DE1257084B - Verfahren zur Gewinnung von d-3-(2-Hydroxy-5, 7-dimethyl-4-oxo-6, 8-nonadienyl)-glutarimid (Streptimidon) - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:

C12d

Deutsche KL: 6b-16/03

P22768 IV a/6b

11. Mai 1959

28. Dezember 1967

Die Erfindung bezieht sich auf das Verfahren zur Gewinnung von d-3-(2-Hydroxy-5,7-dimethyl-4-oxo-6,8-nonadienyl)-glutarimid (Streptimidon) aus einem wäßrigen Kulturfiltrat von Streptomyces rimosus forma Paromomycinus.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von d - 3 - (2 - Hydroxy - 5,7 - dimethyl - 4 - oxo-6,8-nonadienyl)-glutarimid (Streptimidon) aus einem wäßrigen Kulturfiltrat von Streptomyces rimosus forma Paromomycinus ist dadurch gekennzeichnet, daß man das wäßrige Kulturfiltrat mit einem mit Wasser nicht mischbaren Alkylester niederer Fettsäuren, Keton oder aliphatischen Alkohol, chlorierten Methan oder einen aromatischen Kohlenwasserstoff extrahiert und aus dem Extrakt das Streptimidon durch Ausfällung mittels Petroläther oder durch Verdampfung des Lösungsmittels abtrennt.

Vorzugsweise wird zur Extraktion ein wäßriges Kulturfiltrat von Streptomyces forma Paromomycinus eingesetzt, aus dem das Paromomycin abgetrennt ao wurde.

Als Extraktionsmittel wird vorzugsweise Äthylacetat eingesetzt.

Das Produkt nach der Erfindung ist wertvoll als Herbicid, insbesondere als Vorauflauf-Herbicid.

Gegenüber den bekannten Herbicid - Natrium-2-(2,4-dichlorphenoxy)-äthylsulfat bildet das Streptimidon den Vorteil, daß sie nicht nur vor dem Auflaufen, sondern auch nach neuem Auflaufen wirksam ist. Außerdem zeigt die neue, Verbindung eine antifungizide Wirkung insbesondere zur Behandlung von Weizenbrand. Auch ist Streptimidon gegen niedere Organismen, z. B. gegen Pilze und Amoeben, wirksam. Zur Extraktion können als Alkylester niedriger Fettsäuren, z. B. Äthylacetat, Butylacetat, Amylacetat und Äthylpropionat als mit Wasser nicht mischbare Ketone, ζ. B. Methylisobutylketon, als aliphatische Alkohole, z. B. n-Butanol und η-Amylalkohol, ferner chlorierte Methane, wie Chloroform, und aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol und Toluol, verwendet werden.

Die wäßrigen Filtrate der Kulturmedien, wie sie als Ausgangsstoffe verwendet werden, kann man wie in der belgischen Patentschrift 547 976 beschrieben, herstellen.

Das Streptimidon kann aus dem Extrakt entweder durch Fällung mit einem aliphatischen Kohlenwasserstoff, in dem das Streptimidon unlöslich ist, wie Petroläther, oder durch Verdampfen des Lösungsmittels erhalten werden. Es kann auf verschiedenen Wegen gereinigt werden. Zum Beispiel kann man es in einem organischen Lösungsmittel, wie Aceton oder Verfahren zur Gewinnung von
d-3-(2-Hydroxy-5,7-dimethyl-4-oxo-6,8-nonadienyl)-glutarimid (Streptimidon)

Anmelder:

Parke, Davis & Company,

Detroit, Mich. (V. St. A.)

Vertreter:

Dr.-Ing. F. Wuesthoff, Dipl.-Ing. G. Puls
und Dr. E. v. Pechmann, Patentanwälte,
München 90, Schweigerstr. 2

Als Erfinder benannt:

Roger Phillip Frohardt,

Henry William Dion, Royal Oak, Mich.;

John Ehrlich,

Grosse Pointe Park, Mich. (V. St. A.)

Beanspruchte Priorität:

V. St. v. Amerika vom 2. Oktober 1958 (764749)

Äthylacetat, lösen, die Lösung kann dann über Aktivkohle chromatographiert werden, das Eluat konzentriert und das Streptimidon in dem Konzentrat zur Kristallisation gebracht werden. Nach einer anderen Ausführungsform kann man es in Wasser lösen, die Lösung einer Gegenstromextraktion mit einem organischen Lösungsmittel, wie Äthylacetat oder n-Butanol, unterwerfen und die am Streptimidon reiche Fraktion bis zu Beginn der Kristallisation konzentrieren. Ein weiteres Verfahren zur Reinigung besteht in dem Auflösen des rohen Produktes in einem Überschuß eines Kristallisationslösungsmittels für Streptimidon, Behandeln der Lösung mit Holzkohle, Waschen der Lösung mit Wasser und Konzentrieren der organischen Phase bis zur Kristallisation.

DieErfindungwird durch die nachstehenden Beispiele erläutert:

Beispiel 1

36701 eines Filtrats eines Kulturmediums von Streptomyces rimosus forma Paromomycinus, aus denen das Paromomycin abgetrennt wurde, und die nach Erprobung gegen Kloeckera africana 1328 Mikro-

709 710Ί79

gramm Streptimidon je Kubikzentimeter enthalten, Die wäßrige Phase wurde abgetrennt und nachein-

wurden mit Äthylacetat in einem Gegenstromextraktor ander in einem zweiten, dritten, vierten und fünften

bei einem Verhältnis von Lösungsmittel zu wäßrigem Scheidetrichter übergeführt, die je 2,21 organische

Filtrat von 1: 4 extrahiert. Die wäßrige Phase wurde Phase aufwiesen, die einem Gemisch aus 4,351 Wasser,

verworfen und die organische Phase auf ein Volumen 5 2,41 Aceton und 19,8 1 Isopropyläther entstammte,

von 1021 eingeengt. 37851 dieses Äthylacetat-Konzen- Zum ersten Trichter wurde eine frische wäßrige Phase

trats wurden zur Trockene im Vakuum eingedampft, in einer Menge von 1,21 zugegeben. Die organischen

wobei man 133 g rohes Streptimidon erhielt. Den Phasen aus dem zweiten, dritten und vierten Trichter

Rückstand löste man in 650 ecm Aceton und gab dann wurden vereinigt und im Vakuum bis zum Beginn der

650 ecm Wasser und 600 ecm Petroläther zu. Nach io Kristallisation eingedampft. Beim Stehen und Abkühlen

dem Schütteln trennte man die wäßrige Schicht ab erhielt man 7,9 kg kristallines Streptimidon. Das

und unterwarf sie einer Gegenstromextraktion unter Produkt schmolz nach der Umkristallisation aus

Verwendung von fünf 4-1-Scheidetrichtern. Die wäßrige einem Gemisch aus 90% Isopropyläther und 10%

Schicht wurde in den ersten Scheidetrichter eingebracht Aceton bei 72 bis 73 ⁰C; [*]f = +238 (0,5% in

und mit einem Gemisch aus 250 ecm Wasser und 15 Wasser); [x] ff = +245° (0,5% in Chloroform). Das

250 ecm Aceton und 1,751 Isopropyläther geschüttelt. Produkt besaß die Formel

CH₃ CH_S O OH

CH₂-C

CH₂ = CH-C = CH-CH C-CH₂-CH-CH₂-CH NH

CH₂-C ^X

d-optische Form. der Sterilisierung betrug 6,90. Das Medium wurde Das in dem obigen Verfahren verwendete Ausgangs- 30 abgekühlt und mit 200 ecm des entwickelten Kulturmaterial wurde wie folgt hergestellt. gemisches, das, wie im vorstehenden Absatz beschrieben, Eine Menge von 101 wäßriges Nährmedium mit hergestellt war, beimpft, und das beimpfte Kulturnachstehendem Gehalt an gemisch wurde 24 Stunden bei 26 ⁰C entwickelt,

Glucosemonohydrat 2,0 % während welcher Zeit man unter Rühren sterile Luft

Sojabohnenölkuchen 1,0% 35 m das Medium einleitete mit einer Geschwindigkeit

mit Salzlösung ausgezogenen Schweine- ' ™n ^etwa 1741/min. Ein Schäumen wurde während der magenrückstand 0 5°/ Beimpfung durch Zugabe von rohem Schweine-Ammoniumchlorid' '.'.'.'.'.'".'.'..'.'.'.'.'.'.'. o'l67 % ^sch™^a'^{z und} Mineralölen, die Mono- und di-Glycerin Natriumchlorid 0 5°/ enthielten, nach Bedarf vermieden. Das anfallende Calciumcarbonate"'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'. 0,5⁰L ⁴° ^entwi<*elte Kulturgemisch wurde für die Beimpfung

eines dritten Kulturmediums, wie nachstehend bewurden mit 10n-Natronlauge auf einen pH-Wert von schrieben, verwendet.

7,5 eingestellt und in einem 301 Gärballon eingebracht, 1135,5 1 Nährmedium mit der oben beschriebenen

der mit passenden Teilen, wie Sprühverteiler, Schlag- Zusammensetzung wurden in einen Gärbehälter von

rührer, Prallplatten und Sammelleitungen aus nicht- 45 18921 aus nichtrostendem Stahl eingebracht und durch

rostendem Stahl, ausgerüstet war, und das Medium einstündiges Erhitzen auf 121⁰C sterilisiert. Der

wurde durch zweistündiges Heizen auf 121⁰C sterili- pH-Wert nach der Sterilisierung betrug 6,75. Das

siert. Nach der Sterilisierung betrug der pH-Wert 7,3. Kulturmedium wurde abgekühlt und mit 37,8 1 der

Das Medium wurde abgekühlt und mit 20 ecm entwickelten Kulturmischung, wie sie nach dem vor-

Sporensuspension aus zwei Agar Sporenstrichkulturen 50 stehenden Absatz erhalten wurde, beimpft. Das

nach Moyer's von Streptomyces rimoses forma Paro- beimpfte Kulturgemisch wurde 24 Stunden bei 26 ⁰C

momycinus in steriler 0,l%iger Natriumheptadecyl- entwickelt, während welcher Zeit man mit einer

sulfat-Lösung beimpft. Das beimpfte Kulturgemisch Geschwindigkeit von 84 Umdr./min rührte und Luft

wurde 71 Stunden bei 26 ⁰C entwickelt, während in einer Menge von etwa 1280 l/min zugefügt wurde,

welcher Zeit das Gemisch mit 225 Umdrehungen je 55 Ein Schäumen wurde durch Zugabe von 3 1 rohem

Minute gerührt wurde, und es wurde sterile Luft durch Schmalz und Mineralölen, die Mono- und Diglyceride

den Sprühverteiler mit einer Geschwindigkeit von enthielten, vor der Entwicklung verhindert sowie durch

12 l/min eingeleitet. Rohes Schweineschmalz und weitere Zugabe von Schmalz und Mineralölen nach

Mineralöl, die Mono- und Diglyceride enthielten, Bedarf. Eine Teilmenge des erhaltenen entwickelten

wurden nach Bedarf während der Entwicklung 60 Kulturgemisches wurde für die Beimpfung weiteren

zugesetzt, um ein Schäumen zu verhindern. Die an- Kulturmediums, wie nachstehend beschrieben wird,

fallende entwickelte Kulturflüssigkeit wurde zur Be- verwendet.

impfung eines zweiten Nährmediums verwendet, wie 45421 Nährmedium mit der oben angegebenen

es im nachstehenden Absatz beschrieben wird. Zusammensetzung wurden in einem Gärbehälter aus

Ein Nährmedium von 37,8 1 mit der oben beschrie- 65 nichtrostendem Stahl von 75701 eingebracht und

benen Zusammensetzung wurde in einem Gärbehälter 1 Stunde bei 121⁰C sterilisiert. Der pH-Wert nach der

von 113 1 aus nichtrostendem Stahl eingebracht und Sterilisierung betrug 6,70. Man ließ das Medium

60 Minuten bei 121⁰C sterilisiert. Der pH-Wert nach abkühlen und beimpfte mit 567,751 entwickelten

Kulturgemisch, wie es nach dem vorstehenden Absatz erhalten wurde. Das beimpfte Kulturgemisch wurde 3 Tage bei 26 ⁰C entwickelt, während welcher Zeit das Gemisch mit einer Geschwindigkeit von 125 Umdr./min gerührt wurde, und man sterilisierte Luft in das Medium mit einer Geschwindigkeit von etwa 3400 1/ min einleitete. Ein Schäumen wurde durch Zugabe von 101 Antischaummittel aus Schmalz und Mineralöl vor der Entwicklung vermieden sowie durch weitere Zugabe von 121 des Mittels während der Entwicklung. Nach 72 Stunden Entwicklung wurden 35001 entwickeltes Kulturgemisch abgenommen und durch Zugabe von 29,4 kg konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt. Man gab 84 kg Diatomeenerde hinzu, mischte zu einer Aufschlämmung und nitrierte das anfallende Gemisch durch eine Filterpresse mit Platten und Rahmen von 36 Zoll, die im voraus mit 22,6 kg Diatomeenerde überzogen waren. Die vereinigten Filtrate und Waschwasser mit einem Volumen von 41001 wurden durch Zugabe von 56,91 6n-Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und durch eine Säule aus 92,5 1 Carbonsäureharz (Amberlite IRC-50) (Teilchengröße entsprechend 16 bis 50 Maschen) in Form des Ammoniumsalzes geleitet, um das in der Lösung vorhandene Paromomycin zu entfernen. Das Perkolat, das das Streptimidon enthält, wurde eingeengt auf 5301 bei einer Temperatur nicht über 35⁰C. Das konzentrierte Perkolat wurde mit 27601 eines ähnlichen Konzentrats, wie es nach dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde, vereinigt. 3,8 kg (8 lbs) Diatomeenerde wurden zu 33001 vereinigten konzentriertem Perkolat hinzugegeben und das Gemisch durch eine Filterpresse mit Rahmen und Platte von 18 Zoll filtriert, die vorher mit etwa 1,9 kg (4 lbs) Diatomeenerde überzogen war. Das Filter wurde mit Wasser gewaschen, und man gab die Waschwasser zum Hauptfiltrat. Die anfallende Lösung (36701) wurde als Ausgangsmaterial für das obige Beispiel verwendet.

40 Beispiel 2

34061 Filtrat eines Kulturmediums von Streptomyces rimosus forma Paromomycinus, aus dem das Paromomycin gemäß Beispiel 1 entfernt worden war, wurde mit 8531 Äthylacetatin einem Gegenstromextraktor nach Podbielniak extrahiert, und die wäßrige Phase wurde verworfen, der Äthylacetatextrakt wurde auf ein Volumen von 13,251 eingeengt, und 3,51 davon wurden durch eine 6 Zoll Adsorptionskolonne geleitet, die aus einer Aufschlämmung von 2,5 kg Aktivkohle und 2,5 kg Diatomeenerde in Äthylacetat hergestellt war. Die Säule wurde mit Äthylacetat entwickelt, wobei man eine Strömungsgeschwindigkeit von 3 bis 3,5 1/Std. aufrechterhielt. Nach etwa einem Füllvolumen (etwa 141) erscheint Streptimidon in dem Eluat. Die nächsten 71 Eluat werden aufgefangen, und die Äthylacetatlösung wird auf eine Streptimidonkonzentration von etwa 142 mg/ccm eingeengt. Man gibt hinreichend Isopropyläther (etwa 2 bis 3 Volumina) hinzu, um eine leicht trübe Lösung zu erzielen. Die Lösung filtriert man und wäscht das Filter mit 200 ecm eines Gemisches aus Isopropyläther-Äthylacetat. Man gibt hinreichend Isopropyläther zum vereinigten Filtrat und Waschwasser hinzu, um ein Isopropyläther-Äthylacetatverhältnis von 3,5:1 zu erzeugen, und kühlt die Lösung 24 Stunden auf 8° C. Das kristalline Streptimidon wird aufgefangen, mit Isopropyläther-Äthylacetat gewaschen und im Vakuum getrocknet; F. 72 bis 73⁰C; [oi\f = +238° (0,5% in Wasser).

Beispiel 3

361 Filtrat eines Kulturmediums aus Streptomyces rimosus forma Paromomycinus, aus dem das Paromomycin gemäß Beispiel 1 entfernt worden war, wurden mit 4,5 1 Äthylacetat in einem Gegenstromextraktor extrahiert, und der Extrakt wurde auf ein Volumen von 500 ecm eingeengt. Der Extrakt (Versuch gegen K. Africana 85,2 mg/ccm) wurde viermal mit 50 ecm 1 Mol Natriumcarbonatlösung, viermal mit 50 ecm Ο,ΐη-Salzsäure und dreimal mit 50 ecm Wasser gewaschen. Die gewaschene Äthylacetatlösung wurde auf ein Volumen von 138 ecm eingeengt und das Konzentrat in 1240 ecm Petroläther gegossen. Das Gemisch wurde über Nacht bei 5°C stehengelassen, das Lösungsmittel durch Dekantieren entfernt, und der Rückstand wurde in hinreichend Aceton zu 120 ecm Lösung gelöst.

100 ecm der Acetonlösung mit dem gewünschten Streptimidon wurden mit 100 ecm Aceton und 750 ecm Isopropyläther verdünnt. 1 g Aktivkohle wurde zugegeben, das Gemisch wurde etwa ¹I₂ Stunde gerührt, und die Aktivkohle wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde mit einem Gemisch aus 135 ecm Isopropyläther und 45 ecm Aceton gewaschen, und die Waschflüssigkeiten wurden zum Hauptfiltrat gegeben. Zu dieser Lösung gab man unter Rühren ein Gemisch aus 500 ecm Isopropyläther, 500 ecm Wasser und 50 ecm Aceton. Die beiden Phasen wurden voneinander getrennt. Die organische Phase wurde zurückgehalten und die wäßrige Phase zweimal mit einem Gemisch, zusammengesetzt aus 11 Isopropyläther und 200 ecm Aceton, ausgezogen. Die organischen Phasen wurden mit der ursprünglichen organischen Phase vereinigt, wobei man eine Lösung mit einem Volumen von 3825 ecm erhielt und mit 6 mg Streptimidon je Kubikzentimeter. Die Lösung wurde mit 300 ecm Wasser gewaschen, die wäßrige Phase verworfen und die organische Phase auf -2O⁰C abgekühlt, um Wasserspuren auszufrieren. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt, bis die Lösung wolkig wurde. Die Lösung wurde erwärmt, beimpft und über Nacht bei 5⁰C stehengelassen, und das kristalline Streptimidon wurde abfiltriert; F. 72 bis 73°C.

Falls gewünscht, können n-Butanol, Chloroform oder Methylisobutylketon bei der Extraktion des Filtrates des Kulturmediums beim obigen Verfahren verwendet werden. In diesem Fall wird der Extrakt im Vakuum zur Trockene eingedampft, und das zurückbleibende rohe Streptimidon wird in Äthylacetat aufgenommen, und die anfallende Lösung wird, wie oben beschrieben, behandelt.

Falls gewünscht, kann das Filtrat aus dem Kulturmedium, wie es beim obigen verwendet wurde, ersetzt werden durch ein Filtrat eines Kulturmediums von Streptomyces rimosus forma Paromomycinus, aus dem das Paromomycin nicht entfernt wurde. Zur Erhöhung der Stabilität kann das Filtrat aus dem Kulturmedium vor der Anwendung des obigen Verfahrens schwach angesäuert werden.

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung von d-3-(2-Hydroxy- 5,7- dimethyl- 4- oxo- 6,8- nonadienyl)-glutar-

imid (Streptimidon) aus einem wäßrigen Kulturfiltrat von Streptomyces rimosus forma Paromomycinus, dadurch gekennzeichnet, daß man das wäßrige Kulturfiltrat mit einem mit Wasser nicht mischbaren Alkylester niederer Fettsäuren, Keton, aliphatischen Alkohol, chlorierten Methan oder aromatischen Kohlenwasserstoff extrahiert und aus dem Extrakt das Streptimidon durch Ausfällen mittels Petroläther oder durch Verdampfung des Extraktionsmittels abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Extraktion ein wäßriges

Kulturfiltrat von Streptomyces rimosus forma Paromomycinus einsetzt, aus dem das Paromomycin abgetrennt wurde.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Extraktionsmittel Äthylacetat einsetzt.

In Betracht gezogene Druckschriften:
»J. American Chem. Soc«, 1959, Bd. 81, S. 5502 und 5504;

Kirk — Othmer, »Encyclop. of chem. technology«, 1956, Bd. 15, S. 22.

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