DE1795149A1 - Antibiotischer Kemplex A-21101 und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Description

Antibiotischer Komi>ley. A -21101 und Yerfohran ku·seiner

Herstellung

S. Sl X Ϊ.-. a Γ= =· -Jf K S! ·~3

Die Erfindung bezieht eich auf eine neue Keine von Permentationeprodukten und ihre Her3te)lung. Bjc> Erfindung betrifft insbesondere einen neuen antivlralen Komplex, der hierin als A-21101 bezeichnet wird, und seine Einzelkoraponent.en.

Der antibiotische Komplex /-21101 läßt oich als ochwach gefärbte Subatana charakterißieren, die in Wasser und aliphatischen Kohlenwasserstoffen unlöslich und in den meisten organischen Lösungsraitteln löslich, in Lösung bei gewöhnlichen Temperaturen in einen Bereich von pK 3 "bis pH 9 beständig ist und keine titrierbaren Gruppen enthält»

Der antibiotische Komplex JU21101 kann durch Züchtung einea Λ-21101 erzeugenden Stamme des Mikroorganismus Arachniotue aureue in einem Kulturmedium_v das assimilierbare Quellen fUr Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische üalzt enthält, unter eubmereaeroben Bedingungen bis r.ur Bildung einer beträchtlichen »enge de« Komplexes A-21101 durch den Organismue

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in deta Kulturmedium he- gestellt werden

neue antirirale Komplex nach dieser Erfindung enthält wenigstem« 4 Eineelfaktoren, die anscheinend sehr ähnliche Struktur aufweisen. Dar Komplex h&t oas Aueaehen einer schwach gefärbten kristallinen Substanz, die in V/asser und · aliphatischen Kohlenwasserstoffen unlUolich und in den nieten organischen Lösungsmitteln, z<,B. den Alkoholen, Xthern, Estern und Chloroform löslich ist. Der Komplex 1st in Athylacetat gut lösliche Per antivixsle Komplex m.ch dieser BrXindung ist An.Lösung bei gewöhnlichen Temperaturen innerhol)> ainte pH~iiereiohs ron wenigstens 3 Ms 9 beetänäig. Bei «lektroa»trieeher Titration des Komplexes können keine titrierbare« Gruppen ^sstgestellt werden.

Wie «rvähnt, enthält der antlrirale Komplex wenigstens 4 Einzelfök* Die Begtiöhnung "A-21101¹¹ wird hierin zur Benennung des antiviralen Konplexes Verwendet« während die rer-Pihiedenen Pßktoren des Komplexes als Faktoren I, II, III und IV baselehnet werden. In den Komplex, der gewöhnlich erhalten wird« BChwitien die Pektoren I und II vorherrschend ssu sein»

Der A-21101-Komplex» sowie seine Faktoren II, III und IV seiger» antjvirale Aktivität und sind daher sur Unterdrückung der Verunreinigung von Gewebekulturen durch Viren und für andere Zwecke geeignet, bei denen ein Virenwachatum unter-

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drückt warden toll» So kennen haispislsweiee ait den* /ntitiot'icuru Coxecekie-Vtrusi nfektiCKiin bei K3u3<m wirksam bekämpft werden, wann des Antibioticum infcrnperitoneoi. •«••erabrtsßht wird» /aktor 1 kann auf chemiocUen we^re in Jtek-;--tor Ii übergeführt wercSsn und iet deshalb aln Awbsango-»· ötoff «ar Herctel j ang flieser Sub stat:?, geeignet ν

P.ktor Ϊ tat eine feste kriutailine Subr?tönz_t die bei 213 bie 217⁰O echnilat. In Chloroformlösung bei. ein^r i'emperatur von 2<5°C beträgt der npersifische Crehwort von Jlatrj'um-B-Lioht Ur diesen Fektor -315»1°_s wenn die Konzentration der Subetans

£t bezogen ouf äoe Volumen, betrügt. Dieeer Paktor wsist in Ultraviolttttberei':\ keine intensive Ab&orption auf, jedoch wird eteta bei 233 i$u feine Schulter beobachtet»

Ein Rfint&enbcußungapu^Tfcrffpektrura des Viistallinen iak~ tor 1 mit Cnroa^Höntgenatrahlung und einer Wellenlänge von 2,28962 Ä zur Beroohnung der Hetzeben#ßabatänd-3 ergibt folgende Wertet >

BAD ORK51NAU

d» 1/I₁

•Μ«

8,92 0,40

8,41 0,53. Öf23 . 0,2?

7,34 0,67

7 ν "Ό 0,40 ,

6₇5O 1.00

5,77 . 0,27

5,51 0,13

bi26 0,4a

5/19 O₉4O

4,77 0,13

4,44 0,40

4,34 0,27

4,20 O₅27

4,00 . 0,27

3,90 ' 0,40

3,63 0,13

3,51 0/53

3,34 . 0,13

3,26 0_s27

3,22 0,27

3,09 0,13

3,04 0,13

Ini'rarotppektruia de& kriotallinen PDktora I in

miGr.im/i ist in Fig. 1 dor beigefügten Zeichnungen dornestelIt. In. Gebiet zwischen 2 und 15 Micron werden folgcnaa AbsorptionamaximB beobaohteti }_i?4? 3^44- 3*55*.. 5>_f75v 5,9U 5,S7_t ?05 (f.ciiulter)« 7_s20, 7,46₉ 7,70, 8,02_? 0,45, .8_;6B, 8,76, 8_y69_? 9_;.17f 9/f4, 10,04, 01,31 ρ tO_s45_f 10,86_; 11,02 11,65

Aus den Werten Oee Massenepektrume geht hervor,.daß Paktor I öae MolekUlion 534 ergibt* Die enpirieche Porael die am beaten mit 3lle*2 dit £.-eti Wertf« übereinstimciti, iat ^Ü24^26^8^2^2³ or I bat. v>;ahrsoheinl?.ch folgende Struktur»

, _{Λ A ft} „ _Λ

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BAD

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Faktor I läßt sich durch chemische Methoden in Faktor II überführen.? der hohe Aktivität gegen Coxsaekie-Viren in Käucen Qufweist. Eine solche chemische umwandlung kenn nach allgemein bekannten Metboden erfolgen^ bslapielewejee dureh Behandlung der !3-Methylverbindun.e: mit Methyljodld unter Bildung deo -SuI-fonJumsolzGs, anschließende Behandlung dea 3al?.es mit Nairiumsulfid in Alkohll- wodurch die SlitPinierung der S-Kethylgruppen industei't und glßichneitig die Diaulfidbrlicke gebildet wird.

Fo!ctor II ist ein .kristalliner Feststoff ₉ der bei 21o - 215⁰C unter Zersetzung schmilzt. In Chlorofomrlößung bei einer Temperatur von etwa 26⁰G hat dieser Faktor einen speaififinhen Drehwert füf Natrium-D-Licht von -549_f7⁰ _P wenn die Konzentration der Substanz 0»5 Öewioht3-?i_t bezogen auf das Yolumtn» beträgt.

Ein Höntgenbeugucgepulverepektrua des krietollinen Faktors II mit Chrcm-Röntgtnatrehlung und einer Wellenlänge von 2,28962 Ä aur Berechnung der Netzebenenabetände ergibt folgen de Werte:

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1Ö9853/l82d

, 1795Η9

ΐ/τ

9,52 6_?39 5,74 5,33 4,80 4,„>2 3_?fa5

3,46 3,3c 3^% _C23 3>O9 2 _? 32 ;?_V26

Die Infrerotabfiorpticnexurve äea kristullinen Jalcfcors in Jansion 3 st in figur 2 der beigciügten Zeichnungen In Gfebirt von 2 15 Mic-ron werclen folgende

beo^?iachtets 2_;98_? 5_t76_e 5,08, 6,O2„ 6,85_r 6,9?_v 7,32· 7,43_; 7,63₃ 7,82: 0_vU_P 8_t39_P 8_?78_P 9,25_? 9,64, 9,3C, ·ίθ*15_? 10,55- 10.75, 10,86, 11,02p t1_;1?, 11,31, 11,49, 11,87, 1'\io_f 12,42, 12,55, 12,72_; 13,17_r 13.-25, 13,55. 13,82, Hpt'8 14,05 und 15,0^ Micro».

o,	30
o.	OO
Ο.	20
O,	?0
O9	60
O,	80
O,	10
o,	10
O,	20
O,	10
o,	06
O,	10
O,	04

BAD ORIGINAL

1T8514»

Die Werte dee Maeeenepektruna τοη Faktor Π weisen auf ein Molekülion 440 hin, in dom die beiden Schwefelatom« fehlen_s woraus sich ein Molekulargewicht ron 504 ergibt . Die empirieche Formel, die am beaten ait sämtlichen Werten übereinet imnit, ist ^C22^H20°8^N2^S2° ^{Mit allen} diesen Werten etfttef ** besten folgende Strukturformel Übereinι

H₃C-C-O

O-C-CHj

J)er Pnktor II iet gegen Coxeaokie-Tirueinfektionen in Häueen virkaara, wenn er intreperitoneal rerabreicfct wird. Die BDj₀ beträft β mg/kg, Die akftte ToKieitttt der Subeten« für Müaee bei intraperitonealer Injektion, eng·gebeη ale H^q» betrögt et wti 4C tag As· Ouroh eaure Hy d ro Iy β e wird fektor ZX in faktor ZXI Übergeführt. Die Sutetans iet deehalb ein wertroller Aueg«ng88toff eur Hereteilung dieeer iweiten Subetanp.

Faktor III ist eine feste Subfttanss, &it bet etwa 198-200⁰C schwillt, Dieser Paktcr «eigt Absorption iw. l/lttavlolott·

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PAD ORfQiNAL

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gablet mit einein K8id.mu:n b';i 295 VM roJ.t einen a^j -Uert tor 2380 und einer Schulter bei 224 m _r mit einen a_T.~Wes*t von 7900.

Ein Räntgenbeugungspülveroüektrum dieses Fohturo mit

ο Chrom-Strahlung bei aiuer Vellenllinge von <?,23962 Λ Eur

Bereühnung «er Ketzebfcn<snabafcänäe ereilt folgend· viertel

7,6β 0,70

7,40 0,10

6,69 0,70

6,46 0,50

6,25 * 0,50

5,67 0,20

5.20 0,30 5,07 0,10 4,77 * 0,40 4,46 0,20

4.21 ö_f30 4,23 0,30 3,94 0,30 3,% 0,90

BAD

109863/

"d" I/I,

3,59 0,20

3,49 0_tt0

3,40 0»5Ö

3,03 0,20

2,96 0,10

2,86 0,30

2,60 0,10

2,50 0,04

2,24 ' 0,0*

Das Infrarutabaorptiom.opgktrura run Faktor III al3 Mineralöl-Bucponaion ist in Figu · 3 der Zeichnung« {Jßü-ge β teilt. Ia Gebiet znfiechen 2 und 15 illcron werden falgeioeie beobachtet! 3,05, 5,β1_Λ 5,94
6,04, 6,8a_P 6,93, 7_?3ü
7,69, 7,81, 8,03, ß_?34, 8,75, .»,2O,'9,9ft_f 9»4β^ 9^7» 9,85 (Schulter)₅ 1O₈ID, to/8, 11,05, 11,20, 11,35» 11,48, 12,22, 12,55* 13,34, 13,62, i3,8}_r U„ 18 und 15,04 Hieron.

Aus den Werten dee tfanunepektrutss ergibt eich für Faktor III ein MolekUlionen vor. '5]l, in dem die beiöen Schiffe fels tome fehlen. Mit dlusen >.arten stimmt nm bester, die empirische

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^C20^Hiu°7ⁱⁱ2^S2 ttterfin, voraue eich fur den Faktor dee MoIekuiargt*iaht 462 ergibt.

wahrttchitinliefaaten ißt fur don Faktor folgende Struktur:

Faktor III ;.εΐ sogen Riatrnviren und Poliomyelitieriren, IyP Xt TI uad lll_twiric8aa un<? deeholb dafUr geeignet, die Verunrein!jungen τοη Oewebekultureri durch dies« Yiren %u T*rfiin-i dem, Der Faktor let ferner b«i iiitrHperitonealer Verabreichung fc-eßen Coxeackie Virueinfektionen bei Musen wirk-

eaiii , Die H>cq beträgt 6 (sg/kg· Die onnte Toxieitüt XUr Muae hoi intra peritoneal «r Injektion, enge gel cn cle atxia 3? mg/kg.

Faktor IV lot eine Ceete kristalline Sabpt&nss, di« bei etwa 200 bis 205^CG öchiuiliit. Ir? GUloroiorinloounii? be tragt bei iinsr ieiüperntur von 26⁰G 'ter apeziiische Drebwert ron

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ι⁸·)

Satriura»:D**Lictit fur Faktor IV -*/!91,Q'_t Wenu'dle Konzentration der anbeten» 0,5 Gewichte-^_e bezogen auf äue Volumen, beträgtc

Ein Rönt/yenbeußungspulYerspcktrur.; dee kristallinen faktor« IV mit Chrom~StrahluHg und bei einer Wellenlänge ton

sg der Netzebenenabistäiaöe evgibt

2,28962 A

ίο Igen J β v/arte ι

I/I.

θ,71 7,93 7 _Γ 32. 6,69 6,325 5ρ69 !3,20 SfIO 4,78 4,4? 4,23 4,19 3.95

0,60 0,20 0,60 0,60 0,20 0_β30 0,30 0,50 0,40 0,30 0,50 0,40 C ρ 70 Ö/H)

BAD OWGJNAL

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3,49 0,20

3_t37 0,20

3,16 0,30

3,06 0,05

2,91 0_?08

2«34 0,10

2,70 0,08

2,58 0,08

2,21 · 0,20

2,12 . 0,08

2_t09 0,05

1*99 · 0,10

Dee InfrarotabaorptionepektruH von* Faktor IV In ChlorofurmlöGung ist in ?igur 4 der Zeichnungen dargeetellt. Im Geblüt zwifechen 2 und 15 Micron werden folgende Atoaorptiousmaxinia beobachte ti ι 2,95p 3«32_fl 5,73» 5,82p 5».9O_# 5,97; 7,0_a 7,23_P 7,52» 7,67, 7,82, 8,t, 8,75, 9_P22_e 9i41_P 9,5B. 9*7; 10,4 und 10,78 Mieron.

Das TjT.trövlo?ettpbsorptionapektruin von Paktor IV zeigt ein Maxiinynbei 265 ^M mi t eine ei a^-Vert von 3880 und

eine Sobiater bei 226 mu mit einen ε^-V/er« von 9Ü4O. _t

_BAD

-u-

DIe Werte dee Moaaenitpektrune ergeben fUr Faktor IV ein MolekUlion Ton 382, worin die beiden Schwefelatome fehlen* woraus sich ein Molekulargewicht des Paktore yon 446 ergibt. Kit allen diesen Werten stimmt die eiapirieche Formel O_5nH_1nO_AH_oS« für Faktor X7 an beeten überein. -m vahr*qheinliebsten ist folgende Strukturformel:

Faktor IY ist bei iatraperitonealer Injektion in einer Menge /on t>m&Ag (EDg₀) gegen Coxeaokie Virueinfektionen bei Mäusen wirkte» und aeigt Wirk8r>akcit gegon Polioeyelitieviren Yon Typ III in Gewebekultur, Die ekate foxisität in Häuaau bei intraperitoneeler Injektion, angegebeti als 0^{f tieträ}Ä^t etwa 50 »ig/kg.

Doa neue antivirale Antibioticum nach dieser Erfindung wird durch Züchtung eines Α-2110Ϊ erzeugenden Stamme einea Organismus, der unter oaroben Bedingungen in einem goeig-* neton Kulturmedium wachet« herg. Btnllw, hie daa Medium eine bttvfioUtliche antivirule Aktivität üufvfoist. Mn anti«

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Tirele Mittel kann 3_UYCh verschiedene bekannte IsoMerungs- und Reinigungsverfahren .revroanen «.lerden.

Der Microörgeniemus, der A-21101 produziert, igt vom ·

tu ■■ ■ . Central Bureau roor Schiramelculturea, Ba.'irn- Niederlonde unter dev Boseiehnung Araciutiütus aureue (Eidan) Schroetcr erhältlich und bei der ständigen Kultureneammlung der Nortuar« ReeioBol Reeecrcb LaborntorieQ In Peoria, Illinoia ui5ter lir· NHHl 3205 hinterlegt. Uae Genue Arechniotue vird ?ur Pnaiille Gynmooscaceoe , Ordnung Aopergillolos, Kleeee /ecoraycetee gtü-echnetc JBin veceritliohes IdentirixlerufigstavricBBl einer Kultur der Familie Gymno&ecaoeee ist tiae /uftreten sexualer 3poren oder Asci. Bei. dieser Kultur Arachniotus aureus gdang der NcchwciB solcher Ascosporen jedoch nicht. Dtö keine Aacosporen beobachtet werac? konnten, iet waiirecheinlicii darauf üurilckzufUhrer, der verwendete Org&nieaue In Kultur nur eine rfekte Fora entwickelt.Auf dieae Köglichkeit wird in dem Katalog der eben genannten Hinterlegungsstelle hingewiesun, in dem angegeben iet, daß viele Kulturen, die öarin uni-ίΓ dom Hemen der perfekten Porm gefiiUrt warden, in Kul~ tür nur die imperfclcte Pors; entwickeln» Dennoch ist «u be~ ajhven, d&ß die 'iaxonocie des Organismus nicht als voll- «tilcdig a*i£,e3ehF.i werden kann* wenn nicht die Anwesenheit Aacospctren nschgewieeen

öie iiifclernte- Fähigkeit des Oreanieciua au? Bildung von Λεοο~ rco illhrt öadur<?ii sl- weitaren EciiwicTinkeittn, dn-3 woitere

Stufen durchgeführt werden müssen, um el» Wachstum in großen Vorrichtungen zu erslelen. In den meisten Üblicherweise verwendeten regetatiren Medien erfolgt das Wachetun flee Organiemuo in Form von Myoelplättchen oder -pellets. Domit man ein gleichmäßige8 Inoculum mit ausreichenden Wachstums^. jsentren eur Erzielung eines gleichmäßigen Wcchsturae i#Produktionstaedium erhält, iet es im ollgemeinen erforderlich,

die Pelleta aufzubrechen, beispielsweise durch mechanisches Durchmischen der vegetativen Kultur. Durch dieses Mischen wird die Möglichkeit dor Verunreinigung des Mediums durch

Organismen au».der Luft erhöht. Ba das Antibioticum A-21101 praktisch keine antibakterielle oder antifugole Aktivität gegen die üblichen Mioroorganismen aufweist, 1st es sehr zweckmäßig, dem Fermentantionaraedium ein anderes Antibioticum in geringen Mengen zuzusetzen. Bin solchen Antibioticum, mit dem eich eine Verunreinigung durch Bakterien und Fungi unterdrücken läßt, ist Erythromycin. Im allgemeinen genügen Kengen von etwa 25 - 200 Microgramm Erythromyoin/ml Jfercientationsmediu», ua das fermentations» medium von verunreinigenden Mikroorganismen frei zu halten, ohne daß die Bildung dee antiviralen Antibioticum beeinträchtigt wird.

Als Kulturmedium zur Erzeugung von Λ-21101 kenn man eine Reihe verschiedener Medien verwenden, da der Organismus, der daa Mtibioticum ereeugt, Energie cue verschiedenen Quellen zu verwerten vermag. Allgemein gilt, daß das Mediuta Quellen fUr aasirailierburen Kohlenstoff und Stickstoff, sowie die Mineralealae enthalten soll, öle allgemein'al* notweiidig

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oder zweckmäßig fUr das Wochotun von Mcroorganicmen angesehen werden. Eine Quelle für Wachstumsfaktoren, z.Bc Hefe oder Hefeextraktρ kann in dem Medium mit günstigen Ergebnissen angewandt werden. Um eine wirtschaftliche Produktion und eine maximale Ausbeute des Antibioticuma und eine leichte Isolierung zu erreichen, werden Kulturmedien bevorzugt, die"**er~ hältnismäßig einfache Nährstoffquellen enthalten»

Zu geeigneten Quellen für Kohlenstoff gehören beispielsweise Glucose, Fructose, iialtoaep Saccharose, lösliche Stärke, Melasse, Maisquellwasserfeetstoffe und dergleichen* Glucose und Melasse werden bevorzugt.

Geeignete Quellen flir Stickstoff sind beispielsweise Rindfleischextrakt, Peptone (Fleisch oder Soja), hydrolyeiertes Casein, Hefe, Aninosäuregemieche und dergleichen* Hefeextrakt und Peptone werden als Sticketoffquellon bevorzugt.

Zu den Mineralsalzen, die in den Medien enthalten sein können, gehören solche, die Calcium-, Magneeium-·, Natrium-, Kalium-, Eisen-, Chlorid-, Sulfat« und Carbonationen liefern.

Wie bei anderen Microorganismen soll das nur Züchtung des Wicroorganiamus nech dieser Erfindung rerwendete Kulturmedium essentielle Spurenelemente verschiedener Art enthalten. Solche Spurenelemente werden gewöhnlich als Verunreinigungen duroh

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Zueatζ der anderen Bestandteile dee Mediurne eingeführt. . ' .

Der Anfangs-pH-Wcrt des Kulturmediums kann la weiten Grenzen schwanken. Ee hat sich jedoch οIs zweckmäßig erwleoea, die Fermentation in einem Medium mit einem pH-Wert swiscÄen etwa 6 und 8 und vorzugsweise zwischen etwa 6 und 7 einzuleiten. Während dee V/uchotums des Organismus In deta Produktionsmedium nimmt der pH-Wert de? Mediums von dem Anfangswert ellmählich suf einen pH-Wert τοη etwa 8 zu. Der End-pH~Wert hängt wenigstens zum Teil ron solchen Faktoren wie dem Anfangs-pH-Wert dee Mediums, den darin enthaltenen Puffern und dor Zeitdauer, während der der Organismus wachsen gelassen wird, ab.

Zur Herstellung des Antibioticum sind oubfaers-aerobe Kulturbedingungen die Bedingungen der Wahl. Zur Erzeugung verhältnismäßig geringer Mengen können SchUttelkolbenkulturcn und Oberflächenkultüren in Flaschen angewandt werden. Für die Herstellung größerer Mengen dea Antibioticum wird dagegen aerobe Suiraers-Kultur in sterilen Tanke bevorzugt.

Da gewöhnlich eine Wschstumevereögerung beobachtet wird, wenn das Ferraentationsmediua direkt mit dem Organismus beimpft wird, ist es eweckmüBig, eine vegetative Zwischenkultur herzuatellen, und das Ferment»tionemedlua damit su beimpfen· Da das Wachstum des Orgoeieiaue in den ttblicher- * weise verwendeten vegetativen Medien gewöhnlich in Form von

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Myo«Iplättchen erfolgt, werden die Plättchen vor dor Beimpfung das FernentatloneaediuaB vorzugeweiee aufgebrochen, beiepieloweiee durch aeehanischey Durchmischen der vegetativen Kultur. Boβ nechenloche Hiechen ergibt ein gleichmäßiges Inoculuiü mit auereichenden WaehstuasEGntren «ur Erzielung ο ine 3 gleichriHßigen Wachstums in dem Produktionsmedium« Des Medium,' in den das regetative Inoculum erzeugt wird, und daa Medium, doo zi.r Herateilung dee /.ntibiotlcuce in großem Maßstab verwendet wird, können gleich oder verschieden sein* Wie erwähnt, iat ee infolge der fehlenden antibakteriellen oder antifungalen Aktivität von A-21101 sehr zweckmäßig,, dem PerBientntionameaiuci ein anderes Antibioticum in geringen Mangen zuzusetzen, um Verunreinigungen durch Mlcroorgauiemen 3us der Luft zu verhindern,, Ein besondere vorteilhaftes /ntibioticun für diesen Zweck ißt Srythro»yeiH_f dfcp gewöhnlich in Mengen von etwa 25 biß 2OC Microgrofin Krjthrcicycin/ml ?er«entationcaeöluni angewandt wird.

Der Organierme, der A-£1101 eraeuftt, wächst am besten bii Temperatur en Ia Bereich Ton «two 25 - '55⁰C Eine optimale Produktion dee /ntlbiotlcuae scheint bei a?ecapöri»tur<sn awiechan etwa 25 und 28°C su erfolgen.

Wie se bsi aeroben Subnera-iiuiturverfahrsn üt?vich ist, wird während der Pernentaticn eteriie Luft durch 3as Ku3 turmediuir. gou Um ein vorteilter tsc '·.'-..<.. απ tun d;.-c Or^tuiien'sf» ur-'J <ldx.i^J·:

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"95U9

•ine wirksame Erzeugung des Antibiotiouae zu ereielen, betrfegt-idae XrtJftYolumyn, das bei der l'ankproäuktion aögewanät wird, voraugeweiee mehr ale etwa 1/10 Volumenteil/Kine und Volurasnteil Kulturmedium, Ein eehr wirksames Vfachituni und optimale Ausbeuten en /,»21101 werden erzielt, wenn dae angewandte Luftvolunen v/eriigetens 0,3 Volumenteile Luft/ Min» und Yolumentoil Kulturmedium betragt.

Im allgemeinen wird dag Maximum der Bildung des Antibiotieuoe in etwa 2 bis 5 Tagen nach dem Beimpfen des KUlturmediuraa erreicht, venn eine aerobe Subaerskultur oder eine Schtittelkolbenkultur angewandt wird, und in etwa 5 bie 10 Sagen, wenn eine Oberflachenkpltur angevmndt wird.

Dae Antibioticum wird aua $ea Fertaentationomedium in Üblicher Weiee gewonnen. Im allgemeinen filtriert man iae Produktionaoediim' von dom entstandenen Myoel ab_v und extrahiert die erhaltene Brühe mit Athylocctat. Der Äthylocetü ttatträkt wird im Vakuum aur Irockne eingeengt ^nd der RUcketand wird in einer geeigneten Löouügaarittelmiechiing» zum Beispiel einer Mischung ron foluol und Äthvlecetot im Varhältnid 5 t 1 ρ gelöst ρ Dann leite? t man die Liieung durch eine mit einem geeigneten Adocrption8mitt«l gefüllte Ö.ÜuJ.e und fängt die Fraktionen auf, die das Antibiuticmm enthalten . ßinee der bevorzugten /dBorptionunittel fUr die

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Fraktionierung let Kieselsäuregel* Das Fortschreiten der Fraktionierung kann durch DUnnschichtohroiaatographie von Proben der verachiedenen Fraktionen verfolgt werden* Auf .Siliciumdioxydplatten werden bei Verwendung eines Ib'sungsjnittelsyatems aus zwei Teilen Toluol und ein -Teil Ätbylacetat folgende IU~V/erte für die einzelnen Paktoren beo-' fcachteta Factor X₅, 0,24; Factor II, 0,31; Factor III» 0,36; Factor 2V_P 0_p31c Um die Flecken euf dem Chroraatograram sichtbar «u machen? wird die Platte gewöhnlich mit Phosphor« molybdfinsäure besprüht und etwa 5 Minuten In einem Ofen auf etwa 10O⁰C erwärmt. Diejenigen Fxvaktionen, die den gleichen Faktor enthalten, werden vereinigt und zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wird in einem geeigneten Lösungssiittel, z.B. Methanol» gelöst und umkristallieiert. Aus denjenigen Fraktionen, die Mischungen von ewei Faktoren enthalten, können die einzelnen Faktoren gewonnen werden, indem man den Rückstand fraktioniert kristallisiert, oder nochnala nn einem anderen Adaorptioasmittel, zum Beispiel Alutainiumoxyd ehroniatographiert.

Die ilsriindung wird durch die folgenden Bcispielt .näher er-

BAD 109853/1628

Bei

Schrägagar wird mit dein Organiamuo. Areahnlotue oureua inokuliert and bei etwa 25⁰C 7 bis 10 Tage incublert. Das Medium hat folgende Zusammensetzung»

♦••ν,

Dextrose	5 g
Hefeextrakt	2 g
Calciumoarfconat	3 ε
Υ-8-Saft *-	200 al
Agar	20 g
Peionisiertee Wasser	800 nl
*HandelegeaiecU aus Pilaoeeneäften

Dieeee Mediue Wirt Tor äem Beimpfen alt dem 0rganie»ue durch 25 Minuten langes Erwärmen in einem Autoklaven auf 121⁰C aterllifiiert. Der pH-Wert <5e* Kedlune mch dem Sterilisieren liegt in dem Bereich von 7,0 bis 7,2. Bin ?eil dee wird τοπ den Agarsohrägiculturen Xn 250 nl Erlen-

jieyerkolben lifter führt, die pro Kolben 60 ml eine» vegetativen Medium« folgender Zueasuaeneetfcuigenttialtenjs

Glucose 30 g

üatriumriitrat 3,Ί g Kaltumhydroßenphosphst τ g

*' Kaliumottlorid 0.5 Ä-⁰

Jferroeulfat-

heptahydrat 10 ng

Magnesiumsulfat-

heptahydjw» 0_?5 g

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Hefeextrakt 3 β

Delonlßiertoe Wasßcr ad 1000 ml

Dieses Medium wird durch Vereinigen von awei getrennt herge- «teilten Lösungen zubereitet, τοη denen die eine 30 g ölucoee in 200 ql Wueser und die andere die Übrigen Beatandteile des Mediums enthält. Die Lösungen uerden vor dem Vcroiiachen durch 20 Minuten langes Erwärmen in einem Autoklaven auf 121⁰C getrennt fcteiilieiert. Die Kolbon, die dao inokulierte vegetative MeöiuDi enthalten, werden etwa 9*> i-tundcn .bei etv;e 25⁰C im!" einer HotationoochUttolvorrichturjg inUv.biert, die uii 250 Upa betrieben wird und einen -Auaschlag von 5 cm (2") hat. Noch der Inkubationadoucr besteht das Wachstuico aus Mycelplättchen. "Die Plättchen werden in einer I'ischstufe von 15 Sekunden !teuer mit einem Kechonisrihen Mischer von V/a ringtyp aufgebrochen. Mit der εο erhultenon Suepcnsion wird ein Produktionernediuia folgender Zusammensetzung inoculiort.:

Saccharose	25 g
Brer-Rnbbit-iiala aß· *	25 al
KaiBquellv/a83er (50?* Fest stoff)	5 ni
Malzextrakt	10 g
NZ-Caseinpepton	10 g
Keliunhydrogenphoaphgt	? ß
Deioniaiertee Weisser au	1000 ml

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Der pH-Wert dee Produktionsmediuins beträgt nach 20 Minuten langen Sterilisieren bei etwa 121⁰C etwa 6,2. Das sterilisierte Produktsionamedium wirö mit etwa 5$ (Volumen/Volumen) der Suspension inoouliert, die nach Durchmischen der vegetativen Kultur erhalten wird. Das inoculierte Produktionemedium wird etwß 120 Stunden unter den Bedingungen inkubiert, die für^it Inkubation des vegetativen Mediums beechrieben wurden«, Während der fermentation nimmt der pH-Wert deo Mediums von einem Anfangswert von etwa 6,2 bis zu einen .Endwert zu, der bin zu 7,8 betragen kann. Das antivirale Antibioticum A-21101 iet in der ?ermentationsbrUhe enthalten. Dae Fermentations«* gemioch wird filtriert,und dee Piltrat wird mit Xthylacetat extrahiert. Durch Eindampfen aer vereinigten Äthylacetatextrskte im Vakuum wird der rebe Antibioticunkomplex erhalten«

B c, la ρ % e 1 2

Die Erzeugung de« antiviralea Mittele A-21101 in einer RUhr W vorrichtung wird durch folgende Arbeitßwei&e erläutertJ

Haeh der in Beispiel 1 beschriebenen /rbeiteweise wird eine vegetative Vermehrungakültur hergestellt. Die bo erhaltene Kultur wird in einen mit hoher Geschwindigkeit betriebenen Mischer vom Waringiyp gemiacht, um eine gleichraäßi^Q Suspension des Organismus in üan Medium zu erzielen. Anteilo

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der bo orhaltenen Suspenoion von 10 ml werden zum Inoculleren einer Reihe von 1000 ml Erlenmeyerkolben verwendet, die 200 ml eines Mediums der folgenden Zusammensetzung enthalten!

Saccharose , technisch rein	25	S
Melaes«, eöbar	25	ml
Haiequellwaaser	5	ml
Malzextrakt	10	ß
hydrolyeiertee Casein (N-Z-Caee)	10	«
K&liurohydrogenphoephat	2	β
Daionieiertes Wasser	Ίοοο	ml

Die Kolben, dit das Medium enthalten, werden vor dsm Incaulieren durch 45 Minuten langes SrwSrmen auf 120⁰C sterilisiert* Dec inoculierte Kedium wird bei 25 - 26⁰C 48 Stunden auf einer rotierenden SohüttelTorrichtung mit den in Beiopial 1 nngegebensn Werten inkubiert« !(ach dar !Inkubation wird der laholt von 7 Plaechen in einem 4-Liter-Kolben vereinigt, der mit einem seitlichen Anaats und «inem Schlauch Ytrzehzn ist» und Bum Inooulieren von 28 1 doe oben angegebenen Mediums in einem Per» mtßtotionerlihrtank verwendet wird. Dtr Perawnter, der das Kcdium enthält, wird 40 Minuten bei 120 bie 125⁰C unter einem Druck von 1,2 big 1,4 kg/cm (17 - 20 pio) und einer Rühr·- geschwindigkeit von 350 Upm «teriliciert« 7)er iermenter iat ein volletäiidig mit Pralleinriehtungeη Tsrcehen^r Tank, der mit awsi 13 oin {5^(l} eeohH8nhaufl.igen Turbinenri'hrern uro

_BAD

~ 2έ» ~

einrichtungen ver&ehen iat. Uo eine Verunreinigung ζυ unterdrücken, werden 25 Microgram Erythromycin/ml Mediua zugesetct. Das inoculierte Medium wird etwa 90 Stunden bei 25⁰C und einer BelUftungsgeaohwindlgkeit τοη etwa 0,3 Volumenteilen/Yolumenteil Brtlhe und Minute inkubiert· Me RUhrer werden während der Fermente tionikiauer mit 420 Upta betrieben. Dem Medium werden etwa 0*2 g/l einea handelsüblichen .Ent.ociiäumungsmi.tteis zugesetzt, um die Schaumbildung au vermindern« Der pH-Wert nimmt τοη einea Anfangswert von etwa 6,0 bis zu einem Wert τοη etwa pit TfO am Ends der Fermentation zu· Mach etwa 40 Stunden langer'Inkubation tritt ein deutliches Wachotum auf und etwa 72 Stunden nach dta Inooulieren läßt sich die antifirsle Aktirität deutlich uaohweiaen«

Die eineeinen Faktoren_f die den Komplex A-21101 bilden« werden folgendermaßen erhaltene

Sine Prob* dee wl* in Beispiel 1 iitrgeate tlton getrockneten Extrakte aua dtr fermentationsbrilh« τοη 15 g > wird in 200 ml einer Löaungaraittelmißchung aus 3 Teilen Toluol und 1 Teil Äthylacetat gelöst. Die Lürung wird durch eine Ghromato.fjra phiersäul· mit eineta Innendurchnseficer von 0,9 ct. (3,5") geleitet» die bie 2u einer Höhe von etwa 122 cm (48") mit 1500 g KU aeleüuregel-mit einer Teilchengröße unter C₉Ot) -am gefüllt int.

• BADORiGlNAL

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Die Säul« wird ait ttwa 7 1 dee oben beschriebeneu Bitteigenieehe eluiert,und es worden Fraktionen aufgefangen, die jeweilo etwa 75 nl Ltjaungs.rdttel enthalten» Die ernten 12 Fraktionen werden rersinigt und zur Trockne eingedampft, wodurch man etwa 45 ng rohen Faktor III erhält. Dunn wird eis Größe der einseinen Fraktionen auf 100 rol/Praktlon erhöht «und die folgenden 12 i'rokt ionen v;erdsn vereinigt und zur Trockne einßfiiäaiapft_f woc-urch mun eine Mischung erhält, die Faktor II und faktor IV onthHlt» DjL*? einzelnen Faktoren werden durch fraktionierte ICtIbtollieation der Minchung aus Methanol getrennt. Die letzten Fraktionen liefern nach Eindampfen zur

Trockne Faktor I« Das* Fortschreiten der chroaia togra phi sehe η * von Proben

Fraktionierung wird durch DUnnsch-tchtuhromatographie/jeder Fraktion auf Kieeeleciuregelplatten mit einen lösungsmittel« eyatein nue 2 Teilen Toluol und 1 Teil Äthylncet t rerfolgt.

_eAD

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Claims (1)

1795K9 JJ-

ff A J .,.?,' ", ^ ^Π, ⁿ ff

1, Antibiotiaeher Komplex A»21i01p dadurch gekennzeichnet, daß er aus einer schwach gefärbten Substanz feegt.uht, die In Wasser und aliphetiechen Kolilenyaseerhtofi'en unlöslich und in den meiaten anderen organischen Lösungsmitteln 2ο0ϋο1ι ist, in Lösung innerhalb eine β fiäreicha von pH 3 "bis yll 9 bei gewöhnlichen Temperaturen "beBtaritfig ist unö keine titsrierbayan Gruppen enthält.

2. Faktor I des antibiotisehen Komplexes A-211O-J, ddduroh gekennzeichnet, daß er auo einer festen kristallinen Substanz mit einem Öehmelspunfct von etwa 213 bis 217⁰C und einem Bpesifieeben Brelwert [ φ²⁶ τοπ ^15_P1° ^" ¹ o^^Aolumen in Chloroform) besteht» keine intensive. Absorption im Ültraviolettbereich aufweist, ein museenopektxowetiioca hestimmtea Molekulargewicht von etwa 534 in Chloroformlüaimg und spektrale Infrarotabsorptioneina^ima bei ?,34ρ Jt4A₀ 1,53₁ 5,75, 5,91_P 5,97p 7,05 (Schulter), 7,28_f I₉AS₀ 7,70, B_p02_f 8,45_F 8,68, 8,76, 8_f89, 9_P17, 9*74, 10_?04_F 10,31p 10,45? 10j,86p 11pO2 und 11,65 Micro» und die tmpl.vlacne Formel ^C24^H26°8^?!2^S2 ^⁰**

5. faktor II dee antibiotiechen Komplexes A-21191, .dadurch eenneelehnet, daß tr eine imte kristalline Subatana mit

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-17951Λ9

einem Schmelzpunkt von etwa 210 bis 215⁰C ist, ein massen« flpektrometlrsch beatimates Molekulargewicht rou 504 aufweist, einan spezifischen Brehweri /"al? B^⁰ von -549_?7 (C~0,5 Gew.«$,.AfoIuisen in Chloroform) in Mineral-Olsuepenaion, apektralo '-Infrarotmaxiais bei 2,98_P 5,76, 5, 88, 6,02 _f 6,85_f 6,93, 7,32, 7,43,». 7,68«, 7,32, -8,1.4, 8_C39/ 3,78, 9,23» 9,64,- 9ρ80-, 10,15/ 10,35_P-10,75p 1.0,86, 11>02p 11,13, 11,31f ''11,49, 11,87p 12,19, 12,42_P 12_f55_? 12,72/ 13,17, .13*25, .13,55,- 13,82_P-. 14,08_p 14,05 und 15_P01 Micron und die empirische Porael C₂₂K₂₀OqH₂S₂ ^na}··

faktor III des antibiotiachen Komplexes A-21101„ dodurch gekennseicbnet, daß er eine feste Substanz mil; einen Sohmelepunkt ton etwa 198 - 200*0 iat, im Ultravialettepektruni ein Aboorptionaiaexiaun bei 29$ ijtt ait einem a_M-tfert von 2380 und eine Schulter bei 224 mu mic e.ineu a^-¥ert von 7900 aufweletp ein maBsenapektrometrisDh be^ stimmtea Molekulargewicftt von etwa 462 hat, um ..infrarot» ' Spektrum Abßorptionenaxima bei 3,05/5,81, 5,94 (Schulter), 5e98, (Schulter)ρ 6,04', 6,88, 6,95, 7_P5O (Schulter), 7,38, 7,53, CSchulter)^ 7,69, 7_P81, 8,03, β,34,.β,79, 9V²Op 9,32'_p .9,48,-9^67, 9,85 (Schulter), 10,10, 1O.3S, 11,05 _s 11,2-0,-' 11*35, 11,48p 12,22, 12,55» 13,34p 1?,62_? 13,83/ 14,1-8. und 15,04 Mioron aufweiat und die empirische Formel

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so ·-

C₂₀a₁₈C_?;i₂S₂ ha*

5. Paktox? ϊν dos entibiotiKChert KomplexQO /.-21TO1, dadurch gekennüöichnatf du8 er eir>e feste.· krieta.ll.ine Subverts mit einem ScfcmeIspunkt von etwa 200 - 2C5°C uß:3 ei non .one-

von TcTjD*⁰ Tem -491,8° bei etfser ,,, ..., Konzentrat lon in Chloroform von 0,5 Sevicirts«^, besogen auf das Volumen, ist, ein liltraviclettabsorptionsjaaxJEiUa b«i 26$ mi mit eiaew aj,-Wert ran 3880 und eine Schulter bei 226 m ata einem a^Wevt Yon 5040 aufweist, ein aasoenspektrometJcificji beetimiateß KolekulargQwicht von -etwa 446 hat, im Infrarotepektrum einer Chlor of orialöaung Abfsorptione« aaxiraa bai 2,95« 3»52_? 5,75₉ 5,82, '5,90, 5,97,-7,00,_ 7,28,' 7,52, 7,67, 7,92, ,Q,t8_f Θ,75_? 9,22, 9,41, 9,58, 9,07, 10^Of und 10_?7S Micron aufwtiat und die empirieche Porccl

^C20^Hia°6^H2^S2 ^ha*· :

"'■■■ *, - - ■.

6. Verfahren aur Herstellung dee anti biotischen Konplexes A-21101 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen A-21101 erzeugenden Stamm des Organisrau& Arachrdotuo aureuB. in einem Kulturmedium, das aasiiiilierbare Quellen für Kohlenetoff, Stickstoff und anorgnniuche SaI^e entha unter eubmerö aeroben Bedingungen züchtet, bis eine beträchtliche Menge A-21101 von dem ürganieiaus in den'Kuiwr medium produziert worden i^t.

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100053/1828

: ■■'.'■■■ _: ■ * 31 - :

7. Yerfah/en naeh Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Organismus für die Züchtung Arachnid tue «ureus WWPCO $2O*j verwendet.

bo Verfahren nach Anspruch 6 oder 7_f dadurch gekennzeichnet, daß man Arachniotus aureue NÄRL 3205 in einem Kulturmedium, öas assimilierbare Quellen für Kohlenntoff, Stickstoff und anorganische Salsse .enthältι-, unter subaera aeroben Bedingungwn äsUchtet, bis eine beträchtliche Menge A-21101 duivch den Organismus in dem Kultu/mediuR. erzeugt- iet, unfl aus flern Kulturmedium A-21101 gewinnt.

9. Verfahren nach Anspruch 6_β 7 oder 8, dadurch gekennzeichnete

IiRRL 3205

daß mau einen Λ-21101 erzeugenden Steam Arachniotua aureun/ in eignem KulturaediuJi, das assimilierbare Quellen flir Kohlenstoff,, Stickstoff und anorgsnische Salze enthält, unter subwere aeroben Bedingungen züchtet, bis eine beträchtliche Men#e A-21101 τοη dem Organjswus in dem Kulturmedium er** .ieeiigt werden ist, den rohen Xoraplex aus dem KulHurmecliuia gewinnt_c die darin enthaltenen Faktoren aus einer Lösung dee

Antibiotikums an einer Chx-uraatographlerBäule adsorbiert und Faktor X₅ der wie in Anspruch- 2 definiert ist, aus der Säule nelektiv «luiert.

10* Verfahren nach Anspruch 6„ 7 oder 8_f dadurch gekennzeichnet j daß man einen A-Zi 101 erzeugenden Stamm Arachniotus atireua NHRl 3205 in einem Kulturmedium;; das annlmiHierbare Quellen fttr Kohlenstoff, Stickstoff, und anorganische Salze 'enthält* wnter submere aeroben Bedingungen zUchtet, biß eine beträeht-

■■*;■»

liehe Menge A-21101 durch den Organismus in dam Kulturmedium erzeugt worden ist, den rohen Kos&plex aus dem Kulturmedium gewinnt, die darin enthaltenen ?aktore*i aus einer Lösung üea Antibioticums an einer Chroiaatographiersäule adsorbiert und Faktor Ϊ1₉ wie er in Anspruch 3 definiert ict_c eelektiv aus der Säule eluierl.

11» Verfahren nach Anepruöb 6, 7» oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß men einen 4-21101 erzeugenden Stamm Arachn.iotuo aureus HlifiL 3205 in einen Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff« Stickstoff, und anorganieche S'alise enthält, unter submere atrobtn Bedingungen Buchtet, bis eine beträchtliche Menge A»211.o1 von dem Organismus in dem Kulturmedium gebildet worden ist« den rohen Komplex atia dem Kulturmedium gewinnt, die darin enthaltenen Paktoren aue einer Lösung des Antibioticum an einer chrometographiechen Säule adsorbiert und der Säule Paktor III wie er in Anspruch 4 definiert ist, e« eluierti.

Verfahren*neoh Anepruöh 6, 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, ₉ daß man einen A-21101 erzeugenden Stamm Arachmio-tus aureua JfItHL 3205 in einem Kui.turmediuEB_? öaa aesimlllerbare Quellen-

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-■.■; 33

für Kohlenetoff_cStickstoff und anorganischen Salze enthält_β unter submers aeroben Bedingungen suchtet, bia eine beträchtliche Menge /-21101 von dem Organismus in dem Kulturmedium gebildet worden ist, den rohen Komplex aus dem Kulturmedium gewinnt, die darin enthaltenen Faktoren ati8-*iner Lösung des Antibiotikums an einer chrornatographischen Säule adsorbiert ,und aus der Säule Faktor IV, wie er in ,Anspruch 5 definiert ist, selektiv eluiert.

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