels PNGase F) freige
setzt und isoliert oder von der Firma Oxford GlycoSystems direkt als Glycan Pools
eingekauft und mittels HPAE-PAD im Standardgradienten "S" (Hermentin et al.
(1992) Anal. Biochem. 203, 281-289) vermessen.
Die Bestimmung der Z ist am Beispiel des HPAE-PAD Chromatograms von rhu IL-
4R (Fig. 1) beispielhaft aufgezeigt; die zugehörige Berechnung findet sich in
Tabelle 1. Für alle anderen Beispiele erfolgte die Bestimmung von Z analog.
Die Bestimmung der Z für α₁-saures Glycoprotein (AGP) weicht von der Bestim
mung der anderen genannten Glycoproteinen etwas ab, weil AGP in seinen N-
Glycanen antennäre Fucose-Reste aufweist (Hermentin et al. (1992) Anal.
Biochem. 206, 419-429). Derartige N-Glycane eluieren in der HPAEC im Stan
dard-Gradienten "S" im Vergleich zum korrespondierenden nicht-fucosylierten N-
Glycan um etwa 4 min früher. Deshalb kommt es im Falle des N-Glycan Pools von
AGP nicht zu der in den anderen Beispielen beobachteten sauberen Trennung in
ladungsmäßig einheitliche Peakgruppen, sondern zu einer Überlagerung dieser
Peakgruppen (Hermentin et al. (1992) Anal. Biochem. 206, 419-429). Die Be
stimmung der hypothetischen Ladungszahl erfolgte im Falle von AGP in Anleh
nung an die ladungsmäßige Peak-Zuordnung nach Hermentin et al. (1992) (Anal.
Biochem. 206, 419-429). Auf diese Weise wurde die Z in den Beispielen 9 und 10
bestimmt.
In den Fällen, wo die N-Glycane eines Glycoproteins neben Neuraminsäure z. B.
auch Sulfatgruppen enthalten, erfolgt die Bestimmung der Z z. B. so, daß die la
dungsmäßig getrennten Peakgruppen, die im Chromatogramm im Bereich von 6
oder 7 Ladungen liegen, mit 6 bzw. 7 multipliziert werden.
Die für eine Reihe von Glykoproteinen bestimmte Z sind in Tabelle 3 zusammen
gefaßt.
Die nachstehend genannten Beispiele schränken die Erfindung nicht ein.
Die Bestimmung von Z wurde mit rhu IL4R (CHO) als Referenz-Glycoprotein
validiert. Hierzu wurde der Glycan-Pool der IL4R-Probe (Charge E4-930914,
Behringwerke AG) an 3 verschiedenen Tagen in 6 verschiedenen Ansätzen mit
tels automatischer Hydrazinolyse - in Gegenwart von LNFP-V als internalem
Standard S1 - (GlycoPrep 1000TM, Oxford GlycoSystems; gleichzeitige Hydrazi
nolyse an beiden Reaktoren; Ansatz jeweils 1 mg IL4R pro Reaktor) freigesetzt
und isoliert. Jeder der 6 Glycan-Pools wurde über Sephadex G-25 superfein
(Pharmacia) (Säulenfüllung 21 × 1 cm) entsalzt und dreimal (an drei verschiede
nen Tagen; jeweils unter Zusatz von S2 = (Neu5Ac)3) in der HPAE-PAD vermes
sen, und aus dem jeweils erhaltenen Chromatogramm wurde anhand von Glei
chung 1 jeweils Z bestimmt. In Tabelle 1 sind die jeweils integrierten Peakflä
chenanteile für jeden der 18 HPAE-PAD-Einzelläufe sowie die jeweils durchge
führte Summation gemäß Gleichung 1 detailliert aufgeführt. Als illustratives Bei
spiel und Referenz-Lauf dient das HPAE-PAD-Mapping-Chromatogramm aus
Fig. 1.
Dabei wurde Z für die genannte IL-4R-Probe mit Z = 201+/- 3 (VK = 1.4%) mit
sehr hoher Reproduzierbarkeit bestimmt (Tabelle 2).
In einem zweiten Validierungs-Experiment wurde die Hydrazinolyse in 6 verschie
denen Ansätzen analog Beispiel 1 a) mit 0.5 mg rhu IL4R pro Reaktor durchge
führt und gemittelt. Dabei wurde die Z mit Z = 194+/- 5 (VK = 2.3%) bestimmt
(Tabelle 2).
Die Freisetzung der N-Glycane erfolgte nach Reduktion des Glycoproteins (500
µg) mittels Dithioerythrol (DTE; 25 µl einer 0.3 M wäßrigen DTE-Lösung) während
10 min bei 70°C. Der Überschuß an DTE wurde durch Ankonzentrierung in einer
Centricon-Kartusche mit Ausschlußgrenze 10.000 D (Fa. Amicon) entfernt, und
das Konzentrat wurde dreimal mit Glycanase-Verdaupuffer im Centricon-Röhr
chen nachgewaschen. Dann wurde das Konzentrat in ein Eppendorf-Hütchen
überführt und in Glycanase-Verdaupuffer (500 µl) a) mit und b) ohne die Gegen
wart von 0.5% CHAPS mittels PNGase F (Boehringer Mannheim; 5 units) in 50
mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7.6 für 48 h bei 37°C verdaut.
Nach Entsalzung analog Beispiel 1a wurden folgende Z bestimmt:
- a) (ohne CHAPS): Z = 208;
- b) (mit CHAPS): Z = 206 (Tabelle 2).
Somit konnte gezeigt werden, daß durch den Zusatz des Detergenz CHAPS keine
Verbesserung der Deglycosylierung erzielt werden kann.
- c) Alternativ wurde rhu IL-4R nach Reduktion mittels Dithiothreitol (DDT) car boxamidomethyliert und mittels Trypsin verdaut, wie bei Hermentin et al. (Anal. Biochem. (1992), 206, 419) beschrieben. Danach erfolgte die Glycan- Freisetzung analog Beispiel 2b) in Gegenwart von 0.5% CHAPS. Dabei wurde die Z zu Z = 200 bestimmt (Tabelle 2).
- d) Analog Beispiel 2c) erfolgte der Verdau des rhu IL4R mittels des Enzyms Lys C anstelle des Enzyms Trypsin.
Ansonsten wurde wie in Beispiel 2c) verfahren. Dabei wurde die Z zu Z = 204
bestimmt (Tabelle 2).
Der Mittelwert aus den gemäß den Beispielen 2a)-2d) bestimmten Ladungszahlen
beträgt Z = 204,5 ± 34 (VK = 1.7%) (Tabelle 2).
Die Hydrazinolyse erfolgte analog Beispiel 1b mit 0.5 mg rhu IL-4R.
Für die Z wurde Z = 243 bestimmt.
Die Freisetzung der N-Glycane erfolgte analog Beispiel 2a) bzw. 2b).
Es wurden folgende Z bestimmt: a) (ohne CHAPS) Z = 241;
b) (mit 0.5% CHAPS) Z = 246; Mittelwert Z = 243.5 ± 3.5 (1.5%) (Tabelle 2).
Diese beiden Z stehen in guter Übereinstimmung mit der unter Beispiel 3a nach
Hydrazinolyse bestimmten Ladungszahl von Z = 243, so daß für die Charge B11-
930406 von rhu IL-4R ein Z von Z = 243 angegeben werden kann (Tabelle 2).
Somit wurde gefunden, daß das Material aus Klon B11-930406 (Z = 243)
(Beispiele 3 und 4) gegenüber dem Material aus Klon E4-930914 (Z = 204.5)
(Beispiele 1 und 2) - bei gleichen Kultivierungs-, Ernte- und Aufreinigungsbedin
gungen - einen größeren Anteil an höher geladenen bzw. höher-antennären
Glycanen aufweist.
Eine Präparation von aus BHK-Zellen gewonnenem löslichem murinem Inter
leukin-4-Rezeptor (rmur IL-4R, Behringwerke AG) wurde in an sich bekannter
Weise über ein Anionenaustauscher-Harz (Q-Sepharose, Pharmacia) in 5 Frak
tionen Q1-Q5 aufgetrennt (Fig. 2). Die Analytik der Einzelfraktionen (isoelek
trische Focussierung Sialinsäure-Bestimmung, Gehalt an Monosaccharid-
Komponenten) wurde in an sich bekannter Weise durchgeführt. Das IEF-
Bandenmuster wurde in an sich bekannter Weise mittels einer Gel-Auswerte
software gescanned. Die erhaltenen Banden-Scans sind in Fig. 3 dargestellt.
Die in an sich bekannter Weise gewonnenen analytischen Daten sind in Tabelle
3 ausgewiesen.
Die Bestimmung des Gehalts an N-Acetylneuraminsäure (NeusAc; Sialinsäure)
erfolgte nach Hermentin und Seidat (in: GBF Monographs, Vol 15, pp 185-188, H.
S. Conradt, ed., VCH, Weinheim/New York/Cambridge).
Die Monosacchrid-Bestimmung erfolgte in an sich bekannter Weise nach Hardy et
al. (Anal. Biochem. (1988) 170, 54-62). Aus dem Ergebnis der Monosaccharid-
Analytik wurde der Quotienten Neu5Ac/Gal (mol/mol) bestimmt.
Da Neu5Ac bei normalen N-Glycanen stets an antennäre Galactose-Reste ge
bunden ist, erlaubt der Quotient aus Neu5Ac/Gal (mol/mol) eine Berechnung des
Gehalts an terminaler Galactose. Die terminale Galactose der N-Glycane
wiederum beeinflußt das Clearance-Verhalten eines Glycoproteins, da Glycopro
teine mit terminaler Galactose in den N-Glycanen über den sogenannten asialo-
Rezeptor in der Leber aus dem Blut eliminiert werden. Der Sialylierungsgrad
(Neu5Ac/Gal; mol/mol) erlaubt somit eine Aussage über die zu erwartende
Clearance eines Glycoproteins in der Leber. Die Bestimmung des Sialylierungs
grads gestaltet sich jedoch als relativ ungenau, da sich im Sialylierungsgrad die
Varianzen beider Tests (der Neu5Ac- und der Gal-Bestimmung) addieren. Daher
ist ein genauerer Parameter notwendig, der das Clearance-Verhalten eines
Glycoproteins bei in vivo-Applikation beschreibt.
Aus dem Ergebnis der Monosaccharid-Analytik wurde ferner der Quotient aus
dem molaren Anteil an Mannose und Galactose (Man/Gal; mol/mol) ermittelt, der
einen Hinweis auf die Zusammensetzung der N-Glycane aus "high-mannose"-
Strukturen und "complex-type"-Strukturen erlaubt.
Das Man/Gal-Verhältnis erlaubt ebenfalls eine Aussage über das zu erwartende
Clearance-Verhalten eines Glycoproteins, da Glycoproteine mit "high mannose"-
Strukturen ebenfalls über einen Rezeptor in der Leber (den sogen. "high
mannose"-Rezeptor) aus der Blutzirkulation entfernt werden. Da der Gehalt an
"high-mannose"-Strukturen in die Berechnung der hypothetischen Ladungszahl
gemäß Gleichung 1 mit eingeht, reflektiert Z auch den Gehalt an "high-Man-
Strukturen" und erlaubt somit auch eine Vorhersage der Clearance über den
"high-Man-Rezeptor".
Die Z wurde für die Einzelfraktionen analog Beispiel 1 bestimmt.
Des weiteren wurden die Einzelfraktionen in an sich bekannter Weise auf ihr
Clearance-Verhalten im Mausmodell (AUD) überprüft (Tabelle 3).
Hierzu wurden Aliquote der Einzelfraktionen in Mäuse injiziert und die Clearance
von rmur IL-4R aus dem Mäuseblut im ELISA verfolgt.
Die Clearance-Rate von IL-4R wurde wie folgt bestimmt:
Weibliche BALB/C-Mäuse erhielten in die Schwanzvene eine Bolus-Injection von IL4R (10 µg 0.2 µg/kg). Fünf, 10 und 30 min. nach Applikation wurden mittels Punktion des retroorbitalen Venenkomplexes Blutproben zur Serumgewinnung entnommen. Die IL-4R-Konzentration in der jeweiligen Serumprobe wurde mittels eines ELISA bestimmt. Die Kurve der im Serum bestimmten IL4R-Konzentration gegen die Zeit (AUD5-30) wurde unter Anwendung der sogenannten Trapez- Regel (Koch (1985), Apoth. Ztg., 29, 315) berechnet. Hieraus wurde die initiale Clearance (Gl5-30) nach der Gleichung Cl5-30 Dosis/AUD5-30) berechnet.
Weibliche BALB/C-Mäuse erhielten in die Schwanzvene eine Bolus-Injection von IL4R (10 µg 0.2 µg/kg). Fünf, 10 und 30 min. nach Applikation wurden mittels Punktion des retroorbitalen Venenkomplexes Blutproben zur Serumgewinnung entnommen. Die IL-4R-Konzentration in der jeweiligen Serumprobe wurde mittels eines ELISA bestimmt. Die Kurve der im Serum bestimmten IL4R-Konzentration gegen die Zeit (AUD5-30) wurde unter Anwendung der sogenannten Trapez- Regel (Koch (1985), Apoth. Ztg., 29, 315) berechnet. Hieraus wurde die initiale Clearance (Gl5-30) nach der Gleichung Cl5-30 Dosis/AUD5-30) berechnet.
Wie aus den in Fig. 3 ausgewiesenen Scans der IEF-Banden ersichtlich, erge
ben sich in der IEF kontinuierlich verlaufende Unterschiede im Bandenmuster der
Glycoformen für die Fraktionen Q1 bis Q4, während sich die Fraktionen Q4 und
Q5 in der IEF als nicht unterscheidbar erweisen. Die isolektrische Focussierung
birgt jedoch den Nachteil, daß sie quantitativ nicht oder nur sehr schwer faßbar ist
und somit in erster Linie nur einen qualitativen Meßparameter abgibt.
Der Sialinsäure-Gehalt nimmt von Fraktion Q1 (13.6 µg/mg) nach Fraktion Q4
(109.5 µg/mg) kontinuierlich zu, während er sich in den Fraktionen Q4 und Q5 als
praktisch identisch erweist (Tabelle 3). Die Ergebnisse der Sialinsäure-Be
stimmung korrelieren daher gut mit den Ergebnissen der isoelektrischen Fokus
sierung.
Ähnlich wie der Sialinsäure-Gehalt, jedoch weniger ausgeprägt steigt auch der
Sialylierungsgrad (Quotient Neu5Ac/Gal) von Fraktion Q1 (0.20 Neu5Ac-Reste
pro Galactose-Rest) nach Fraktion Q4 (0.67 Neu5Ac-Reste pro Galactose-Rest)
an, fällt jedoch in Fraktion Q5 (0.63 Neu5Ac-Reste pro Galactose-Rest) wieder in
etwa auf den Wert der Fraktion Q3 (0.62 Neu5Ac-Reste pro Galactose-Rest) ab
(Tabelle 3). Dieser Abfall des Analysenwerts von Fraktion Q5 auf den Wert der
Fraktion Q3 wurde weder bei der Sialisäure-Bestimmung noch bei der
isoelektrischen Focussierung beobachtet. Es ist daher zu vermuten, daß der Sia
lylierungsgrad (Neu5Ac/Gal; mol/mol) einen weniger verläßlichen Parameter
darstellt als die Neu5Ac-Bestimmung oder die isoelektrische Focussierung, weil
sich im Quotienten des Sialylierungsgrads die Ungenauigkeiten der beiden Ein
zeltests (also der Neuraminsäure-Bestimmung und Monosaccharid-Komponen
tenanalytik) addieren.
Umgekehrt nimmt der Quotient Man/Gal von Fraktion Q1 (3.02 mol/mol) nach
Fraktion Q4 (1.04 mol/mol) kontinuierlich ab und bleibt in Fraktion Q5 im Rahmen
der Meßgenauigkeit praktisch konstant (0.98 mol/mol) (Tabelle 3). Der Quotient
Man/Gal erscheint wegen seines von Fraktion Q1 nach Q5 kontinuierlichen
Verlauf wiederum als ein verläßlicher und aussagefähiger Parameter - ähnlich
wie die Neu5Ac-Bestimmung und die isoelektrische Focussierung.
Die gemäß Gleichung 1 bzw. Beispiel 1 bestimmte Z nimmt, wie zu erwarten,
parallel rum Sialinsäure-Gehalt zu und verläuft kontinuierlich von Z = 147
(Fraktion Q1) nach Z = 248 (Fraktion Q4) während sie von Fraktion Q4 (Z = 248)
nach Fraktion Q5 (Z = 247) konstant bleibt (Tabelle 3). Somit spiegelt die
Bestimmung von Z sehr gut sowohl die Ergebnisse der Sialinsäure-Bestimmung
als auch den qualitativen Verlauf der isoelektrischen Focussierung wieder und er
scheint (wie die Neu5Ac-Bestimmung und die IEF) der Bestimmung des Sialylie
rungsgrads (Neu5Ac/Gal; mol/mol) überlegen. (Daß sich die Bestimmung von
aber auch gegenüber der Neu5Ac-Bestimmung als überlegen erweist, wird im
nachfolgenden Beispiel 6 gezeigt).
Das Clearance-Verhalten (AUD, area under data; µg/ml*min) der Fraktionen Q1-
Q5 wurde ebenfalls in an sich bekannter Weise bestimmt. Dabei ist die Zirkulati
ons-Halbwertszeit des IL-4R im Blut der Maus umso größer, je größer die AUD.
Wie Tabelle 3 zu entnehmen, steigt die AUD von Fraktion Q1 (AUD = 1) nach
Fraktion Q5 (AUD = 86) kontinuierlich an. Somit ergibt sich eine gute Korrelation
der AUD mit der IEF, dem Sialinsäure-Gehalt, dem Quotienten Man/Gal (mol/mol)
und der Z für die Fraktionen Q1-Q4. Lediglich für Fraktion Q5 ergibt sich eine
Abweichung der AUD von den genannten Meßparametern. Somit wurde
gefunden, daß die Clearance eng mit der Ladungszahl korreliert und daß Z - im
Vergleich mit einem geeigneten Standard - eine gute Aussage über das zu
erwartende Clearance Verhalten eines Glycoproteins bei in vivo-Applikation
erlaubt.
Ob es sich bei dieser Abweichung der AUD von den restlichen analytischen
Meßwerten um einen realen Sachverhalt oder um einen Artefakt (Ausreißer)
handelt, konnte mangels Materials nicht reproduziert werden. Ferner ist festzu
halten, daß die AUD aus Tierschutz-Gründen jeweils nur mit einer Maus pro AUD-
Meßpunkt ermittelt wurde, was die Verläßlichkeit des AUD-Wertes im Vergleich
zu den analytischen Meßwerten relativiert.
Die Z besitzt somit für die Vorhersage des zu erwartenden Clearance-Verhaltens
eines Glycoproteins in vivo den besonderen Vorteil, daß Z gemäß Gleichung 1
sowohl die zu erwartende Clearance aber den asialo-Rezeptor als auch die zu
erwartende Clearance über den high-Man-Rezeptor erfaßt und somit eine ge
nauere Vorhersage über des zu erwartenden Clearance-Verhaltens ermöglicht,
als jede andere der genannten Analysenmethoden.
Zur Bestimmung der Lagerungsfähigkeit von IL-4R im Fermenter-Erntemedium
wurden Aliquots der Ernten bei verschiedenen Temperaturen (RT, +4°C, -20°C
und -70°C) gelagert. Zum Zeitpunkt Null sowie nach 1, 2 und 3 Monaten wurden
Aliquots entnommen. Aus diesen Aliquots wurde der IL-4R in an sich bekannter
Weise mittels Affinitätschromatographie an einem immobilisierten anti-IL-4R
monoklonalen Antikörper aufgereinigt. Von den gereinigten IL-4R-Proben wurde
jeweils der Neuraminsäure-Gehalt sowie die Z (analog Beispiel 1) bestimmt. Die
Ergebnisse sind in Fig. 4 zusammengefaßt.
Wie aus Fig. 4a ersichtlich, erwies sich die Z für die bei -70°C und -20°C gela
gerten Proben als konstant, fiel jedoch bei den bei +4°C deutlich und bei den bei
RT gelagerten Proben mit zunehmender Lagerdauer massiv ab.
Die Ergebnisse der Neuraminsäure-Bestimmung (Fig. 4b) sind von deutlich
geringerem Aussagewert, obwohl sich eine der Ladungszahl analoge Tendenz
erkennen läßt. Somit liegt auf der Hand, daß die Bestimmung der Ladungszahl in
analytischer Hinsicht der Neuraminsäure-Bestimmung überlegen ist. Der Vorteil
gründet in der hohen Genauigkeit, mit welcher sich die Ladungszahl bestimmen
läßt - mit dem besonderen Vorteil, daß für die Bestimmung der Ladungszahl - im
Gegensatz zur Neuraminsäure-Bestimmung - der Bezug auf die (Glyco)Protein-
Konzentration nicht erforderlich ist und somit die Ungenauigkeit der
Proteinbestimmung nicht in das Testergebnis eingeht.
Somit konnte gezeigt werden, daß sich Z in hervorragender Weise als Parameter
zur Überprüfung der Lagerungsstabilität eines Glycoproteins eignet.
Die Freisetzung der N-Glycane erfolgte aus rhu EPO (BHK) (Merckle AG) mittels
PNGase F in an sich bekannter Weise (Nimtz et al., Eur. J. Biochem. (1993) 213,
39).
Die Z wurde analog Beispiel 1 mit Z = 323 bestimmt (Tabelle 4).
Von Nimtz et al. (Eur. J. Biochem. (1993) 213, 39-56) wurde die Glycosylierung
von rhu EPO (BHK) (Merckle AG) in einer detaillierten analytischen Studie (mittels
GC-MS, FAB-MS und ¹H-NMR) sehr ausführlich untersucht. Demnach enthält der
N-Glycan Pool des besagten rhu EPO (BHK) 40.9% tetrasialylierte, 35.0% trisia
lylierte und 21.1% disialylierte N-Glycane. Aus diesen Angaben errechnet sich für
den N-Glycan-Pool unter Verwendung von Gleichung 1 eine Z von Z = 40.9 × 4 +
35.0 × 3 + 21.1 × 2 = 311. Überraschenderweise steht diese nach den Angaben von
Nimtz et al. errechnete Ladungszahl von Z = 311 in sehr guter Übereinstimmung
mit der gemäß Beispiel 1 errechneten Ladungszahl von Z = 323. Der Unterschied
beider Ladungszahlen beträgt 12, was einer prozentualen Differenz von weniger
als 4% entspricht. Die Bestimmung der Ladungszahl nach Beispiel 1 gestaltet sich
jedoch vergleichsweise sehr viel billiger, schneller und einfacher. Somit erweist
sich Z als ein neuer und sehr hilfreicher und vorteilhafter Meßparameter für die
Charakterisierung des Glycosylierungs-Status eines Glycoproteins.
Die Freisetzung der N-Glycane erfolgte aus rhu EPO (CHO) (Boehringer
Mannheim) mittels PNGase F in an sich bekannter Weise (Nimtz et al., ibid.).
Die Z wurde analog Beispiel 1 mit Z = 361 bestimmt (Tabelle 4).
Von Watson et al. (Glycobiology (1994) 4, 227-237) wurde die Glycosylierung von
rhu APO (CHO) (Arngen) ebenfalls in einer detaillierten analytischen Studie
untersucht. Demnach sind die N-Glycane des besagten rhu EPO (CHO) zu über
90% sialyliert, was die im Vergleich zum BHK-EPO aus Beispiel 9 erhöhte La
dungszahl erklärt.
Von Watson et al. (ibid.) wurde der nach PNGase F-Verdau erhaltene N-Glycan-
Pool über eine GlycopakTM DEAE-Anionenaustauschersäule der Fa. Waters
getrennt. Das in Fig. 1 der Publikation von Watson et al. (S. 228) abgebildete
Chromatogram wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung
der Z nach Gleichung 1 herangezogen. Dabei wurde für das CHO-EPO von
Amgen Z = 367 bestimmt, was in sehr guter Übereinstimmung mit der in Beispiel 8
für das CHO-EPO von Boehringer Mannheim bestimmten Ladungszahl von
Z = 361 steht.
In der Doktorarbeit von C.H. Hooke (Hokke et al. (1993), in Hokke, C.H. "Structure
determination of glycoprotein glycans" (doctoral thesis), pp. 51-90) ist die detail
lierte Aufklärung der Zuckerstrukturen von rhu EPO (CHO) der Fa. Organon
Technika beschrieben. Dabei konnte für dieses EPO gezeigt werden, daß bei 18-
20% der N-Glycane ein und bei 3% der N-Glycane zwei Neuraminsäure-Reste
fehlten. Die von Hokke vorgestellten Daten erlaubten im Rahmen der vorliegen
den Erfindung die Ermittlung der Z zu Z = 286. Diese Ladungszahl ist gegenüber
der Z des CHO-EPO von Amgen (Z = 367) und der Z des CHO-EPO von
Boehringer Mannheim (Z = 361), aber auch gegenüber der Z des BHK-EPO von
Merckle (Z = 323) deutlich erniedrigt. Aus diesem Grunde darf für das CHO-EPO
der Firma Organon Teknika eine deutlich erhöhte Clearance und - damit
verbunden - eine deutlich geringere biologische Wirksamkeit angenommen
werden.
Wie in den vorgegangenen Beispielen und im Eingangstext ausgeführt, kann die
Glycosylierung (und somit die Ladungszahl) je nach Gewinnung des entspre
chenden Glykoproteins von Charge zu Charge schwanken. Dies wird noch einmal
in den Beispielen 9 und 10 belegt.
Von Hermentin et al. (Anal. Biochem. (1992) 206, 419-429) wurde ein Vergleich
von auf verschiedenem Wege hergestellten N-Glycan Pools von AGP (Charge
281184, Behringwerke AG) vorgenommen und mit einer käuflich erworbenen "N-
Glycan Library" von AGP (LB-001, OGS) verglichen. Die jeweils erhaltenen
HPAE-PAD-Mapping-Chromatogramme wurden publiziert (Hermentin et al., ibid.).
In der genannten Publikation wurde aufgezeigt, daß sich die Mapping Chromato
gramme infolge des Verlusts an gebundener N-Acetylneuraminsäure unterschei
den - und dies wurde durch eine Übereinanderlagerung der Mapping-Chromato
gramme dokumentiert (Hermentin et al., ibid., Fig. 5).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde für die von Hermentin et al. (ibid.,
Fig. 5) publizierten Mapping Chromatogramme von AGP retrospektiv die jeweilige
Ladungszahl bestimmt (analog Beispiel 1). Dabei ergab sich ein Anstieg der La
dungszahl wie folgt:
Run a: Z = 248 (LB-001, OGS; "hydrazinolysis-derived")
Run b: Z = 262 ("large-scale hydrazinolysis", 50 mg AGP)
Run c: Z = 276 ("large-scale hydrazinolysis", 1000 mg AGP)
Run d: Z = 285 ("automated hydrazinolysis", 2 mg AGP)
Run e: Z = 289 ("PNGase F-derived after previous tryptic AGP digest").
Run b: Z = 262 ("large-scale hydrazinolysis", 50 mg AGP)
Run c: Z = 276 ("large-scale hydrazinolysis", 1000 mg AGP)
Run d: Z = 285 ("automated hydrazinolysis", 2 mg AGP)
Run e: Z = 289 ("PNGase F-derived after previous tryptic AGP digest").
Die Z der Läufe belegt mit ihrem jeweiligen Zahlenwert die unterschiedliche Be
schaffenheit der Glycan Pools. Sie belegt aber auch den von Hermentin et al.
(ibid.) über den Vergleich der Mapping-Chromatogramme erbrachten Befund der
Ähnlichkeit der Chromatogramme der Läufe d und e. Dies wiederum belegt die
aussagekräftige, hilfreiche und somit vorteilhafte Bedeutung der Ladungszahl Z.
Von AGP ist bekannt, daß sich seine N-Glycane mit PNGase F ohne vorherigen
tryptischen Verdau und/oder den Zusatz spezieller Detergentien nur unvollständig
abspalten lassen (Nuck et al. (1990), Glycoconjugate J. 7, 279-286). Im Beispiel
10 wird gezeigt, daß sich die unvollständige Gewinnung des N-Glycan Pools von
AGP (bei Verwendung von PNGase F) über die Berechnung der Ladungszahl
(analog Beispiel 1) nachweisen läßt.
Hierzu wurden die N-Glycane von AGP (wie in den Beispielen 7 und 8 beschrie
ben) nach 48-stündiger Inkubation mit PNGase F isoliert. Vom isolierten N-
Glycan-Pool wurde die Ladungszahl analog Beispiel 1 zu Z = 248 bestimmt. Die
ser Wert liegt deutlich unter dem gemäß Beispiel 9 bestimmten Wert von Z = 289
("Run e"). Somit läßt sich anhand der Ladungszahlen folgern, daß bei Inkubation
von AGP mit PNGase F nach Beispiel 10 (also ohne den in Beispiel 9 verwende
ten vorherigen tryptischen AGP-Verdau) offenbar die höher geladenen N-Glycane
besonders schwer abgespalten werden.
Dies belegt erneut die aussagekräftige und hilfreiche und somit vorteilhafte Be
deutung der Ladungszahl Z und ihre Bedeutung als diagnostischer Parameter für
den Glykosylierungs-Status eines Glykoproteins. Beispielsweise läßt sich durch
die Bestimmung der Z von AGP von Einzelspendern eine Aussage über den Grad
einer Entzündung machen (De Graf et al., J. Exp. Med. (1993), 177, 657).
Weil sich Z als ein neuer und sehr hilfreicher und vorteilhafter Meßparameter für
die Charakterisierung des Glycosylierungs-Status eines Glycoproteins erweist,
sind in Tabelle 4 die analog Beispiel 1 bestimmten Ladungszahlen verschiedener
Glycoproteine beispielhaft aufgeführt. Die Herkunft des jeweiligen Glycoproteins
und die Herstellung oder Herkunft des jeweiligen N-Glycan-Pools (Herstellung
mittels Hydrazinolyse oder PNGase F oder käuflich erworben bei der Fa. Oxford
GlycoSystem (OGS), Abingdon, England) ist ebenfalls aus Tabelle 4 ersichtlich.
Somit eignet sich die Z in sehr vorteilhafter Weise zur Charakterisierung des
Glycosylierungs-Status eines Glycoproteins.
Fig. 1
Fig. 1 zeigt das N-Glycan-Mapping-Profil von rhu IL-4R (Charge E4-930914) nach Trennung mittels HPAE-PAD unter Standardbedingungen nach Hermentin et al., Anal. Biochem. 203 (1992), S. 281.
Fig. 1 zeigt das N-Glycan-Mapping-Profil von rhu IL-4R (Charge E4-930914) nach Trennung mittels HPAE-PAD unter Standardbedingungen nach Hermentin et al., Anal. Biochem. 203 (1992), S. 281.
Anmerkung:
S1: Interner Standard 1
S2: Interner Standard 2
S1: Interner Standard 1
S2: Interner Standard 2
Die Glycane befinden sich im Chromatogramm zwischen S1 und S2. Die Peaks
vor S1 stammen aus der Hydrazinolyse; die Peaks nach S2 sind unbekannter
Natur.
Fig. 2
Fig. 2 zeigt die Fraktionierung von rmur IL4R (Charge 018PP) mittels Anionen austausch-Chromatographie an Q-Sepharose FF.
Fig. 2 zeigt die Fraktionierung von rmur IL4R (Charge 018PP) mittels Anionen austausch-Chromatographie an Q-Sepharose FF.
Fig. 3
Fig. 3 zeigt die isoelektrische Focussierung (IEF) der gemäß Fig. 2 gewonne nen Q-Sepharose-Fraktionen von rmur IL4R Charge 018PP.
Fig. 3 zeigt die isoelektrische Focussierung (IEF) der gemäß Fig. 2 gewonne nen Q-Sepharose-Fraktionen von rmur IL4R Charge 018PP.
Die zugehörigen analytischen Daten finden sich in Tabelle 3.
Fig. 4
Fig. 4 a zeigt den Abfall der Z, Fig. 4 b den Abfall des NANA-Gehalts von rhu IL-4R im Kulturüberstand bei Lagerung bei Raumtemperatur (RT) +4°C, -20°C und -70°C.
Fig. 4 a zeigt den Abfall der Z, Fig. 4 b den Abfall des NANA-Gehalts von rhu IL-4R im Kulturüberstand bei Lagerung bei Raumtemperatur (RT) +4°C, -20°C und -70°C.
Claims (14)
1. Verfahren zur Charakterisierung der Glycosylierung eines Glycoproteins
durch eine hypothetische Ladungszahl (Z), die dadurch erhalten wird, daß
man
- a) den Glycan-Pool des Glycoproteins isoliert,
- b) denselben mittels Ionenaustausch-Chromatographie primär nach Ladung auftrennt,
- c) die prozentualen Flächenanteile der ladungsmäßig getrennten Peakgruppen (der Glycane) bestimmt,
- d) die prozentualen Flächenanteile der Peakgruppen im neutralen (asialo)-, monosialo- (MS), disialo- (DiS), trisialo- (TriS), tetrasialo- (TetraS) und pentasialo (PentaS)-Bereich mit null (asialo) bzw. 1 (MS) bzw. 2 (DiS) bzw. 3 (TriS) bzw. 4 (TetraS) bzw. 5 (PentaS) multipliziert und
- e) über die jeweils erhaltenen Produkte aufsummiert.
2. Verfahren zur in-vitro Bestimmung der Bioverfügbarkeit eines Glycoproteins,
wobei die für das Glycoprotein mit dem Verfahren gemäß Anspruch 1 erhal
tene Ladungszahl in Bezug gesetzt wird zu einem Standardwert, der in einer
in-vivo Bestimmung erhalten worden ist.
3. Verfahren zur in-vitro Bestimmung der Bioverfügbarkeit eines Glycoproteins,
wobei die für das Glycoprotein mit dem Verfahren gemäß Anspruch 1 erhal
tene Ladungszahl in Bezug gesetzt wird zu einem Standardwert, die rechne
risch erhalten worden ist.
4. Verfahren zur Bestimmung der Chargenkonsistenz eines Glycoproteins, wo
bei die für das Glycoprotein mit dem Verfahren gemäß Anspruch 1 erhaltene
Ladungszahl in Bezug gesetzt wird zu einem Standardwert, der mit dem
Verfahren gemäß Anspruch 1 für eine Standardpräparation erhalten worden
ist.
5. Verfahren zur Bestimmung der Chargenkonsistenz eines Glycoproteins, wo
bei die für das Glycoprotein mit dem Verfahren gemäß Anspruch 1 erhaltene
Ladungszahl in Bezug gesetzt wird zu einem Standardwert, der rechnerisch
erhalten worden ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Freisetzung
des Glycan-Pools aus dem Glycoprotein durch Hydrazinolyse erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Freisetzung
des Glycan-Pools aus dem Glycoprotein auf enzymatischem Wege (mittels
PNGase F) erfolgt.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ionenaus
tausch-Chromatographie eine HPAE-PAD (high-pH anion-exchange chro
matography with pulsed amperometric detection) ist.
9. Verfahren nach Anspruch 1 zur Charakterisierung des Glycosylierungs-Sta
tus eines Glycoproteins.
10. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3 zur Überprüfung der Bioverfügbarkeit ei
nes Glycoproteins.
11. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5 zur Überprüfung der Chargenkonsistenz
eines zelltechnologisch produzierten Glycoproteins.
12. Verwendung eines Verfahrens nach Anspruch 1 als diagnostisches Hilfsmit
tel bzw. als Diagnostikum.
13. Verfahren nach Anspruch 1 zur Überprüfung des Krankheits-Status einer
Spezies über deren Glycosylierungs-Status (die Ladungszahl Z) eines für
die Erkrankung charakteristischen Glycoproteins.
14. Verfahren nach Anspruch 1 zur Überprüfung des Krankheits-Status eines
Patienten über den Glycosylierungs-Status (die Ladungszahl Z) eines für die
Erkrankung charakteristischen Glycoproteins.
Priority Applications (15)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19527054A DE19527054A1 (de) | 1995-07-26 | 1995-07-26 | Verfahren zur Charakterisierung der Glycosylierung von Glycoproteinen sowie zur in-vitro Bestimmung der Bioverfügbarkeit von Glycoproteinen |
PCT/EP1996/002319 WO1997005490A1 (de) | 1995-07-26 | 1996-05-30 | Verfahren zur charakterisierung der glycosylierung von glycoproteinen sowie zur in-vitro bestimmung der bioverfügbarkeit von glycoproteinen |
PT96917465T PT843821E (pt) | 1995-07-26 | 1996-05-30 | Processo para a caracterizacao da glicosilacao de glicoproteinas bem como para a determinacao in vitro da biodisponibilidade de glicoproteinas |
DE59607840T DE59607840D1 (de) | 1995-07-26 | 1996-05-30 | Verfahren zur charakterisierung der glycosylierung von glycoproteinen sowie zur in-vitro bestimmung der bioverfügbarkeit von glycoproteinen |
AU60032/96A AU6003296A (en) | 1995-07-26 | 1996-05-30 | Process for characterising the glycosylation of glyco-proteins and for the in vitro determination of the bio-availability of glyco-proteins |
KR1019980700604A KR19990035943A (ko) | 1995-07-26 | 1996-05-30 | 당단백질의 글리코실화 특성분석 및 생물이용성의 시험관내 측정 방법 |
US09/000,307 US6096555A (en) | 1995-07-26 | 1996-05-30 | Process for characterizing the glycosylation of glyco-proteins and for the in vitro determination of the bio-availability of glyco-proteins |
AT96917465T ATE206524T1 (de) | 1995-07-26 | 1996-05-30 | Verfahren zur charakterisierung der glycosylierung von glycoproteinen sowie zur in- vitro bestimmung der bioverfügbarkeit von glycoproteinen |
ES96917465T ES2162652T3 (es) | 1995-07-26 | 1996-05-30 | Procedimiento para la caracterizacion de la glicosilacion de glicoproteinas, asi como para la determinacion in vitro de la biodisponibilidad de glicoproteinas. |
JP50713697A JP3631495B2 (ja) | 1995-07-26 | 1996-05-30 | 糖タンパク質のグリコシル化の特性表示方法および糖タンパク質の生物学的利用能のインビトロ測定方法 |
CA002227743A CA2227743C (en) | 1995-07-26 | 1996-05-30 | Processes for characterizing the glycosylation of glycoproteins and for determining in vitro the bioavailability of glycoproteins |
DK96917465T DK0843821T3 (da) | 1995-07-26 | 1996-05-30 | Fremgangsmåde til karakterisering af glycosyleringen af glycoproteiner samt til in vitro-bestemmelse af biotilgængeligheden af glycoproteiner |
EP96917465A EP0843821B1 (de) | 1995-07-26 | 1996-05-30 | Verfahren zur charakterisierung der glycosylierung von glycoproteinen sowie zur in-vitro bestimmung der bioverfügbarkeit von glycoproteinen |
NO980276A NO980276L (no) | 1995-07-26 | 1998-01-21 | Fremgangsmåte for karakterisering av glykosyleringen av glykoproteiner og for in vitro bestemmelse av biotilgjengeligheten av glykoproteiner |
MXPA/A/1998/000690A MXPA98000690A (en) | 1995-07-26 | 1998-01-23 | Procedure for the characterization of glycoprotein glicosilation, as well as for the in vitro determination of the biodisponibility of glicoprotei |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19527054A DE19527054A1 (de) | 1995-07-26 | 1995-07-26 | Verfahren zur Charakterisierung der Glycosylierung von Glycoproteinen sowie zur in-vitro Bestimmung der Bioverfügbarkeit von Glycoproteinen |
Publications (1)
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---|---|
DE19527054A1 true DE19527054A1 (de) | 1997-01-30 |
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ID=7767674
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