DE1617538B2 - - Google Patents

Description

.mmoniumsulfat wird in einer Menge von etwa 0,45 kg »mmoniumsulfat auf 1200 ml Milchserum zugegeben, -lach gründlichem Mischen wird die Mischung etwa 12 Runden lang auf eine Temperatur von 4,5° C gekühlt, vorauf die klare, überstehende Flüssigkeit abgehebert ^r> nd verworfen wird unter Zurücklassung des ausgefallen Proteins.

Die erhaltene homogene proteinhaltige Lösung wird ann bei 20 000 g zentrifugiert und die klare, übersteende Lösung im Zentrifugenbecher verworfen, und der ι ο Jiederschlag am Boden des Bechers wird in einen erilen Behälter überführt. Dieses Sediment wird dann /eiter durch ein Filterpapier filtriert, wobei man einen icken, festen Überzug auf dem Papier erhält. Das ilterpapier mit dem dicken Proteinniederschlag wird r> twa 12 Stunden lang auf eine Temperatur von —29° C ekühlt. Danach wird das halbfeste Protein von der oberfläche des Filterpapiers mit einem Spatel od. dgl. bgeschabt, und das konzentrierte Protein wird in einem lischer im Verhältnis von etwa 5 ml Wasser auf 10 g >o rotein mit Wasser emulgiert. Die erhaltene Emulsion 'ird dann in üblicher Weise gegen steriles destilliertes /asser 72 Stunden lang dialysiert. Bei der Dialyse /erden aus der konzentrierten Proteinemulsion alle .mmoniumsulfatspuren entfernt. Sobald alle Salzspu- _'^r> en verschwunden sind, wird das Protein aus dem .»ialysierschlauch entfernt und gefriergetrocknet. Es iellt dann das Antitoxin dar.

Das nach dem oben beschriebenen Verfahren ergestellte Tetanus-Antitoxin wurde folgendermaßen so ntersucht: Zuerst erfolgte eine Bestimmung der linimalen lethalen Dosis (MLD) des Toxins für die oeziellen Versuchstiere, d. h. Meerschweinchen und -lause. Zuerst wurde eine Reihenverdünnung des oxins in physiologischer Kochsalzlösung auf Konzen- r> ationen von 1 :10,1 :100,1 : 200 usw. bis auf 1 :10 000 orgenommen.

Unterschiedliche Einzeldosen der Toxinverdünnung /urden an Gruppen von Mäusen verabreicht und der oxische Effekt des Toxins an den Labortieren wurde ·ιο estgestellt und die Symptome und die Zeit oder das )atum des Todes wurden aufgezeichnet.

Der toxische Effekt bei Mäusen ließ sich bereits 12 tunden nach der Inokulationszeit erkennen, und in ielen Fällen wurde eine hohe Mortalität beobachtet. -r> )ie häufigsten Symptome waren Unruhe, Überaktivität, äufiges Urinieren beim Einsetzen der Symptome, und ι den späten Stadien wurde Disurie beobachtet. Auch /urde ein Steifwerden des Beins festgestellt und am läufigsten an der Stelle beobachtet, wo das Toxin ^r> <> ^okuliert worden war. Die Steifheit nahm zu und führte u einem Nachschleppen des Beins durch das Versuchsier, und zwar sowohl bei Maus als auch bei Meerschweinchen. Die häufigsten Symptome in den indstadien der Krankheit waren Urin- und Fäcesreten- ^r>^r> ion und Zurückweisung von Nahrung und Wasser. Der anze Körper wurde paralysiert, und gelegentlich legt ich das Tier nieder, dreht den Kopf von der njektionsseite weg gerichtet zum Boden und zeigt Uemschwierigkeiten. Innerhalb weniger Stunden stirbt <>o ias Tier.

Der Tod des mit dem Toxin geimpften Tieres erfolgte wischen einigen Stunden bis zu einigen Tagen nach der mpfung. Ein kleiner Prozentsatz der Tiere zeigte gegen üe Toxine in niedriger Verdünnung Resistenz. Bei h^r> /erdünnungen über 1 :2000 fiel die Mortalitätsrate limählich ab, aber ein dauernder pathologischer 'ustand hinsichtlich steifer, unbeweglicher Beine verblieb als Folge der Krankheit.
. Aus den obigen Untersuchungen ging hervor, daß Tetanus-Toxin in Verdünnungen von 1 :1000 in einer Dosis von 0,2 ml pro Maus lethal wirkt. Diese minimale lethale Dosis wurde dann zum Testen des erfindungsgemäß hergestellten Tetanus-Antitoxins verwendet, wie in den folgenden Versuchen gezeigt wird.

Im ersten Versuch wurde die Neutralisation des Tetanus-Toxins durch das wie oben beschrieben hergestellte Tetanus-Antitoxin gezeigt, indem das Tetanus-Toxin mit verschiedenen Mengen des Tetanus-Antitoxins gemischt wurde. Tetanus-Toxin und Antitoxin wurden 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur gemischt und inkubiert, und dann wurde eine Dosis von 0,2 ml pro Meerschweinchen jedem Tier intramuskulär injiziert. Die Vergleichsgruppe erhielt eine Injektion des Toxins selbst verabreicht, dem kein Antitoxin zugemischt worden war. Für die anderen Tiere wurden 0,2 ml Toxin mit 0,2, 0,4, 0,6 bzw. 0,8 ml Tetanus-Antitoxin vermischt und in einer Dosis von 0,2 ml der Mischung jedem Tier der Versuchsgruppen inokuliert.

Alle Versuchsmeerschweinchen überlebten. Hieraus geht hervor, daß die Wirksamkeit des Antitoxins 100% betrug. Alle Vergleichstiere starben, woraus hervorgeht, daß die Mortalität der Kontrollen ebenfalls 100% betrug.

In einem zweiten Versuch wurde das Tetanus-Toxin im Verhältnis 1:10, 1:100, 1:500 und 1:100 reihenverdünnt, und 0,2 ml von jeder der obigen Konzentrationen wurde mit 0,2 ml des erfindungsgemäß hergestellten Antitoxins gemischt. Wiederum wurde die Mischung 1 Stunde inkubiert, und dann wurden 0,2 ml der Mischung intramuskulär jedem Tier eingespritzt. Die Ergebnisse zeigten, daß bei konzentriertem Toxin der Schutz verhältnismäßig gering war. Auf Grund der sich widersprechenden Ergebnisse, die bei dem obigen Versuch erhalten wurden und die teilweise auf das kannibalistische Betragen der männlichen Mäuse zurückgeführt werden können, die sich gegenseitig umbrachten, wurde der Versuch mit Toxinverdünnungen im Verhältnis von 1:10, 1:200 und 1:500 wiederholt. Die Ergebnisse dieses Wiederholungsversuches zeigten, daß alle Versuchsmäuse immun waren und alle Vergleichsmäuse starben. Hieraus geht hervor, daß, wenn 0,2 ml des Toxins in einer Verdünnung von nur 1:10 mit 0,2 ml des wie oben beschrieben aus Milch hergestellten Tetanus-Antitoxins gemischt werden, eine vollständige Neutralisation des Toxins erfolgt. Wenn daher den Tieren eine solche Mischung injiziert wurde, waren sie vollständig geschützt

Ein dritter Versuch wurde durchgeführt, um die Ergebnisse der beiden oben beschriebenen Versuche weiter zu erhärten. Bei diesem Versuch wurde das erfindungsgemäß hergestellte Tetanus-Antitoxin in gleichen Anteilen mit Tetanus-Toxin gemischt und 15 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. 0,2 ml dieser Mischung wurden in den Ballen des rechten Fußes bei einer Gruppe von Meerschweinchen injiziert. Der Vergleichsgruppe wurden 0,2 ml 1 :100 verdünntes Tetanus-Toxin, welches nicht mit Antitoxin gemischt war, pro Meerschweinchen injiziert. Alle Versuchsmeerschweinchen überlebten und alle Tiere der Vergleichsgruppe starben. Dieser dritte Versuch zeigt deutlich, daß durch Mischen von 0,2 ml des erfindungsgemäß gewonnenen Tetanus-Antitoxins mit unverdünntem wirksamem Tetanus-Toxin in einer Menge von 0,2 ml die toxische Wirkung des Toxins neutralisiert wird. Die toxische Wirksamkeit des Toxins wurde durch

die Tatsache gut demonstriert, daß es in einer Verdünnung von 1 :100 den Tod der Vergleichstiere in 24 Stunden verursachte.

Die vorstehende Beschreibung zeigt, daß das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene Tetanus-Antitoxin viel billiger und in viel größerer Menge erhältlich ist als dies bisher bei Verwendung von Pferdeserum für möglich gehalten wurde.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von Tetanus-Antitoxin über das Milchsystem von weiblichen Tieren der zu den Pferden, Rindern, Hunden, Schweinen, Ziegen und Kamelen gehörenden Art, wobei die Tiere mit einem kommerziellen Toxoid hyperimmunisiert werden, die Milch der hyperimmunisierten Tiere gesammelt und mit sterilem, destilliertem Wasser verdünnt wird, das Kasein aus der Milch entfernt, das verbleibende Milchserum filtriert, das Protein aus dem Serum ausgefällt, der Proteinniederschlag gewonnen und zentrifugiert, der abzentrifugierte Niederschlag in einen sterilen Behälter überführt und filtriert und der Rückstand gekühlt und gesammelt, dann mit Wasser emulgiert und die Emulsion gegen destilliertes Wasser dialysiert wird, bis alle Salzspuren verschwunden sind und schließlich das verbliebene Antitoxin-Protein gesammelt und gefriergetrocknet wird, wobei man dem Tier das Toxoid in zeitlichen Abständen mehrmals verabreicht, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Tier das Toxoid oral verabreicht.

   Die Erfindung betrifft die Herstellung von Tetanus-Antitoxin. Bisher wurde Tetanus-Antitoxin gewöhnlich aus Pferdeserum hergestellt. Die Herstellung aus Pferdeserum stellt jedoch ein ziemlich teures und aufwendiges Verfahren dar und das gewonnene Volumen ist nicht groß. Außerdem wurde gefunden, daß viele Menschen bei Injektion eines aus Pferdeserum gewonnenen Antitoxins einen heftigen anaphylaktischen Schock erleiden. Es scheint, daß das Pferdeserum-Protein für den Menschen ein Fremdprotein darstellt und daher stets große Gefahr bei der Verwendung eines aus Pferdeserum gewonnenen Antitoxins besteht, infolge der heftigen Reaktion, die sogar zum Tode des Patienten führen kann.

   Eine andere bekannte Art der Herstellung verläuft über das Milchsystem von weiblichen Tieren der zu den Pferden, Rindern, Hunden, Schweinen, Ziegen und Kamelen gehörenden Art, wobei die Tiere mit einem kommerziellen Toxoid hyperimmunisiert werden, die Milch der hyperimmunisierten Tiere gesammelt und mit sterilem, destilliertem Wasser verdünnt wird, das Kasein aus der Milch entfernt, das verbleibende Milchserum filtriert, das Protein aus dem Serum ausgefällt, der Proteinniederschlag gewonnen und zentrifugiert, der abzentrifugierte Niederschlag in einen sterilen Behälter überführt und filtriert und der Rückstand gekühlt und gesammelt, dann mit Wasser emulgiert und die Emulsion gegen destilliertes Wasser dialysiert wird, bis alle Salzspuren verschwunden sind und schließlich das verbliebene Antitoxin-Protein gesammelt und gefriergetrocknet wird, wobei man dem Tier das Toxoid in zeitlichen Abständen mehrmals verabreicht. Die Hyperimmunisierung der Tiere erfolgt dabei durch mehrmalige Injektion eines Antigens in den Euter der Tiere. Eine solche Injektion erfordert nun jedoch Sachkenntnis, Geschicklichkeit und Übung in der Handhabung eines so diffizilen Geräts, wie es eine Injektionsspritze darstellt.

   Die Nachteile dieser Herstellungsart zu überwinden ist Aufgabe dieser Erfindung denn die eingangs genannten Probleme, wie anaphylaktischer Schock oder

   Serumkrankheit treten nicht auf, wenn ein aus Milch isoliertes Antitoxin verwendet wird. Es ist zu erwarten, daß die Milch und das Colostrum aller Säugetiere mit dem System anderer Säugetiere, also auch einschließlich des Menschen, verträglich ist. Daher ist nicht zu erwarten, daß ein Mensch, dem ein aus Milch gewonnenes Antitoxin injiziert wird, die Gefahr eines anaphylaktischen Schocks läuft.

   Außerdem ist das Milchsystem bestimmter Tiere so entwickelt, daß das produzierte Milchvolumen und das Antitoxinvolumen, welches aus der Milch gewonnen werden kann, weit größer ist als es aus Pferdeserum erhalten werden kann, so daß die Herstellung von Antitoxin sehr viel wirtschaftlicher wird. Von einem Pferd kann nur '/2 bis 1 1 gewonnen werden, gegenüber etwa 45 kg Milch pro Tag bei einer Kuh.

   Die Erfindung bezweckt somit die Schaffung eines verbesserten Verfahrens zur Gewinnung von Tetanus-Antitoxin über das Milchsystem weiblicher Tiere und die Erfindung besteht darin, daß man dem Tier ein Toxoid oral verabreicht und nicht wie bei dem bekannten, vorstehend beschriebenen Verfahren mehrmals in den Euter einspritzt, wodurch die genannten Schwierigkei- ^ ten und Probleme vermieden werden. \

   Die Erfindung wird im folgenden insbesondere in Verbindung mit Kühen beschrieben, einfach aus dem Grund, daß Kühe wahrscheinlich die größten Milchproduzenten sind; dies ist jedoch so zu verstehen, daß alle Säugetiere in Frage kommen, die z. B. zu den Rindern, Pferden, Hunden, Schweinen, Ziegen und Kamelen gehören.

   Zur Ausführung der Erfindung wird die Kuh oder ein anderes Tier der verschiedenen oben beschriebenen Familien mit einem kommerziellen Tetanustoxid hyperimmunisiert, indem man es auf einem Zuckerwürfel oder gelöst in Honig oder Melasse oder in Kapseln der Kuh oder einem anderen Tier oral verabreicht. Das Tier kann in jedem Zustand hyperimmunisiert werden, ob es trächtig ist oder nicht und ob es laktiert oder nicht.

   Die Kuh oder ein anderes Tier wird dann gemolken, die Milch wird gesammelt, das Kasein wird daraus entfernt und das verbleibende Protein im Milchserum wird durch Filtration, Fällung und Abzentrifugieren konzentriert, und schließlich wird das zur Ausfällung verwendete Salz durch Dialyse entfernt und das verbleibende Antitoxin-Protein gefriergetrocknet.

   Detailliert beschrieben, erfolgt die Herstellung des Antitoxins folgendermaßen: Die Milch des hyperimmunisierten Tieres (unter der Bezeichnung »Milch« wird auch das Colostrum verstanden) wird gesammelt und auf einen Teil Milch mit drei Teilen sterilem destilliertem Wasser verdünnt. Die verdünnte Milch wird auf etwa 38⁰C erwärmt, und dann wird konzentrierter Labmagen in einer Menge von etwa 5 Teilen Labmagen auf 100 000 Teile M ilch (d. h. 0,05 ml pro 1000 ml Milch) zugesetzt. Labmagen und Milch werden gründlich gemischt, und die Temperatur der Milch wird dann auf etwa 27° C herabgesetzt, worauf die Milch ohne Rühren etwa 1 Stunde lang stehengelassen ' wird, um die Koagulation eintreten zu lassen. Nachdem die Koagulation eingetreten ist, wird die Milch wieder gerührt, um die Klumpen zu verrühren, und danach wird das Milchserum gesammelt und das zusammengeballte oder koagulierte Kasein verworfen.

   Das Milchserum wird dann durch mehrere Schichten Käsetuch (beispielsweise fünf) filtriert. Danach wird der | pH-Wert auf 6,8 eingestellt und Ammoniumsulfat zum t Milchserum zugesetzt und gründlich gemischt. Das |