DE1442141A1 - Verfahren zur Herstellung von Gentiobiose - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von GentiobioseInfo
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Description
1 BERLIN 33 ■ g MÜNCHEN 27
Auginte-Viktorla-StraBe 86 D Γ.-Ing. HANS RUSCHKE Plenzenau« Str»6e 2
Poat,checfckon£ PATENTANWÄLTE , Τ.Ι.ίοη:0β11/«««
Berlin 83 IHHZIq-I Manchen
Kto. 82780· Kto. ΕΘ 516
f 619
Verfahren but Herstellung von Sentiobiote (Ausscheidung aus latent · ... ... - Patentanmeldung f 32 874 I/a/6 b)
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren sur Her»
stellung von Gentiobiose, insbesondere ein verbessertes
/erfahren sur ensymatischen Herateilung von üentiobiose.
Die technische Herstellung von Gentiobiose wurde bisher
durch Teilhydrolyee von üentiobiose mit einer 0,2#-igen
Lösung von Schwefelsaure oder alt Invertin durchgeführt·
Die Gentienose wurde als Bestandteil von getrocknete« Rhiso«
und './urseln von Gentlana lutia erhalten·
Die auf diese Weise hergestellte üentioblose let jedooh häufig
alt erheblichen Kengen anderer Kohlehydrate verunreinigt.
Die übrigen bisher vorgeschlagenen synthetischen chemischen
und enaymatischen Herstellungsireisen für üentiobiose sind relativ
umständlloh und somit kostspielig «der auf andere Weise
für die Technik ungeeignet·
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-.2- 1U2H1
Hinbliok auf diese und andere Nachteile der bisherigen Verfahren besteht ein Ziel der »rfindung in einem verbesserten
Verfahren zur ensymatisehen Herstellung von Gentiobioee.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in einem verbesserten Verfahren zur enaymatischen Herstellung von fientiobioae,
bei dem das Endprodukt durch andere Kohlehydrate nicht verunrdnigt
ist.
Diese und andere Zielstellungen ergeben sich im einzelnen aus der nachfolgenden Beschreibung, in der anhand eines Beispiels
eine bevorzugte Ausführungeform der praktischen Ausführung der Erfindung gegeben ist.
Gemäß einer bevorzugten Aueführungsform der Erfindung wird
al» Auegangsmaterlal ein Polyaaccharici verwendet, weiches aus
einer Hauptkette von in ß-Bindung von "!-Stellung nach 3-3tellung
gebundenen ölucoaemolekülen besteht und Seitketten von
in Ö-Bindung von 1-Steilung nach 6-3tellung gebundenen Grlucοsemolekülen
aufweist, beispielsweise ein Polyaaceharldgumad, der
trluooee als ei/neigen Monomerenbestandteil enthält, und aus den
linearen, in ß-Bindung von 1-3teilung nach 3-Steilung unter Bildung
des Kettengerttetetes gebundenen Glucosemolekülen mit angehängten,
in ß-Bindung von 1-Steliung nach 6-Steilung gebundenen
GlucoeemolekUlen an jedem dritten ülucoeemolekül in der Kette,
wie Is den folgenden Formeln dargestellt» besteht:
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1 β 6
| O | 1 | 1 | O | 1 |
| 8 | ß | β | ||
| 6 | !6 |
)β
worin β Glucopywuioe· bedeutet und dl· j«weilig«n fl-Bindungen,
wit an««geb«n, in 1,6-Steilung oder 1,3-Steilung erfolgen, wan.
rend I etwa 15 bis 19 In der ersten Verbindung und etwa 6 in
der «weiten Verbindung bedeutet.
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Der Poly sac char iüguniffii wird der Einwirkung irgendeiner wasserlöslichen
ß-1,3-Glucanaee unter Erzeugung eines ^emiechee von
D-GlucoBG und Geutiobioae unterworfen, Nach der Einwirkung der'
Glucanase wird die Gentiobiose von der in dem Gemisch verbleibenden
D-Glueoae abgetrennt.
Spezifisch wird dieser Polysaccharidgumsi unter Bildung von
D-Glucoae und fientiobioet durch ensymatische Hydrolyae mit
einer ß~1,3-D-Glucanase der sich von dem Organismus Basidiomycete
Hr. 806 der SaEualung Ira Microbiology Laboratory, Quartermaster
Research and Engineering Center, iJatick, Massachusetts,
ableitenden Art hydrolysiert· Bs wurde gefunden, daß das Eneym
nur von dem nichtredueierenden Ende des Moleküle aus angreift
und selektiv nur 0-1,3-Bindungen spaltet, so dafi bei der folgenden
vollständigen Hydrolyse durch dieses Enzym der Gummi in Ewei Fraktionen aufbricht, von denen eine aus ^-Glucose und eile
andere aus Gentioblose besteht· Ze wurde festgestellt« daß im
Verlauf dieser Reaktion das Holverhältnie an erhaltener Gentiobiose
fsu D-üluoose konstant hinsichtlich der Zeit verbleibt.
Gemäß d er Erfindung wird der Polysaocharidgunuai, wie in der Patentschrift
. ... ... (Patentanmeldung i 32 ί>74 iVa/6 b) erhalten.
Zusammengefaßt beoteht das Verfahren darin, dul3 eine
wäßrige Lösung, die aindeotetia eine der Carbohydrate Kohraukker,
D-XyIose, D-Iiannose, L-Glucose, L-Ärabinose, U-Galactose,
Fructose, Hai tose, lleleei to se, Iiaf f inoee, lie thyl-ö-mal to aid,
Ae ac vil in ,Cello bio Bö* !'!"ehalose, L-ivhatanose, Glycerin, Cellulose
oder Xylan enthält, ;.,it einen; ürganieinus, wie Sc le rot ium
glucanioum n.sp. (IfRHL 3006) oder anderen Mitgliedern des Uenue
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3d«rotium oder der Genera Cortioium, Solerotinia oder 3tromatinia,
vie ale in der vorstehend aufgeführten l-atentschrlft erwähnt
eiod, inokuliert wird. 4% nach dem angewandten Organismus , kann das Verhältnis von Glucose su Gentiobioit erheblich
variieren. Z.B. kann ein Organ!«ame eine Verbindung alt einem
Verhältnis von 5 Holen Glucose auf je 3 KoI Gentiobioee erseugen9
während ein anderer 3 Hol Glucose auf j eve 11 β K Hol Gentiobioee
oder auch überhaupt nur Oentiobioee eraeugen kann· Sie
vorstehend aufgeführten Organ!asten erseugen Verbindungen alt
eines Verhältnis von 3 Mol Glucose auf jeweils 2 Hol. Gentiobioee
oder 2 Mol Glucose auf jeweils 1 Mol Gentiobioee. Die /ermentierung
wird bei einer Temperatur svisohen etva 20 und 37% autgeführt
Der auf diese Weise erhaltene Guemi wird aus dem Kulturmedium
abgetrennt und in irgendeiner bekannten weise gereinigt. Bei eines typischen Gewinnungeverfahren wird der reine Guaai aus
des Mycel durch Verdünnung in it 2 Heilen Feraentierflussigkelt
auf 1 Teil Wasser und ansehBeSende nitrierung oder einen anderen
geeigneten Abtrennvorgang abgetrennt* Das Polysaccharin
wird dann aus den anderen wasserlöslichen Bestandteilen durch Ausfällung mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel,
beispielsweise Methyl-, Äthyl-, Propjl· oder Isopropylalkohol
oder Aceton abgetrennt« Das ausgefällte Polysaconarid
f-kann dann von der Flüssigkeit abfiltriert ν erden· Der auf die
vorstehend beschriebene Weise hergestellte gereinigte Quasi kann getrocknet und gelagert werden, bevor er verwendet wird,
o£sr er kann erneut gelöst und in Lösung für die weitere Behandlung
gehalten werden.
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Das Ensym ß-D-1,3-Glucanase wird auf folgende Welse hergestellt!
Sine Kultur von Basidlomyeets sp.Q.H. 806 wird während eines
Zeitraumes von 4 bis 14 'lagen und bei einer Temperatur τοη
280C in einem Medium der folgenden Zusammensetzung wachsen gelassen*
| Glucose | 10 g |
| Proteosepepton | 1 " |
| KH2PO4 (1H4)2SO4 Harnstoff |
2 * 1,4 ■ 0,3 ■ |
| MgSO4-7H2O | 0,3 " |
| CaCl2 | 0,3 ■ |
| Hefeextralct | 0,1 " |
| Wasser ph 5·5 |
1 Liter |
Das rohe KuIturf 11 trat wird sentrifugiert, konzentriert, filtriert,
dialysiert und im /akuum auf das Volumen Tor der Dialyse
rekonsentriert· Die erhaltene Lösung enthält etwa 5o bis 400
Aktivität se inhei ten je ml nach der Untersuchung und Messung
in der ron Nelson und Hitarbeitern in "Can.J.Chaa.", Band 41,
1671 (1962) beschriebenen Weise. Zahlreiche Proben zeilen etwa
240 Aktivitätseinheiten Je al.
Das auf diese Weise erhaltene Ensym wird dann sur Hydrolyeierung
des Gummi β auf folgende Weise verwendet! Bin relativ kleines Voluffltn der Bnsyalöeung, beispielsweise etwa 5 al, wird su
einer Lösung des Polysaooharldguamls, de^sdt einem Aoetatpuffer
auf einen pg-Wtrfc swisohen etwa3 und 7 und Yorsugswelse swlsohen
4 und 5 gepuffert 1st» und bei einer Temperatur von etwa
30 bis 70^ auge geben. Unter Laborbedingungen läßt man die Hydro-
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Iy·β sei 50"C während etwa 4 odtr 5 ötundtn ablaufen. Di· Umsetsung
wird durch Wärmebehandlung bei einer ausreichenden
Temperaturt ua da« £nsym su denaturieren, abgebrochen. Se
wird dann abaentrifuglert,und der Gehalt an reduzierendem
Sucker wird nach einer geeigneten anr.lytischen r-ethode , beispielsweise
nach lelaoa-3o«0gyi»"J.Biol.Chem.·» 195, 19« (1952),
bestimmt. Dana wird dl· Gluooee in der Mischung in irgendeiner
geeigneten bekannten Welse, beispielsweise auf chemischen Wege«
durch lonsnauBtauschharae, durch ensyaatische Behandlung alt
Glucoeeoxydaee oder durch Fersentierung, wie nit eine» OrgunisiBuo*
«ris Hefe, der geeignet 1st, die uluooss selektiv im Jtoffweohsel
su verbrauchen« entfernt. Kine bevorzugte Hefe beetent
aus dsr handelsüblichen Bäckerhefe. Die liefe wird in einer Konsentrfctlon
Ton etwa 5 g auf JewelIe 50 al Lösung verwendet·
Kan met dls /ernentierung dann bei einer i'eaperatur von etwa
1u bis 550C und vorsugsvtise swisehen 2ϋ und 30°: während einte
Isltrauaes von etwa 5 Stunden ablaufen, während des ieruentierungsverfahrens
wird der Überwiegende Anteil der uluoose
in der Lösung entfernt· Die verbliebene ölucoee wird, wie nachfolgend
geschildert« durch Adsorption entfernt* lie Zellen werden
dann durch Zentrifugieren entfernt und die Löeuiig i& Vakuum
su einen Sirup konsentrlert.
Die in der LOsung enthultens Gentiobiose wird dann durch Chromatographie
auf e iner Aktivkohlekolonne in folgender Welse gereinigt
ι Daa Hydrolysat wird auf eine Kolonne von Kokosnufi-Xktivkoale
oder irgendein anderes geeignetes Adsorptionsmittel gegeben und aufeinanderfolgend cit uaseer und varliorenden Konsentrationen
an Äthanol gewaaohen. Las auf diese >«eise herge-
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«teilte Produkt erwies eich ale chromatographieoh frei von
Glucose und anderen organischen toffen. Die gegenwärtig nan- dtlsüblich
erhältlichen Gentiobiosenproben seigten hingegen
Spurenmengen an Verunreinigungen bis «u 1 Gewichte-^ des froduktee.
Die rar Hydrolyse des Polysaccharide angewandte Konzentration
dee Eneyme kann ewischen weiten Extremen variieren. Allgemein
ausgedruckt, erfordern kleinere Mengen dee Enrnymo lediglich
längere Digestioneseiten, Die obere Qrense der Snsyakonsentratlon
wird hauptsächlich von wirtschaftlichen Überlegungen bedingt. Ia allgemeinen erwies aicheine Konsentration von 1200 '
Aktivitätseinheiten auf jeweils 5 g Polysaeeharid als sufrledensteilend.
Der hier angewandte Ausdruck "Standardaktiritataeinheiten**
besieht sich auf die Aktivitätseinheiten, die nach IeIeon und Mitarbeitern, wie vorstehend angegeben, bestiamt
wurden. Ee wird bevorsugt, die Konsentration des Ensyme durch
Aktlvitätseinheiten anstelle auf Oewichtsbasis anlügeben, da
sich die Wirkung des Enzyme leicht durch Denaturierung auf
Grund von Wärmetrocknung oder anderen Faktoren als unwirksam
ergeben kann· Dann wird die Gentiobioee aus einem geeigneten
Lösungsmittel, wie Ithanol, Methanol oder Eisessig, utskristallisiert.
Beim Auesetsen an Luft wird auf eirund der Hygroskopisltat
der Gentiobioee ausreichend feuchtigkeit absorbiert, so
daß sich ein Sirup bildet. £s ist deshalb günstig, 2 Hol «ethanol,
1 KoI Essigsäure oder 1/2 Mol Äthanol oder ein anderes geeignetes
Material auf jedes Mol Gentiobioee susugeben, üb ein kristallines
Produkt su erhalten·
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Pit folgenden Beispiele dienen «ur weiteren Xrläuterung der
Erfindung.
Zur Herstellung too fi-D-1,3-Gluoanaae wurde Baeidiomycete »p.
QM 806 in dta Torstehend beschriebenen Mediua bei einer Temperatur
von 28*ß während ein·» Zeiträume· von 4 Tagen waoheen gelassen*
1 Liter dta FiItrat·· der Rohkultur wurde sentrlfugiert
und ie Vakuum in einem Bad von einer leaperatur τοη 30*C
auf das 50-faehe koneentriert. Bann wurde ei· durch ein Millipor
R-?ilter gefiltert, dialyeiert und auf das Volumen Tor der
Dialyee erneut konzentriert. Die Löeung enthält etwa 240 AXtiritäteeinheiten
je ml, beetieat nach der Arbeitsweise τοη IeX-•on
und Mitarbeitern,
Sin Teil ( 5 al ) der EiisymlBeung wurde su 5 g dee Torstenen«
beschriebenen Polyeaocharidgujamie «it eines MolTerhältnie τοη
2 Hol ölucoee auf 1 Mol Uentioblo·· sugegeben und in eines
0»OSm-Aoetatpufffer (1,0 1) alt eine« pg-Wert von 4(8 diepergiert.
Man ließ die Hydrolyee bei SO*c ablaufen, wobei Proben
nach 1, 2, 4» 6, 10 und 21 Stunden entnommen wurden« Jede Probe
wurde in eine« Dampfbad 2 Minuten erhitst, u« da* Ensya tu
deaktivieren, dann sentrifuglert und der öehalt an redusieiv
tem Zucker nach der Methode τοη lele/on-Soaogyi, "J.Biol.Chee.",
19?. 19, (1952), beetiamt. Säen 4 stunden wurde ein konstanter
Redusierwert erhalten·
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' Di· Hydrolyse wurde nach 21 Stunden beendet, indem 2 Minuten bei 110*%? autoklavisrt wurde. Eine geringe Menge ma anorganischem
Material wurde durch Zentrifugieren entfernt« worauf die Lorning durch Zugabe Ton 10 + Vatriuahydroxyd neutralisiert
und im Yakuua auf etwa $0 ml könsentriert wurde· Das Hydrolysat
wurde dann alt 5 g gewaschener Bäckerhefe während etwa 4 Stunden
behandelt· Das Terschwinden der Glucose wurde durch Dünnechiehtehromatographie
auf Kieselgur Ct gemäß Stahl, "J.Chroaatography",
*>, 351» (1961), verfolgt· Sie Zellen wurden durch Zentrifugieren
entfernt und die lösung neutralisiert und konzentriert.
Das Hydrolysat wurde auf eine Kolonne ron Kokoenufi-Aktlrkohle
(2,5 ca ζ 18 on) gegeben und aufeinanderfolgend alt
7 1 Was »er, 4 1 eines Sjt-lgen Äthanols und schließlich mit 2
eines 1OJt-ige η Äthanol» gewaschen, wobei die iäluate in 500 ml-Fraktiontn
gesammelt wurden« Die Fraktionen wurden la Vakuum
konsentriert und der Gehalt durch Dünnschicht- und Paplerohrosatographie
analysierte Das die Gentiobiose enthaltende
10£*lge wftdrige ithanoleluat wird in Form eines chromatographiseh
rslnen Sirups durch Abdampfen des Löeung»mittel· im /akutt»
erhalten· H%r Sirup wird dann in aa ätteJ£flie6en gehaltenem
absoluten Methanol gelöst und das Produkt durch Abkühlen auskristallisiert.
Das Produkt seigt die folgenden Eigenschaften» F * $4*Γ (Zers·), C*j\$ 5 · ♦ 13,0° bei einer Konse&tratlon
Ton 3,3 g in 100 al Wasser (nach 15 Minuten), die sich in 24
Stunde« su + 8,4° (Qleiohgewichtewert) ändert·
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IiB kleiner Teil d·· nach Beispiel 1 erhaltenen Produkt·« wurde
in iesi«saureenhydrid und wasserfreien Batrluaacet&t acetyliert,
wobei sich Ö-Oentiobioseoctaacetat ergab, Sohoelspunkt
und Mie«h»oha«l«punkt « 19HC nach Unkristallisation aus Hethanol.
S-D-I,5-Oluoanaet wurdt durch Wachsen τοη Baeidlooycttt ap.
QH 806 in d·« Yor«ttu*nd be»chri«b«n«n Madiun b«i einer
ratur ren 208C \Ahr«nd «in·· ieitrau«· Ton U Tagen berge et· lit.
Etwa 1 1 de» Filtrate· der üohkultur wurde filtriert und i» Vakuua
bei etwa 5<K Bad temperatur auf da· 5Cn.faohe konsentriert.
Se wurde dann durch ein Killipore H-Filter filtriert, düyeiert
und auf dae Voluaen Tor der Jialj-ββ erneut koneentriert. Die
enthielt 200 Aktiritllteeinheiten je al, bestirnt in derselben weise wie in Beiepiel 1.
Ein 5 «1-Anteil der £nsyslusung wurde «u 5 β dee vorstehend
geschilderten Polysaooharid^iUBuie Bit einen HolTerhaltnie τοη
3 Mol Glucose auf 2 -fcol öentiobiose sugeseben und in O90$a-Aoetatpuff
erlösung nit einen Pg-Wert τοη 4,0 diepergiert. Man führte
die Hydrolyse bei 50*c durch. Eine Probe wurde nach 4 Stunden
entnommen· Die Probe wurde in einea Baapfbad während 3 Minuten
«ur Desaktirierung dee Snnrne erhitst. Sie wurde dann sentrifugiert
und der Öehalt an re&usierendea Zucker nach der Methode
τβη leleon-SoBogyi beetinat·
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Di· Hydroly·· wurde naoh 21 Stunden beendet» lad·« während 3
Minuten bei 12Q0C autoklaviert wurde. Anorganisches Material
wurde durch Zentrifugieren entfernt« worauf die Löeung durch Zugabe τοη 10 Jt Natrlumhydroxyd neutralisiert und Ib Vakuum
auf-etwa 50 ml konzentriert wurde« Da· Hydrolysat wurde dann
alt 2 g gewaschener Bäckerhefe während etwa 10 Stunden behandelt. Das Verschwinden der Glucose wurde durch DUnnaohiohtohromatographi·
auf Kieselgur G nach Stahl (siehe oben) Terfolgt·
-ie Zellen wurden ahsentrifuglert und die Löeung neutral
leiert und konzentriert. Bas Hydrolyeat wurde auf eine
Kolonne τοη Kokosnufi-Aktlrkohle {2,5 em χ 18 om) gegeben und
aufeinanderfolgend mit Waes«r, 5 Jl-igea Äthanol und schließ- '
Hch alt lOjUigea Äthanol gewaschen» wob·! dl· fluate in $00 al«
Fraktionen gseammelt wurden. Di· Fraktionen wurden la Takuua
konsentrisrt und der Inhalt durch Dünneohicht- und Papi*rchronatographie
analysiert. Dae Eluat mit den 10bigen wäßrigen
Ithanol enthielt dl· Gentiobioee, die als chromatographisch
reiner "irup durch Abdaapfen des Löeungemittele la Vakuum
erhalten wurde· Der Sirup wurde in am Rückfluß gehaltenem absoluten «ethanol gelöst und das Produkt durch Kühlen auekrietallisiert.
Das Produkt seigte die folgenden Eigensohaftem
dl« sich In 24 Stunden su + 8,4° (Gleichgewichtewert) ändert··
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9098 50/0087
Claims (1)
- FitintaniprUohi1.) Verfahren sur Herstellung τοη Gentiobiosc» dadurch. gekennzeichnet t daJ «in au· in 8-Bindung τοη 1-Sttllung nach 5-3ttilung und in 3-Blndung τοη 1-3teilung nach 6-Steilung gebunden Ölueoeeeonoaeren aufgebauter Polrsaocharidgiwai 4er Einwirkung eint· fl-1,3-Glucanaee enthaltenden Ensymee unter Hydrolysieren dee Polysaccharides iu eines Geeieoh aue Oluooee und Qentiobioae unterworfen wird und dad aneohlie-Send die Gluooe· τοη der gebildeten Gentiobioee abgetrennt wird.2.) Verfahren naoh Anspruch 1, dadurch gekennseiohnet« daß der Pg-Wert swieohen etwa 3 und etwa 7 und die Temperatur swieohen etwa 20 und 50V während der Behandlung dea Polyeaocharide Kit des Eneye gehalten wird·3·) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennseie&net, dal die Konsentration des Snsyas bei etwa 1200 Otandardeinheiten auf jeweils 5 g Polyeaooharid bei der Behandlung des Polysaccharide ait des En*ya gehalten wird.4·) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennseiohnet» daf die Oluooee aus der Gentiobioeelöeung durch llnbringen eines sw Verbrauch der Konoaacoharide im Stoffweoheel geeigneten Orga- * niemus entfernt wird·BAD ORIGINAL 909850/0087Ί4Α2Η15·) Verfahren nach Anspruch 4» dadurch gekennzeichnet» dad die nach dor fermentierung durch, den ürganieous verbliebene GIueoso duroh Adsorption auf einem kohlenstoffhaltigen Adsorptionsmedium» da« sur selektiven Adsorption von Glucose geeignet iet, ontfomt wird.(S ·) Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gokoa&soiohnott dat da· Adsorptionsmodium au· Aktivkohle oder ein« anderen geeigneten Adsorptionsmittel besteht.7·) Verfahren naeh Anspruch 1» dadurch gekennzeichnet, das sin Polyeaccharid dor ForaolI'dor Simdrkunf eines 1-1,3-iJlucanaee enthaltenden Emsjh» in einer eur Aufreohterhaltung eweag einer andauernden tftuetsung ausreichenden Konssntration hol eimer Temperatur tob etwa 30 bis 5O-C unterworfen wird, hl· das Polysaeoharid su einem Qemisch au· Sluoos« und üentiobiose hydrolysiert wird, worauf die Lueung auf ein· sur Denaturierun« des Snsymes auareiohende Temperatur erhitst UBd die aiuoose tob der öentiobiose abgetrennt wird, das andere Verunreinigungen aus der Luaung entfernt werden und die erhaltene LOsung tob Sentiobioee konsentriert und -iir uentlOBioee au· der Lösung duroh Xugabe eines mit Wasser■lsehbaren organischen Lösungsmittel« abgetrennt und annUliBbd di· «of diese Weise aus der Lösung erhaltene Cemtiofelose isoliert wird·8.) Verfahren nach Anspruch 7f dadurch gekennseichnet, daJ dl· sjation etwa 1200 Stendardeinheiten an £n*ya auf Jeweils 5 g Polyeaecharid betragt und dai die Gluoose aus der fteeÜobioa« dnreh selektive Hydrolyse der Glucose entfernt wird «ad das aioht-kolloldale Stoffe aas der LBsung durch Dialyse entfernt werden, worauf die erhaltene Lttsung der Oeatiosiös· tomsentrlert und die Oentiobiose durch Zugabe •lass sdt nasser sdsehbaren organisehen Lösungsmittel· uakrlstallialert und aasehliesend die auf diese «eise erhale· durch Filtrieren abgetrennt wird·Verfahren naeh Anapmeh 8, dadurch gekenneelehnet., da· der - lsi Bereich von etwa 4 bis 5 vJfhrend der Hydrolyse des Jely»e*echaridee duroh das Snsya gehalten wird·10·) Verfahre* oaeh inaprueh 19 dadurch gekennseichnet« daS ein Peljaaoeharid der FormelTl 11 IiIL.J, ί9 0 9850/0087 BAD ORIGINALH42H1dtr Einwirkung «in·· ß-1,3-Glucanase enthaltenden Ensyme in finer Konzentration von etwa t20*> Standardeinheiten de· Enayn.a auf jeweils 5 g Folysaecharid bei einer Temperatur Ton etwa 30 bis 5O«C unterworfen wird, bis das Polyaaocharid «u einem (tasi sch «us Glucoee und Gentiobioae hydrolysiert iet, worauf dann die Glucoee von der uentiobioee durch selektive Hydrolyse der Glucoee entfernt wird» daß nicht-kolloidale Stoffe aus der Lösung durch Dialyse entfernt und die erhaltene Lusting der ^entiobiose körnen tr iert und die Gsntio« biose durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels uakristallislert und anschließend dje auf dieee v/eise erhaltene Gentiobioee durch filtrieren abgetrennt wird.11.) Verfahren naoh Anspruch 1, dadurch gtkennseiennet» daß ein Polysaocharid der Forms!1 β 6 (1*3)3(1-»)\l
1 1 · ι1 ΰ S * 6 6 »6 BAD ORIGINAL909850/0087der Einwirkung β ine a 3-1,5-ürlucanar.e in eintr iur Aufrecht-•rhaltung einer andauernden Umsetsung ausreichenden Koneentration bei einer Temperatur von etwa 30 bis 500C unterworfen wird, bie das Folysaooharid en einem (ieaisch au· Glucose und Gentiobiose hydrolysiert lat, worauf d ie Lösung auf eine sur Denaturierung dta Ensymes ausreichende Temperatur erhitzt und dann die Sluoose von der Gentiobioee abgetrennt wird, daß andere Verunreinigungen aus der Lösung entfernt werden und die erhaltene Lösung der Gentiobioee konzentriert und die Sentiobiose au· der Lösung durch Zugabe eines mit Wasser aischbaren organischen Lösungaaittele abgetrennt und sohließlioh die auf diese eise au· der Lösung erhultene üentiobiose isoliert wird.12.) Verfahren nach Anspruoh 9, dadurch gekennseiohnet, daß der Pj-Wert i« lereioh τοη etwa 4 bis 9 während der Hydrolyse de· Polysaccharide durch das Insjrs gehalten wird.13.) Verfahren nach Anspruch 10, daduroh gekennselchnett daß die Oluoost durch ?ermentierung »it einer Hefe der sun Verbrauch der Glucose is Stoffwechsel geeigneten Art entfernt14·} Verfahre* oaah Ansprueh 1O,iaduroh gekennzeichnet, dal lie 0 Ium μ i«rah tfereentierung ait ein·· sur Oxydation der alt*···« gseifnetem tamgm entfernt wird·BAD ORIGINAL
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