DE1492144A1

DE1492144A1 - Verfahren zur Herstellung von Tetacyklin

Info

Publication number: DE1492144A1
Application number: DE1965S0097587
Authority: DE
Inventors: Slezak Dipl-Chem Josef; Culik Dr Karel; Herold Dipl-Ing Milos; Vondracek Dr Miloslav
Original assignee: Spofa Vereinigte Pharma Werke
Current assignee: Spofa Vereinigte Pharma Werke
Priority date: 1964-06-13
Filing date: 1965-06-11
Publication date: 1969-07-17
Also published as: BE665379A; NL6507554A; BR6570383D0; GB1073047A; FR1450587A; US3425911A; DK108850C; CH444383A; AT257046B

Description

Patentanwalt Dipl. Phys. Dr. Walther 3unlus ²^ ^{Juli 1968}

3 Hannover, Abbe*. 20 _])r# j

Aktenzeicheni(S 97 587 IVa/JOh ) P U 92 144.9 Anmelder : SP(XPA, Sdruz"eni podniku* pro zdravotnickou

v^robu, Praha
Mein Zeichen: 9840

Verfahren zur Herstellung von Tetracyklin

Sie vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren *ur Herstellung von Tetracyklin durch submerse Fermentation eines flüssigen währmediums mit assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und mit Zusatz von Hineralaährsalzen sowie Triazinverbindungen als Chlorierungsinhibitoren, unter aeroben Bedingungen, mit Hilfe von Chlortetracyklin sowie auch Tetracyklin produzierenden Mikroorganismen des Genus Streptomyces und durch Isolierung des Antibiotikums aus der fermentierten Brühe·

Fast alle Streptomyceten, welche unter bestimmten Kultivierungsbedingungen Chlortetraoyklin erzeugen, sind unter anderen Bedingungen befähigt, das Tetracyklin in einer äquivalenten Menge zu produzieren. TOr praktische Anwendungszwecke ist es notwendig, daß das erhaltene Produkt mindestens 90 bis 95%.des einen oder des anderen Antl-

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_— .. μ λ ι

biotikums enthält. Da ihre Trennung bei der Isolierung aus der fermentierten Brühe sehr schwierig ist, ist es zweckmäßig, die Fermentation so zu führen, daß das erwünschte Antibiotikum in möglichst großer Menge erzeugt und die Bildung des anderen unterdrückt wird·

Bei der Kultivierung von geeigneten Nährmedien, in weleben mit einem bestimmten Stamm des Genus Streptomyces die höchsten Ausbeuten an Antibiotikum erzielt werden, kann üblicherweise in Gegenwart von genügend hoher Chlo— rionenkonzentration etwa 90 bis 95# Chlortetracyklin gebildet werden. Venn es erforderlich ist, bei der Fermentation überwiegend Tetracyclin zu gewinnen, ist es möglich, unter Verwendung desselben Stammes und eines Nähr— mediums güoher Zusammensetzung fast ebenso hohe Tetracyklin-Ausbeuten zu erreichen, wobei die Menge dee entstandenen Chlortetracyklins nicht mehr als 5 — 10 % der Gesa«tausbeute der Tetracyklinantibiotika auemacht. In der Literatur wurden verschiedene Verfahren erwähnt, Bit denen dieses Ziel zu erreichen ist· Eines stellt s.B· dl· Verminderung des Chlorionengehaltes in den Nährmedien dar, was sun ersten Mal Minieri vorgeschlagen hat (kanadisches Patent Nr. 5*2 622)· Dieses Verfahren ist allerdings «üh-88JI und kostspielig· Sine vorteilhaftere Maßnahme stellt die Anwendung von bestimmten Chlorierungsinhibitoren dar, durch die bei geeigneter Konzentration in den Afähraedien die Biosynthese des Chlortetracyklins zugunsten des

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Tetracyklins auch in Gegenwart von Chlorionen beträchtlich unterdrückt wird. Es werden anorganische Bromide zugesetzt (kanadisches Patent Nr* 602 694), welche durch kompetitive Inhibierung den iäinbau des Chlors in das Molekül des Antibiotikums während der Biosynthese hindern«

Ss wurde auch eine Reihe von organischen Verbindungen verschiedener Struktur beschrieben, welche die Chlorie- " rung hemmen, d. i. als sogenannte Antimetabolite wirken CJ.J. Goodman und Mitarbeiter, J. Bacteriol, 78 492,1959)·

Bekannt ist auch die Verwendung von symmetrischen 1,3,5-Triazinen, insbesondere von 2-Anilino-4,6-dithiol-triazin und 6-Amino-2,4-dithiol-l,3,5-triazin, welche die Gruppierung CN CXI der Atome haben, wobei der Substituent X einfache S- oder N-Derivate und X ein S-, 0- oder ein N-Atom bedeutet (USA-Patentschrift 3 019 173)· Diese ( Chlorierungsinhibitoren sind relativ schwer herstellbar· Die von ihnen benötigte Menge beeinflußt den Herstellungspreis für Tetracyklin nicht unerheblich·

Die vorliegende Erfindung bringt Triazine in Anwendung, welche relativ leicht herstellbar sind, welche nur in geringer Menge dem Nährmedium zuzusetzen sind und welche daher die Wirtschaftlichkeit der Tetracyklin-Herstellung erhöhen·

_BA0 ORIGINAL 9 0 9 8 2 9/1380

Sie Erfindung besteht darin, daß man dem Nährmedium als Triazin-Verbindung Verbindungen der allgemeinen Formel I

xs·

worin die Substituenten bedeuten:

X ein Wasserstoffatom oder einen Methylrest, Y ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxygruppe, Z ein Wasserstoff at om, einen Alkylrest mit 1-6 Kohlenstoffatomen, einen Aryl- oder Aralkylrest, eine (CH₂)_n000H- oder (0H₂)_nCONH₂-Gruppe, wobei η - O bis %

in einer Menge von 0,0001 bis 0,02$ zugibt.

Als für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besonders geeignete Verbindungen der allgemeinen Formel I seien z.B. 3-Me thy lmercapt o-iJ-hydroxy-6-benzyl-l ,2,4- -triazin, 5-M«rcapto-5-hydroxy-i, 2,4-triazin, 3-Hercapto- -5-hydroxy-6-carboxy-l, 2,4-triazin, J-Mercapto-^-hydroxy- -6-carboxamido-l, 2,4-triazin, ß- ( 3-Mercapto-5-hydroxy- -1,2,4-triazin-6)-propioneäure, 5-Mercapto-5,6-diphenyl- -1,2,4-triazin, 5-Mercapto-5-hydro3?y-6-iiethyl-1,2,4- -triazin und j-Mercapto-^-hydroxy-e-benzyl-l,2,4-triazin

genannt· _5-

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Diese Verbindungen, Derivate des 3-Mercapto-l,2,4-triazine, zeigen eine merkliche antimetabolische Wirkung auf die Chlorierung meistens schon bei einer Konzentration im Nährmedium von 0,0001 - 0,0002 %, gewöhnlich liegt der bevorzugte Bereich zwischen etwa 0,0005 - 0,01 %, wobei 90 - 95 % Tetracyklin gebildet wird. Hit zunehmender Konzentration dieser Inhibitoren beginnen sich, wie bei anderen Chlorierungsinhibitoren, immer mehr auch nichtspezifische toxische Wirkungen auszuwirken, wodurch die Gesamtausbeute an beiden Antibiotika vermindert wird·

In einem Mährmedium, in welchem bei der Fermentation mit einem Streptomyces aureofaciens-Stamm das Verhältnis des entstandenen Chlort etracyklins zu Tetracyklin 95 '· 5 ausmachte, wurde durch Zugabe der angeführten Triazinderivate das umgekehrte Verhältnis 5 : 95 erreicht, ohne merkliche Verminderung der Gesamtauabeute.

Beispiele:

1. Bin Nährmedium, enthaltend 4% Saccharose, 3% Sojamehl, 0,5% Ammoniumsulfat, 0,5% Calciumcarbonat, 0,2% Melasse, 0,4% Haisquellwasser (65% Trockensubstanz) und 0,038% Natriumchlorid, wurde mit 5% einer 24-stündigen Kultur eines Streptomyces aureofaciens-Stammes, welche im Nährmedium gleicher Zusammensetzung ohne NaCl-Zusatz gezüchtet wurde, beimpft. Die Kultivierung wurde in Anem ^: 10 1 Fermentationegefäß unter Belüftung und Rühren bei 30⁰O 84-92 Stunden lang geführt. In Kontrollmedie^

909829/1380 ^ _omml

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ohne NaCl-Zusatz wurde eine Ausbeute von etwa 0,1 - 0,2 % Chlortetracyklin erreicht. Neben der Gesamtausbeute der Antibiotika wurde auch das Verhältnis Tetracyclin : Chlortetracyklin gegen Ende der Fermentation Bit chromatographiseher Methode und durch Vergleich mit einer Reihe von Standarden ermittelt.

Als Antimetabolit wurde das J-Methylmercapto-^-hydroxy-ö- -benzyl-l,2,4-triazin (hergestellt nach Barlow, Welch, J. Amer. Chem. Soc. 78, 1258. 1936) verwendet. Es wurde zu dem sterilisierten Nährmedium in Form einer sterilen wässrigen Suspension in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle I angeführt·

Tabelle I

Konsentration des Sie Gesamtausbeute verhältnis Antimetabolits im der Antibiotika (in CTC ί TC Nährmedium (£) % der Kontrolle;

0 (Kontrolle) 100 79 : 21

0,00* 70,5 26 j 74

2. Bei der Fermentation wurde dieselbe Arbeitsweise wie im Beispiel 1 verwendet. Als Antimetabolit diente das 3-Hercapto-5-hydroxy-l,2,4-triazin (hergestellt nach Gut, Coll. Czech. Chem. Oommuns 26, 986. 1961).

-7-909829/1380 ^ßAD

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- 7 Tabelle II

Konsentration des Sie Gesamtauebeute Verhältnis Ant!metabolites in der Antibiotika (in CTC : TO NährmediuB (£) % der Kontrolle)

0 (Kontrolle)	IUO	79 :	21
0,004	9ü	5 ι	95
U, 02	45,5	5 :	95

3. uei der Fermentation wurde dieselbe Arbeitsweise wie im Beispiel 1 verwendet· Als Antimetabolit diente das 5-Mercapto-6-carboxy-l,2,4-tria*in (hergestellt nach Barlow, Welch, J. Am. Chem· Soc. 78, 1258, 1956).·.

Tabelle IH

Konzentration des Die Gesamtausbeute Verhältnis Antimetabolites im der Antibiotika OTC : TC N&hrmedium (£) (in % der Kontrolle)

0 100 76 ι

0,02 102 58 ί 62

4. Dasselbe «erfahren wie im Beispiel i. Als Antimetabolit diente das 3-Mβrcapto-5-hydroxy-6-carboxamido-l,2,4-triazin (hergestellt nach Veisberger, The Chemistry of Heterocyclic compounds, vol. 10, 1956)·

909829/ 1 3Θ0 _BA0 oBiGiN/0.

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Tabelle IV

Konsentration des Die Gesamtausbeute Antimetabolites im der Antibiotika Nährmedium ($0 (in % der Kontrolle)

Verhältnis CIC : TC

0,006

0,02

100

96,5 105

60 ι 20

71 t 29 50 ι 50

5· Dasselbe verfahren wie im Beispiel 1· Als Antimetabolit diente das p-(5-Mercapto-5-hydroxy-l,2,4-triazin-6)· -propionsäure (hergestellt nach Slouka, Pharmazie 15,317· 196U)·

Tabelle Y

Konzentration des Antimetabolites im Nährmedium )

Die Gesamtausbeute

der Antibiotika

(in # der Kontrolle)

Verhältnis OTC * TC

100

105

76 t 24-4u : 60

6. Dasselbe Verfahren wie im ueispiel 1. Als Antimetabolit diente das 3-Mercapto-5-hydroxy-6-methyl-l,2,4- -triazin (hergestellt nach Weisberger, ibidem).

-9-

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Tabelle VI

Konzentration dee Antimetabolites im Nährmedium )

Die Gesamtausbeute der Antibiotika (in {6 der Kontrolle)

verhältnis üTC : TC

0,0006

0,004-

100

97 80

60 ι 23 : 6 t

Die Ergebnisse in dieser Tabelle zeigen, daß die Verbindunf ein starker Chlorierungsantimetabolit ist·

7. Sasselbe Verfahren wie im Beispiel 1· Als Antimetabolit diente das 3~Mereapto-^hydroxy-6-b«nByl-l,2,4~ -triasin (hergestellt nach Weisberger, ibidem)·

Tabelle VII

Konzentration des Antimetabolites im Nährmedium )

Die tesaetaußbeute der Antibiotika (in % der Kontrolle)

Verhältnis OTO s TG

0,004-

0,008

100 80 58

: 22 ι 81 5 t 95

Auch diese Substanz stellt einen starken Chlorierungs-

antimetabolit dar.

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Claims

H92U4 - ίο - Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Tetracyklin durch submerse Fermentation eines flüssigen Nährmediums mit assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und mit Zusatz von Mineralnährsalzen sowie Triazin-Verbindungen als Chlorierungsinhibitoren, unter aeroben Bedingungen, mit Hilfe von Chlortetracyklin sowie auch Tetracyklin produzierenden Mikroorganismen des Genus Streptomyces und durch Isolierung des Antibiotikums aus der fermentierten Brühe,
dadurch gekennzeichnet,

daß man dem Nährmedium als Triazin-Verbindung Verbindungen der allgemeinen Formel I

xs^x

worin die Substituenten bedeuten: X ein Wasserstoffatom oder einen Methylrest, T ein Wasserstoff atom oder eine Hydroxygruppe, Z ein Wasserstoffatom, einen Alkylrest mit 1-6 Kohlenstoffatomen, einen Aryl- oder Aralkylrest, eine (CH₂)_nC00H - oder (CH₂)_nC0NH₂-Gruppe, wobei η - 0 bis 7,

in einer- Menge von 0,0001 bis 0,02$ zugibt·

-11-

BAD ORIGINAL 909829/1380

U921U - li -

2. Verfahren nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß man als Verbindung der allgemeinen Formel I 3-Me thylmercapto-IHiydroxy-e-benzyl-l, 2,4-triazln verwendet·

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Verbindung der allgemeinen Formel I 3-Mercapto-iHtiydroxy-l,2,4--triazin verwendet.

4» Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Verbindung der allgemeinen Formel I 3-Mercapto-5~hydroxy-6-carboxy-l,2,4-triazin verwendet·

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Verbindung der allgemeinen Formel I 3-Mercapto-5-hydroxy-6-carboxamido-l,2,4-triazin verwendet·

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Verbindung der allgemeinen Formel I ß-(3-Mercapto-5-hydroxy-l,2,4-triazin-6)-propionsäure verwendet.

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H92H4

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Verbindung der allgemeinen Formel I 3-Mercapto-5-hydroxy-6-methyl-l,2,4-triazin verwendet,

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

daß man als Verbindung der allgemeinen Formel I J-Mercapto-^-hydroxy-ö-benzyl-l,2,4—triazin verwendet«

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