DE1617538A1 - Verfahren zur Herstellung eines Antitoxins - Google Patents

Description

Terfahren zur Herstellung eines Antitoxins

Die Erfindung betrifft die Herstellung eines Antitoxins. Sie wird nachstehend speziell in Verbindung mit der Herstellung von Tetanus-Antitoxin beschrieben, ist jedoch auch zur Herstellung anderer Antitoxine brauchbar, beispielsweise gegen Diphtherie, Staphylokokken, Shigella, Botulinus.sowie gegen Schlangengift und andere .Toxine, die durch Mikroorganismen gebildet werden, beispielswei- _; se durch Bakterien, Viren, Eickettsien, Schimmel und Pilze.

Bisher wurden Antitoxine und, insbesondere Tetanus-Antitoxin gewöhnlich aus Pferdeserum hergestellt. Das Antitoxin v/ird subkutan oder intramuskulär injiziert und als prophylaktisches und therapeutisches Mittel zur Verhütung oder Bekämpfung von Tetanus verwendet.

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BADORKStNAL

I¹Ur

3?ür die Zwecke der vorliegenden Beschreibung ist es nicht notwendig, die Herstellung eines ArititoxiHS aus Pferdeserum im Detail zu beschreiben, es muß jedoch darauf hingewiesen werden, daß die Herstellung eines Antitoxins aus Pferdeserum ein ziemlich teures und aufwendiges Verfahren darstellt und das Volumen nicht groß ist. Außerdem wurde gefunden, daß viele Menschen bei Injektion eines aus Pferdeserum gewonnenen Antitoxins einen heftigen anaphylaktischen Schock erleiden. Es scheint, daß das Pferdeserum-Protein für den Menschen ein Premdprotein darstellt und daher äets große Gefahr bei der Verwendung eines aus Pferdeserum gewonnenen Antitoxins besteht, infolge der heftigen Reaktion, die sogar zum i'ode des Patienten führen kann.

Diese Probleme, wie anaphylaktischer Schock oder Serumkrankheit treten nicht auf, wenn ein aus Milch isoliertes Antitoxin verwendet wird. Ss ist zu erwarten, daß die Milch und das Colostrum aller Säugetiere mit dem System anderer Säugetiere, also auch einschließlich des Menschen, verträglich ist. Daher ist nicht zu erv/arten, daß ein Mensch, dem ein aus Milch gewonnenes Antitoxin injiziert wird, die Gefahr eines anaphylaktisclieri Ochocks läuft.

Außerdem

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Aulat-rdem ist das ililciisystea; "bestimmter Tiere so entjd.ekelt, daß das produzierte Milclivolumen und das Aiit-— toad-üvolumeii, velehes aus der HiIcIi gewonnen, werden kann,

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weit ^röi-ier als es aus Bferdeserum erhalten werden, kann, so daß die Herstellung von Antitoxin sehr viel wirtschaft-Ii eher wix'd. Von einem Pferd kann nur-1/2 bis 11 ge won-neii werden, gegenüber etwa 45 kg Milch pro i'ag feei einer Kuli»

Auf Crruiid der oMgen Überlegungen' ist es ein ErVrI der Brfinaung, ein Terfaiireii zur Herstellung von iUititoxin aus Säugetieriaiicii au schaffen, .welche hyperimnunisiert wurde. Die iärfiiiduncy v.-ird im folgenden ijisbesondere in Terminating mt .Kühen beschrieben, einfach aus tea G-rundj üaS Kühe wahrscheinlich die größten MllGliproduzenten siTid, dies ist jedoch so su verstehen, daß alle Säugetiere in ^rage können, die 3.B. au den Hindern, Pferden, Sunden, Sciiweinen," Siegen und Kamelen gehör en..-.-VJi e oben angegeben, v.drd in den meisten Ländern Kuhmilch verwendet werden,- aber in einigen Teilen der Vielt würde man eher Büffel und Kamele sowie Ziegen, Schafe und andere Landsäugetiere verwenden.

Es ist zwar möglich, verschiedene -Antitoxine herzustellen, die Erfindung wird jedoch insbesondere anhand der Herstel-

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lung von iCetanus-Antitoxin beschrieben, da Tetanus-Antitoxin eines der technisch am sehwieri.rsten herzustellenden Antitoxine ist.

Zur Ausführung der Erfindung wird die Kuh oder ein anderes xier der verschiedenen oben beschriebenen i'amilien -. mit Ginem kommerziellen i'etanustoxoid hyperimmunisiert. Id e injizierte lienge kann etwa 5*0 ni pro Kuh betragen, und die Injektion-kann intramuskulär 3 ",fachen lang in Abstanden von einer lioche vorgenommen worden. Das 'x'oxoid kann auch intravenös, intradermal, intrapei-itoneal und subkutan injiziert werden.- Außerdem kann es auf einem Zuckerwürfel oder gelöst in Honi^ oder Kelasse oder lii Kapseln der Kuh od^-r einem ärmeren i'ier oral verabreicht werden. Das Tier kann, in jedem Zustand hyperimraunisiert wurden, ob es trächtig ist oder nrclit und ob es laktiert oder nicht.

Diη Kuli oder ein anderes I'ier \Ai\1 dann ^pnolken, die IIiIch wird gesammelt, das Kasei?i wiru daraus entfernt und das verbleibende Protein iifl Uilciiserum wird durch Filtration, iällaug und Abzentrifuaieren konzentriert, und schließlich wird das zur Ausfällung verwendete balz

durch

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durch. Dialyse entfernt und das verbleibende Antitoxin-Protein gefrlergetrocicnet. - .

Detailliert besenrieben, erfolgt die Herstellung des Antitoxins folgendermaßen: Die Milch" des hyperlimunisierten Tieres «(untp^r der Bezeichnung "Milch" wird auch das Kolostrum verstanden) wird gesammelt und auf einen Seil liiIch mit drei Teilen sterilem destilliertem Wasser verdünnt. Die verdünnte Milch wird auf etwa 38 Θ erwärmt, und dann wird konzentrierter Labmagen in einer Menge von etwa 5 Seilen Labmagen auf 100000 Teile Milch (d.h.. 0,05 ml pro 1000 DiI Milch) augesetzt. Labmagen und Milch werden gründlich gemischt,und die Temperatur der. Milch wird dann auf etwa 27°0 herabgesetzt, worauf die Milch ohne Rühren etwa 1 Stunde lang stehengelassen vird, um die Koagulation eintreten zu lassen, iiachdem die,Koagulation eingetreten ist, wird die Milch wieder gerührt, um die Klumpen zu verrühren, und danach wird das Milchserum gesammelt und das zusammengeballte oder koagulierte Kasein verworfen.

Das Ililchserurii wird dann durch ,.mehrere Schichten Käse·- tuch (beispielsweise fünf) filtriert» Danach wird der pH-

,/ert

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Wert auf 6,3 eingestellt und Ammoniuiasulfat κ um I-iilchserum augesetzt und gründlich gemischt. Das Ai:imoniumsulfat wird in einer Menge von etwa 0,45 kg Ammoniumsulfat auf 1200 ml Milchserum zugegeben. Lach -rundlichem Mischen wird die Mischung etwa 12 Stunden Ihns auf eine. Temperatur von 4,5 G gekühlt, worauf die klare, überstehende Flüssigkeit abgehebert und verworfen wird unter Zurücklassung des ausgefällten Proteins.

Die erhaltene homogene proteinhaltige Losung "wird dann bei 20 000 g zentrifugiert und die klaip, überstehende lösung im Zentrifugenbecher verworfen,und der I.'iederscnlag am läoden des Bechers wird in einen sterilen Behälter überführt. Dieses Sediment v/ird dann v/eiter durch ein Filterpapier Er. TQ filtriert, vobei man einen dicken, festen Überzug auf dem Papier erhält. Das Filterpapier mit dem dicken Pro teinrii eder schlag \/xrd' etwa 12 stunden lang auf eine Temperatur von -29 C gekühlt. Danach v/ird das halbfeste Protein von der Oberfläche des Filterpapiers mit einem Spatel oder dergl. abgeschabt,und das konzentrierte Protein wird in einem I-Iischer im Verhältnis von etwa 5 ml Vasser auf 10 g Protein rait Nasser emul-. giert. Die erhaltene jümulsion wird dann in üblicher ¥eise

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ij-egeii' steriles destilliertes . '„'asser 72 stunden lang dialjsiert. 3ei. der Dialyse v/er den aus der konzentrierten Pro i-eineriulsion alle Ärainoni ums ulf at spuren entfernt, bobald alle Salisspuren v^rschwunden sind, >rird das Protein aus dem Bialysierschlauch entfernt und, gefriergetroclQxet. üis stellt dann das Antitoxin dar.

Die ii^rütellun^; anderer imtitoxine als Tetanus -Antitoxin erfolgt in gleicher Veise, nur wird axe EuIi odir das andere Säugetier mit dem ^ri^loxQid,iiyperim"anisiert, das die Axitixo

Das nach, des oben bescnritbellen ¥erf eiiren hergestellte !Tetanus-Antitoxin ν,-urde folgexj.dermaSen Uütersacnt: Zuertit ei-fol^te eine Bestiianimg der minimalen letnalen Dosis (MLD) des ioxiiis für die spesiellen Tersuciistiere, d.ii. Heersciiweinclien "and Mäuse. Zuerst v:urde eirie I-leihenverdiuinung des Soxins; in physiplogisciiei- IZociisalzlösmig auf Kons en tr η ti o-i en "von 1:10, 1:100, Ts 200 usw..'..bis auf 1:10 000 YOi-geüo*nrien. ■

Binseldos.en.der ioxinVerdiinnung. vurden an Gruppen von Käusen^^erabreiciit mid der toxisclie iiffekt

des

ι α % a t & //ι a 3 4 , bad original

des Toxins an den Labortieren wurde festgestellt und die Symptome und die Zeit oder das Datum des Todes wurden aufgezeichnet.

Der toxische Effekt bei Mäusen ließ sich bereits "12 Stunden nach der liiokulationszeit erkennen,und in vielen Fällen wurde eine hohe Mortalität.beobachtet» Die Häufigsten Synptome waren Unruhe, überaktivität, häufiges Urinieren beim üiinsetzen der Symptome,und in den spaten Stadien wurde Disurie beobachtet. Auch wurde ein Steifwerden des Beins festgestellt und am häufigsten an der Stelle beobachtet, VfO das Toxin inokuliert worden war. Die Steifheit nahm zu und führte zu einem liachschleppen des Beins durch das Versuchstier,, und zwar sowohl bei Haus als auch bei Meerschweinchen. Die häufigsten Symptome in den Endstadien der Krankheit 'waren Urin- und I'äcesretention und ZurücEweisuiivon L'anrung und "viasser. I)-.=r _anze Körper wurde paralysiert,und gelegentlich legt sich das Tier nieder, dreht den Kopf von der Injektionsseite weg gerichtet zum Boden und zeigt Atemschwierigkeiten. Innerhalb weni ger Stunden stirbt das Tier«

Der Tod des mit dem Toxin geimpften Tieres erfolgte zwi schen einigen Stunden bis zu einigen Tagen naoh der Impfung,

" '"'·.-■ Bia

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■ üiiii kleiner Prozentsatz der Tiere zeigte gegen, die Toxine in niedriger Verdiinnung Resistenz. Bei Verdünnungen über 1:2000 fiel der Mortalitätsrate allmählich ab, aber ein

- dauernder pathologischer Zustand hinsichtlich steifer, unbeweglicher Beine verblieb als Folge der Krankheit.

Aus den obigen Untersuchungen ging hervor, daß Tetanus-Toxin in Verdünnungen von 1:1000 in einer Dosis von 0,2 ml pro Haus lethal wirkt. Diese minimale 'lethaie.Dosis wurde dann zum Testen des erfindungsgemäß hergestellten Tetanus-Antitoxins verwendet, wie in den folgenden Versuchen gezeigt wird.

Im ersten Versuch wurde die Ifeutralisation des Tetanus-Toxirii durch das wie oben beschrieben hergestellte Tetanus-Antitoxin gezeigt, indem das Tetanus-Toxin mit verschiedenen Mengen des Tetanus-Antitoxins gemischt wurde« Tetanus-Toxin und Antitoxin wurden 1 Stunde lang bei-Zimmertemperatur gemisch und inkubiert,und dann wurde eine Dosis von 0,2 ml pro Heerschweinchen jedem Tier intramuskulär injiziert... Die VergleichsgruppO: erhielt eine Injektion des Toxins selbst verabreicht, dem kein Antitoxin zu^e;mischt worden war. Mir die anderen Tiere "wurden- 0,2 ml Toxin mit 0,2,

0,4

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- ίο -

0}4> Öj6 bzw. 0,8 ml ±^:etaiius-Anti toxin vermiculit und in einer !Dosis von 0,2 ml der Iliscliuiig jedem 'i'ier der Versuchsgruppen inokuliert. '

Alle Versacnsmeerschveinenen überlebten. Hieraus gelrfc hervor, daß die "riirksamkeix des Antitoxins 100;o betoug. Alle Vergleichstiere starben, woraus hervorgeht, daß die Kortalität der Kontrollen ebenfalls 100/0 betrug.

In eines zweiten Versuch wurde das Tetanus-i'oxim im Yerliältnis 1:10, 1:100, 1:500■ und 1:1000 reihenverdünnt,oi.d 0,2 ml von jeder der obigen Konzentrationen wurde mit 0,2 ml des erfindungsgemäß hergestellten Antitoxins gemischt. Wieder um vmrde die 1-Ii sehung 1 Stunde inkubiert, und dann wurden 0,2 ml der Mischung intramuslculär jedem Tier eingespritzt· Die Ergebnisse zeigten, daß bei kon.-zentrierterem-Toxin der Schutz verhältnismäßig gering war. Auf Gfrund der sich widersprechenden Ergebnisse, die bei dem obigen Versuch erhalten wurden und die teilweise auf das kannibalistische !Betragen der männlichen Mäuse zurückgeführt \\rerdeii können, die sich gegenseitig umbrachten, wurde der Versuch mit Toxinverdünnungen im Verhältnis von 1:10, 1:200 und 1:500 wiederholt. i)ie Ergebnisse

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nl3se dieses ^IMerholungsVersaciies zeigten, daS alle. Yersticlasraäuse immun waren uud alle Yer^leiciisnäuse starben« Hieraus _:jeht herVör-, daß» wenn 0,2 ml des Toxins in einer Terdiimiung" τοη Mr U10 mit 0,2 nl des vie oben bescnrieben aus !»lilcli hergestellten Tetaiius-Antitoxiiis ^enisclit verdeiij eine völlstäiicage ITsutralS sation des xOxii.o erfolgt» Ifemi dalier den xi sr en eine solche Hiscirung injiziert V.^rai-äe_s v/areii sie vollständig jescliütst-.

Versiiieli vrarde durelagefülii-ti, tun .-die SrgebniSBe aer "beiden oaeii beBcJiriebenen Yersueiie v.'elxer zu erhärten* Bei diesem Versueli v/urde das. erfii^dun.-sgeinäS liergestellte ^rfetanus-JtntItos:in in gleichen, Anteilen jsit iLetanus^^oxin tieEii'öCixt und 15 Hinuten bei Zirümertemperatui' inlrubiert. 0,2 ml dieser ΪΊ1 sellung bürden in den Ballen d^s rechten ]?UiSes bei einer Gruppe von lieerseliv/einclien injiziert* Der Yergleichisgruppe "viurden 0 j2 ml 1i 100 verdünnt es tetanusiLOxiiiij welches.nickt alt akntitOxiii gemiseilt^-war, pro Meerscliv/einchen injiziert. Alle VerBuciisaieerscimeincheii tiberlebten unä alle iCiere der Yergleiclisgruppe starben* Dieser dritte Versuch zeigt deutlich, daß durch I¹Uschen von 0*2 ml des erfinöungsgemäiS gewoimenen Tetanus-Antitoxins mit unverdiiraiteffl wirkBameBi Tetanus-Toxin in einer Menge

von.

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U₃,2 al· die ii&Jische "i/irlaiii^ des ji'oiv vilrd. Me toxisc&e ^irlrsaafceit des lOxiiia .-var^e Is-tsaeüe >-vcz demon^strie-Tt, daß ©s 1.<ι %ί.ϊίίϊ~£ Teriii 1 ί 1CÖ deii ϊοα der Tergleicjistiere in 24 Stiiaiw-en

biine zei^t, da6 aaeli

titoxiiie gegen

gestellt i/erdea ΙεοίΛβίι tmd daS die er-jÄltenea latitoxine viel !billiger ui_d iü viel größ-parejF M.i33i^e eyiiiilfteii a^a^deji als aiee ^isiier laei Vejnieiida^^ τγολ 'Pferch3ί?3~«:·α f%* Jiög— lieli ^eii&l seit %/

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Claims (6)

PA ϊ E J TASS

1. Torf ahr.en zur Herstellung eines Antitoxins durch. das Hilchsystein von weiblichen Heren der zu den·. Pferden, niiiderii, Hunden, Schweinen, Ziegen und Kamelen gehörenden Arten, dadurch gekennzeichnet, daß die !liiere rail; einem kouiiuerzielleii l'oxoid hyperimiaunisiert werden, die I'iilch der hyperimmunisierten 'l'iere ges'aifliaelt uixd mit sterileiü, destilliert em Ifasser verdünnt wird,- das Kasein aus der Milch, entfernt, das verbleibende Milcnserum filtriert, das Protein aus dem Serum ausgefällt, der Proteinnieder schlag gewonnen .und zentrifugiert, der abzentrifugierte laedersehlag in einen sterilen Behälter überfüirrt Uiicl filtriert und der Rückstand gekühlt und gesammelt, dann.mit Wasser emulgiert und die Emulsion gegen destilliertes Nasser dialysiert v/ird, bis alle Salzspuren verschwunden sind und schließlich das verbliebene Antitoxin-Protein gesammelt und gefriergetrocknet v/ird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß den i'ieren 5 ml des kommerziellen l'oxoids in Abständen von 1 Woche während insgesamt 8 Wochen verabreicht werden, um die Hyperimmunisierung hervorzurufen.

3.

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3. Verfahren nach Anspruch. 2, dadurch Kekeiinzeichnet, daß als I-oxoid i'etar.us-x'oxoid verwendet v;ird υ^Λ xetauus-An ti toxin gewonnen v.ird.

4. Verfahr ext nacii Aits^ruch 1, dadurcii gekennzeichnet,

daß die I-ülcii in Verhältnis 1:3 mit sterilem destillierten f v,^rasser .verdiüuxt v/ird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gek

daß d-.r verdünnten ϊ-Iilch konzentrierter Labmagen in Verhältnis von 5 teilen auf 100 000 JJeile der verdlnrrfcen Hilch zugesetzt und gründlich gemischt wird, die Mischung auf etwa 27°0 abgekühlt und etwa 1 Stunde lang koagulieren gelassen, dann zum Verteilen der gebildeten Klumpen gerührt und das Hilchserua vom koagulierten Kasein abgezogen v/ird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein aus dem Hilehserum entfernt wird, indem das Serum durch ,mehrere Schichten Käsetuch filtriert vfird, der pH-~./ert auf 6,8 eingestellt wird, dem Serum Ammoniumsulfat in einer Menge von etwa 0,45 kg auf etwa 1200 ml Hilehserum zugesetzt und gründlich damit vermischt wird

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