DE1794156B2 - Verfahren zur Auflösung unlöslichen Kollagens - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur a₅ sowohl intra- als auch intermolekulare Querverbin-

Auflösung unlöslichen Kollagens, bei dem die unlös- düngen. Die Telopeptidteile des unlöslichen Kollagens

liehen Kollagenfasem in einer wäßrigen Lösung von werden durch ein eiweißlösendes, d. h. proteolytisches

Alkalimetallhydroxiden und Aminen behandelt werden. Enzym angegriffen, und hierdurch ist es möglich, die

Dabei soll im Sinne der vorliegenden Beschreibung Auflösung von unlöslichem Kollagen durchzuführen,

iowie der Patentansprüche unter unlöslichem Kollagen 30 Die Zerstörung der Telopeptidbereiche des unlöslichen

ein Kollagen verstanden werden, das üblicherweise Kollagens einer Stierhaut durch die Enzyme geht je-

nicht in einer wäßrigen alkalischen Lösung oder in doch sehr langsam voran, wenn man sie mit den ent-

einer anorganischen Salzlösung aufgelöst werden sprechenden Vorgängen bei der Zersetzung eines

kann. Kalbfelles vergleicht. Dies beruht auf den zusätzlichen

Es sind bereits viele Verfahren für die Auflösung 35 Quer\ erbindungen.

unlöslichen Kollagens in wäßrigen Lösungen bekannt, N.T.Crosby und G. Stainsby berichteten in denen das Kollagen in den monomolekularen Zu- in der Zeitschrift »Research«, 15 p. p. 427 (1962), daß •tand überführt wird, wobei eine wäßrige Säurelösung das unlösliche Kollagen des Kalbfelles teilweise durch mit verschiedenen Enzymen benutzt wird, um die eine Behandlung mit einer 5 %igen wäßrigen Natrium-Kollagenlösung zu erhalten. Im einzelnen befassen 40 hydroxydlösung, die mit Natriumsulfat gesättigt ist, «ich die USA.-Patentschriften 30 34 852 und 31 21 049 bei einer Temperatur von 20°C innerhalb von 5 Tagen mit dem Gebrauch von eiweißlösenden (proteoly- gelingt. K. Kühn, E. Zimmer, P. Waykile tischen) Enzymen, die aus den Eingeweiden von und P. F i e t ζ e k haben ebenfalls in der Zeitschrift Tieren gewonnen werden; die britische Patentschrift »Physioi. Chem.«, 333, 209 (1936), berichtet, daß mit 10 90 967 beschreibt den Gebrauch von Enzymen, die 45 dem gleichen Verfahren das unlösliche Kollagen des aus Aspergillen gewonnen werden, und gemäß der Kalbfelles völlig aufgelöst wird,
britischen Patentschrift 11 19 342 wird ein Enzym Wenn das oben beschriebene Verfahren auf das unbenutzt, dessen Basis das Penicillin ist. Weiterhin ist lösliche Kollagen einer Stierhaut, d. h. auf das Fell durch die USA.-Patentschrift 33 14 861 ein Verfahren eines erwachsenen Tieres, angewendet wird, ist die tür Auflösung unlöslichen Kollagens bekannt, bei 50 Ausbeute an gelöstem Kollagen sehr gering. Dies bedem die Behandlung mit einem Enzym erfolgt, dessen ruht auf der im Vergleich zum Kalbfell übermäßig optimaler pH-Wert für Milchkasein zwischen 2 und 10 großen Anzahl von Querverbindungen.

j liegt, wobei ein kationischer oberflächenaktiver Stoff Aufgabe der Erfindung ist es daher, zu zeigen, wie

oder ein wasserlösliches Salz eines zweiwertigen auch unlösliche Kollagene, die eine große Anzahl von

Metalls vorhanden ist. 55 Querverbindungen aufweisen, in verhältnismäßig ge-

', Bei den Kollagenen wird entsprechend ihrer Lös- ringer Zeit aufgelöst werden können.

'' lichkeit eine Einteilung in drei Gruppen vorgenommen: Diese Aufgabe wird bei dem eingangs dargestellten

' ·* Verfahren erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß eine

^-I₁, 1. In neutralen Salzen lösliche Kollagene, die in wäßrige Lösung verwendet wird, welche Alkali-Me-

"*■* einer wäßrigen Lösung neutraler Salze, wie z. B. 60 tall-Sulfat und als Amine eine geringe Menge primärer

"_ei einer wäßrigen Lösung von 0,5 M Natrium- oder sekundärer verzweigter, unverzweigter oder cy-

^ chlorid, aufgelöst werden können; clischer Amine mit 0 bis 5 Kohlenstoffatomen enthält

2. säurelösliche Kollagene, die in einer Säurelösung, und daß der Faserbrei entsalzt und die Kollagenfasem wie beispielsweise einer Zitratpufferlösung (Zi- mit einer Säurelösung, deren pH-Wert kleiner als 4 ist, ixonensäure + Natriumzitrat) und verdünnter Es- 65 behandelt werden.

sigsäurelösung, aufgelöst werden können und Es hat sich nämlich herausgestellt, daß das unlös-

3. unlösliche Kollagene, die in solchen Lösungen liehe Kollagen ausgewachsener Tiere in seine lösliche nicht aufgelöst werden können. Form umgesetzt werden kann, wenn es mit einer

wäßrigen Lösung von Alkali-Metall-Hydroxid und verwendeten Säuren zählen Salzsäure, Schwefelsäure, Alkali-Metall-Sulfat behandelt wird, die eine kleine Essigsäure, Zitronensäure und Milchsäure. Der pH-Menge einer organischen Base, wie beispielsweise Wert wird so eingestellt, daß er unter 4,0 liegt. Die eines Amins, enthälL Die Wirkung des Alkali auf die Menge der beigefügten Säure wird so eingestellt, daß Telopeptidteile wird dadurch stark beschleunigt. Wenn 5 sich der gewünschte pH-Wert und die gewünschte Konanschließend die Behandlung mit einer Säurelösung zentration der Kollagenlösung ergeben. Die Konzenfortgesetzt wird, wird das Kollagen aufgelöst, und man tration der entstehenden Lösung hegt im aligemeinen erhält eine Kollagenlösung. bei etwa 8 Gewichtsprozent.

_ Im allgemeinen schwillt Kollagen in einer wäßrigen Die Kollagenmoleküle in der gemäß der Erfindung Ätzalkalilösung an. Das in der Lösung gleichfalls vor- io hergestellten Kollagenlösung wurden behaglich ihrer handene Natriumsulfat verhindert jedoch ein der- Eigenviskosität, ihrer Doppelbrechung und ihrer Sediartiges Anschwellen des Kollagens. Auf diese V/eise mentation durch Ultrazentrifugalanalyse und optischer wird verhindert, daß infolge des Alkalizusatzes die Rotation untersucht, und es stellte sich heraus, daß die Denaturierungstemperatur des Kollagens herabgesetzt Kollagenmoleküle in der Lösung monomolekular gewird. Folglich kann das erfindungfgemäße Verfahren 15 löst sind und ihre ursprüngliche Struktur beibehalten bei relativ hohen Temperaturen durchgeführt werden. haben. Die Lösung kann durch Auspressen in regene-

Jedes primäre oder sekundäre Amin, das 0 oder rierte Kollagenartikel, wie Fasern, Filme und Röhren,

5 Kohlenstoffatome enthält, kann bei dem eründungs- mittels konventioneller Verfahren umgewandelt werden,

gemäßen Verfahren Anwendung finden. Das Amin Ein weiteres wichtiges Merkmal der vorliegenden

kann dabei jede Form haben. Es kann unverzweigt, »o Erfindung ist darin zu sehen, daß die Kollagenfaser,

verzweigt oder cyclisch sein. Typische Amine sind: die Kollagtnlösung oder die regenerierte Kollagenfaser,

Monomethylamin, Dimethylamin, Hydrazin, Äthylen- die gemäß der Erfindung erhalten wird, in Gelatine

diamin, Hydroxylamin. Piperidin und Piperazin. An- umgewandelt werden kann, was durch Erhitzen der

dere brauchbare Amine können von jedem Fachmann Kollagenlösung geschieht oder durch Erhitzen der

ausgewählt werden. 25 Kollagenfa^ern in Wasser bei einer Temperatur, die

Die Aminkonzentration liegt zwischen 0,05 und über der Denaturierungstemperatur des Kollagens

0,3 M. Die Konzentration des Alkali-Metall· Hy- liegt. Die entstehende Gelatine besitzt einen isoioni-

droxyds, beispielsweise des Natrium- oder Kalium- sehen Punkt von etwa 4,9, was der gleiche Wert ist wie

hydroxyds, liegt zwischen 0,3 und 1,0 N. Die Konzen- derjenige der Gelatine, die durch Kälkverfahren er-

tration des Alkali-Metall-Sulfats, beispielsweise Na- 30 zeugt wird, und sie unterscheidet sich von der Gelatine,

triumsulfat und Kaliumsulfat, liegt zwischen 10 und die aus unlöslichem Kollagen mit Hilfe von Enzymen

20% (Gewicht/Volumen). Die Arbeitstemperatur liegt erzeugt wurde nur im Hinblick auf den isoionischen

zwischen 15 und 25°C, und die Behandlungszeit Punkt.

schwankt zwischen 5 und 14 Tagen. Im allgemeinen Die auf dem Markt befindlichen Gelatineprodukte

sollte die Behandlungstemperatur herabgesetzt werden, 35 werden üblicherweise so hergestellt, daß die enthaarten

wenn die Konzentration des Natriuinsulfats abgesenkt Rohhäute für eine lange Zeit, beispielsweise für 60 oder

oder die Konzentration des Alkali erhöht wird. 90 Tage, gekalkt werden und daß dann die Gelatine

Das Amin beschleunigt die Hydrolyse, die durch den aus der gekalkten Haut in mehreren Extraktions-Alkali hervorgerufen wird, nur bei den Telopeptiden schritten unter Anwendung von warmem Wasser gedes Kollagens. Das Reststück des Kollagens wird 40 wonnen wird. Die Qualität der so erhaltenen Gelatine nicht hydrolysiert und behält seine ursprüngliche verringert sich mit jedem Extraktionsschritt. Im Struktur. Damit unterscheidet sich das erfindu:ngs- Gegensatz dazu weist die Gelatine, die nach dem gemäße Verfahren von den bisher bekannten, wie sie erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt r,st, eine hohe beispielsweise in der USA.-Patentschrift 21 84 494 Qualität und ein einheitliches Molekulargewicht auf beschrieben werden, wo Kollagen mit einer wäßrigen 45 und kann in einem einzigen Extraktionsschritt nach Lösung von Kalziumhydroxyd behandelt wird, die der Alkalivorbehandlung von weniger als 2 Wochen Amine enthält, die denen ähnlich sind, die bei dem erfolgen.

erfindungsgemäßen Verfahren angewandt werden, da R^1-Ii

diese Kombination eine Hydrolyse nicht nur der TeIo- Beispiel

peptide, sondern auch des Restes der Kollagenfasern 50 Unlösliche Kollagenfasern wurden aus Häuten fol-

hervorruft, wodurch dieses in Teile niedrigeren Mole- gendermaßen gewonnen: Die Stierhaut wurde ent

kulargewichtes aufgespalten wird. Demgemäß ist ein haart und mit Wasser gewaschen. Anschließend wurde

wichtiges Merkmal der Erfindung darin zu sehen, daß sie gespalten, um Fett und Fleisch zu entfernen. Die

das Amin nur in der Weise wirkt, daß sichergestellt ist, verbleibende Zwischenschicht (Corium), die einen

daß nur rlie Telopeptidteile l-nd nicht der Rest der un- 55 größeren Anteil von Kollagen als die anderen Teile

löslichen Kollagenfasern durch das Alkali angegriffen aufweist, wurde mit Wasser gewaschen und in einer

werden. 10%igen wäßrigen Salzlösung eingeweicht. Die Haut

Nach der Alkalibehandlung wird der Kollagen- wurde anschließend durch einen Fleischwolf gedreht,

faserbrei mit einer beliebigen Säure, wie beispielsweise um einen Brei zu erhalten und dabei gekühlt. Zur Ent-

Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Zitronensäure 60 fernung der in neutralen Salzen löslichen Kollagene

oder Milchsäure, neutralisiert. Anschließend wird der und der säurelöslichen Kollagene, die in einem geringen

Faserbrei sorgfältig mit Wasser gewaschen, um das Umfang vorhanden sind, wurde der Brei in einer

Salz zu entfernen. Die Telopeptidteile des so behandel- 10%igen wäßrigen Salzlösung eingeweicht, der eine

ten Kollagens sind aufgelöst, und die Faser schwillt an, 0,15-M-Zitratpufferlösung zugesetzt war, und zwar

ohne jedoch ihr Aussehen wesentlich zu verändern. 65 für die Dauer von 2 Tagen. Anschließend wurde der

Folglich kann die Kollagenfaser leicht in eine Brei erneut mit Wasser gewaschen. Nach der Ein-

Kollagenlösung umgewandelt werden, wenn eine stellung des pH-Wertes des Breies auf 7,0 unter Ver-

Säurelösung beigegeben wird. Zu den üblicherweise Wendung von Natriumhydroxyd wurde der Brei mit

Wasser gewaschen, und die Fasern wurden unter Verwendung von Äthylalkohol dehydriert. Anschließend wurden die Kollagenfasern mit einer Mischung von Äthylalkohol und Äthyläther im Verhältnis von 1:1 entfettet und getrocknet, um adf diese Weise unlösliche Kollagenfasern zu erhalten.
EHe Fasern wurden wie folgt behandelt:

Kollagenfasern 100 g

MaOH 20 g

Na₄SO₁ 160 g

Monomethylamin 6,21 g

Volumen der Lösung Ig

Behandlungstemperatur 20⁰C

Dauer der Behandlung 2 Wochen

Während der Behandlung wurden die Kollagenfasern täglich wenige Male für eine kurze Zeit durchgerührt Anschließend wurde der Brei unter Zuhilfenahme von Säuren, wie beispielsweise Schwefelsäure, Salzsäure, Essigsäure, Zitronensäure oder Milchsäure, neutralisiert. Dann wurde der Brei gewaschen, um alle Salze daraus zu entfernen. Schließlich wurde die Kollagenfaser mit Hilfe einer Säurelösung, beispielsweise einer Essigsäurelösung, mit einem pH-Wert, der unter 4 lag, einen Tag lang unter Rühren ausgezogen, und der Betrag der Säure wurde so eingeregelt, daß die entstehende Kollagenlösung eine Konzentration von etwa 8 % aufwies. Nach dem Ausziehen wurde die Lösung gefiltert, um eine kleine Menge nicht kollagenen Materials, das in der Lösung verblieben war, zu entfernen. Es stellte sich heraus, daß das Molekulargewicht des Kollagens in der Lösung bei etwa 300 000 lag. Die Länge des Moleküls betrug 2800 AE, der Durchmesser 15 AE, und das Molekül hatte die Form eines stanen Stabes, der aus drei Polypeptidketten zusammengesetzt war und war monomolekular in dem wäßrigen Medium gelöst. Als die Kollagenlösung durch eine Düse in ein Koagulationsbad entsprechend den üblichen Verfahren versponnen wurde, wurde die Faserstruktur des Kollagens restlos wieder hergestellt.

Wenn der neutralisierte und gewaschene Kollagenfaserbrei oder die Kollagenlösung oder die regenerierten Kollagenfasern in Wasser eingestreut wurden, das über die Denaturierungstemptratur des Kollagens, beispielsweise auf 50 bis 60° C erhitzt wurde, wurden die drei Polypeptidketten in einzelne Ketten aufgebrochen und bildeten eine Gelatine mit einem einheitlichen Molekulargewicht und einem isoionischen Punkt von etwa pH 4,9.

Beispiel 2

Ossein zunächst wie im Beispiel 1 behandelt, die Alkalibehandlung wurde jedoch wie folgt vorgenommen:

Kollagenfasern 100 g

NaOH 20g

Na₄SO₄ 100 g

Dimethylamin 4,5 g

Volumen der Lösung 1 Liter

Temperatur 15°C

Dauer 2 Wochen

Dann wurde der Kollagenfaserbrei neutralisiert, gewaschen und mit Säure ausgezogen wie im Beispiel

Die entstehende Kollagenlösung hatte die gleichen Eigenschaften wie das Erzeugnis gemäß Beispiel 1 und konnte in regenerierte Fasern und Gelatine umgewandelt werden.

Beispiele 3 bis 6

Kollagenfasern wurden entsprechend dem Beispiel 1 behandelt, die Alkalibehandlung wurde jedoch wie folgt durchgeführt:

Beispiel 3 4 5 6

Verhältnis von 10 10 10 10

Flüssigkeit zu Fasern

KoHagenfasern (g) 100 100 100 100 NaOH (g) 32 32 28 40

Na₂SO₄ (g) 250 160 160 160

Hydrazin (g) 15 — — —

(H₂N - NH₂₁H₂O)

Äthylendiamin (g) —

Hydroxylamin- —

Sulfat (g)

Piperazin (g) — — — 4,3

Temperatur (⁰C) 25 20 20 20

Dauer (Wochen) 1111

12 — —

- 16,4 —

Beispiel 7

Die Verfahren gemäß Beispiel 2 wurden durchgeführt, aber die Bedingungen bei der Alkalibehandlung waren wie folgt:

Verhältnis von Flüssigkeit zu Fasern... 10 g

Kollagenfasern 100 g

NaOH 20 g

Na₂SO₄ 100 g

Piperidin 17 g

Stierknochen wurden 7 Tage lang mit einer 1,2-N- Die Eigenschaften der auf diese Weise erhaltenen

Salzsäurelösung behandelt. Die Säure wurde jeden 55 Kollagenlösungen gemäß Beispiel 3 bis 7 waren die-Tag durch eine frische Lösung ersetzt, um Ossein zu erhalten, das eine große Menge von Kollagen enthielt. Um unlösliches Kollagen zu erhalten, wurde das

selben wie die Eigenschaften der Lösungen gemäß Beispiel 1 und 2. Die Kollagene konnten in regenerierte Fasern und in Gelatine umeewandeit werden.

Claims (2)

Ein Kollagenmolekül ist aus drei Polypeptidketten Patentansprüche: aufgebaut. Diese Ketten aus in neutralem Salz löslichem KoUagen weisen im wesentlichen keine Quer-

1. Verfahren zur Auflösung unlöslichen KoI- verbindungen auf. Mit der Zeit, d. h., bei weiterem lagens bei dem die unlöslichen Kollagenfasem in s biologischem Reifen von löslichem Kollagen, enteiner wäßrigen Lösung von Alkali-MetaU-Hy- stehen zwischen zwei oder drei dieser Ketten intradroxyden und Aminen behandelt werden, da- molekulare und kovalente Querverbindungen,,wie im durch gekennzeichnet, daß eine wäß- FaUe des säurelöslichen Kollagens. Die Moleküle rige Lösung verwendet wird, welche femer ein dieses löslichen Kollagens haben spezieUe Teile so-Alkali-MetaU-Sulfat und als Amine eine geringe io genannte Telopeptide, an den Enden der Moleküle. Menge primärer oder sekundärer verzweigter, un- Die Struktur der Telopeptide unterscheidet sich deutverzweigter oder cyclischer Amine mit O bis lieh von der des Restes der Polypeptidketten. Die TeIo-5 Kohlenstoffatomen enthält und daß der Faser- peptide werden durch Enzyme verhältnismäßig leicht brei entsalzt wird und die Kollagenfasem mit angegriffen. Dagegen bleibt das Mittelstuck der PoIyeiner Säurelösung, deren pH-Weit kleiner als 4 ist, i_S peptidketten unversehrt. Bei dem unlöslichen Kollagen behandelt werden. sind noch weitere Querverbindungen aufgebaut. Im

2. Verwendung der nach Anspruch 1 gewönne- FaUe von Kalbfell bauen sich zwei oder mehr Quernen Kollagenlösung, dadurch gekennzeichnet, daß verbindungen auf, die auch Macromolekule mterdie Kollagenlösung in regenerierte Kollagen- molekular und kovalent im Bereich der Telopeptide artikel umgewandelt wird. ao verbinden. Hierdurch wird das zunächst lösliche

Kollagen, das nur intramolekulare Querverbindungen aufweist, unlöslich. Bei weiterem biologischem Al-

tem, d. h., wenn das Kalbfell zu einer Stierhaut wird,

bauen sich weitere Querverbindungen auf, und zwar