DE1124636B

DE1124636B - Verfahren zur Isolierung eines Saponins aus Rosskastanienextrakt

Info

Publication number: DE1124636B
Application number: DEC20210A
Authority: DE
Inventors: Dr Rer Nat Joachim Bosse; Dr Rer Nat Josef Wagner; Dr Rer Nat Fritz Wojahn
Original assignee: Chemische-Pharmazeutische Fabrik Adolf Klinge and Co
Current assignee: Chemische-Pharmazeutische Fabrik Adolf Klinge and Co
Priority date: 1959-11-20
Filing date: 1959-11-20
Publication date: 1962-03-01
Also published as: BE596333A; LU39368A1; CH397154A

Description

Verfahren zur Isolierung eines Saponins aus Roßkastanienextrakt Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Isolierung eines neuen Saponins aus dem Extrakt von Teilen, insbesondere Samen, der Roßkastanie-und zwar eines Saponins, das in einer seiner beiden Formen von einer hämolytischen Wirkung völlig frei und in der anderen seiner Formen von bei der Injektion seiner Lösung in die Blutbahn schädlichen hämolytischen Wirkungen frei ist.
Die Erfinder haben diesem neuentdeckten wasserlöslichen Saponin die Bezeichnung » Kryptoäscin « gegeben, wobei Kryptoäscin A die nicht hämolytische und Kryptoäscin B, in das das Kryptoäscin A übergeht, die geringfügig hämolytische Form ist.
Während lange Zeit die Meinung herrschte, daß die therapeutische Wirkung des per os eingenommenen Roßkastanienextraktes zurückzuführen sei auf den Gehalt dieser Extrakte an Saponin, und in neuerer Zeit festgestellt wurde, daß beim Entfernen des beim Einspritzen in die Blutbahn hämolytisch wirkenden, die Injizierung des Extraktes also verhindernden Saponins, z. B. durch Behandeln mit Cholesterin und Abtrennen des Feststoffes, ein Restextrakt erhalten wird, der nicht nur die wertvollen therapeutischen Eigenschaften des ursprünglichen saponinhaltigen Extraktes aufweist, sondern bei dem Injizieren zusätzliche wertvolle Wirkungen hervorruft, haben die Erfinder festgestellt, daß in dem wässerig-alkoholischen oder wässerigen Extrakt von Teilchen, insbesondere Samen, der Roßkastanie nach Befreien von den durch Einwirkung von Cholesterin fällbaren Saponinen noch ein Saponinkörper vorliegt, der durch das Behandeln mit Cholesterin nicht entfernt wurde und der sich, wie weiter gefunden wurde, isolieren läßt durch Extrahieren eines auf an sich bekannte Weise von solchen Saponinen, die durch Einwirkung von Cholesterin entfernbar sind, befreiten wässerigen oder wässerig-alkoholischen, auf einen pH-Wert von 2 oder darunter angesäuerten Restextrakts, insbesondere aus Roßkastaniensamen, mit Butylalkohol, Amylalkohol oder anderen mit Wasser nicht mischbaren Alkoholen, oder mit Methyläthylketon, Abtrennen der organischen Phase und Gewinnen des Kryptoäscins aus dieser.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird die organische Phase mit Wasser gewaschen, mit Tierkohle oder mit Aluminiumoxyd behandelt, die Lösung zur Trockne verdampft, in Wasser aufgenommen, diese wässerige Lösung mit einem Kationenaustauscher behandelt, in Butanol übergeführt, die Butanollösung zur Trockne verdampft, in Methylalkohol aufgenommen, diese Lösung mit Tierkohle behandelt und der Methylalkohol dann abgedampft.
Die anderen Inhaltsstoffe des Roßkastanienextraktes, z. B. Flavone, bleiben nach Abscheiden dieses Saponins nun frei von allen saponinartigen Körpern zurück, während das Kryptoäscin für sich frei von anderen Saponinen gewonnen wird.
Bei Injizieren einer Lösung dieses Kryptoäscins treten keine schädlichen hämolytischen Wirkungen auf ; das Kryptoäscin wirkt in starkem Maße auf das Gefäßsystem und weist Diuresewirkung und Antihistaminwirkung auf.
Dieses Saponin liegt in einer unhämolytischen wasserlöslichen A-Form vor und in einer eine leichte, jedoch unschädliche Hämolyse bewirkenden B-Form.
Der Übergang von der A-Form in die-isomere-B-Form geht in wässeriger Lösung vor sich ; er wird mit steigender Temperatur und sinkendem pH-Wert beschleunigt ; bei Raumtemperatur und pn 6 bis 7 bleibt die A-Form auch in wässeriger Lösung über einen längeren Zeitraum stabil.
Das Kryptoäscin A unterscheidet sich von dem bisher in dem Roßkastanienextrakt aufgefundenen Saponin Äscin durch einen Mehrgehalt an l Mol Arabinose. Außerdem fehlt ihm wahrscheinlich die im Aglukon des Äscin-Moleküls vorhandene Doppelbindung zwischen Cl2 und Cl3.
Der Schmelzpunkt von Kryptoäscin A liegt bei 218 bis 220°C. Das Molekulargewicht beträgt 1253.
Das ohne Änderung des Molekulargewichtes aus dem Kryptoäscin A durch Isomerisierung in wässeriger Lösung beim Erwärmen entstehende Kryptoäscin B zeigt einen Schmelzpunkt von 220 bis 221°C.
Die Kryptoäscinlösung kann aIs solche für therapeutische Zwecke verwendet werden, oder aber sie kann zur Anreicherung eines Roßkastanienextraktes, insbesondere eines Roßkastanienextraktes, dessen mit Cholesterin fällbare Saponinanteile entfernt sind, verwendet werden ; die nach Abtrennen des zu isolierenden Kryptoäscins von allen Saponinanteilen befreite oder praktisch freie Roßkastanienextraktlösung kann für therapeutische Zwecke mit Vorteil dann verwendet werden, wenn die therapeutische Wirkung des Kryptoäscins nicht erwünscht ist, dagegen die therapeutische Wirkung der übrigen Inhaltsstoffe des Extraktes, z. B. der Flavonstoffe.
Nach Abscheiden des mit Cholesterin fällbaren Anteils des Extraktes der Roßkastanie fällt beim Ansäuern auf einen pH-Wert von 2 oder darunter das Kryptoäscin aus, das von der Flüssigkeit mechanisch, z. B. durch Zentrifugieren, abgetrennt und durch Umlösen gereinigt werden kann ; nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung geschieht die Abtrennung durch Behandeln des Gemisches von Flüssigkeit und ausgefälltem Stoff bzw. der Lösung bei Ansäuern auf einen weniger sauren pB :-Wert, der nicht zu einem Ausfällen in sichtbarer Form führt, mit bestimmten organischen, mit Wasser nicht oder teilweise mischbaren Lösungsmitteln und die Isolierung durch Abdampfen der von dem übrigen Extrakt getrennten organischen Lösung.
Gegebenenfalls wird von Extrakten ausgegangen, die von Begleitstoffen wie Flavonolglycosiden durch Behandeln mit Aluminiumoxyd und vollständiges Entmineralisieren durch Kationenaustauschersäulen befreit wurden.
Die Erfindung schafft nicht nur die Möglichkeit, einen Roßkastanienextrakt zu erzeugen, der von Saponinstoffen völlig oder im gewünschten Maße frei ist, sondern schafft weiter die Möglichkeit, das therapeutisch wirksame, keine schädliche Hämolyse bei dem Einspritzen in die Blutbahn bewirkende Kryptoäscin als solches zu verwenden, was die Möglichkeit genauer Dosierung mit sich bringt, und die Möglichkeit, den Gehalt eines Roßkastanienextraktes an diesem neu entdeckten therapeutisch wirkungsvollen Kryptoäscin zu erhöhen und/oder zu dosieren.
Als organische Lösungsmittel eignen sich Alkohole wie n-Butanol sowie iso-Butanol, n-Amylalkohol, iso-Amylalkohol und Methyläthylketon.
Die folgenden Ausführungen und des Beispiels veranschaulichen die Erfindung.
Wird aus einem ledigen wässerigen Roßkastanienextrakt durch Versetzen mit Cholesterin (100 g auf 101 Extrakt) in ätherischer Lösung, nach Abdampfen des Äthers und Zentrifugieren das beim Injizieren in die Blutbahn hämolytisch wirkende Saponin abgetrennt, so verbleibt ein Restextrakt von bitterem Geschmack ohne hämolytische Wirkung, der eine gewisse Schaumkraft besitzt. Beim Ansäuern dieses Restextraktes, z. B. auf pH 2, entsteht ein Niederschlag von Kryptoäscin A, der abzentrifugiert werden kann. Noch in Lösung verbleibendes Kryptoäscin kann mittels eines mit Wasser nicht oder teilweise mischbaren Alkohols wie n-Butanol oder mit Methyläthylketon ausgeschüttelt werden.
Aus diesem Niederschlag und den Extrakten können begleitende Flavonolglycoside durch Behandeln mit Aluminiumoxyd abgetrennt werden. Eine weitere Reinigung ist möglich durch sorgfältiges Waschen des organischen Lösungsmittels mit Wasser. Die noch in sehr geringer Menge verbleibenden gefärbten Verunreinigungen lassen sich mit Tierkohle in methanolischer Lösung entfernen. Bei Reinigung über Aluminiumoxyd muß die wässerige Saponinlösung über einen Kationenaustauscher entmineralisiert werden.
Aus der sauer abfließenden wässerigen Lösung kann das reine Saponin mit den schon genannten organischen Lösungsmitteln wiederum extrahiert werden.
Die hämolytische Aktivität des Kryptoäscins ist sehr gering ; die von Kryptoäscin A ist Null ; die Toxizität liegt niedriger als die des cholesterinfällbaren Saponinanteils des Roßkastanienextraktes.
Die folgende Tabelle zeigt im Vergleich die Werte für das Hämolysevermögen und die Toxizität.

Hämolyse und 24-Stunden-DLsO-Werte von Roßkastanien extrakten bzw. Fraktionen

HI I DLso

Roßkastanienextrakt (normal) l : 6000

Roßkastanienextrakt (chole-

sterinbehandelt, nicht hitze-

sterilisiert, enthält etwa 10%

Kryptoäscin A) I : 0 1900 mg/kg

Roßkastanienextrakt (chole-

sterinbehandelt, hitzesterili-

siert, enthält etwa 10°/o Kryp-

toäscin 1 : 500 1400 mg/kg

Kryptoäscin A.............. 1 : 0 195 mg/kg

Kryptoäscin 1 : 6000 160 mg/kg

Cholesterinfällbares Saponin,

Äscin 1 : 30000 32 mg/kg

Pharmakologische Untersuchungen von Kryptoäscin A und Kryptoäscin B brachten sehr befriedigende Ergebnisse ; die Stoffe zeichneten sich durch starke Gefäßwirksamkeit, diuretische Wirkung sowie Antihistaminwirkung aus.

Beispiel Mit Cholesterin vorbehandelter Extrakt von RoB-kastaniensamen (11, 10%ig) wurde auf pH 2 angesäuert; der entstehende Niederschlag wurde abzentrifugiert. Der Uberstand wurde mehrmals mit n-Butanol (viermal 200 ml) extrahiert. In den vereinigten Extrakten wurde der Niederschlag gelöst. Die Lösung wurde mit Wasser (viermal 100 ml) einige Male zur Befreiung von Mineralsäuren behandelt.
Zur Abtrennung von Flavonolglycosiden wurde der Butanolextrakt mit Aluminiumoxyd (Woelm, neutral) behandelt.
Nach Abdestillieren des Butanols im Vakuum wurde der Rückstand in 400 ml Wasser gelöst und über einem Kationenaustauscher (40 ml, Dowex 50, x-4) entmineralisiert.
Aus der abfließenden sauren Lösung wurde das Kryptoäscin mit n-Butanol extrahiert ; es wurde nach Abtreiben des Extraktionsmittels im Vakuum in 200 ml Methanol gelöst und mit Tierkohle entfärbt ; dann im Vakuum zur Trockne eingeengt.
Ausbeute : 10, 5 g.
Eigenschaften : Schmp. (Säure) = 218 bis 220°C, Schmp. (Na-Salz) = 255 bis 257°C.
NID D27 = 7,9; Rf = 0, 5 ; HI = 1 : 0.
Die Bestimmung der Rf-Werte erfolgte durch 14stündige, aufsteigende Trennung der Substanzen auf Schleicher & Schüll 2043b mit Essigester-Ameisensäure-Wasser (10 : 2 : 3). Die Verbindungen färbten sich, nach Behandlung mit SbCl3-gesättigtem Chloroform und anschließendem kurzem Erhitzen auf 100°C, rötlichbraun.
Weißes, amorphes und hygroskopisches Pulver von stark bitterem Geschmack mit Reizwirkung auf die Schleimhaut.
Leicht löslich in Methanol, mäßig in Wasser und Äthanol, schlecht löslich in Aceton und unlöslich in Äther und Kohlenwasserstoffen.
Entwickelt in wässeriger Lösung, noch 1 : 20000 verdünnt, beim Schütteln kräftig Schaum. Die Verbindung fällt bei PH 2 aus mäßig verdünnten Lösungen aus, nicht aber in Anwesenheit von cholesterinfällbarem Saponin.
Zusammensetzung : Äscigenin, -Methyl--oxybuttersäure, Essigsäure, Arabinose, Xylose, Glukose, Glukuronsäure und Wasser.
C-H-Analyse : C59H94O27#H2O.
Molekulargewicht 1253, 4.
Berechnet... C 56, 55 °/o, H 7, 72 °/o ; gefunden ... C 56, 54 °/o, H 7, 74 °/0 (aus wässeriger Lösung isoliert).
Äquivalentgewichtsbestimmung : 1000 g verbrauchtenzur Verseifung 23,90n/10-NaOH.
Aquivalentgewicht : Berechnet..... 417, 8 ; gefunden..... 418, 5.
Molekulargewicht : Berechnet..... 1253, 4 ; gefunden..... 1255, 5.
Durch Lösung von Kryptoäscin A in Wasser und Erhitzen kann Kryptoäscin B gewonnen werden.
Die an Aluminiumoxyd adsorbierten Flavonolglycoside wurden mit verdünnten Mineralsäuren abgelöst und über ihre Bleisalze gereinigt. Die von Blei befreiten Flavonolglycoside stellten ein gut wasserlösliches Produkt dar.
Aus dem Kunstharzaustauscher ließen sich keine Roßkastanieninhaltsstoffe isolieren, da dieser nur Kationen festhält.
Umwandlung von Kryptoäscin A in Kryptoäcsin B 10 g eines nach dem Beispiel erhaltenen Kryptoäscin A wurden in 250 ml Wasser gelöst und unter Rückfluß 1 Stunde im kochenden Wasserbad gehalten.
Nach dem Abkühlen wurde die Lösung im Vakuum eingeengt und die Substanz zur Trockne gebracht.
Ausbeute : 10 g Eigenschaften : Schmp. (Säure) = 220 bis 221 ° C, Schmp. (Na-Salze) = 255 bis 257CC.
[a] D =-10, 7° ; Rf = 0, 5 ; HI = 1 : 6000.
Die Substanz gleicht in allen sonstigen Eigenschaften dem Kryptoäscin A.
C-H-Analyse : C59H94O27#H2O.
Molekulargewicht 1253, 4.
Berechnet... C 56, 55 °/o, H 7, 72 °/o ; gefunden... C 56, 89 °/o, H 7, 73 °/0 aus (wässeriger Lösung isoliert).
Aquivalentgewichtsbestimmung : 1000 g verbrauchten zur Verseifung 23, 90 ml n/10-NaOH.
Äquivalentgewicht : Berechnet..... 417, 8 ; gefunden.... 418, 5.
Molekulargewicht : Berechnet..... 1253, 4 ; gefunden..... 1255, 5.
Durch Verseifen läßt sich aus Kryptoäscin A und Kryptoäscin B ein einheitliches Kryptoäscinol herstellen.
10 g eines nach dem Beispiel erhaltenen Kryptoäscin A wurden in 250 ml Wasser gelöst und nach dem Versetzen mit 50 ml 4 °/oiger Natronlauge 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Die trübe Lösung wurde heiß filtriert und anschließend mit Mineralsäure stark angesäuert. Der voluminöse Niederschlag wurde scharf abzentrifugiert und so lange mit Wasser gewaschen, bis keine Mineralsäure mehr nachweisbar war. Nach dem Trocknen wurde in 200 ml Methanol gelöst, mit Tierkohle gereinigt und der Rückstand nach Entfernung des Methanols getrocknet.
Ausbeute : 8, 6 g.
Eigenschaften : Schmp. (Säure) = 230 bis 231°C, Schmp. (Na-Salz) = 257 bis 260°C.
[a] o =-13, 5° ; Rf = 0, 32 ; HI = 1 : 0.
Die Substanz entspricht in allen übrigen Eigenschaften dem Äscinol.
Zusammensetzung : Äscigenin, Arabinose, Xylose, Glukose, Glukuronsäure und Wasser.
C-H-Analyse : C52H84O84#H2O.
Molekulargewicht 1111, 3.
Berechnet... C56, 22°/o, H7, 80°/o ; gefunden... C 55, 95%, H 7,89% (aus wässeriger Lösung isoliert).
Äquivalentgewichtsbestimmung : 1000 g verbrauchten 900 ml n/10-NaOH.
Äquivalentgewicht : , Berechnet ..... 1111, 3 ; gefunden..... 1111, 1.
Der Drehwert des Kryptoäscin A wurde zu-7, 9°, der von Kryptoäscin B zu-10, 7° ermittelt.
Zur Ermittlung der Drehwerte wurden je 1, 25 g Substanz in abs. Methanol gelöst und auf 25 ml verdünnt. Die Drehwerte wurden aus zehn Einzelmessungen (Küvettenlänge I = 2 dm) gemittelt und die spezifische Drehung nach der Formel : () 100 (--yberechnet ; a = abgelesener Drehwert ; 1 = Rohrlänge in dm ; c = Konzentration.
Aus I I eines cholesterinbehandelten Roßkastanienextraktes, in dem die Flavonolglycoside und Kryptoäscin in einem Mischungsverhältnis von etwa 1 : 4 vorliegen, wurden nach dem Verfahren des Beispiels etwa 10 g Kryptoäscin isoliert. Der verbleibende Extrakt kann mit von Aluminiumoxyd abgelösten Flavonolglycosiden (Beispiel) versetzt und als therapeutisch wirksamer, nicht hömolytischer Roßkastanienextrakt mit einem Gehalt von 2, 5 g Flavonolglycosiden je Liter verwendet werden.
Die Verträglichkeit von Kryptoäscin zeigt folgender Versuch : Ein durch Behandeln von Roßkastanienextrakt mit Cholesterin und Abtrennen der Ausfällung gewonnener Extrakt, der je 50ml 150mg Kryptoäscin bei 3"/o Trockenrückstand enthielt und der als Infusion ohne weiteres vom Menschen vertragen wurde, wurde in 5-ml-Ampullen-Portionen, die 15 mg Kryptoäscin A bzw. B enthielten, unterteilt ; jeder dieser Portionen wurden je 15 mg des nach der Erfindung isolierten Kryptoäscin A zugesetzt.
Eine schädliche hämolytische oder toxische Wirkung war nicht zu beobachten.
PATBNTANSPRÜCHE : 1. Verfahren zur Gewinnung von Kryptoäscin aus wässerigen oder wässerig-alkoholischen RoB- kastanienextrakten, besonders aus Roßkastaniensamenextrakten, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extrakte auf an sich bekannte Weise von solchen Saponinen befreit, die durch Einwirkung von Cholesterin entfernbar sind, die Extrakte dann auf einen pH-Wert von 2 oder darunter ansäuert, mit Butylalkohol, Amylalkohol oder anderen mit Wasser nicht mischbaren Alkoholen oder mit Methyläthylketon extrahiert, die organische Phase abtrennt und aus ihr das Kryptoäscin gewinnt.

Claims

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die organische Phase mit Wasser wäscht, mit Tierkohle oder mit Aluminiumoxyd behandelt, die Lösung zur Trockne verdampft, in Wasser aufnimmt, und im Falle der Verwendung von Aluminiumoxyd die wässerige Lösung mit einem Kationenaustauscher behandelt, in Butanol übergeführt, die Butanollösung zur Trockne verdampft, in Methylalkohol aufnimmt, die Lösung mit Tierkohle behandelt und den Methylalkohol abdampft.