DE1199923B

DE1199923B - Verfahren zur Gewinnung von Holotoxin

Info

Publication number: DE1199923B
Application number: DES88373A
Authority: DE
Inventors: Shigetoshi Shimada
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1962-11-30
Filing date: 1963-11-21
Publication date: 1965-09-02
Also published as: GB1004726A; US3271255A

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT Int. CL:

A61k

Deutsche KL: 30 h-2/04

AUSLEGESCHRIFT

Nummer: 1199

Aktenzeichen: S 88373IV a/30 h

Anmeldetag: 21. November 1963

Auslegetag: 2. September 1965

Bei Arbeiten über die Zusammensetzung der HoIothurien (Seegurken) wurde gefunden, daß sich aus diesen Tieren ein Wirkstoff isolieren läßt, der eine hohe antifungale Wirkung z. B. gegen pathogene Pilze besitzt, wie sie bei anderen, bereits bekannten Wirk-Stoffen nicht vorhanden sind. Dieser Wirkstoff wird im folgenden genauer beschrieben und als »Holotoxin« bezeichnet.

Das Holotoxin wurde in reiner Form erstmals gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt. Es bildet farblose, nadeiförmige Kristalle mit Fp. 250° C und enthält gemäß der Elementaranalyse 51,9% Kohlenstoff und 7,93% Wasserstoff. Die qualitative Analyse des Holotoxins ergab, daß es Stickstoff, Schwefel und Halogen nicht enthält. Das Produkt ist in niederen Alkoholen, wie Methanol und Äthanol, in der Wärme relativ gut, bei Zimmertemperatur mäßig löslich; es ist unlöslich in Äthyläther, Chloroform, Äthylacetat, Benzol, Toluol, Xylol, Petroläther, Petrolbenzin und Ligroin; seine Löslichkeit in Wasser ist gering. Die Liebermann-Burchard-Reaktion ist positiv. Das infrarote Absorptionsspektrum (in Nujohl) zeigt einen charakteristischen Maximumbereich bei 3300 ~ 3500 und 1745 cmr¹. Eine Kopie des infraroten Absorptionsspektrums zeigt die Zeichnung. Das Ultraviolettspektrum zeigt keine charakteristische Absorption. Die spezifische Drehung beträgt [*]f — 44,6° (Konzentration 2,02 mg je Milliliter Dir methylformamid). Das Produkt wurde mit 5%iger Schwefelsäure bei 100° C hydrolysiert, die Lösung mit Natriumcarbonat neutralisiert und dann mit Chloroform extrahiert. Die erhaltene Wasserschicht wurde auf Papier chromatographiert (Butanol zu Wasser zu Essigsäure = 4:5:1). Der Rf-Wert zeigt an 0,38 ± 0,02 und 0,16 ± 0,02 (gefärbt mit dem Reagenz der Anilinphosphorsäure, das positiv für Zucker ist).

Die in vitro bestimmte antifungale Wirksamkeit des Holotoxins ist wie folgt:

Bestimmte Mengen von kristallinem Holotoxin wurden in einer 17,5%igen Lösung von Dimethylformamid in Wasser gelöst, so daß sich eine Lösung von 2 mg/ml ergab. Die erhaltene Lösung wurde in einem Reihenversuch mit sterilem Wasser verdünnt. Eine Reihe von Agarplatten wurde hergestellt. Die zu untersuchenden Organismen wurden auf die Agarplatten geimpft, um ihr Wachstum festzustellen. Dann wurde festgestellt, welche Minimumkonzentration (mcg/ml) des Wirkstoffs erforderlich war, um das Wachstum zu verhindern. Die Ergebnisse sind aus der Tabelle I zu ersehen.

Verfahren zur Gewinnung von Holotoxin

Anmelder:

Shigetoshi Shimada, Osaka (Japan)

Vertreter:

Dr.-Ing Dr. jur. F. Redies, Dr. rer. nat. B. Redies und Dr. rer. nat. D. Türk, Patentanwälte, Opladen, Rennbaumstr.

Als Erfinder benannt:

Shigetoshi Shimada, Osaka (Japan)

Beanspruchte Priorität:

Japan vom 30. November 1962 (54 120)

2 Tabelle I

Organismen

Minimum-Konzentration

mit

hemmender Wirkung (mcg/ml)

Verwendetes Medium

und Bedingungen der Kultur

Trichophyton asteroides ...

Trichophyton rubrum

Trichophyton interdigitale

Bacillus subtilis

Cornebacterium xerosis ...

Bacillus megaterium

Staphylococcus aureus 209 P

Staphylococcus
Pc-resistant R₃

Staphylococcus
Pc-resistant R₄

Escherichia coli

Proteus vulgaris

Pseudomonus aeruginosa ..

Mycobacterium tuberculosis 607

Mycobacterium phlei

Candida albicans

Torula utilis

Saccharomyces cerevisiae ..

6,25

6,25 bis 1,56 6,25 bis 1,56 >100 >100 >100 >100

>100

>100 >100 >100 >100

>

>100 16,7 2,78 2,78

) ²) ²)

²) ²) ²) ²)

⁸) ³) ⁴) ⁴) ⁴)

*) Saburaud-Agar

²) Bouillon-Agar

³) Glycerin-bouillon-Agar

⁴) Saburaud-Agar

28° C, 96 Stunden 37° C, 15 Stunden 37⁰C, 39 Stunden 28° C, 39,63 Stunden

509 659/430

	Minimum-	Verwendetes
	Konzentration	Medium
Organismen	mit hemmender	und Bedin
	Wirkung	gungen
	mcg/ml	der Kultur
Penicillium chrysogenxun ..	16,7	^s)
Aspergillus niger	16,7	⁵)
Fusarium lini	16,7	J 8)
Gibberella saubinetii	16,7	⁶)
Glomerella cingulata	16,7	⁶)
Helminthosporium avenae	16,7	⁶)
Ophiobolus miyabeams ...	16,7	⁸)
Piricularia oryzae	2,78	⁶)

⁵) Kartoffel-Agar
«) Kartoffel-Agar

28° C, 39,63 Stunden 28° C, 111 Stunden Aus den obigen Feststellungen ergibt sich, daß das Holotoxin in vitro eine hohe antifungale Wirkung gegenüber verschiedenen Pilzen einschließlich der pathogenen Organismen mit pflanzlichem Ursprung besitzt, seine Wirksamkeit in vitro gegen grampositive, gramnegative und Myco-Bakterien aber gering ist.

Das Ergebnis der klinischen Verwendung von Holotoxin war wie folgt:

ίο Alkoholische, wäßrige Lösungen, die Holotoxin in einer Konzentration von 0,01% enthielten, wurden auf die befallenen Stellen der Haut täglich einmal oder mehrmals aufgetragen. Die Behandlungszeit betrug wenigstens 3 Tage und höchstens 4 Wochen. Das Ergebnis ist aus der Tabelle II ersichtlich.

Tabelle II

Ergebnis	Pompholyx trichophytia	Trichophytia am Lanugo- haarteil	Krankheit Tinea versicolor	Candida erosio interdigitalis	Insgesamt
Sehr wirksam	16 14 5 35	1 2 1 4	1 0 0 1	0 1 0 1	18 17 6 41
Wirksam
Unwirksam
Insgesamt

Zum Verständnis der obigen Tabelle wird folgendes bemerkt:

Der Ausdruck »sehr wirksam« bedeutet die Umwandlung des Krankheitszustandes in die negative Feststellung bezüglich des Vorhandenseins von Pilzen unter dem Mikroskop und das vollständige Verschwinden von subjektiven und objektiven Symptomen.

Der Ausdruck »wirksam« bedeutet eine bemerkenswerte Wendung zum Besseren bezüglich der subjektiven und objektiven Symptome.

Der Ausdruck »unwirksam« bedeutet, daß keine symptomatischen Veränderungen eintreten.

Wie sich aus der Tabelle II ergibt, war das Holotoxin in 85,3% der Fälle wirksam; es wurden kaum Nebenwirkungen beobachtet.

Das Holotoxin kann medizinisch in verschiedenen Formen verwendet werden. Die Verwendung in Form einer alkoholisch-wäßrigen Lösung ist zweckmäßig. In dieser Form ist die Substanz stabil, selbst wenn sie bei Zimmertemperatur über 1 Jahr gelagert wird. Für externe Verwendung ist das Holotoxin in Konzentrationen bis herab zu 0,01% genügend wirksam. Holotoxin kann auch im Gemisch mit anderen Medikamenten verwendet werden.

Gegenstand des vorliegenden Patents ist ein Verfahren zur Herstellung des Holotoxins in reiner,vorzugsweise kristallisierter Form. Das Holotoxin kommt in der Natur in einer sehr stark verdünnten Form vor, in der es als Arzneimittel nicht zu verwenden ist. Es war vor der Erfindung nicht möglich, die antifungalen Wirkungen des Holotoxins aus den Eigenschaften der natürlichen Rohstoffe zu erkennen. Das Verfahren zur Herstellung des Holotoxins in reiner Form beruht auf der Erkenntnis, daß das Holotoxin in hydrophilen organischen Lösungsmitteln löslich ist, während die anderen Bestandteile der Holothurien in lipophilen organischen Lösungsmitteln oder in Wasser besser löslich sind, und daß die Unterschiede der Löslichkeiten der verschiedenen in Betracht kommenden Stoffe in den verschiedenen Arten von Lösungsmitteln genügend groß sind, um die Gewinnung des Holotoxins in reiner Form auf dem Wege der Extraktion zu ermöglichen.
Die Ausgangsstoffe für die Gewinnung des HoIotoxins sind die Holothurien (Seegurken). Diese Tiere gehören zur Klasse der Holothroidea der Echinodermata und leben in großen Mengen in den verschiedenen Weltmeeren. Zu den Tieren, die zur Klasse der Holothroidea gehören, rechnen z. B. Stichopus japonicus (S e 1 e η k a), Stichopus chloronotus (Brandt), Holothuria pervicax (S e 1 e η k a), Holothuria monacaria (Lesson), Holothuria leucospilota (Brandt) und Cucumaria frondosa var. japonica (Semper).

Im allgemeinen ist es vorteilhaft, die als Ausgangsprodukte zu verwendenden Holothurien vor der Extraktion mit Lösungsmitteln zu zerkleinern und zu trocknen.

Als hydrophile organische Lösungsmittel werden vorzugsweise niedrige Alkohole, wie Methanol und

Äthanol, verwendet. Als lipophile organische Lösungsmittel kommen z. B. Äthyläther, Chloroform, Benzol, Toluol, Xylol, Petroläther, Petroleumbenzine, Ligroin und Äthylacetat in Betracht. Unter bestimmten Voraussetzungen kann es sich empfehlen, Gemische von verschiedenen hydrophilen oder verschiedenen lipophilen Lösungsmitteln zu verwenden.

Das Extraktionsverfahren kann in verschiedener Weise durchgeführt werden. Beispielsweise kann das Ausgangsprodukt mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel extrahiert, das Lösungsmittel abgedampft, der Rückstand mit einem lipophilen organischen Lösungsmittel und mit Wasser extrahiert und der so erhaltene gereinigte Rückstand dann aus einem hydrophilen organischen Lösungsmittel umkristallisiert werden.

Man kann die Reihenfolge der Extraktionsstufen aber auch umgekehrt durchführen, d. h., das Ausgangsprodukt kann zuerst mit einem lipophilen organi-

sehen Lösungsmittel behandelt werden, wodurch die in lipophilen organischen Lösungsmitteln löslichen unerwünschten Bestandteile entfernt werden; der verbleibende Rückstand kann dann zunächst durch Behandlung mit Wasser gereinigt und abschließend mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel oder in umgekehrter Reihenfolge behandelt werden. Wesentlich ist, daß die in lipophilen Lösungsmitteln und in Wasser löslichen unerwünschten Bestandteile von dem in hydrophilen Lösungsmitteln löslichen Wirkstoff abgetrennt werden.

Die Extraktionsstufen können bei Zimmertemperatur durchgeführt werden; es ist aber vorteilhaft, erhöhte Temperaturen zu verwenden.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabenstellung, den in den Holothurien enthaltenen Wirkstoff in konzentrierter oder reiner Form durch Anwendung von Extraktionsverfahren aus den bezeichneten Ausgangsprodukten zu isolieren, ist als solche neu und erfinderisch; sie konnte aus dem Stand der Technik nicht abgeleitet werden, sondern konnte erst auf Grund der der Erfindung zugrunde liegenden neuen, wissenschaftlichen Erkenntnisse gestellt werden.

Beispiell

1 kg Stichopus japonicus (S e 1 e η k a) wurde in Scheiben geschnitten und unter Erwärmen getrocknet. Ungefähr 100 g der getrockneten Substanz wurden kontinuierlich mit Benzol extrahiert, um die in Benzol löslichen Stoffe zu entfernen. Der Rückstand wurde mit 500 ml Äthanol behandelt, wobei das Gemisch auf dem Wasserbad 6 Stunden lang unter Rückfluß erwärmt wurde. Die Äthanollösung wurde in warmem Zustand filtriert. Der Rückstand wurde noch dreimal mit 300 ml Äthanol extrahiert. Die verschiedenen Filtrate wurden zusammengegeben und das Äthanol unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde unter Rühren mit möglichst wenig Wasser gemischt. Dann wurde abfiltriert oder abzentrifugiert. Die verbleibende wasserunlösliche Substanz wurde mit wenig Wasser gewaschen. Das so erhaltene rohe Holotoxin wurde in wenig Äthanol unter Erwärmen gelöst; die Lösung wurde mit aktiver Kohle entfärbt. Nach dem Kühlen fielen farblose nadeiförmige Kristalle aus, die durch Abfiltrieren isoliert wurden. Die Ausbeute betrug 87 mg.

Beispiel 2

1 kg Holothuria pervicax (S e 1 e η k a) wurde in Scheiben geschnitten und unter Erwärmen getrocknet. 100 g der getrockneten Substanz wurden mit 500 ml Methanol extrahiert, wobei auf dem Wasserbad 6 Stunden unter Rückfluß erwärmt wurde. Die so erhaltene methanolische Lösung wurde warm filtriert.

Der Rückstand wurde noch dreimal mit je 300 ml Methanol extrahiert. Die Filtrate wurden zusammengegeben. Das Methanol wurde unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde getrocknet und in 300 ml Methanol unter Erwärmen wieder gelöst. Die in Methanol unlösliche Substanz wurde entfernt. Dann wurde das Methanol unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde mit 100 ml Toluol verrührt. Der in Toluol unlösliche Wirkstoff wurde durch Abzentrifugieren oder Abfiltrieren unter Absaugen abgetrennt. 50 ml Toluol wurden zu der in Toluol unlöslichen Substanz zugegeben und wieder abgetrennt; dieser Vorgang wurde noch einmal wiederholt. Die so gereinigte, in Toluol unlösliche Substanz wurde mit möglichst wenig Wasser verrührt. Der in Wasser unlösliche Rückstand wurde abfiltriert oder abzentrifugiert und mit wenig Wasser gewaschen. Das so erhaltene rohe Holotoxin wurde weiter aufgearbeitet, wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist. Die Ausbeute betrug 153 mg.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung von Holotoxin, dadurch gekennzeichnet, daß Holothurien einem Extraktionsverfahren unterworfen werden, durch das die in hydrophilen organischen Lösungsmitteln löslichen Bestandteile der Holothurien von den in lipophilen organischen Lösungsmitteln und in Wasser löslichen Bestandteilen abgetrennt und in reiner Form isoliert werden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgangsmaterial zuerst mit dem lipophilen organischen Lösungsmittel und dann mit dem hydrophilen organischen Lösungsmittel behandelt wird und daß der durch Abdampfen des hydrophilen organischen Lösungsmittels aus der Lösung erhaltene Rückstand mit Wasser behandelt wird.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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