DE112011105841B3

DE112011105841B3 - Restriktionsendonukleasen mit hoher Genauigkeit

Info

Publication number: DE112011105841B3
Application number: DE112011105841.1T
Authority: DE
Inventors: Dapeng Sun; Yishu Huang; Shuang-yong Xu; Zhenyu Zhu; Siu-Hong Chan; Xuhui Lai; Chunhua Zhang; Aine Quimby; Shengxi Guan; Xianghui Li
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 2010-02-05
Filing date: 2011-02-07
Publication date: 2018-05-09
Anticipated expiration: 2031-02-08
Also published as: GB201503416D0; US11001818B2; DE112011100467B4; US9856464B2; LT2014078A; LT2014079A; US20140154778A1; US20210238566A1; US12060587B2; GB2518074B; JP2016063815A; GB201420134D0; US20190276811A1; LT2014080A; LT6165B; GB2521070B; CN109706217A; JP6509963B2; GB2521068B; GB2520434A

Abstract

Zusammensetzung, umfassend: ein Enzym, das die SEQ ID Nr. 2 umfasst, worin eine oder mehrere Aminosäure(n) mutiert worden sind, wobei die Position einer Mutation Q148 und die Aminosäuremutation Q1481 ist.

Description

HINTERGRUND
Restriktionsendonukleasen sind Enzyme, die doppelsträngige DNAs in sequenzspezifischer Weise spalten (Roberts, R.J. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 5905-5908 (2005); Roberts et al., Nucleic Acids Res 31:1805-1812 (2003); Roberts et al., Nucleic Acids Res 33:D230-232 (2005); Alves et al. Restriction Endonucleases, „Protein Engineering of Restriction Enzymes," Hrsg. Pingoud, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, New York, 393-407 (2004)). Sie sind bei prokaryotischen Organismen ubiquitär vorhanden (Raleigh et al., Bacterial Genomes Physical Structure und Analysis, Kap.8, Hrsg. De Bruijin, et al., Chapman & Hall, New York, 78-92 (1998)), in denen sie einen Teil von Restriktions-Modifikations-Systemen bilden, die hauptsächlich aus einer Endonuklease und einer Methyltransferase bestehen. Die zugehörige Methyltransferase methyliert die gleiche spezifische Sequenz, die ihre gepaarte Endonuklease erkennt, und macht die modifizierte DNA resistent gegen Spaltung durch die Endonuklease, so dass die Wirts-DNA geeignet geschützt werden kann. Wenn jedoch eine Invasion von Fremd-DNA, insbesondere Bakteriophagen-DNA, stattfindet, wird die Fremd-DNA abgebaut, bevor sie vollständig methyliert werden kann. Die biologische Hauptfunktion des Restriktionsmodifikationssystems besteht darin, den Wirt vor einer Bakteriophagen-Infektion zu schützen (Arber Science 205:361-365 (1979)). Andere Funktionen sind ebenfalls vorgeschlagen worden, wie eine Beteiligung an Rekombination und Transposition (Carlson, et al. Mol Microbiol, 27:671-676 (1998); Heitman, Genet Eng (N Y) 15:57-108 (1993); McKane, et al. Genetics 139:35-43 (1995)).
Die Spezifität der ungefähr 3000 bekannten Restriktionsendonukleasen für ihre mehr als 250 verschiedenen Zielsequenzen könnte man als ihre interessanteste Eigenschaft ansehen. Nach der Entdeckung des sequenzspezifischen Charakters der ersten Restriktionsendonuklease (Danna et al., Proc Natl Acad Sci U S A 68:2913-2917 (1971); Kelly et al., J Mol Biol 51:393-409 (1970)), dauerte es nicht lang, bis Wissenschaftler herausfanden, dass bestimmte Restriktionsendonukleasen unter nicht-optimalen Bedingungen Sequenzen spalten, die ähnlich aber nicht identisch zu ihren definierten Erkennungssequenzen sind (Polisky et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 72:3310-3314 (1975); Nasri et al., Nucleic Acids Res 14:811-821 (1986)). Diese gelockerte Spezifität wird als Stern-Aktivität der Restriktionsendonuklease bezeichnet.
Die Stern-Aktivität ist ein Problem bei Molekularbiologie-Reaktionen. Stern-Aktivität führt unerwünschte Schnitte in einem Klonierungsvektor oder sonstiger DNA ein. In Fällen, wie forensischen Anwendungen, wo ein gewisses DNA-Substrat durch eine Restriktionsendonuklease gespalten werden muss, um einen einmaligen Fingerabdruck zu erstellen, ändert eine Stern-Aktivität ein Spaltungsmuster-Profil, wodurch die Analyse erschwert wird. Essentiell ist das Vermeiden von Stern-Aktivität ebenfalls bei Anwendungen, wie der Strangverdrängungs-Amplifikation (Walker et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 89:392-396 (1992)) und der seriellen Analyse von Genexpression (Velculescu et al., Science 270:484-487 (1995)).
ZUSAMMENFASSUNG
Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, ein Enzym, ein Nukleinsäuremolekül, einen Vektor und eine Wirtszelle gemäß den Ansprüchen.
In einer Ausführungsform der Beschreibung wird außerdem ein Verfahren zum Identifizieren eines Genauigkeits-Index (fidelity index) (FI) von einer Restriktionsendonuklease und von Varianten davon bereitgestellt, das beinhaltet: Auswählen eines Reaktionspuffers und eines DNA-Substrats, das die Bindungs- und Spaltungsstelle der Restriktionsendonuklease enthält; Zulassen, dass die seriell verdünnte Restriktionsendonuklease oder Varianten davon das DNA-Substrat spalten; und Ermitteln eines FI für jede der Restriktionsendonukleasen und die eine oder mehreren Varianten davon.
In einer Ausführungsform der Beschreibung umfasst das Verfahren ferner das Vergleichen des FI für die Restriktionsendonuklease und die Varianten davon, um einen Verbesserungsfaktor von, zum Beispiel, größer als 2 für die Variante zu erhalten.
In einer Ausführungsform der Beschreibung wird ein Puffer ausgewählt, der Kaliumacetat, Trisacetat und Magnesiumacetat; oder Magnesiumchlorid einschließt.
Zusätzliche Ausführungsformen der Beschreibung beinhalten eine Zusammensetzung, umfassend: ein Enzym, das die SEQ ID Nr. 2 umfasst, worin eine oder mehrere Aminosäure(n) mutiert worden sind, wobei die Position von einer oder mehreren Mutationen aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus K198 und Q148 besteht.
Jedwede der oben genannten Zusammensetzungen kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, dass das mutierte Enzym einen FI in einem vorbestimmten Puffer aufweist, der größer als derjenige von dem Enzym ohne die Mutationen in dem vorbestimmten Puffer ist.
Figurenliste

Die 1A und 1B zeigen den Vergleich von Pvul-HF- und Pvul-WT-Aktivität.
In der 1A kennzeichnet das Sternchen(*)-Zeichen die Spur auf der linken Seite (Spur 2), in der Stern-Aktivität nicht länger nachgewiesen wird. Das Zahl(#)-Zeichen gibt die Spur auf der rechten Seite (Spur 8) an, in der ein partieller Verdau auftritt. Es wurde berechnet, dass sich die Ausgangskonzentration des Pvul-WT auf 77 Einheiten belief.
In der 1B wurde ein vollständiger Verdau bis zur Spur 15 beobachtet, nach welcher Stern-Aktivität beobachtet wurde. Das Verdünnungs-Fenster, das den vollständigen Verdau erlaubte, erstreckte sich von 6 Verdünnungen bis 15 Verdünnungen in der Serie. Es wurde berechnet, dass die Ausgangskonzentration des Pvul-HF mindestens 9600 Einheiten beträgt.
Die 2A und 2B zeigen den Vergleich von HindIII-HF- und HindIII-WT-Aktivität.
In der 2A kennzeichnet das Sternchen(*)-Zeichen die Spur auf der linken Seite (Spur 9), in der Stern-Aktivität nicht länger nachgewiesen wird. Das Zahl (#)-Zeichen kennzeichnet die Spur auf der rechten Seite (Spur 15), in der ein partieller Verdau auftritt. Es wurde berechnet, dass die Ausgangskonzentration des HindIII-WT 9600 Einheiten beträgt.
In der 2B wurde ein vollständiger Verdau bis zur Spur 13 beobachtet, nach welcher Stern-Aktivität beobachtet wird. Das Verdünnungs-Fenster, das den vollständigen Verdau erlaubte, erstreckte sich von 6 Verdünnungen bis 13 Verdünnungen in der Serie. Es wurde berechnet, dass die Ausgangskonzentration des Hindlll-HF mindestens 2400 Einheiten beträgt.
Die 3A und 3B zeigen den Vergleich von DraIII-HF- und DraIII-WT-Aktivität.
In der 3A kennzeichnet das Sternchen(*)-Zeichen die Spur auf der linken Seite (Spur 12), in der Stern-Aktivität nicht länger nachgewiesen wird. Das Zahl(#)-Zeichen kennzeichnet die Spur auf der rechten Seite (Spur 12), in der ein partieller Verdau auftritt. Weder Stern-Aktivität noch partiell verdaute DNA wurde beobachtet. Es wurde berechnet, dass die Ausgangskonzentration des Dralll-WT 1200 Einheiten beträgt.
In der 3B wurde ein vollständiger Verdau bis zur Spur 12 beobachtet, wonach Stern-Aktivität beobachtet wird. Es wurde berechnet, dass die Ausgangskonzentration des DraIII-HF mindestens 1200 Einheiten beträgt.
4A und 4B zeigen den Vergleich von Kpnl-HF- und Kpnl-WT-Aktivität.
In der 4A kennzeichnet das *-Zeichen die Spur auf der linken Seite (Spur 9), in der Stern-Aktivität nicht länger nachgewiesen wird. Das #-Zeichen kennzeichnet die Spur auf der rechten Seite (Spur 13), in der ein partieller Verdau auftritt. Es wurde berechnet, dass, in der 1A, die Ausgangskonzentration des Kpnl-WT 2000 Einheiten beträgt.
In 4B wurde überall ein vollständiger Verdau, ohne Stern-Aktivität oder partiellen Verdau, beobachtet. Es wurde berechnet, dass die Ausgangskonzentration des Kpnl-HF größer als 12000 Einheiten ist.
Die 5A-5B zeigen den Vergleich von Styl-HF und Styl-WT
In der 5A zeigt das *-Zeichen den Beginn der Stern-Aktivität auf seiner linken Seite (Spur 6), das #-Zeichen zeigt den Beginn von Partiell-Aktivität rechts davon (Spur 12). Es wurde berechnet, dass die Ausgangsmenge von Sty-WT sich auf 1000 Einheiten beläuft.
In der 5B wurde Stern-Aktivität in den ersten 2 Spuren und partieller Verdau ab Spur 14 oder 15 beobachtet. Es wurde berechnet, dass die Ausgangsmenge von Styl-HF sich auf 4000 Einheiten beläuft.
Die 6 zeigt einen Vergleich von BgII-HF und BgII-WT auf pXba. Das BgII-HF weist einen FI von mindestens 8000 auf, während das BgII-WT einen FI von 32 besitzt, was einen Verbesserungsfaktor von mindestens 250 zur Verfügung stellt. Die rechte Tafel ist das theoretische Verdau-Muster.
Die 7 zeigt einen Vergleich von BsrDI-HF und BsrDI-WT auf pBR322. Das BsrDI-HF besitzt einen FI von mindestens 1000 in NEB4, während das BsrDI-WT einen FI von ½ besitzt, was einen Verbesserungsfaktor von mindestens 2000 zur Verfügung stellt. Die rechte Tafel ist das theoretische Verdau-Muster.
Die 8 zeigt einen Vergleich von Bcll-HF und Bcll-WT in NEB4 auf Lambda (dam^-). Das Bcll-HF besitzt einen FI von mindestens 2000, während das Bcll-WT einen FI von 32 besitzt, was einen Verbesserungsfaktor von mindestens 64 zur Verfügung stellt. Die rechte Tafel ist das theoretische Verdau-Muster.
Die 9 zeigt einen Vergleich von BgIII-HF und BgIII-WT auf pXba. Das BgIII-HF besitzt einen FI von mindestens 32000, während das BgIII-WT einen FI von 16 aufweist, was einen Verbesserungsfaktor von mindestens 2000 zur Verfügung stellt. Die rechte Tafel ist das theoretische Verdau-Muster.
Die 10 zeigt einen Vergleich von BstEII-HF und BstEII-WT auf Lambda-DNA. Das BstEII-HF besitzt einen FI von mindestens 2000, während das BstEII-WT einen FI von 4 besitzt, was einen Verbesserungsfaktor von mindestens 500 zur Verfügung stellt. Die rechte Tafel ist das theoretische Verdau-Muster.
Die 11 zeigt einen Vergleich von Sfil-HF und Sfil-WT auf pBC4. Das Sfil-HF besitzt einen FI von mindestens 8000 in NEB4, während das Sfil-WT einen FI von 64 aufweist, was einen Verbesserungsfaktor von mindestens 120 zur Verfügung stellt. Die rechte Tafel ist das theoretische Verdau-Muster.
Die 12 zeigt einen Vergleich von Smal-HF und Smal-WT auf pXba. Die Smal-HF besitzt einen FI von mindestens 256000, während die Smal-WT einen FI von 64 besitzt, was einen Verbesserungsfaktor von mindestens 4000 zur Verfügung stellt. Die rechte Tafel ist das theoretische Verdau-Muster.
Die 13 zeigt einen Vergleich von BsmBI-HF und BsmBI-WT auf Lambda-DNA. Das BsmBI-HF besitzt einen FI von 250 in NEB4, während das BsmBI-WT einen FI von 4 besitzt, was einen Verbesserungsfaktor von mindestens 64 zur Verfügung stellt. Die rechte Tafel ist das theoretische Verdau-Muster.
Die 14 zeigt einen Vergleich von BstNI-HF und BstNI-WT auf pBR322. Das BstNI-HF besitzt einen FI von 500 in NEB4, während das BstNI-WT einen FI von 4 hat, was einen Verbesserungsfaktor von mindestens 120 zur Verfügung stellt. Die rechte Tafel ist das theoretische Verdau-Muster.
Die 15 zeigt einen Vergleich von Mlul-HF und Mlul-WT auf Lambda-DNA. Das Mlul-HF besitzt einen FI von mindestens 32000 in NEB4, während das Mlul-WT einen FI von 32 besitzt, was einen Verbesserungsfaktor von mindestens 1000 zur Verfügung stellt. Die rechte Tafel ist das theoretische Verdau-Muster.
Die 16 zeigt einen Vergleich von Nspl-HF und Nspl-WT auf pUC19. Das Nspl-HF besitzt einen FI von 500 in NEB4, während das Nspl-WT einen FI von 32 hat, was einen Verbesserungsfaktor von mindestens 16 zur Verfügung stellt. Die rechte Tafel ist das theoretische Verdau-Muster.
Die 17 zeigt einen Vergleich von BsrFI-HF und BsrFI-WT auf pBR322. Das BsrFI-HF besitzt einen FI von mindestens 500 in NEB4, während das BsrFI-WT einen FI von 16 besitzt, was einen Verbesserungsfaktor von mindestens 32 zur Verfügung stellt. Die rechte Tafel ist das theoretische Verdau-Muster.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG VON AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Erzeugung von Mutanten von Restriktionsendonukleasen mit verbesserter Spezifität für eine einzige Sequenz ist keine geradlinige Angelegenheit. Es ergaben sich zahlreiche Probleme. Diese schließen Folgende ein: ein mutiertes Enzym hatte verringerte oder gar keine Aktivität, hatte keine verringerte Stern-Aktivität oder hatte sogar eine erhöhte Stern-Aktivität. Alternativ dazu konnte ein mutiertes Enzym nicht kloniert werden und konnte deshalb nicht analysiert werden.
Erfolglosigkeit beim Herstellen einer Mutante, resultierte aus einer beliebigen einer Vielzahl möglicher Ursachen, einschließlich jeglicher der nachstehenden. Sie könnte auf einer fehlgeschlagenen invertierten PCR beruhen. Es ist auch möglich, dass die Mutation, welche eine neue spezifische Aktivität erzeugte, für eine Wirtszelle toxisch war, selbst wenn sie die zugehörige bzw. kognate Methylase unter Bedingungen exprimierte, die normalerweise für die Expression der nicht-mutierten Restriktionsendonuklease protektiv waren. Unter diesen Umständen wird kein lebensfähiger Mutantenklon erhalten. Alternativ könnte die Mutante eine Präferenz für einen bestimmten Puffer aufweisen, so dass beim Testen in einem anderen Puffer keine Aktivität nachgeweisen würde. Eine andere Schwierigkeit, auf die gestoßen wurde, bestand darin, dass obwohl im Allgemeinen ein Rohlysat von jeder Mutation getestet wurde, das Enzym in manchen Fällen gereinigt werden musste, um eine Aktivität zu erfassen, wo eine Aktivität nicht im Lysat detektiert wurde, was eine negative Wertung des Assays zur Folge hatte.
Es war überraschend festzustellen, dass in mehreren Vergleichsbeispielen ein Austausch eines Prolins gegen ein Alanin zu Varianten mit einem gewünschten FI führte, der mindestens größer als 250 war, und einen Verbesserungsfaktor von mindestens zweifach ergab. Hierfür dienten Varianten von Pvul, BamHI, Nrul und Spel als Beispiel.
Andere Herausforderungen bei der Herstellung von Hochgenauigkeits-Mutanten beinhalten die Größe der DNA, die manche Restriktionsendonukleasen codiert. Diese DNA kann angesichts der erheblichen Größe der Matrize schwierig durch PCR zu amplifizieren sein. Darüber hinaus transformierten die PCR-Produkte unter manchen Umständen nicht ohne Weiteres in einen neuen Wirt hinein. Selbst wenn eine Wirtszelltransformation erfolgreich war, produzierten transformierte Zellen nicht immer Kolonien und konnten daher nicht leicht detektiert werden. Selbst wenn die Kolonien aus der Transformation erhalten wurden, konnten diese in einigen Fällen unter keinerlei Bedingung kultiviert werden.
Gründe für die Verringerung der spezifischen Aktivität von Mutanten können sich aus beliebigen der folgenden ergeben: die Mutation stört die Faltung des Proteins, was den Expressionsspiegel signifikant absenkte, oder die Mutation beeinflusst die spezifische Enzymaktivität.
Zum Beispiel wurde dies für die Styl-Mutanten: N34A, F35A, D58A, F65A, K66A, K67A, F100A, N148A, E213A, F250A, T251A, D258A, D262A, N283A, R293A, F294A, R295A, R296A, D298A, D299A, M304A, M310A, D318A, S337A, S346A und F371A, beobachtet.
Ein Verlust der Enzymaktivität kann aus Ursachen resultieren, welche beliebige der folgenden einschließen: die Mutation deletierte die Reste, die in der Katalyse wichtig sind; oder die Mutationen veränderten Reste, die in der Faltung wichtig sind, weswegen das fehlgefaltete Mutantenprotein inaktiv ist.
Zum Beispiel wurde dies für die Styl-Mutanten M33A, D37A, F41A, D55A, D71A, N77A, R79A, E80A, F81A, T82A, E83A, F97A, F101A, E136A, W137A, M138A, M140A, K144A, Q145A, R151A, R255A, R259A, S261A, T264A, F278A, R281A, T284A, M297A, H305A, N306A, D314A, D338A und E382A beobachtet.
Das Erzeugen von Hochgenauigkeits-Mutanten erfordert mühevolle Arbeit. Zahlreiche Mutanten werden selektiert und getestet, und nur eine verhältnismäßig kleine Anzahl zeigt eine hohe Genauigkeit. Es war nicht möglich, durch Extrapolation vorherzusagen, welche Mutanten wahrscheinlich verbesserte Eigenschaften zeigen.
Beispiele für Assays, die zum Identifizieren von Hochgenauigkeits-Varianten von Restriktionsendonukleasen durchgeführt wurden, sind in den 1-17 gezeigt. Die Figuren zeigen die Ergebnisse in einem einzigen Puffer für sowohl Wildtyp- als auch Hochgenauigkeits-Varianten. Alle Figuren zeigen Umfänge und Arten der Spaltung von DNA nach einer Serie von Zweifachverdünnungen von links nach rechts auf dem Gel, wobei die Konzentration an Enzym in der Richtung des Dreiecks abnimmt. Die Tabelle 1 schildert detailliert die Ergebnisse für die 33 beschriebenen Enzyme (Beispiel und Vergleichsbeispiele). Die im Beispiel und in den Vergleichsbeispielen verwendeten Restriktionsendonuklease-Reaktionspuffer (Puffer 1-4) sind zum Beispiel im NEB-Katalog (2009/10) definiert. Andere Puffer können gemäß den Präferenzen des Anwenders gewählt werden.
Die Assays ergeben einen FI, der das Verhältnis der höchsten Restriktionsenzym-Konzentration, die keine erkennbare (apparent) Stern-Aktivität zeigt, wie durch die Anwesenheit von mit Stern-Aktivität assoziierten Banden bestimmt, zu derjenigen Restriktionsenzym-Konzentration ist, die 1 µg Standard-DNA-Substrat in 50 µl Reaktion während 1 Stunde bei einer definierten Temperatur in einem Standard-NEB-Puffern vollständig verdaut. In den 6-17 ist ein Rahmen in den Figuren platziert, um Stern-Aktivität-Banden zu zeigen. In Ausführungsformen der Erfindung ist der FI zum Beispiel vorzugsweise mindestens 250, zum Beispiel größer als 500, zum Beispiel größer als 1000, zum Beispiel größer als 5000.
Ein Verbesserungswert der Genauigkeit wird berechnet als ein Verhältnis des FI der Variante, dividiert durch den FI des Nicht-Mutantenenzyms. In einer Ausführungsform der Erfindung ist der Verbesserungswert zum Beispiel vorzugsweise mindestens 2, zum Beispiel, mindestens 4, zum Beispiel mindestens 8, zum Beispiel mindestens 16.

In einer Ausführungsform bezeichnet der FI das Verhältnis der höchsten Restriktionsenzym-Menge, die keine erkennbare Stern-Aktivität zeigt, zu der Menge, die 1 µg Standard-DNA-Substrat in 50 µl Reaktion während 1 Stunde bei einer spezifischen Temperatur in Standard-NEB-Puffern vollständig verdaut. Tabelle 1: Zusammenfassung der Eigenschaften von HF-Enzymen (VB: Vergleichsbeispiel)

Enzym	Sub	FI1'	FI2'	FI3'	FI4'	Beispiel	VB	SEQ ID Nr.
Pvul-HF	pXba	≥2000(1/8)	≥16000(1)	≥4000(¼)	≥ 16000(1)		1	1
HindIII-HF	I	≥260000(½)	≥260000(½)	≥250(1/2000)	≥520000(1)	1		2
DraIII-HF	I	≥120(1/16)	≥1000(½)	≥32(1/64)	≥2000(1)		2	3
Kpnl-HF	pXba	≥1000000(1)	≥1000000(1)	≥30000(1/500)	≥1000000(1)		3	4
Styl-HF	I	≥4000(½)	2000(1)	≥16(1/250)	4000(½)		4	5
BsaJI-HF	pBR322	≥1000(¼)	≥4000(1)	≥4000(1)	≥4000(1)		5	6
BsaWI-HF	pXba	8(1/64)	120(1)	≥120(1))	≥4000(1)		6	7
BgII-HF	I	≥4000(½)	≥8000(1)	≥500(1/16)	≥8000(1)		7	8
BsrDI-HF	pBR322	≥120(1/8)	≥500(1)	≥64(1/16)	≥1000(1)		8	9
Nsil-HF	pXba	≥250(1/32)	≥1000(1/8)	≥500(1/16)	≥8000(1)		9	10
Dpnll-HF	I(-)	4000(¼)	2000(1/8)	64(1/128)	8000(1)		10	11
Bcll-HF	I(-)	≥250(1/32)	≥500(¼)	≥32(1/64)	≥2000(1)		11	12
BgIII-HF	pXba	≥8000(1/8)	≥128000(1)	2000(½)	≥32000(¼)		12	13
BstEII-HF	I	≥64(1/32)	≥1000(½)	≥32(1/64)	≥2000(1)		13	14
Banll-HF	I(-)	≥4000(1)	≥2000(½)	≥500(1/8)	≥2000(½)		14	15
PspGI-HF	pBC4	≥1000(¼)	≥4000(1)	≥4000(1)	≥4000(1)		15	16
Spel-HF	T7	≥4000(½)	≥250(1/8)	≥120(½)	≥1000(1)		16	17
BsmAI-HF	FX174	≥4000(1)	≥2000(½)	≥500(1/8)	≥4000(1)		17	18
BstXI-HF	I	≥500(½)	≥1000(1)	≥500(1/2)	≥1000(1)		18	19
Sfil-HF	pBC4	250(½)	≥1000(1/8)	≥32(1/250)	≥8000(1)		19	20
Pmel-HF	pXba	≥2000(1/8)	≥500(1/16)	≥32(1/250)	≥8000(1)		20	21
Smal-HF	pXba	≥2000(1/500)	≥32000(1/32)	≥32(1/32000)	≥256000(1)		21	22
Aatll-HF	pXba	NC	NC	NC	≥1000(1)		22	23
Apol-HF	pXba	≥2000(½)	≥4000(1)	≥1000(¼)	≥2000(½)		23	24
BsmBI-HF	I	32(½)	120(½)	≥120(½)	250(1)		24	25
Bmtl-HF	pXba	25600(¼)	25600(¼)	2000(1/500)	1000000(1)		25	26
BstNI-	pBR322	≥120(½)	≥500(1)	≥120(¼)	500(1)		26	27
HF
Mlul-HF	I	≥16000(½)	≥32000(1)	≥2000(1/16)	≥32000(1)		27	28
Banl-HF	I	≥1000(½)	≥250(1/8)	≥250(1/8)	≥2000(1)		28	29
Kasl-HF	pBR322	≥8000(½)	≥16000(1)	≥2000(1/8)	≥16000(1)		29	30
Nrul-HF	I	≥64(1/250)	≥1000(1/16)	≥100(1/16)	≥16000(1)		30	31
Nspl-HF	pUC19	≥4000(1)	500(1)	≥250(1/8)	500(1)		31	32
BsrFI-HF	pBR322	≥500(1)	≥64(1/8)	>100	≥500(1)		32	33

Verdünnungsmittel (Dil) A, B und C und die Puffer 1-4 sind im NEB-Katalog 2009/10, Seite 87, definiert.
Alle hierin zitierten Literaturstellen sowie die provisorischen U.S.-Patentanmeldungs-Nummern 61/301,666, die am 5. Februar 2010 eingereicht wurde, und 61/387,800, die am 29. September 2010 eingereicht wurde, sind hiermit durch den Bezug darauf einbezogen.
BEISPIELE
Vergleichsbeispiel 1: Konstruieren von "High-Fidelity"(HF)-Pvul
Expression von Pvul
Pvul wurde in E. coli exprimiert, der mit pUC19-PvuIR und pACYC184-PvuIM transformiert war, welche jeweils Pvul-Endonuklease- und -Methylase-Gene enthielten. Die Zellen wurden über Nacht bei 30°C in LB mit Amp und Cam wachsen gelassen.
Mutagenese von Pvul-HF
Alle Reste Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr wurden zu Ala an den Positionen 7, 8, 11, 12, 16, 17, 20, 21, 22, 23, 26, 28, 29, 30, 31, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 46, 48, 49, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 72, 73, 77, 78, 80, 81, 82, 87, 88, 90, 92, 93, 96, 97, 101, 102, 104, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 115, 116, 119, 120, 121, 122, 126, 127, 129, 131, 132, 135, 138, 139, 144, 146, 147, 148, 150, 151, 152, 154, 155, 157, 158, 160, 161, 162, 163, 167, 169, 170, 172, 173, 174, 178, 180, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 189, 192, 194, 195, 196, 201, 202, 203, 205, 206, 210, 211, 214, 215, 218, 219, 220, 221, 226, 230, 231, 232, 233, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 246, 247, 248, 249, 251, 253, 254 verändert; während Tyr zu Phe an den Positionen 18, 52, 56, 84, 91, 130, 143, 165, 204, 242 verändert wurde.
Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm ER2683 transformiert.
Selektion von Pvul-HF
Die Selektion von Pvul-HF wurde mit Hilfe eines Vergleichs der Aktivität in NEB3 und NEB4 (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA (NEB)) unter Verwendung von pXba-DNA als Substrat bewerkstelligt. Die Pvul-WT weist mehr Aktivität in NEB3 auf. Diejenige mit mehr Aktivität in NEB4 wurde ausgewählt. 6 Mutanten besaßen nachweislich mehr Aktivität in NEB4: S36A, K77A, P154A, E163A, Y165F und K185A. P154A hatte eine wesentlich höhere Aktivität als WT in NEB4. Normalerweise war diejenige mit der höchsten Aktivität in NEB4 diejenige mit verbesserter Stern-Aktivität. Pvul(P154A) wurde als Pvul-HF bezeichnet. Dies ist das erste Mal, dass es sich bei einer effektiven Mutation um eine Prolin-zu-Alanin-Mutation handelte.
Reinigung von Pvul-HF
Zwei Liter der Zelle ER2683(pUC19-Pvul(P154A), pACYC184-PvulM)) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp und 33 µg/ml bei 30°C über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert bzw. voräquilibriert (pre-balanced) worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient, und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl-Schritt. Die eluierten Fraktionen wurden dann auf Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden mittels Vivaspin® 15R (Vivascience, heute Sartorius Vivascience GmbH, Göttingen, Deutschland) weiter aufkonzentriert und in Glycerol bei -20°C aufbewahrt.
Vergleich von Pvul-HF und Pvul-WT

Die Fls von Pvul-HF und Pvul-WT sind separat auf pXba-DNA in vier NEB-Puffern mit Verdünnungsmittel B bestimmt worden. Der Vergleich ist in der 1 gezeigt, und das Ergebnis ist in der Tabelle 2 (nachstehend) aufgelistet. Tabelle 2: Vergleich von Pvul-HF und Pvul-WT

Puffer	Pvul-HF		Pvul-WT
Puffer	Aktivität	FI	Aktivität	FI	Verbesserungsfaktor
NEB1	12,5%	≥ 2000	6,3%	32	≥64
NEB2	100%	≥ 16000	25%	32	≥500
NEB3	25%	≥ 4000	100%	32	≥125
NEB4	100%	≥ 16000	12,5%	32	≥500

Pvul-HF zeigte die beste Leistung in NEB2 und NEB4, in welchen der FI ≥ 16000 betrug; WT Pvul zeigte die beste Leistung in NEB3, in welchem sich der FI auf 32 belief. Somit war der Gesamt-Verbesserungsfaktor ≥ 16000/32= ≥ 500.
Beispiel 1: Konstruieren von HF-HindIII
HindIII erkennt und verdaut bei A/AGCTT, wie im Beispiel 14 der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 2009/009797 A2 beschrieben. Eine Mutante HindIII(K198A) wurde als die HF-Version der HindIII selektiert. Die weitere Charakterisierung dieser Mutante zeigte, dass obwohl die Leistung von HindIII(K198A) im Ein-Stunden-Maßstab hervorragend war, sie keine gute Leistung im Über-Nacht-Verdau aufwies. Es wurde nach mehr Mutanten gesucht. Es wurde festgestellt, dass HindIII(Q148I) sowohl in der Ein-Stunden- als auch der Über-Nacht-Reaktion hervorragend war, und es wurde als Hindlll-HF benannt (2).
Die Hindlll-HF wurde in ER3081 (pUC19-HindIIIR(Q148I)M) exprimiert. Die Wachstums- und Reinigungsverfahren wurden gemäß WO 2009/009797 A2 durchgeführt.

Die folgende Tabelle (Tabelle 3) vergleicht die Fls von Hindlll-HF und Hindlll-WT Tabelle 3: Vergleich von Hindlll-HF und Hindlll-WT

Puffer	Hindlll-HF		Hindlll-WT
Puffer	Aktivität	FI	Aktivität	FI	Verbesserungsfaktor
NEB1	50%	≥ 260000	25%	32	≥8000
NEB2	50%	≥ 260000	100%	250	≥1000
NEB3	0,05%	≥ 250	25%	4000	≥1/32
NEB4	100%	≥ 520000	50%	32	≥16000

Die Hindlll-HF wies die beste Aktivität in NEB4 auf; der FI von Hindlll-HF in NEB4 war ≥520000; die WT-Hindlll wies die beste Aktivität in NEB2 auf. Der FI von Hindlll-WT in NEB2 war 250. Somit war der Gesamt-Verbesserungsfaktor ≥2000.
Vergleichsbeispiel 2: Konstruieren von HF-DraIII
Expression von DraIII
Dralll erkennt und verdaut bei CACNNN/GTG. DraIII wurde in E. coli ER3081 mit pAGR3-DraIIIR () und pACYC-DraIIIM () exprimiert. Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C in LB mit Amp und Cam wachsen gelassen.
Mutagenese von DraIII
Die Länge des Dralll-Proteins beträgt 227 Aminosäuren. Insgesamt 132 Aminosäurestellen des DraIII-Proteins wurden am Anfang für eine Mutation zu Ala (oder Phe) vorgesehen. Cys, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Gly und Trp wurden zu Ala mutiert. Try wurde zu Phe mutiert. Diese waren: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37, 40, 42, 43, 44, 45, 47, 51, 54, 55, 57, 58, 59, 60, 64, 65, 66, 67, 68, 72, 73, 74, 76, 77, 82, 83, 84, 88, 89, 90 ,91, 93, 94, 95, 96, 99, 101, 102, 104, 106, 107, 108, 111, 112, 113, 114, 115, 117, 120, 121, 123, 124, 127, 128, 130, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 144, 145, 146, 147, 150, 154, 155, 156, 157, 158, 160, 161, 165, 167, 169, 170, 171, 172, 173, 175, 176, 180, 181, 183, 184, 185, 187, 189, 190, 192, 193, 196, 198, 199, 200, 201, 202, 205, 207, 208, 209, 211, 212, 213, 214, 216, 217, 218, 219, 22 und 223.
Die Punktmutagenese der ausgewählten Mutationen wurde durch inverse PCR vorgenommen. Die PCR-Reaktion in einem Reaktionsvolumen von 100 µl enthielt 2 µl von jedem PCR-Primer, 1 µl pAGR3-DraIIIR, 400 µM dNTP, 4 Einheiten Deep Vent™ DNA-Polymerase (NEB) und 10 µl 10X Thermopol-Puffer mit zusätzlichem Wasser.
Die PCR-Reaktionsbedingungen waren 94°C für 5 Minuten, gefolgt von 25 Zyklen von 94°C 30 Sekunden, 55°C 60 Sekunden, 72°C 4 Minuten und einer finalen Verlängerungszeit bei 72°C für 7 Minuten. Das PCR-Produkt wurde mittels 20 Einheiten Dpnl 1 Stunde verdaut. Das verdaute Produkt wurde in E. coli ER3081 (pACYC- DraIIIM) transformiert.
Selektion von Dralll-HF
Vier Kolonien von jeder Mutation wurden in LB mit Amp und Cam bei 37°C über Nacht heranwachsen gelassen. Die Assays bezüglich der standardmäßigen zugehörigen und der Stern-Aktivität von Dralll wurden unter Verwendung von pXba als Substrat in NEB4-Puffer und 10% Glycerol durchgeführt.
Die Mutanten S15A, H20A, E34A, M58A, Q95A, R106A, K108A, T181A, R187A, R199A, N202D, T181G, T181N, T181Q, T181C, T181V, T181L, T181I, T181M, D55A, D55S, D55C, D55G, D55N, T12A, H20A, E34A, H45A, T57A, M58A, T60A, S66A, R76A, F90A, M94A, T101A, C115A, F169A, N172A, R173A, H189A, N193A und Q95A/K104A wurden in Screening-Assays ausgewählt. Nach mehreren Runden des Vergleichens in verschiedenen Bedingungen und Substraten wurde festgestellt, dass Dralll(T181A) eine bevorzugte Mutante ist, die eine hohe Spaltungs-hohe Aktivität beibehält, aber eine erheblich verringerte Stern-Aktivität aufweist. Dralll (T181A) wurde als Dralll-HF bezeichnet.
Vergleich von Dralll-HF und Dralll-WT

Die Dralll-WT- und Dralll-HF(T181A)-Proteine wurden unter Verwendung von einer Heparin- und Source-15S-Säule gereinigt. Die Assay-Bedingung für den ausführlichen Vergleich war wie folgt: NEB4 (oder NEB1, 2, 3), 37°C, 1h; 2 µl gereinigtes Protein in 20 µl Reaktionssystem; Lambda-DNA als Substrat. Der Vergleich ist in den 3A und 3B gezeigt, und das Ergebnis ist in der Tabelle 4 aufgelistet. Tabelle 4: Vergleich von Dralll-HF und Dralll-WT

Substrat	Dralll-HF (T181A)		DraIII-WT		Verbesserungsfaktor
Substrat	Aktivität	FI	Aktivität	FI	Verbesserungsfaktor
Puffer 1	6,25%	≥120	16%	16	≥8
Puffer 2	50%	≥1000	100%	2	≥500
Puffer 3	1,56%	≥32	50%	2	≥16
Puffer 4	100%	≥64000	50%	0,5	≥128000

Dralll-HF weist die meiste Aktivität in NEB4 auf, in welchem der FI mindestens 64000 betrug; das Dralll-WT hat die meiste Aktivität in NEB2, in welchem der FI 2 ist. Der insgesamte FI-Verbesserungsfaktor war mindestens 32000-fach.
Vergleichsbeispiel 3: Konstruieren von HF-Kpnl
Kpnl erkennt und verdaut bei GGTAC/C, wie in Beispiel 26 der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 2009/009797 beschrieben. Eine Dreifachmutante Kpnl(D16N/E132A/D148E) wurde als die Hochgenauigkeitsversion der Kpnl ausgewählt.
Während D148E und E132A durch ortsgerichtete Mutagenese eingebracht worden waren, wurde die D16N durch PCR eingebracht. Die weitere Charakterisierung der Mutationen in dieser Dreifachmutante enthüllte, dass das Entfernen des E132A das Restriktionsenzym weiter verbessern wird, speziell unter dem Aspekt der Enzym-spezifischen Aktivität. Die Dreifachmutante Kpnl(D16N/E132A/D148E) besitzt eine spezifische Aktivität von 200 000 Einheiten/mg Protein, während Kpnl(D16N/D148E) eine spezifische Aktivität von 1 800 000 Einheiten/mg Protein aufweist. Die Doppelmutante ist 9 Mal aktiver als die vorausgehende Dreifachmutante, und so wurde die Doppelmutante Kpnl(D16N/D148E) als die Kpnl-HF bezeichnet.
Die Kpnl-HF wurde in ER2523(pAGR3-Kpnl(D16N/D148E), pSYX20-KpnIM) exprimiert. Die Wachstums- und Reinigungsverfahren wurden gemäß WO/2009/009797 durchgeführt.

Die folgende Tabelle (Tabelle 5) vergleicht die Fls von Kpnl-HF und Kpnl-WT Tabelle 5: Vergleich von Kpnl-HF und Kpnl-WT

Puffer	Kpnl-HF		Kpnl-WT		Verbesserungsfaktor
Puffer	Relative Aktivität	FI	Relative Aktivität	FI	Verbesserungsfaktor
NEB1	100%	≥1 000 000	100%	16	62 500
NEB2	100%	≥1 000 000	25%	16	62 500
NEB3	0,2%	≥30 000	6%	8	3 750
NEB4	100%	≥1 000 000	50%	4	250 000

Die Kpnl-WT wies die beste Aktivität in NEB1 auf; der FI von Kpnl-WT in NEB1 war 16; die Kpnl-HF wies die beste Aktivität in NEB1, NEB2 und NEB4 auf. Die FI von Kpnl-HF in diesen drei Puffern waren alle am höchsten bei ≥ 1 000 000. Der Gesamt-Verbesserungsfaktor war ≥ 62 500.
Vergleichsbeispiel 4: Konstruieren von HF-Styl
Expression von Styl
Styl erkennt und verdaut bei C/CWWGG. Styl wurde in E. coli (ER2833) mit pACYC-StylM und placzz1-StylR exprimiert. Die Zellen wurden bei 37°C über Nacht in LB mit Amp und Cam wachsen gelassen.
Mutagenese von Styl
Die Punktmutagenese der ausgewählten Mutationen wurde durch inverse PCR durchgeführt. 237 Aminosäuremutationem wurden in Styl wie folgt vorgenommen: Cys, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp wurden zu Ala mutiert. Tyr wurde zu Phe mutiert. Diese waren an den Positionen: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 22, 23, 24, 25, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 43, 49, 51, 52, 53, 54, 57, 58, 59, 61, 62, 64, 65, 66, 69, 70, 73, 75, 76, 78, 79, 80, 81, 82, 85, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 104, 105, 106, 109, 111, 112, 114, 116, 118, 119, 122, 123, 124, 125, 126, 128, 129, 130, 131, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 150, 151, 152, 153, 155, 157, 158, 159, 163, 164, 165, 166, 167, 170, 172, 173, 175, 176, 177, 178, 181, 183, 187, 188, 192, 193, 194, 195, 196, 200, 203, 204, 205, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 216, 218, 219, 220, 221, 222, 227, 229, 230, 232, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 241, 242, 245, 247, 248, 249, 250, 252, 253, 254, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 263, 266, 267, 269, 272, 274, 277, 280, 282, 283, 284, 286, 288, 289,291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 313, 317, 318, 319, 320, 323, 324, 326, 327, 329, 331, 335, 336, 337, 339, 340, 343, 345, 346, 347, 349, 350, 351, 353, 355, 356, 359, 360, 361, 363, 365, 366, 368, 369,370, 372, 373, 376, 377, 379, 381 und 382.
Das Verfahren zum Primerdesign und die PCR können wie in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 2009/0029376 (Beispiel 1) beschrieben durchgeführt werden. Das PCR-Produkt wurde mit Dpnl verdaut und in kompetente ER2833 (pACYC-StyIM) transformiert.
Selektion von Styl-HF
Vier Kolonien von jeder Mutation wurden in LB mit Amp und Cam bei 37°C über Nacht heranwachsen gelassen. Der Assay auf die zugehörige Aktivität und die Stern-Aktivität-Assays von Styl wurden unter Verwendung von Lambda in NEB4 bzw. Exol-Puffer und 20% Glycerol durchgeführt.
Die Mutanten K75A, N146A und D256A wurden in Screening-Assays herausgepickt. Nach mehreren Runden des Vergleichens in verschiedenen Bedingungen und Substraten wurde festgestellt, dass K75A die bevorzugte Mutante ist, die eine hohe Spaltungs-hohe Aktivität beibehält, aber eine erheblich verringerte Stern-Aktivität aufweist. Styl(K75A) wurde als Styl-HF bezeichnet.
Vergleich von Styl-HF und Styl-WT

Der Vergleich von Styl-HF und Styl-WT in NEB4 ist in den 5A und 5B gezeigt, und das Ergebnis ist in der Tabelle 6 aufgelistet. Tabelle 6: Vergleich von Styl-HF und Styl-WT

Puffer	Styl-HF		Styl-WT		Verbesserungsfaktor
Puffer	Relative Aktivität	FI	Relative Aktivität	FI	Verbesserungsfaktor
NEB1	50%	≥4000	25%	32	≥125
NEB2	100%	2000	100%	16	125
NEB3	0,4%	≥16	50%	32	≥0,5
NEB4	50%	4000	25%	16	250

Styl-WT und Styl-HF wiesen die meiste Aktivität in NEB2 auf. Der FI für Styl-WT betrug 16, und jener für Styl-HF betrug 2000. Der insgesamte FI-Verbesserungsfaktor war 125.
Vergleichsbeispiel 5: Konstruieren von HF-BsaJI
Expression von BsaJI
BsaJI wurde in E. coli exprimiert, das mit pRRS-BsaJIR+M transformiert war, welches das BsaJI-Endonuklease- und -Methylase-Gen im selben Plasmid enthält. Die Zellen wurden bei 37°C über Nacht in LB mit Amp und Cam wachsen gelassen.
Mutagenese von BsaJI-HF
Alle Reste Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Phe, Trp, wurden zu Ala an den Positionen 9, 10, 14, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 27, 30, 32, 35, 39, 42, 43, 48, 50, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 60, 61, 65, 66, 67, 68, 70, 71, 72, 73, 78, 79, 81, 83, 84, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 104, 106, 110, 111, 113, 114, 117, 119, 120, 121, 123, 127, 129, 131, 132, 134, 136, 138, 140, 141, 142, 147, 152, 153, 157, 158, 159, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 175, 178, 181, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 194, 196, 197, 198, 199, 200, 202, 203, 204, 206, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 218, 220, 222, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 233, 238, 239, 240, 241, 246, 247, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 257, 260, 262, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 273, 274, 276, 277, 280, 281, 282, 283, 285, 287, 288, 290, 291, 293, 294, 295, 298 und 299 abgeändert; während Tyr zu Phe an den Positionen 21, 59, 62, 77, 89, 105, 130, 191, 208, 272, 286 und 296 abgeändert wurde.
Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm ER3081 transformiert.
Selektion von BsaJI-HF
Die Selektion von BsaJI-HF wurde mit Hilfe eines Vergleichs der Aktivität in NEB3 und NEB4 unter Verwendung von pBR322-DNA als Substrat bewerkstelligt. E198A und D200A besitzen die höchste Aktivität. D200A besitzt viel geringere Stern-Aktivität als WT in NEB4. BsaJI (D200A) wird als BsaJI-HF bezeichnet.
Reinigung von BsaJI-HF
Zwei Liter der Zelle ER3081 (pRRS-BsaJIR(D200A)+M) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp, 33 µg/ml Cam und 0,5 mM IPTG bei 37°C über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in 50 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient, und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl-Schritt. Die eluierten Fraktionen werden dann auf Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden durch Amicon® Ultra 30KDa (Millipore, U.S.A; heute Merck, Deutschland) weiter aufkonzentriert. Die konzentrierte BsaJI-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen an Glycerol zugesetzt und bei -20°C aufbewahrt.
Vergleich von BsaJI-HF und BsaJI-WT

Die Fls von BsaJI-HF und WT-BsaJI sind separat auf pBR322-DNA in vier NEB-Puffern mit Verdünnungsmittel A bestimmt worden. Das Ergebnis ist in Tabelle 7 aufgelistet. Tabelle 7: Vergleich von BsaJI-HF und BsaJI-WT

Puffer	BsaJI-HF		BsaJI-WT
Puffer	Aktivität	FI	Aktivität	FI	Verbesserungsfaktor
NEB1	25%	≥1000	100%	64	≥15
NEB2	100%	≥4000	100%	64	≥60
NEB3	100%	≥4000	25%	16	≥250
NEB4	100%	≥4000	100%	64	≥60

BsaJI-HF zeigte die beste Leistung in NEB 2, 3 und 4, worin der FI ≥ 4000 war; WT-BsaJI zeigte die beste Leistung in NEB 1, 2 und 4, worin der FI sich auf 64 belief. Somit war der Verbesserungsfaktor in NEB4 ≥ 4000/64 ≥ 64.
Vergleichsbeispiel 6: Konstruieren von HF-BsaWI
Expression von BsaWI
BsaWI wurde in E. coli exprimiert, das mit pLacZZ1-BsaWIR und pACYC-MspIM transformiert war, welches jeweils das BsaWI-Endonuklease- und -Methylase-Gen enthält. Die Zellen wurden bei 30°C über Nacht in LB mit Amp und Cam wachsen gelassen und bei 30°C mit 0,5 mM IPTG 18 Stunden induziert.
Mutagenese von BsaWl-HF
Alle Reste Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr wurden zu Ala an den folgenden Positionen verändert 9, 10, 13, 16, 17, 18, 20, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 34, 35, 36, 39, 42, 43, 45, 46, 48, 51, 54, 58, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 75, 78, 80, 81, 82, 84, 85, 86, 88, 89, 92, 93, 96, 99, 100, 101, 102, 104, 105, 107, 109, 113, 114, 115, 117, 121, 112, 123, 124, 127, 128, 129, 130, 131, 133, 136, 137, 138, 140, 141, 142, 145, 149, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 160, 163, 164, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 181, 184, 189, 195, 196, 197, 200, 202, 203, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 216, 218, 219, 221, 222, 228, 229, 230, 231, 233, 234, 237, 239, 241, 243, 247, 248, 250, 251, 254, 255, 258, 259, 260, 261, 264 und 266; während Tyr zu Phe an den Positionen 11, 57, 106, 147, 157, 215, 224, 236 und 265 verändert wird.
Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm ER3081 transformiert.
Selektion von BsaWl-HF
Die Selektion von BsaWI-HF wurde mit Hilfe eines Vergleichs der Aktivität in NEB3 und NEB4 unter Verwendung von Lambda-DNA als Substrat bewerkstelligt. Die folgenden Mutanten zeigten Änderungen: K229A, E025A, R034A und Q261A. WT-BsaWI kann den Verdau in beiden Puffern vervollständigen, wenn es in kleiner Kultur wachsen gelassen wird; bei Q261A wurde bemerkt, dass es lediglich ein stabiles Partiell-Muster ergibt. Dies könnte auf der Tatsache beruhen, dass die Mutante in kleiner Kultur schlecht wuchs. Als sie in großer Kultur wachsen gelassen und gereinigt wurde, wurde das Partiell-Muster eliminiert und das Substrat wurde stattdessen vollständig verdaut, und die Ergebnisse erwiesen sich auch als eine Hochgenauigkeits-Mutante, wenn auf dem Substrat pXba getestet wurde.
Reinigung von BsaWI-HF
Zwei Liter der Zelle ER3081(pLacZZ1-BwaWI(Q261A), pACYC-MspIM)) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp und 33 µg/ml bei 30°C über Nacht wachsen gelassen. Nach 8 Stunden wurde die Kultur mit 0,5 mM IPTG induziert. Die Zellen wurden geerntet und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15 000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient, und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl-Schritt. Die eluierten Fraktionen wurden dann hinsichtlich Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden mittels Vivaspin® 15R (Vivascience, heute Sartorius Vivascience GmbH, Göttingen, Deutschland) weiter aufkonzentriert. Die aufkonzentrierte BsaWI-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen von Glycerol zugesetzt und bei -20°C aufbewahrt.
Vergleich von BsaWI-HF und BsaWI-WT

Die Fls von BsaWI-HF und BsaWI-WT sind separat auf pXba-DNA in vier NEB-Puffern mit Verdünnungsmittel A bestimmt worden. Das Ergebnis ist in der Tabelle 8 (nachstehend) aufgelistet. Tabelle 8: Vergleich von BsaWI-HF und BsaWI-WT

Puffer	BsaWI-HF		BsaWI-WT
Puffer	Aktivität	FI	Aktivität	FI	Verbesserungsfaktor
NEB1	1,6%	8	12,5%	4	2
NEB2	100%	120	50%	8	≥15
NEB3	3,1%	≥250	3,1%	64	≥4
NEB4	100%	≥4000	100%	16	≥250

BsaWI-HF ist am aktivsten in NEB2 und NEB4, in welchen der beste FI ≥ 4000 ist; BsaWI-WT ist am aktivsten in NEB4, in welchem der FI 16 beträgt. Der Gesamt-Verbesserungsfaktor ist ≥ 4000/16= ~250.
Vergleichsbeispiel 7: Konstruieren von „High Fidelity“-BgII
Expression von BgII
BgII wurde in E. coli exprimiert, der mit pUC19-BgIIR und pSYX20-BgIIM transformiert war, welches jeweils das BgII-Endonuklease- und -Methylase-Gen enthält. Die Zellen wurden bei 37°C über Nacht in LB mit Amp und Kan wachsen gelassen.
Mutagenese von BgII-HF
Alle Reste Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr wurden zu Ala an den folgenden Positionen verändert 7, 8, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 31, 34, 36, 39, 40, 43, 44,45, 46 47, 48, 50, 52, 54, 5, 57, 60, 61, 65, 67, 68, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 84, 86, 87, 88, 91, 92, 94, 95, 96, 99, 100, 101, 102, 103, 105, 107, 108, 110, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 122, 123, 124, 125, 128, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 152, 158, 159, 160, 161, 163, 164, 165, 166, 167, 170, 172, 173, 174, 176, 177, 178, 179, 180 181, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 193, 194, 196, 197, 202, 203, 204, 205, 208, 211, 215, 216, 221, 222, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 234, 236, 239, 241, 242, 243, 245, 249, 250, 251, 255, 256, 259, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 275, 276, 277, 279, 281283, 286, 287, 289, 290 und 291; während Tyr zu Phe an den Positionen 19, 13, 33, 53, 66, 119, 127, 153, 199, 218, 233, 252 und 258 verändert wird.
Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm ER2566 transformiert.
Selektion von BgII-HF
Die Selektion von BgII-HF wurde mit Hilfe eines Vergleichs der Aktivität in NEB4 unter Verwendung von Lambda-DNA als Substrat bewerkstelligt. BgII-WT weist geringe Aktivität in NEB4 auf, und so wurden jegliche Mutanten mit ähnlicher oder mehr Aktivität als WT in NEB4 selektiert, wonach sie gegen Glycerol zum Vergleich von Stern-Aktivitäts-Spiegeln geprüft wurden. Nur eine Mutante, K225A, zeigte eine ähnliche Aktivität zu WT in NEB4, während auch die Stern-Aktivität verringert wurde, als sie in Glycerol getestet wurde. BgII(K225A) wird als BgII-HF bezeichnet.
Reinigung von BgII-HF
Zwei Liter der Zelle ER2566(pUC19-BgII(K225A), pSYX20-BgIIM) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp und 33 µg/ml Kan bei 37°C über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient, und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1M NaCI-Schritt. Die eluierten Fraktionen wurden dann auf Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden mittels Vivaspin® 15R (Vivascience, heute Sartorius Vivascience GmbH, Göttingen, Deutschland) weiter aufkonzentriert. Die konzentrierte BgII-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen von Glycerol gegeben und bei -20°C aufbewahrt.
Vergleich von BgII-HF und BgII-WT

Die Fls von BgII-HF und WT-BgII sind separat auf lambda-DNA in vier NEB-Puffern mit Verdünnungsmittel B bestimmt worden. Der Vergleich ist in der 6 gezeigt, und das Ergebnis ist in der Tabelle 9 (nachstehend) aufgelistet. Tabelle 9: Vergleich von BgII-HF und BgII-WT

Puffer	Bgll-HF		Bgll-WT
Puffer	Aktivität	FI	Aktivität	FI	Verbesserunqsfaktor
NEB1	50%	≥ 4000	25,0%	64	≥62
NEB2	100%	≥ 8000	100%	64	≥125
NEB3	6,3%	≥ 500	100%	250	≥2
NEB4	100%	≥ 8000	50%	32	≥250

BgII-HF war am aktivsten in NEB2 und NEB4, in welchen der FI ≥ 8000 war; BgII-WT ist am aktivsten in NEB3, in welchem der FI 250 betrug. Der Gesamt-Verbesserungsfaktor war ≥ 8000/250= ≥ 32.
Vergleichsbeispiel 8: Konstruieren von HF-BsrDI
Expression von BsrDI
Das BsrDI-Enzym enthält zwei Untereinheiten: BsrDIA und BsrDIB.
Um eine reine BsrDIA-Untereinheit zu erhalten, wurde das IMPACT(lntein-verMittelte Purifikation mit einem Affinitäts-Chitin-Bindungs-Tag)-System (NEB Kat.: E6901) für die Ein-Schritt-Reinigung von BsrDIA verwendet. Kurz gesagt, wurde das BsrDIA-Gen in den pTXB1-Vektor subkloniert, der dann in einen kompetenten Stamm transformiert wurde, der die T7-RNA-Polymerase, gesteuert vom Iac-Operon, enthielt (NEB #ER2566). Nach Screening und Sequenzieren wurde der korrekte Stamm selektiert. Zellen wurden in LB-Medium mit Ampicillin (100 µg/ml) bei 37°C wachsen gelassen, bis die OD₆₀₀ 0,5 erreichte. Dann wurde IPTG zugesetzt, um eine Endkonzentration von 0,4 mM für die Induktion von BsrDIA für 3 Stunden zu erreichen. Die Zellkultur wurde dann pelletiert, in eiskaltem Säulen-Puffer (20 mM Tris-HCI, pH 8,5, 500 mM NaCl) resuspendiert und durch Schallbehandlung lysiert. Das resultierende Zelllysat wurde dann zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Als nächstes wurde der Überstand auf eine äquilibrierte Chitin-Säule aufgetragen. Nach Waschen mit dem Auftragpuffer wurde die Säule mit Spaltungspuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,5, 500 mM NaCl und 50 mM DTT) bei 4 °C über Nacht inkubiert. Schließlich wurde das Btsl.A-Protein mit Dialyse gegen den Aufbewahrungspuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50 mM KCl und 50% Glycerol) eluiert.
Die BsrDIB-Untereinheit wurde in E. coli exprimiert, das mit pUC19-BsrDIBR und pLG-BsrDIM1M2, welches jeweils das BsrDI-Endonuklease- und -Methylase-Gen enthält, transformiert war. Die Zellen wurden bei 37°C über Nacht in LB mit Amp und Kam wachsen gelassen.
Mutagenese von BsrDI-HF
Alle Reste von BsrDIB, einschließlich Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, wurden zu Ala an den folgenden Positionen verändert 7, 11, 12, 14, 15, 17, 21, 22, 25, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 37, 40, 45, 46, 47, 51, 52, 56, 58, 62, 64, 65, 67, 68, 71, 72, 74, 75, 81, 83, 90, 91, 92, 93, 99, 100, 101, 106, 108, 109, 112, 113, 115, 116, 120, 122, 123, 124, 132, 133, 136, 137, 138, 139, 142, 143, 144, 145, 146, 150, 155, 157, 158, 161, 162, 164, 168, 170, 171, 173, 174, 176, 177, 179, 180, 182, 185, 189, 190, 193, 197, 200, 202, 203, 206, 210, 213, 215, 217, 218, 221, 224, 225, 226, 228, 229, 230, 232, 237, 238, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 249, 253, 258, 259, 261, 264, 265, 268, 271, 272, 273, 274, 276, 278, 279, 281, 285, 287, 288, 292, 294, 295, 299, 300, 301, 306, 307, 308, 312, 314, 315, 317, 318, 320, 321, 324, 325, 326, 327, 328, 331, 332, 335, 337, 341, 343, 345, 347, 352, 353, 354, 355, 356, 360, 361, 362, 363, 364, 370, 373, 374, 376, 380, 381, 385, 387, 389, 392, 393, 395, 396, 397, 405, 406, 408, 411, 415, 418, 420, 422, 425, 426, 430, 431, 432, 434, 437, 445, 446, 449, 450, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 463, 465, 466, 467, 469, 470, 475, 481; während Tyr zu Phe an den Positionen 9, 38, 63, 87, 118, 129, 169, 178, 198, 216, 251, 286, 291, 303, 357, 358, 367, 371, 402, 442, 443 448 verändert wurde.
Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm ER2566 transformiert.
Selektion von BsrDI-HF
Die Selektion von BsrDI-HF wurde unter Verwendung eines Vergleichs der Stern-Aktivität zwischen der WT-BsrDIB, gemischt mit BsrDIA, und der Mutanten-BsrDIB, gemischt mit BsrDIA, in NEB4 auf pBR322-DNA als Substrat bewerkstelligt. Bei acht Mutanten wird gefunden, dass sie weniger Stern-Aktivität in NEB4 aufweisen: H137A, D177A, K363A, K408A, R411A, Q215A, Q226A, Q230A.
Um die Stern-Aktivität weiter zu verringern, kombinieren wir die oben stehenden Mutationen, um Doppelmutationen zu erzeugen: K363A/Q230A, K363A/K408A, Q230A/K408A. Demnach wird die BsrDI mit den Mutationen Q230A/K363A auf BsrDIB als BsrDI-HF bezeichnet.
Reinigung von BsrDI-HF
Zwei Liter der Zelle ER2566(pUC19-BsrDI(Q230A/K363A), pLG-BsrDIM1M2)) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp und 33 µg/ml Kam bei 37°C über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient, und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl-Schritt. Die eluierten Fraktionen werden dann auf Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden mittels Vivaspin® 15R (Vivascience, heute Sartorius Vivascience GmbH, Göttingen, Deutschland) weiter aufkonzentriert. Die aufkonzentrierte BsrDI-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen an Glycerol zugesetzt und bei Bedingungen von -20°C aufbewahrt.
Vergleich von BsrDI-HF und BsrDI-WT

Die Fls von BsrDI-HF und BsrDI-WT sind separat auf pBR322-DNA in vier NEB-Puffern mit Verdünnungsmittel A bestimmt worden. Das Ergebnis ist in der 7 gezeigt und in Tabelle 10 (nachstehend) aufgelistet. Tabelle 10: Vergleich von BsrDI-HF und BsrDI-WT

Puffer	BsrDI-HF		BsrDI-WT
Puffer	Aktivität	FI	Aktivität	FI	Verbesserungsfaktor
NEB1	12,5%	≥ 120	6%	1	≥ 120
NEB2	100%	≥ 500	100%	4	≥ 120
NEB3	6%	≥ 64	12,5%	4	≥ 16
NEB4	100%	≥ 1000	25%	½	≥ 2000

BsrDI-HF zeigte die beste Leistung in NEB4, in welchem der FI ≥ 1000 war; BsrDI-WT zeigte die beste Leistung in NEB2 und NEB3, in welchen der FI 64 war. Somit war der Gesamt-Verbesserungsfaktor ≥ 1000/0.5= ≥ 2000.
Vergleichsbeispiel 9: Konstruieren von HF-Nsil
Expression von Nsil
Nsil wurde in E. coli exprimiert, der mit placzz1-NsilR und pACYC-NsilM transformiert war, welches jeweils das Nsil-Endonuklease- und -Methylase-Gen enthält. Die Zellen wurden bei 37°C über Nacht in LB mit Amp und Cam wachsen gelassen.
Mutagenese von Nsil-HF
Alle Reste Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Phe, Trp wurden zu Ala an den folgenden Positionen verändert 8, 9, 10, 11, 12, 13, 18, 21, 22, 23, 24, 26, 27, 32, 34, 35, 42, 44, 45, 46, 47, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 57, 58, 60, 61, 69, 70, 73, 74, 79, 80, 84, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 105, 106, 108, 109, 110, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 126, 134, 135, 137, 138, 139, 140, 142, 144, 145, 146, 149, 151, 153, 154, 155, 156, 159, 160, 161, 162, 163, 166, 167, 170, 173, 174, 175, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 186, 188, 189, 190, 191, 192, 195, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 215, 216, 217, 219, 221, 222, 225, 230, 231, 232, 234, 235, 236, 237, 239, 242, 243, 244, 245, 246, 249, 250, 251, 256, 257, 259, 260, 261, 263, 264, 268, 269, 271, 272, 273, 276, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 287, 288, 290, 292, 294, 295, 297, 298, 299, 302, 303, 306, 307, 308, 309, 310, 312, 315, 316, 319, 320, 323, 325, 327, 329, 333, 334, 336, 337, 338, 340, 341, 344, 347, 349, 350, 352, 353, 354, 355, 358, 359, 360, 362, 363, 365, 366, 367, 371, 372, 373, 375, 376 und 377; während Tyr zu Phe an den Positionen 30, 40, 62, 65, 71, 76, 83, 86, 141, 226, 233, 255, 289, 311, 326, 335, 351, 357, 378 verändert wird.
Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm ER3081 transformiert.
Selektion von Nsil-HF
Die Selektion von Nsil-HF wurde mit Hilfe eines Vergleichs der Aktivität in NEB3 und NEB4 unter Verwendung von pXba-DNA als Substrat bewerkstelligt. Nsil-WT hat mehr Aktivität in NEB3, wobei man diejenige(n) mit mehr Aktivität in NEB4 selektierte. Es wird festgestellt, dass 148 Mutanten mehr Aktivität in NEB4 aufweisen. F376A hat eine wesentlich höhere Aktivität als WT in NEB4. Normalerweise ist diejenige mit der höchsten Aktivität in NEB4 diejenige mit verbesserter Stern-Aktivität. Nsil (F376A) wird als Nsil-HF bezeichnet.
Reinigung von Nsil-HF
Zwei Liter der Zelle ER3081 (placzz1-Nsil(F376A), pACYC-NsilM)) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp, 33 µg/ml Cam und 0,5 mM IPTG bei 37°C über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in 50 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl-Schritt. Die eluierten Fraktionen werden dann auf Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden durch Amicon Ultra 30KDa (Millipore, U.S.A; heute Merck, Deutschland) weiter aufkonzentriert. Das konzentrierte Nsil-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen Glycerol zugesetzt und bei der Bedingung von -20°C aufbewahrt.
Vergleich von Nsil-HF und Nsil-WT

Die Fls von Nsil-HF und WT-Nsil sind separat auf pXba-DNA in vier NEB-Puffern mit Verdünnungsmittel A bestimmt worden. Das Ergebnis ist in Tabelle 11 (nachstehend) aufgelistet. Tabelle 11: Vergleich von Nsil-HF und Nsil-WT

Puffer	Nsil-HF		Nsil-WT
Puffer	Aktivität	FI	Aktivität	FI	Verbesserungsfaktor
NEB1	3%	≥250	6,3%	32	≥8
NEB2	12,5%	≥1000	25%	32	≥30
NEB3	6%	≥500	100%	32	≥15
NEB4	100%	≥8000	12,5%	32	≥250

Nsil-HF zeigte die beste Leistung in NEB4, in welchem der FI ≥ 8000 war; WT-Nsil zeigte die beste Leistung in NEB3, in welchem der FI 32 war. So war der Verbesserungsfaktor in NEB4 ≥ 8000/32= ≥ 250.
Vergleichsbeispiel 10: Konstruieren von HF-DpnII
Expression von Dpnll
Dpnll wurde in E. coli 3081 exprimiert, das mit pBAD241-Dpnll RM transformiert war. Die Zellen wurden bei 30 °C über Nacht in LB mit Amp wachsen gelassen.
Mutagenese von DpnII
Die Punktmutagenese der gewählten Mutationen erfolgte mittels inverser PCR. 189 Aminosäuremutationen wurden in Dpnll wie folgt durchgeführt. Cys, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp wurden zu Ala mutiert. Try wurde zu Phe mutiert. Diese waren: 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 46, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 59, 61, 62, 63, 64, 66, 69, 76, 77, 78, 80, 81, 82, 86, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 116, 117, 118, 120, 121, 122, 125, 126, 129, 130, 132, 135, 138, 139, 140, 141, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 152, 153, 156, 157, 158, 160, 161, 162, 164, 168, 169, 171, 172, 173, 175, 176, 177, 178, 180, 181, 183, 184, 186, 188, 189, 191, 192, 193, 195, 196, 198, 199, 200, 201, 202, 205, 206, 207, 208, 211, 214, 216, 217, 218, 219, 221, 223, 224, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 244, 246, 247, 248, 249, 251, 252, 254, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 264, 265, 266, 267, 268, 272, 274, 275, 277, 278, 280, 281 und 282.
Das Verfahren zum Primerdesign und zur PCR ist ähnlich zu jenem, das früher beschrieben wurde. Das PCR-Produkt wurde mit Dpnl verdaut und in kompetenten E. coli 3081 transformiert.
Selektion von Dpnll-HF
Vier Kolonien von jeder Mutation wurden in LB mit Amp bei 37 °C über Nacht heranwachsen gelassen. Die standardmäßigen Screening-Assays von Dpnll wurden unter Verwendung von dam^--Lamda-Substrat in NEB4-Puffer und 5% Glycerol durchgeführt.
Die Mutanten R78A, T140A, E152A, R199A und F217A wurden aus dem Screening-Assay heraus ausgesucht. Nach mehreren Runden des Vergleichens in verschiedenen Bedingungen und Substraten wurde R199A als Kandidat gewählt, der eine hohe kanonische Enzym-Aktivität beibehält, aber eine erheblich verringerte Stern-Aktivität aufweist. R199A wurde als Dpnll-HF bezeichnet.
Reinigung von Dpnll-HF
Zwei Liter der Zelle E. coli 3081 (pBAD241.DpnII.RM (R199A)) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp bei 30 °C über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl-Schritt. Die eluierten Fraktionen werden dann auf Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden weiter aufkonzentriert. Das konzentrierte Bmt-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen Glycerol zugesetzt und unter Bedingungen von -20 °C aufbewahrt.
Vergleich von Dpnll-HF und Dpnll-WT
Dpnll-HF wurde 2-fach seriell mit B verdünnt und in vier NEB-Puffern reagieren gelassen, und Dpnll-WT wurde 2-fach seriell verdünnt und in vier NEB-Puffern reagieren gelassen. Das Ergebnis ist in der Tabelle 12 aufgelistet. Tabelle 12: Vergleich von Dpnll-HF und Dpnll-WT

Puffer DpnII-HF DpnII-WT

Aktivität FI Aktivität FI Verbesserungsfaktor

NEB1 50% 4000 25% 1 4000

NEB2 25% 2000 25% 1 2000

NEB3 0,8% 64 100% 32 2

NEB4 100% 8000 25% 1 8000
Dpnll-HF zeigte die beste Leistung in NEB4, in welchem der bevorzugte FI =8000 war; Dpnll zeigte die beste Leistung in NEB3, worin der FI 32 war. Der insgesamte FI-Verbesserungsfaktor betrug 8000/32=250.
Vergleichsbeispiel 11: Konstruieren von High-Fidelity-BcII
Expression von BcII
BcII wurde in E. coli exprimiert, der mit pRRS-BcIIR und pACYC184-BcIIM transformiert war, welches jeweils das BcII-Endonuklease- und -Methylase-Gen enthält. Die Zellen wurden bei 37°C über Nacht in LB mit Amp wachsen gelassen.
Mutagenese von Bcll-HF
Alle Reste Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr wurden zu Ala an den folgenden Positionen verändert 9, 10, 11, 12, 19, 22, 23, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 35, 37, 38, 40, 42, 44, 46, 47, 49, 51, 53, 54, 55, 58, 59, 62, 65, 67, 69, 72, 73, 74, 75, 76, 80, 82, 83, 85, 86, 89, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 101, 103, 105, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 120, 124, 128, 129, 130, 132, 136, 137,, 138, 139, 143, 144, 145, 149, 150, 151, 152, 154, 156, 160, 162, 163, 164, 166, 167, 170, 171, 172, 174, 175, 178, 179, 180, 182, 183, 188, 190, 191, 195, 196, 197, 199, 200, 201, 204, 205, 208, 209, 210, 212, 213, 215, 217, 218, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 228, 229, 234, 235, 237, 238, 241, 243, 244, 245, 249, 252, 255, 257, 260, 261, 265, 266, 267, 270, 271, 273, 274 und 277; während Tyr zu Phe an den Positionen 17, 27, 36, 63, 66, 77, 87, 100, 116, 118, 133, 142, 147, 157, 192, 193, 194, 207, 212, 231, 236 und 246 verändert wird.
Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm ER2984 transformiert.
Selektion von Bcll-HF
Die Selektion von Bcll-HF erfolgte mit Hilfe eines Vergleichs der Aktivität in Glycerol und NEB4 unter Verwendung von dam- lambda-DNA als dem Substrat. Sobald der Verdacht einer geringeren Stern-Aktivität aufkam, wurden Mutanten auch mit normaler Aktivität in Wasser und NEB4 auf dem gleichen Substrat verglichen. Mutanten mit ähnlicher Aktivität zu WT in NEB4 und ebenfalls mit dem Potential, geringere Stern-Aktivität aufzuweisen, wurden selektiert. Von 6 Mutanten wird festgestellt, dass sie solche Charakteristika besitzen: G26A, P105A, T195A, Q210A, Y147F und Y193F. Einige Mutanten (K114A, T197A, S245A, D252A und Y027F) zeigten geringere Aktivität in Wasser, aber ebenfalls eine verminderte Stern-Aktivität; sie wiesen üblicherweise die kognate Aktivität bei höherer Aktivität als der WT unter Hoch-Glycerol-Bedingungen auf. Eine Mutante zeigte höhere Aktivität als WT und auch eine niedrigere Stern-Aktivität: Y192F. BcII(Y192F) wird als Bcll-HF bezeichnet.
Reinigung von Bcll-HF
Zwei Liter der Zelle ER2984(pRRS-BcII(Y192F), pACYC184-BcIIM)) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp bei 37°C über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in 20 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient und anschließend ein 10 ml großer 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl-Schritt. Die eluierten Fraktionen wurden dann hinsichtlich Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden mittels Vivaspin® 15R (Vivascience, heute Sartorius Vivascience GmbH, Göttingen, Deutschland) weiter aufkonzentriert. Das konzentrierte Bcll-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen Glycerol zugesetzt und bei -20 °C aufbewahrt.
Vergleich von Bcll-HF und Bcll-WT

Die Fls von Bcll-HF und Bcll-WT sind separat auf dam- lambda-DNA in vier NEB-Puffern mit Verdünnungsmittel A bestimmt worden. Der Vergleich ist in der 8 gezeigt, und das Ergebnis ist in Tabelle 13 (nachstehend) aufgelistet. Tabelle 13: Vergleich von Bcll-HF und Bcll-WT

Puffer	BcII-HF		Bcll-WT
Puffer	Aktivität	FI	Aktivität	FI	Verbesserungsfaktor
NEB1	12,5%	≥ 250	50%	120	≥2
NEB2	100%	≥ 500	100%	32	≥16
NEB3	25%	≥ 32	50%	64	≥½
NEB4	100%	≥ 2000	100%	32	≥60

Bcll-HF zeigte die beste Leistung in NEB2 und NEB4, in welchen der beste FI ≥ 2000 war; Bcll-WT zeigte die beste Leistung in NEB2 und NEB4, in welchen der FI 32 betrug. Der Gesamt-Verbesserungsfaktor beträgt ≥2000/32=≥ 64.
Vergleichsbeispiel 12: Konstruieren von HF-BgIII
Expression von BgIII
BgIII wurde in E. coli exprimiert, der mit pLacZZ-BgIIIR und pACYC-BgIIIM transformiert war, welches jeweils das BgIII-Endonuklease- und -Methylase-Gen enthält. Die Zellen wurden bei 37 °C über Nacht in LB mit Amp und Cam wachsen gelassen.
Mutagenese von BgIII-HF
Alle Reste Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr wurden zu Ala an den folgenden Positionen verändert 2, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 16, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 29, 30, 33, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 53, 54, 55, 58, 59, 60, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 74, 75, 76, 77, 78, 81, 82, 84, 85, 87, 88, 89, 90, 93, 95, 96, 97, 98, 101, 104, 105, 106, 108, 109, 110, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 120, 121, 122, 124, 125, 131, 132, 134, 135, 136, 139, 140, 141, 142, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 157, 159, 161, 162, 166, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 179, 182, 183, 184, 187, 188, 189, 191, 192, 193, 195, 196, 197, 198, 199, 201, 203, 206, 207, 208, 209, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 219, 222; während Tyr zu Phe an den Positionen 8, 56, 99, 144, 145, 158, 185 und 190 verändert wird.
Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm ER3081 transformiert.
Selektion von BgIII-HF
Die Selektion von BgIII-HF wurde mit Hilfe eines Vergleichs der Aktivität in NEB3 und NEB4 unter Verwendung von pXba-DNA als Substrat bewerkstelligt. BgIII-WT hat mehr Aktivität in NEB3, so dass die Mutanten mit mehr Aktivität in NEB4 ausgewählt wurden. Alle Mutanten mit mehr Aktivität wurden dann mit der WT-Aktivität in Glycerol verglichen, um hinsichtlich Stern-Aktivität zu überprüfen. Normalerweise ist die Mutante mit der höchsten Aktivität in NEB4 diejenige mit verbesserter Stern-Aktivität. Die Mutanten, die am vielversprechendsten waren (H10A, N208A, K48A, K74A, R75A, Y56F, K58A, M117A) wurden schließlich mit Exol-Puffer in Wasser getestet, was die Stern-Aktivität bei BgII-WT fördern kann. Eine Mutante, N208A, zeigte verringerte Stern-Aktivität in NEB4 und erhöhte Gesamtaktivität. In kleiner Kultur kann diese Mutante dem Anschein nach eine stabile Partiell-Aktivität besitzen, was, so haben wir festgestellt, ein weiterer Indikator dafür ist, dass sich die Genauigkeit verändert hat. BgIII(N208A) wird als BgIII-HF bezeichnet.
Reinigung von BgIII-HF
Zwei Liter der Zelle ER3081(pLacZZ-BgIII(N208A), pACYC-BgIIIM)) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp und 33 µg/ml bei 30°C über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl-Schritt. Die eluierten Fraktionen wurden dann auf Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden mittels Vivaspin® 15R (Vivascience, heute Sartorius Vivascience GmbH, Göttingen, Deutschland) weiter aufkonzentriert. Die aufkonzentrierte BgIII-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen Glycerol zugesetzt und bei -20°C aufbewahrt.
Vergleich von BgIII-HF und BgIII-WT

Die Fls von BgIII-HF und BgIII-WT sind separat auf pXba-DNA in vier NEB-Puffern mit Verdünnungsmittel B bestimmt worden. Der Vergleich ist in der 9 gezeigt, und das Ergebnis ist in Tabelle 14 (nachstehend) aufgelistet. Tabelle 14: Vergleich von BgIII-HF und BgIII-WT

Puffer	BgIII-HF		BgIII-WT
Puffer	Aktivität	FI	Aktivität	FI	Verbesserungsfaktor
NEB1	12.5%	≥ 8000	25%	250	≥32
NEB2	100%	≥ 128000	100%	64	≥2000
NEB3	50%	≥ 2000	100%	120	≥16
NEB4	25%	≥ 32000	6,3%	16	≥2000

BgIII-HF zeigte die beste Leistung in NEB2, in welchem der FI ≥ 128000 war; BgIII-WT zeigte die beste Leistung in NEB3, in welchem der FI 120 war. Der Gesamt-Verbesserungsfaktor war ≥ 128000/120= ≥ 1000.
Vergleichsbeispiel 13: Konstruieren von HF-BstEII
Expression von BstEII
BstEII wurde in E. coli exprimiert, der mit pUC19-BstEIIR und pACYC-BstEIIM transformiert war, welches jeweils das BstEII-Endonuklease- und -Methylase-Gen enthält. Die Zellen wurden bei 37°C über Nacht in LB mit Amp und Cam wachsen gelassen.
Mutagenese von BstEII-HF
Alle Reste Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr wurden zu Ala an folgenden Personen verändert 7, 9, 10, 14, 17, 20, 21, 22, 25, 26, 29, 30, 32, 36, 37, 40, 41, 44, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 57, 58, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 67, 68, 69, 72, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 85, 88, 89, 90, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 111, 112, 113, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 130, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 140, 142, 143, 147, 150, 151, 152, 154, 155, 157, 160, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 171, 172, 175, 176, 178, 179, 180, 182, 184, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 199, 202, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 224, 225, 227, 228, 232, 233, 234, 236, 238, 243, 244, 245, 246, 247, 251, 252, 255, 256, 258, 261, 262, 264, 265, 266, 272, 274, 277, 278, 279, 281; während Tyr zu Phe an den Positionen 8, 15, 24, 27, 35, 43, 77, 129, 131, 139, 156, 188, 203, 229, 257 und 263 verändert wird.
Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm ER2683 transformiert.
Selektion von BstEII-HF
Die Selektion von BstEII-HF wurde mit Hilfe eines Vergleichs der Aktivität in NEB3 und NEB4 unter Verwendung von lambda-DNA als Substrat bewerkstelligt. WT-BstEII besitzt mehr Aktivität in NEB3, so dass die Mutanten mit mehr Aktivität in NEB4 ausgewählt wurden. Von sieben Mutanten wurde festgestellt, dass sie eine verbesserte Aktivität in NEB4 aufweisen: K014A, Q069A, E099A, R105A, R117A, G135A und Y035F. R105A wies den größten Unterschied in der Aktivität verglichen zum WT in NEB4 und Wasser auf, und zeigte auch eine verminderte Stern-Aktivität, wenn in Glycerol mit Exol-Puffer getestet wurde, einem Umstand, der Stern-Aktivität beim WT zeigt. BstEII(R105A) wird als BstEII-HF benannt.
Reinigung von BstEII-HF
Zwei Liter der Zelle ER2683(pUC19-BstEII(R105A), pACYC-BstEIIM)) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp und 33 µg/ml bei 30°C über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl-Schritt. Die eluierten Fraktionen wurden dann auf Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden mittels Vivaspin® 15R (Vivascience, heute Sartorius Vivascience GmbH, Göttingen, Deutschland) weiter aufkonzentriert. Die konzentrierte BstEII-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen Glycerol zugesetzt und bei -20°C aufbewahrt.
Vergleich von BstEII-HF und WT-BstEII

Die Fls von BstEII-HF und WT-BstEII sind separat auf lambda-DNA in vier NEB-Puffern mit Verdünnungsmittel A bestimmt worden. Der Vergleich ist in der 10 gezeigt, und das Ergebnis ist in Tabelle 15 (nachstehend) aufgeführt. Tabelle 15: Vergleich von BstEII-HF und BstEII-WT

Puffer	BstEII-HF		BstEII-WT
Puffer	Aktivität	FI	Aktivität	FI	Verbesserungsfaktor
NEB1	3%	≥ 64	50%	16	≥4
NEB2	50%	≥ 1000	100%	4	≥250
NEB3	1,6%	≥ 32	50%	16	≥2
NEB4	100%	≥ 2000	100%	4	≥500

BstEII-HF zeigte die beste Leistung in NEB4, in welchem der FI ≥ 2000 war; BstEII-WT zeigte die beste Leistung in NEB2 und NEB4, in welchen der FI 4 war. Der Gesamt-Verbesserungsfaktor ist ≥ 2000/4= ≥ 500.
Vergleichsbeispiel 14: Konstruieren von HF-BanII
Expression von Banll
Banll wurde in E. coli exprimiert, der mit pUC19-BanIIR und pACYC1-BanIIM transformiert war, welches jeweils das BanII-Endonuklease- bzw. -Methylase-Gen enthält. Die Zellen wurden bei 37°C über Nacht in LB mit Amp und Cam wachsen gelassen.
Mutagenese von Banll-HF
Alle Reste außer Tyr (und jene, die bereits Ala waren) wurden zu Ala an den folgenden Positionen verändert 7, 8, 9, 10, 12, 16, 17, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 24, 31, 32, 35, 38, 39, 43, 44, 45, 47, 49, 54, 59, 61, 63, 64, 66, 67, 71, 72, 73, 74, 75, 77, 78, 81, 83, 84, 87, 88, 92, 94, 95, 96, 97, 99, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 113, 115, 117, 118, 120, 121, 122, 123, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 135, 139, 142, 143, 145, 146, 147, 148, 149, 152, 153, 155,156, 163, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 173, 175, 176, 178, 179, 180, 181, 183, 184, 186, 190, 191, 194, 195, 196, 198, 199, 200, 207, 208, 211, 213, 214, 215, 216, 219, 220, 221, 222, 224, 226, 229, 230, 231, 232, 234, 235, 236, 237, 239, 240, 242, 245, 246, 247, 248, 252, 254, 256, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 264, 266, 267, 270, 271, 272, 274, 276, 278, 279, 281 284, 285, 286, 287, 289, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 300, 302, 303, 305, 309, 311, 312, 314, 317, 318, 319, 322, 326, 327, 328, 330, 331, 334, 338, 339, 341, 342, 344, 346, 347, 348, 349, 351, 352, 355, 356 und 358; Tyr wurde zu Phe an den Positionen 27, 50, 80, 160, 182, 197, 244, 251, 260, 307 und 313 verändert.
Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm ER2566 transformiert.
Selektion von Banll-HF
Die Selektion von Banll-HF erfolgte unter Anwendung des Vergleichens der Aktivität, in NEB4 mit Wasser, mit der Stern-Aktivität in Exol-Puffer und Glycerol, wobei lambda-DNA als Substrat verwendet wurde. Mutanten, die eine ähnliche oder verbesserte Aktivität gegenüber WT in Wasser und NEB4 zeigten, während sie auch eine verbesserte Stern-Aktivität zeigten, wurden für weitere Tests ausgewählt. Diese Mutanten schließen N106A, Q169A und E314A ein. R126A wurde ebenfalls gewählt, weil es ein konsistentes partielles Muster zeigte, von welchem wir zeigten, dass es ein Indikator für hohe Genauigkeit ist. Nach der Aufreinigung zeigte R126A die beste Verringerung bei der Stern-Aktivität. Banll(R126A) wird als Banll-HF bezeichnet.
Reinigung von Banll-HF
Zwei Liter der Zelle ER2566(pUC19-Banll(R126A), pACYC-BanIIM)) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp und 33 µg/ml bei 30°C über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl-Schritt. Die eluierten Fraktionen wurden dann auf Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden mittels Vivaspin® 15R (Vivascience, heute Sartorius Vivascience GmbH, Göttingen, Deutschland) weiter aufkonzentriert. Das konzentrierte Banll-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen Glycerol zugesetzt und bei -20°C aufbewahrt.
Vergleich von Banll-HF und Banll-WT

Die Fls von Banll-HF und Banll-WT sind separat auf dam- lambda-DNA in vier NEB-Puffern mit Verdünnungsmittel A bestimmt worden. Das Ergebnis ist in der Tabelle 16 (nachstehend) aufgelistet. Tabelle 16: Vergleich von Banll-HF und Banll-WT

Puffer	Banll-HF		Banll-WT
Puffer	Aktivität	Fl	Aktivität	Fl	Verbesserungsfaktor
NEB1	100%	≥ 4000	100%	64	≥64
NEB2	50%	≥ 2000	100%	64	≥32
NEB3	12,5%	≥ 500	12,5%	16	≥32
NEB4	50%	≥ 2000	100%	16	≥125

Banll-HF zeigte die beste Leistung in NEB1, in welchem der Fl ≥ 4000 war; Banll-WT zeigte die beste Leistung in NEB1, NEB2 und NEB4, in welchen der beste Fl 64 betrug. Somit ist der Gesamt-Verbesserungsfaktor in NEB1 ≥ 4000/64= ≥ 64.
Vergleichsbeispiel 15: Konstruieren von HF-PspGl
Expression von PspGl
PspGl wurde in E. coli exprimiert, der mit pRRS-PspGlRM, welcher das PspGl-Endonuklease- und -Methylase-Gen enthält, transformiert war. Die Zellen wurden bei 30°C über Nacht in LB mit Amp wachsen gelassen.
Mutagenese von PspGl-HF
Die Länge des PspGl-Proteins beträgt 272 Aminosäuren. Insgesamt 166 AA-Stellen des PspGl-Proteins wurden am Anfang so entworfen, dass sie zu Ala (oder Phe) mutiert werden sollten. Cys, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp wurden zu Ala mutiert. Try wurde zu Phe mutiert. Diese waren: 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ,16, 18,19, 20, 21, 22, 25, 26, 29, 30, 32, 34, 35, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 51, 52, 53, 54, 57, 60, 61, 62, 65, 68, 69, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 82, 84, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 99, 100, 101, 102, 105, 109, 110, 113, 134, 135, 136, 137, 138, 142, 143, 145, 149, 150, 151, 152, 153, 158, 160, 161, 162, 164 und 165. Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm 2984 transformiert.
Selektion von PspGl-HF
Die Selektion von PspGl-HF wurde mit Hilfe eines Vergleichs von Mutanten- und WT-Aktivität in NEB4 unter Verwendung von pBC4-DNA als Substrat bewerkstelligt. Die Selektionsassays von PspGl wurden unter Verwendung von pBC4 als Substrat in NEB4 durchgeführt (2h Verdau bei 69°C). Von 11 Mutanten wurde festgestelllt, dass sie mehr Aktivität in NEB4 als WT aufweisen: T20A, P52A, Y67F, K68A, R75A, E86A, Q90A, S91A, Q93A, H121A und G172A. PspGl (R75A) besitzt wesentlich höhere Aktivität als WT in NEB4. Normalerweise war diejenige mit der höchsten Aktivität in NEB4 diejenige mit verbesserter Stern-Aktivität. Nach mehreren Runden des Vergleichens in verschiedenen Bedingungen und Substraten wurde festgestellt, dass PspGl (R75A) die bevorzugte Mutante ist, die eine hohe Spaltungs-hohe Aktivität beibehält, aber eine erheblich verringerte Stern-Aktivität aufweist. PspGl (R75A) wird als PspGl-HF bezeichnet.
Reinigung von PspGl-HF
Zwei Liter der Zelle E. coli 2984 (pRRS-PspGlRM (R75A)) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp bei 30°C über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl-Schritt. Die eluierten Fraktionen werden dann auf Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden weiter aufkonzentriert. Das konzentrierte PspGl-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen Glycerol zugesetzt und im Zustand von -20°C aufbewahrt.
Vergleich von PspG-HF und PspGl-WT

Die Fls von PspG-HF und PspGl-WT sind separat auf pBC4-DNA in vier NEB-Puffern mit Verdünnungsmittel A bestimmt worden. Das Ergebnis ist in Tabelle 17 (nachstehend) aufgelistet. Tabelle 17: Vergleich von PspG-HF und PspGl-WT

Puffer	PspGl-HF		PspGl-WT
Puffer	Aktivität	Fl	Aktivität	Fl	Verbesserungsfaktor
NEB1	25%	≥ 1000	12.5%	1	≥ 1000
NEB2	100%	≥ 4000	100%	4	≥ 1000
NEB3	100%	≥ 4000	100%	8	≥500
NEB4	100%	≥ 4000	100%	1	≥4000

PspGl-HF zeigte die beste Leistung in/bei NEB2, NEB3 und NEB4, in welchen der bevorzugte Fl ≥4000 war; PspGl-WT zeigte die beste Leistung in NEB2, NEB3 und NEB4. Der bevorzugte Fl von PspGl-WT in NEB3 war 8. Der insgesamte Fl-Verbesserungsfaktor war ≥4000/8=≥500.
Vergleichsbeispiel 16: Konstruieren von HF-Spel
Expression von Spel
Spel wurde in E. coli exprimiert, der mit pRRS-Spel und pASYX20-SpelM9 transformiert war, welche jeweils das Spel-Endonuklease- bzw. -Methylase-Gen enthalten. Die Zellen wurden bei 30°C über Nacht in LB mit Amp und Kan wachsen gelassen.
Mutagenese von Spel-HF
Alle Reste Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr wurden zu Ala an den folgenden Positionen verändert 7, 9, 10, 17, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 40, 43, 45, 46, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 57, 58, 59, 61, 65, 66, 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 80, 81, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 92, 96, 97, 101, 102, 103, 105, 107, 108, 109, 110, 112, 113, 115, 116, 118, 121, 122, 125, 126, 128, 130, 131, 137, 138, 139, 140, 142, 146, 149, 151, 152, 154, 157, 158, 159, 160, 161, 163, 166, 167, 169, 170, 172, 174, 175, 179, 180 und 182; Tyr wurde zu Phe an den Positionen 13, 19, 28, 55, 104, 120, 129 und 164 verändert. Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm ER1038 transformiert.
Selektion von Spel-HF
Die Selektion von Spel-HF wurde mit Hilfe des Vergleichens der Aktivität von jeder Mutante in NEB4 mit Wasser und pXBA-DNA, die zuvor mit Sacl-HF verdaut worden war, als Substrat zu einer Glycerol-Reaktion mit Exol und normalem pXba bewerkstelligt. Die Sacl-HF-verdaute pXBA ermöglichte eine größere Deutlichkeit beim Testen von Mutanten auf Aktivität im Vergleich zum WT. Die Glycerol-Reaktion wurde angewandt, um Stern-Aktivität-Ergebnisse zu vergleichen. Einige Mutanten zeigten hohe kognate Aktivität mit einer gleichzeitigen Verringerung der Stern-Aktivität: E059A, P065A, S108A, N172A, K174A, Q179A, G182A und Y055F. Nach Vergleichen gereinigter Proben wurde Spel(P065A) als Spel-HF benannt.
Reinigung von Spel-HF
Zwei Liter der Zelle ER3081(pRRS-SpelM7(P065A), pSYX20-SpelM9)) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp und 33 µg/ml bei 30°C über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient, und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl-Schritt. Die eluierten Fraktionen wurden dann hinsichtlich Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden mittels Vivaspin® 15R (Vivascience, heute Sartorius Vivascience GmbH, Göttingen, Deutschland) weiter konzentriert. Das konzentrierte Spel-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen Glycerol zugesetzt und bei -20°C aufbewahrt.
Vergleich von Spel-HF und Spel-WT

Die Fls von Spel-HF und Spel-WT sind separat auf pXba-DNA in vier NEB-Puffern mit Verdünnungsmittel C bestimmt worden, und das Ergebnis ist in der Tabelle 18 (nachstehend) aufgeführt. Tabelle 18: Vergleich von Spel-HF und Spel-WT

Puffer	Spel-HF		Spel-WT
Puffer	Aktivität	Fl	Aktivität	Fl	Verbesserungsfaktor
NEB1	50%	≥ 4000	100%	1000	≥ 1000
NEB2	12,5%	≥ 2000	50%	500	≥2
NEB3	12,5%	≥ 2000	12,5%	2000	≥1/8
NEB4	100%	≥ 8000	50%	500	≥2

Spel-HF weist die meiste Aktivität in NEB4 auf, worin der Fl ≥ 8000 ist; Spel-WT weist die meiste Aktivität in NEB1 auf, worin der Fl 1000 ist. Somit ist der Gesamt-Verbesserungsfaktor ≥ 8.
Vergleichsbeispiel 17: Konstruieren von HF-BsmAl
Expression von BsmAl
BsmAI wurde in E. coli exprimiert, der transformiert war mit pBAD241-BsmAlR und pACYC-BsmAIM, welches jeweils das BsmAl-Endonuklease bzw. -Methylase-Gen enthält. Die Zellen wurden bei 37°C über Nacht in LB mit Amp und Cam wachsen gelassen und dann mittels Arabinose 4 Stunden induziert.
Mutagenese von BsmAl-HF
Wegen der Homologie unter Bsal, BsmBl und BsmAl wurden Aminosäuren in der Region 210-227 von BsmAl jeweils einzeln zum Mutieren zu Ala ausgewählt, weil dass die Hochgenauigkeits-Mutanten von Bsal und BsmBl in der dieser ähnlichen Region gefunden wurden.
Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm ER3081 eintransformiert.
Selektion von BsmAl-HF
Die Selektion von BsmAl-HF wurde mit Hilfe des Vergleichs der Stern-Aktivität von mutanter BsmAl und WT-BsmAl in NEB4 auf FX174-DNA als Substrat bewerkstelligt. Zwei Mutanten hatten weniger Stern-Aktivität als die WT-BsmAl: N212A und L213A. Die Mutante BsmAl(N212A) wird als BsmAl-HF bezeichnet.
Reinigung von BsmAl-HF
Zwei Liter der Zelle ER2566(pBAD241-BsmAl(N212A), pACYC184-BsmAlM)) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp und 33 µg/ml Cam bei 37°C über Nacht wachsen gelassen. Dann wurden die Zellen durch Arabinose mit einer Endkonzentration von 0,2% 4 Stunden induziert. Die Zellen wurden geerntet und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient, und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl-Schritt. Die eluierten Fraktionen werden dann auf Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden mittels Vivaspin® 15R (Vivascience, heute Sartorius Vivascience GmbH, Göttingen, Deutschland) weiter aufkonzentriert. Das konzentrierte BsmAl-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen an Glycerol zugesetzt und bei -20°C aufbewahrt.
Vergleich von BsmAl-HF und BsmAl-WT

Die Fls von BsmAl-HF und BsmAl-WT sind separat auf FX174-DNA in vier NEB-Puffern mit Verdünnungsmittel B bestimmt worden. Das Ergebnis ist in Tabelle 19 (nachstehend) aufgelistet. Tabelle 19: Vergleich von BsmAl-HF und BsmAI-WT

Puffer	BsmAl-HF		BsmAl-WT
Puffer	Aktivität	Fl	Aktivität	Fl	Verbesserungsfaktor
NEB1	100%	≥ 4000	50%	120	≥32
NEB2	50%	≥ 2000	50%	500	≥4
NEB3	12,5%	≥ 500	50%	500	1
NEB4	100%	≥ 4000	100%	250	≥8

BsmAl-HF zeigte die beste Leistung in NEB1 und NEB4, in welchen der Fl ≥ 4000 war; BsmAl-WT zeigte die beste Leistung in NEB4, in welchem der Fl 250 war. Somit war der Gesamt-Verbesserungsfaktor ≥ 4000/250= ≥ 16.
Vergleichsbeispiel 18: Konstruieren von HF-BstXl
BstXl erkennt und verdaut bei CCANNNNN/NTGG, wie im Beispiel 19 der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 2009/009797 beschrieben. Eine Mutante BstXl(N65A) wurde als die Hochgenauigkeitsversion der BstXl ausgewählt. Ein weiterer Schritt zum Suchen nach einer besseren BstXl mit weniger Stern-Aktivität besteht darin, N65 zu allen sonstigen Aminosäureresten zu mutieren. Unter diesen wurde von BstXl(N65T) gefunden, weniger Stern-Aktivität zu besitzen, und es wurde ausgesucht, die BstXl-HF zu sein.
Die BstXl-HF wurde in ER2833 (pBAD241-BstXl(N65T), pACYC-BstXIM exprimiert. Die Wachstums- und Reinigungsverfahren wurden gemäß WO/2009/009797 durchgeführt.

Die folgende Tabelle (Tabelle 20) vergleicht die Fls von BstXl-HF und BstXl-WT Tabelle 20: Vergleich von BstXl-HF und BstXl-WT

Puffer	BstXl-HF		BstXl-WT
Puffer	Aktivität	Fl	Aktivität	Fl	Verbesserungsfaktor
NEB1	50%	≥ 500	6%	4	≥125
NEB2	100%	≥ 1000	100%	32	≥32
NEB3	100%	≥ 1000	100%	2	≥500
NEB4	100%	≥ 1000	100%	32	≥32

Die BstXl-HF wies die beste Aktivität in NEB2, NEB3 und NEB4 auf, der beste Fl von BstXl-HF betrug ≥1000; die WT-BstXl wies die beste Aktivität in NEB2, NEB3 und NEB4 auf. Der Fl von WT-BstXl in NEB2 und NEB4 war 32. Somit war der Gesamt-Verbesserungsfaktor ≥32.
Vergleichsbeispiel 19: Konstruieren von HF-Sfil
Expression von Sfil
Sfil wurde in E. coli exprimiert, der transformiert war mit pRRS-SfilR und pSX33-SfilM, das jeweils das Sfil-Endonuklease- bzw. -Methylase-Gen enthält. Die Zellen wurden bei 30°C über Nacht in LB mit Amp und Kan wachsen gelassen.
Mutagenese von Sfil-HF
Alle Reste Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr wurden zu Ala an den folgenden Positionen verändert 7, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 26, 29, 30, 32, 33, 34, 36, 37, 40, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 55, 56, 58, 59, 63, 66, 67, 69, 71, 72, 73, 76, 79, 81, 82, 84, 87, 88, 89, 90, 91, 94, 95, 100, 102, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 116, 118, 120, 122, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 133, 135, 137, 140, 141, 145, 146, 148, 149, 150, 153, 156, 157, 158, 162, 166, 167, 169, 170, 172, 173, 174, 176, 177, 179, 180, 185, 187, 188, 190, 192, 193, 194, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 205, 207, 208, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 218, 220, 224, 225, 227, 228, 231, 233, 235, 236, 238, 240, 242, 243, 244, 246, 247, 248, 249, 251, 252, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263; Tyr wird zu Phe an den Positionen 31, 60, 68, 80, 164, 165, 175, 182, 195, 222, 239 und 245 verändert.
Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm ER2169 transformiert.
Selektion von Sfil-HF
Die Selektion von Sfil-HF wurde mit Hilfe eines Vergleichs der Aktivität zwischen Mutanten und WT in Wasser mit NEB-Exol-Puffer und BSA unter Verwendung von mit EcoRI-HF vorverdauter pXba-DNA als Substrat bewerkstelligt. Es wurden Mutanten mit ähnlicher oder größerer Aktivität als der Wildtyp ausgewählt, während sie ebenfalls eine Veränderung in der Stern-Aktivität in einem definierten Puffer im Vergleich zu WT zeigten. Von manchen Mutanten wird festgestellt, dass sie mehr Aktivität in NEB4 aufweisen: E007A, D011A, E049A, R073A, R0114A, G137A, S210A und R213A. Nach der Reinigung erwies sich, dass P114A die signifikanteste Verminderung in der Stern-Aktivität aufwies. Sfil(R114A) wird als Sfil-HF bezeichnet.
Ebenfalls bemerkenswert waren die Mutanten, welche die Stern-Aktivität erhöhten: N071A, D079A, H162A, R225A, K227A, Y068F und Y182F. Es wurde früher bemerkt, dass Y068F eine unterschiedliche Spaltung gegenüber dem WT aufweist.
Reinigung von Sfil-HF
Zwei Liter der Zelle ER2169(pRRS-Sfil(R114A), pSX33-SfilM)) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp und 33 µg/ml Kan bei 30°C über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient, und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl-Schritt. Die eluierten Fraktionen wurden dann auf Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden mittels Vivaspin® 15R (Vivascience, heute Sartorius Vivascience GmbH, Göttingen, Deutschland) weiter aufkonzentriert. Das konzentrierte Sfil-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen Glycerol zugesetzt und bei -20°C aufbewahrt.
Vergleich von Sfil-HF und Sfil-WT

Die Fls von Sfil-HF und Sfil-WT sind separat auf pBC4-DNA in vier NEB-Puffern mit Verdünnungsmittel C bestimmt worden. Der Vergleich ist in 11 gezeigt, und das Ergebnis ist in Tabelle 21 (nachstehend) aufgelistet. Tabelle 21: Vergleich von Sfil-HF und Sfil-HF

Puffer	Sfil-HF		Sfil-HF
Puffer	Aktivität	Fl	Aktivität	Fl	Verbesserungsfaktor
NEB1	50%	≥ 250	12,5%	64	≥4
NEB2	12.5%	≥ 1000	100%	250	≥4
NEB3	0,4%	≥ 32	100%	2000	≥1 /64
NEB4	100%	≥ 8000	25%	64	≥125

Sfil-HF zeigte die beste Leistung in NEB4, in welchem der Fl ≥ 8000 war; WT-Sfil zeigte die beste Leistung in NEB3, in welchem der Fl 2000 war. Der Gesamt-Verbesserungsfaktor ist ≥ 8000/2000= ≥ 4.
Vergleichsbeispiel 20: Konstruieren von HF-Pmel
Expression von Pmel
Pmel wurde in E. coli exprimiert, der mit pRRS-PmelR und pACYC184-EsaS9IM transformiert war, welches jeweils das Pmel-Endonuklease- und -Methylase-Gen enthält. Die Zellen wurden bei 37°C über Nacht in LB mit Amp und Cam wachsen gelassen.
Mutagenese von Pmel-HF
Alle Reste Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr wurden zu Ala an den folgenden Positionen verändert 7, 8, 10, 13, 14, 17, 20, 21, 22, 25, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 37, 39, 41, 42, 43, 46, 47, 49, 50, 51, 54, 55, 60, 62, 63, 64, 66, 67, 68, 69, 71, 72, 73, 77, 79, 80, 81, 82, 83, 86, 87, 91, 94, 95, 96, 97, 98, 100, 104, 106, 107, 108, 109, 110, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 121, 123, 124, 127, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 137, 138, 145, 147, 148, 149, 151, 152, 153, 154, 155, 157, 160, 162, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 172, 177, 180, 181, 182, 183, 185, 186, 188, 190, 191, 192, 193, 194, 199, 200, 201, 202, 204, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 215, 218, 219, 221, 222, 223, 225; Tyr wird zu Phe an den Positionen 111, 129, 146 und 161 verändert.
Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm ER2426 transformiert.
Selektion von Pmel-HF
Die Selektion von Pmel-HF erfolgte mit Hilfe des Vergleichens der Aktivität zwischen WT und Mutanten in Wasser-NEB4 unter Verwendung von Lambda-DNA als Substrat mit den gleichen Mutanten in Glycerol mit NEB-Thermopol-Puffer und pXba als einem Substrat. Das Testen von Mutanten- und WT-Pmel in Wasser auf Lambda-DNA gestattet eine Referenz der kognaten Aktivität, und solche mit ähnlicher oder mehr Aktivität als WT in NEB4 wurden ausgewählt. Mutanten mit annehmbarer Aktivität wurden dann abgelehnt, wenn sie keine Änderung in der Stern-Aktivität beim Testen unter Glycerol-Bedingungen mit Thermopol-Puffer und pXba zeigten. Es wurde gezeigt, dass mehrere Mutanten Unterschiede bei der Stern-Aktivität aufweisen: P079A, E086A, H096A und E218A. Pmel(E086A) wird als Pmel-HF bezeichnet.
Reinigung von Pmel-HF
Zwei Liter der Zelle ER2426(pRRS-Pmel(P154A), pACYC184-EsaS9IM)) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp und 33 µg/ml Cam bei 37°C über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15 000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl-Schritt. Die eluierten Fraktionen wurden dann auf Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden mittels Vivaspin® 15R (Vivascience, heute Sartorius Vivascience GmbH, Göttingen, Deutschland) weiter aufkonzentriert. Das konzentrierte Pmel-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen Glycerol zugesetzt und bei -20°C aufbewahrt.
Vergleich von Pmel-HF und Pmel-WT

Die Fls von Pmel-HF und Pmel-WT sind separat auf pXba-DNA in vier NEB-Puffern mit Verdünnungsmittel A bestimmt worden. Das Ergebnis ist in der Tabelle 22 (nachstehend) aufgelistet. Tabelle 22: Vergleich von Pmel-HF und Pmel-WT

Puffer	Pmel-HF		Pmel-WT
Puffer	Aktivität	Fl	Aktivität	Fl	Verbesserungsfaktor
NEB1	12,5%	≥ 2000	100%	250	≥64
NEB2	6,3%	≥ 500	100%	250	≥500
NEB3	0,4%	≥ 32	50%	120	≥125
NEB4	100%	≥ 8000	25%	64	≥500

Pmel-HF zeigte die beste Leistung in NEB4, in welchem der Fl ≥ 8000 war; Pmel-WT zeigte die beste Leistung in NEB1 und NEB2, in welchen der Fl 250 war. Der Gesamt-Verbesserungsfaktor ist ≥ 8000/250= ≥ 16.
Vergleichsbeispiel 21: Konstruieren von HF-Smal
Expression von Smal
Smal wurde in E. coli exprimiert, der mit pRRS-SmaIR und pSYX20-SmalM transformiert war, welches jeweils das Smal-Endonuklease- bzw. -Methylase-Gen enthält. Die Zellen wurden bei 37°C über Nacht in LB mit Amp und Kan wachsen gelassen.
Mutagenese von Smal-HF
Alle Reste Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr wurden zu Ala geändert; alle Tyr wurden zu Phe geändert.
Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm ER2428 transformiert.
Selektion von Smal-HF
Die Selektion von Smal-HF wurde mit Hilfe eines Vergleichs der Aktivität in Wasser-NEB4 unter Verwendung von pXba-DNA als Substrat bei einer Stern-Aktivität hervorrufenden Glycerol-Bedingung mit NEB-Standard-Taq-Puffer bewerkstelligt. Mutanten, welche Änderungen in der Stern-Aktivität im angegebenen Puffer zeigten, während sie eine ähnliche oder hohe kognate Aktivität gegenüber WT beibehielten, wurden ausgewählt. Es wurden einige Mutanten gefunden: E32R, S081A, G132A und eine Doppelmutante F60L/S61R. Smal(F60L/S61 R) wird als Smal-HF bezeichnet.
Reinigung von Smal-HF
Zwei Liter der Zelle ER2428(pRRS-Smal(F60US61R), pSYX20-SmalM)) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp und 33 µg/ml Kan bei 37°C über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1M NaCI-Schritt. Die eluierten Fraktionen wurden dann hinsichtlich Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden mittels Vivaspin® 15R (Vivascience, heute Sartorius Vivascience GmbH, Göttingen, Deutschland) weiter aufkonzentriert. Das konzentrierte Smal-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen Glycerol zugesetzt und bei -20°C aufbewahrt.
Vergleich von Smal-HF und Smal-WT

Die Fls von Smal-HF und WT-Smal sind separat auf pXba-DNA in vier NEB-Puffern mit Verdünnungsmittel A bestimmt worden. Der Vergleich ist in der 12 gezeigt, und das Ergebnis ist in der Tabelle 23 (nachstehend) aufgelistet. Tabelle 23: Vergleich von Smal-HF und Smal-WT

Puffer	Smal-HF		Smal-WT
Puffer	Aktivität	Fl	Aktivität	Fl	Verbesserungsfaktor
NEB1	0,2%	≥ 2000	3%	≥ 16	ND
NEB2	3,2%	≥ 32000	12,5%	≥ 64	ND
NEB3	0,0032%	≥ 32	0,8%	≥ 8	ND
NEB4	100%	≥ 256000	100%	64	≥4000

ND: Nicht bestimmbar

Smal-HF zeigte die beste Leistung in NEB4, in welchem der Fl ≥ 256000 war; Smal-WT zeigte die beste Leistung in NEB2 und NEB4, in welchen der Fl 64 war. Der Gesamt-Verbesserungsfaktor ist ≥ 256000/64= ≥ 4000.
Vergleichsbeispiel 22: Konstruieren von High-Fidelitv-AatII
Expression von Aatll
Aatll wurde in E. coli exprimiert, der mit pRRS-AatIIR und pACYC184-AatIIM transformiert war, welches jeweilig das Aatll-Endonuklease- und -Methylase-Gen enthält. Die Zellen wurden bei 37°C über Nacht in LB mit Amp und Cam wachsen gelassen.
Mutagenese von Aatll-HF
Alle Reste Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr wurden zu Ala an den folgenden Positionen verändert 8, 9, 11, 12, 13, 16, 17, 18, 20, 22, 26, 29, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 40, 43, 45, 46, 49, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 60, 61, 62, 64, 65, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 77, 79, 80, 83, 84, 86, 87, 90, 92, 93, 94, 95, 97, 99, 100, 103, 104, 106, 107, 111, 113, 114, 117, 121, 123, 124, 125, 126, 128, 129, 131, 132, 133, 135, 136, 140, 141, 143, 144, 145, 146, 148, 149, 150, 151, 153, 155, 156, 157, 160, 164, 165, 167, 169, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 179, 181, 182, 186, 189, 191, 192, 193, 194, 196, 198, 200, 201, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 210, 211, 213, 214, 216, 217, 219, 220, 221, 222, 226, 228, 230, 231, 233, 235, 236, 237, 238, 240, 241, 244, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 256, 262, 264, 265, 266, 268, 269, 272, 273, 275, 280, 281, 282, 283, 286, 298, 292, 293, 295, 296, 297, 298, 301, 302, 308, 309, 311, 312, 313, 314, 315, 317, 319, 321, 325, 327, 329, 330, 333, 334, 335, 336; Tyr wurde zu Phe an den Positionen 82, 89, 98, 112, 232, 305 und 306 verändert.
Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm ER2426 transformiert.
Selektion von Aatll-HF
Die Selektion von Aatll-HF erfolgte mit Hilfe des Vergleichs der Aktivität in NEB4 in Wasser zu NEB-Exol-Puffer in Glycerol unter Verwendung von pXba-DNA als Substrat. Mutanten, welche Änderungen in der Stern-Aktivität unter den Glycerol-Bedingungen zeigten, wurden für das weitere Testen ausgewählt, so lange sie ähnliche oder größere Aktivität als WT under normalen Bedingungen in Wasser aufwiesen. Mehrere Mutanten wurden für das weitere Testen nach dem anfänglichen Screenen ausgewählt: G013A, G016A, K018A, P052A, R053A, K070A, E071A, D072A, G073A, S84A, E086A, R090A, K094A, R095A, P099A, P103A, K113A, N135A, S151A, P157A, G173A, T204A, S206A, K207A, E233A, N235A, E237A, S238A, D241A, K295A, S301A und S302A. Aatll(N235A) wird als Aatll-HF bezeichnet.
Reinigung von Aatll-HF
Zwei Liter der Zelle ER2426(pRRS-Aatll(N235A), pACYC184-AatIIM)) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp und 33 µg/ml Cam bei 37°C über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCI-Schritt. Die eluierten Fraktionen wurden dann auf Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden mittels Vivaspin® 15R (Vivascience, heute Sartorius Vivascience GmbH, Göttingen, Deutschland) weiter aufkonzentriert. Das konzentrierte Aatll-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen Glycerol zugesetzt und bei -20°C aufbewahrt.
Vergleich von Aatll-HF und Aatll-WT
Die Fls von Aatll-HF und WT-Aatll sind separat auf pBR322-DNA in vier NEB-Puffern mit Verdünnungsmittel A bestimmt worden. Das Ergebnis ist in der Tabelle 24 (nachstehend) aufgelistet. Tabelle 24: Vergleich von Aatll-HF und Aatll-WT

Puffer Aatll-HF Aatll-WT

Aktivität Fl Aktivität Fl Verbesserungsfaktor

NEB1 NC NC 3% 32 ND

NEB2 NC NC 100% ¼ ND

NEB3 NC NC NC NC ND

NEB4 100% ≥ 1000 50% 16 ≥64

NC: Nicht komplettierbar; ND: Nicht bestimmbar
Aatll-HF zeigte die beste Leistung in NEB4, in welchem der Fl ≥ 1000 war; WT-Aatll zeigte die beste Leistung in NEB2, in welchem der Fl sich auf ¼ belief. Der Gesamt-Verbesserungsfaktor ist ≥ 1000/¼ = ≥ 4000.
Vergleichsbeispiel 23: Konstruieren von HF-Apol
Expression von Apol
Apol wurde in E. coli exprimiert, der transformiert war mit pRRS-ApoIR und pACYC184-ApoIM, welches jeweilig das Apol-Endonuklease- und -Methylase-Gen enthält. Die Zellen wurden bei 37°C über Nacht in LB mit Amp und Cam wachsen gelassen.
Mutagenese von Apol-HF
AII Reste Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gln und Arg wurden zu Ala an den folgenden Positionen verändert 8, 9, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 29, 33, 35, 36, 37, 39, 41, 43, 47, 48, 49, 50, 51, 56, 57, 60, 62, 63, 64, 66, 67, 69, 71, 72, 73, 75, 76, 77, 80, 81, 82, 83, 84, 87, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 102, 103, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 124, 125, 128, 129, 131, 132, 133, 136, 137, 143, 144, 145, 148, 153, 155, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 166, 167, 169, 170, 175, 176, 178, 179, 181, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 192, 193, 194, 195, 199, 201, 202, 204, 206, 207, 209, 210, 214, 216, 217, 218, 221, 226, 227, 229 und 230.
Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm ER2426 transformiert.
Selektion von Apol-HF
Selektion von Apol-HF wurde mit Hilfe eines Vergleichs der Aktivität in NEB3 und NEB4 unter Verwendung von lambda-DNA als Substrat bewerkstelligt. Mutanten mit mehr Aktivität als WT in NEB4 wurden selektiert, da erhöhte Aktivität in NEB4 ein Indikator für verbesserte Genauigkeit ist. Es wurde festgestellt, dass die folgenden Mutanten mehr Aktivität in NEB4 aufweisen: S64A, S80A, S162A, T77A/T96A und N178A. Apol(T77A/T96A) wird als Apol-HF bezeichnet.
Reinigung von Apol-HF
Zwei Liter der Zelle ER2426(pRRS-Apol(T77A/T96A), pACYC184-ApoIM)) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp und 33 µg/ml Cam bei 37°C über Nacht wachsen gelassen, wobei nach 8 Stunden Wachstum mit 0,5 mM ITPG induziert wurde. Die Zellen wurden geerntet und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl-Schritt. Die eluierten Fraktionen wurden dann auf Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden mittels Vivaspin® 15R (Vivascience, heute Sartorius Vivascience GmbH, Göttingen, Deutschland) weiter aufkonzentriert. Das konzentrierte Apol-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen Glycerol zugesetzt und bei -20°C aufbewahrt.
Vergleich von Apol-HF und Apol-WT

Die Fls von Apol-HF und Apol-WT sind separat auf pXba-DNA in vier NEB-Puffern mit Verdünnungsmittel A bestimmt worden. Das Ergebnis ist in der Tabelle 24 (nachstehend) aufgelistet. Tabelle 24: Vergleich von Apol-HF und Apol-WT

Puffer	Apol-HF		Apol-WT
Puffer	Aktivität	Fl	Aktivität	Fl	Verbesserungsfaktor
NEB1	50%	≥ 2000	25%	120	≥16
NEB2	100%	≥ 4000	100%	32	≥125
NEB3	25%	≥ 1000	100%	64	≥16
NEB4	50%	≥ 2000	50%	32	≥64

Apol-HF zeigte die beste Leistung in NEB2, in welchem der Fl ≥ 4000 war; WT-Apol zeigte die beste Leistung in NEB2 und NEB3, in welchen der beste Fl 64 betrug. Der Gesamt-Verbesserungsfaktor ist ≥ 4000/64= ≥ 64.
Vergleichsbeispiel 24: Konstruieren von High-Fideiitv-BsmBl
BsmBl erkennt und verdaut bei CGTCTCN1/N5, wie im Beispiel 23 der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 2009/009797 beschrieben. Eine Mutante BsmBl(R232A) wurde als die Hochgenauigkeitsversion der BsmBl ausgewählt. Die weitere Charakterisierung dieser Mutante enthüllte, dass, obwohl die Leistung von BsmBl(R232A) im Ein-Stunden-Maßstab hervorragend ist, sie keine gute Leistung im Über-Nacht-Verdau aufwies. Während nach mehr Mutanten gesucht wurde, wurde auch von BsmBl(W238A) gefunden, sowohl in der Ein-Stunden- als auch der Über-Nacht-Reaktion hervorragend zu sein, und sie wurde benannt, die BsmBI-HF zu sein (13).
Die BsmBI-HF wurde in ER3081 (pBAD241-BsmBIR(W238A)/pACYC-BsmAIM) exprimiert. Die Wachstums- und Reinigungsverfahren wurden gemäß WO/2009/009797 durchgeführt.
Die folgende Tabelle (Tabelle 26) vergleicht die Fls von BsmBI-HF und BsmBI-WT Tabelle 26: Vergleich von BsmBI-HF und BsmBI-WT

Puffer BsmBI-HF BsmBI-WT

Aktivität Fl Aktivität Fl Verbesserungsfaktor

NEB1 50% 32 12,5% 1 32

NEB2 50% 120 50% 8 25

NEB3 12.5% 250 100% 120 2

NEB4 100% 250 25% 4 64
Die BsmBI-HF besaß die beste Aktivität in NEB4, der Fl von BsmBI-HF in NEB4 war 250; die BsmBI-WT besaß die beste Aktivität in NEB3. Der Fl von WT-BsmBI in NEB2 war 120. Somit war der Gesamt-Verbesserungsfaktor 2.
Vergleichsbeispiel 25: Konstruieren von HF-Bmtl
Expression von Bmtl
Bmtl wurde in E. coli exprimiert, der mit pACYC-BmtIM und placzz1-BmtlR transformiert war. pACYC ist ein kompatibles Niederkopien-Plasmid. Die Zellen wurden bei 37 °C über Nacht in LB mit Amp und Cam wachsen gelassen.
Mutagenese von Bmtl-HF
Die Punktmutagenese der ausgewählten Mutationen wurde durch inverse PCR durchgeführt. 150 Aminosäure-Mutationen wurden in Bmtl wie folgt vorgenommen. Cys, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp wurden zu Ala mutiert. Try wurde zu Phe mutiert. Diese waren: 5, 9, 11, 12, 16, 19, 20, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 39, 45, 46, 49, 50, 51, 53, 56, 58, 59, 60, 63, 65, 69, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 78, 79, 80, 81, 83, 85, 86, 88, 89, 90, 92, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 104, 105, 106, 108, 110, 111, 112, 113, 116, 118, 119, 120, 121, 122, 124, 128, 129, 131, 132, 133, 134, 136, 138, 139, 140, 141, 142, 144, 145, 146, 147, 148, 150, 151, 152, 154, 156, 157, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 168, 169, 171, 172, 173, 175, 178, 179, 180, 181, 185, 186, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 196, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 210, 211, 213, 214, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 226, 228, 229, 230, 231, 234, 236, 237, 238, 239 und 241. Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm 3081 transformiert.
Selektion von Bmtl-HF
Vier Kolonien von jeder Mutation wurden in LB mit Amp und Cam bei 37°C über Nacht heranwachsen gelassen. Die Assays bezüglich der standardmäßigen kognaten und der Stern-Aktivität von Bmtl wurden unter Verwendung von pBC4 in Exol-Puffer und 10% DMSO durchgeführt.
Die Mutanten S50A, Y81F, N93A und W207A wurden in Screening-Assays herausgepickt. Nach mehreren Runden des Vergleichens in verschiedenen Bedingungen und Substraten wurde festgestellt, dass S50A die bevorzugte Mutante ist, die eine hohe kanonische EnzymAktivität beibehält, aber eine erheblich verringerte Stern-Aktivität aufweist. Bmtl(S50A) wurde als Bmtl-HF bezeichnet.
Reinigung von Bmtl-HF
Zwei Liter der Zelle E. coli 3081 (placzz1-BmtlR(S50A), pACYC-BmtIM) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp und 30 µg/ml Cam bei 37°C über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl-Schritt. Die eluierten Fraktionen werden dann hinsichtlich Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden weiter aufkonzentriert. Das konzentrierte Bmtl-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen Glycerol zugesetzt und bei -20°C aufbewahrt.
Vergleich von Bmtl-HF und Bmtl-WT

Bmtl-HF wurde 2-fach seriell mit A verdünnt und auf pXba reagieren gelassen. Das Ergebnis ist in der Tabelle 27 gezeigt. Tabelle 27: Vergleich von Bmtl-HF und Bmtl-WT

Puffer	Bmtl-HF		Bmtl-WT
Puffer	Aktivität	Fl	Aktivität	Fl	Verbesserungs faktor
NEB1	25%	≥256000	50%	32	≥8000
NEB2	25%	≥256000	100%	16	≥16000
NEB3	0,2%	≥ 2000	6,3%	32	≥64
NEB4	100%	≥1000000	100%	16	≥62500

Bmtl-HF zeigte die beste Leistung in NEB4, in welchem der bevorzugte Fl ≥1000000 war; Bmtl-WT zeigte die beste Leistung in NEB2 und NEB4, worin der Fl 16 war. Der insgesamte Fl-Verbesserungsfaktor war ≥1000000/16=≥62500.
Vergleichsbeispiel 26: Konstruieren von HF-BstNI
Expression von BstNI
BstNl wurde in E. coli exprimiert, der mit pBAD241-BstNIR und pACYC184-BstNIM, welches jeweilig das BstNl-Endonuklease- und -Methylase-Gen enthält, transformiert war. Die Zellen wurden bei 37°C über Nacht in LB mit Amp und Cam wachsen gelassen, auf 1/10 mit LB verdünnt und dann durch Arabinose 4 Stunden induziert.
Mutagenese und Selektion von BstNI-HF
Während des Experiments zur Erzeugung einer Serie von Mutationen von BstNl wurde festgestellt, dass BstNI(G26N) weniger Stern-Aktivität als die WT-BstNl besitzt. Zur Suche nach besseren BstNI-Mutanten mit noch geringerer Stern-Aktivität wurde G26 in alle anderen Aminosäuren mutiert. Unter all diesen Mutanten besitzt BstNI(G26T) die geringste Stern-Aktivität und wird als BstNl-HF bezeichnet.
Reinigung von BstNI-HF
Zwei Liter der Zelle ER2833(pBAD241-BstNl(G26T), pACYC184-BstNIM) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp und 33 µg/ml Cam bei 37°C über Nacht wachsen gelassen. Dann wurden die Zellen 1- bis 10-fach mit LB verdünnt und danach durch Arabinose bei einer Endkonzentration von 0,2% 4 Stunden induziert. Die Zellen wurden geerntet und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl-Schritt. Die eluierten Fraktionen werden dann auf Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden mittels Vivaspin® 15R (Vivascience, heute Sartorius Vivascience GmbH, Göttingen, Deutschland) weiter aufkonzentriert. Das konzentrierte BstNl-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen an Glycerol zugesetzt und bei -20°C aufbewahrt.
Vergleich von BstNI-HF und WT-BstNI

Die Fls von BstNI-HF und WT-BstNI sind separat auf pBR322-DNA in vier NEB-Puffern mit Verdünnungsmittel A bestimmt worden. Der Vergleich ist in 14 gezeigt, und das Ergebnis ist in Tabelle 28 (nachstehend) aufgelistet. Tabelle 28: Vergleich von BstNI-HF und BstNI-WT

Puffer	BstNI-HF		BstNI-WT
Puffer	Aktivität	Fl	Aktivität	Fl	Verbesserungsfaktor
NEB1	50%	≥ 120	50%	8	≥16
NEB2	100%	≥ 500	100%	64	8
NEB3	25%	≥ 120	100%	250	≥1/8
NEB4	100%	500	50%	4	≥32

BstNI-HF zeigte die beste Leistung in NEB2 und NEB4, in welchen der beste Fl ≥ 500 war; BstNI-WT zeigte die beste Leistung in NEB2 und NEB3, in welchen der beste Fl 250 war. Somit war der Gesamt-Verbesserungsfaktor ≥ 500/250= ≥ 2.
Vergleichsbeispiel 27: Konstruieren von HF-Mlul
Expression von Mlul
Mlul wurde in E. coli exprimiert, der mit pUC19-MIuIR und pACYC184-MlulM, welches jeweilig das Mlul-Endonuklease- und -Methylase-Gen enthält, transformiert war. Die Zellen wurden bei 30°C über Nacht in LB mit Amp und Cam wachsen gelassen.
Mutagenese von Mlul-HF
Alle Reste Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr wurden zu Ala an den folgenden Positionen verändert 7, 8, 10, 11, 13, 16, 21, 23, 24, 26, 27, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 42, 44, 48, 50, 51, 54, 57, 59, 60, 61, 67, 68, 71, 72, 74, 75, 78, 79, 81, 83, 84, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 95, 97, 99, 101,102, 104, 106, 108, 111, 112, 114, 116, 117, 119, 120, 121, 123, 125, 128, 130, 131, 132, 134, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 144, 145, 146, 148, 152, 154, 155, 156, 157, 159, 161, 163, 165, 166, 170, 172, 173, 174, 176, 177, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 186, 189, 192, 195, 196, 197, 200, 206, 207, 208, 210, 211, 214, 216, 218, 219, 220, 221, 223, 227, 228, 230, 232, 233, 234, 236, 237, 238, 240, 243, 244, 247, 249, 255, 256, 257, 258, 261, 263, 264, 265, 266, 269; Tyr wurde zu Phe an den Positionen 14, 28, 47, 53, 77, 107, 175, 198, 217, 239 und 248 verändert.
Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm ER1582 transformiert.
Selektion von Mlul-HF
Die Selektion von Mlul-HF wurde mit Hilfe eines Vergleichs der Aktivität in NEB3 und NEB4 unter Verwendung von lambda-DNA als Substrat bewerkstelligt. Mutanten mit mehr Aktivität als WT in NEB4 wurden selektiert, da erhöhte Aktivität in NEB4 ein Indikator von verbesserter Genauigkeit ist. Die einzige Mutante, von der gefunden wurde, unsere Kriterien zu erfüllen, war E112A/R132A; Mlul(E112A/R132A) wird als Mlul-HF bezeichnet.
Reinigung von Mlul-HF
Zwei Liter der Zelle ER1582(pUC19-Mlul(E112A/R132A), pACYC184-MluIM)) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp und 33 µg/ml Cam bei 30°C über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl-Schritt. Die eluierten Fraktionen wurden dann auf Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden mittels Vivaspin® 15R (Vivascience, heute Sartorius Vivascience GmbH, Göttingen, Deutschland) weiter aufkonzentriert. Das konzentrierte Mlul-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen Glycerol zugesetzt und bei -20°C aufbewahrt.
Vergleich von Mlul-HF und Mlul-WT

Die Fls von Mlul-HF und WT-Mlul sind separat auf lambda-DNA in vier NEB-Puffern mit Verdünnungsmittel A bestimmt worden. Der Vergleich ist in 15 gezeigt, und das Ergebnis ist in der Tabelle 29 (nachstehend) aufgelistet. Tabelle 29: Vergleich von Mlul-HF und Mlul-WT

Puffer	Mlul-HF		Mlul-WT
Puffer	Aktivität	Fl	Aktivität	Fl	Verbesserungsfaktor
NEB1	50%	≥ 16000	25%	500	≥32
NEB2	100%	≥ 32000	6,3%	16	≥200
NEB3	6,3%	≥ 2000	100%	2000	≥1
NEB4	100%	≥ 32000	25%	32	≥ 1000

Mlul-HF zeigte die beste Leistung in NEB2 und NEB4, in welchem der Fl ≥ 32000 war; Mlul-WT zeigte die beste Leistung in NEB3, in welchem der Fl 2000 war. Der Gesamt-Verbesserungsfaktor ist ≥ 32000/2000= ≥ 16.
Vergleichsbeispiel 28: Konstruieren von HF-Banl
Expression von Banl
Banl wurde in E. coli exprimiert, der transformiert war mit pUC19-BanIR und pACYC184-BanIM, welches jeweilig das Banl-Endonuklease- und -Methylase-Gen enthält. Die Zellen wurden bei 37°C über Nacht in LB mit Amp und Cam wachsen gelassen.
Mutagenese von Banl-HF
Alle Reste Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr wurden zu Ala an den folgenden Positionen verändert 7, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 16, 19, 22, 23, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 42, 43, 47, 50, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 61, 64, 66, 67, 69, 70, 71, 75, 76, 81, 82, 84, 85, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 100, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 117, 121, 122, 123, 124, 126, 130, 131, 133, 135, 136, 138, 139, 140, 141, 143, 145, 146, 148, 150, 151, 152, 154, 156, 157, 160, 161, 169, 171, 174, 175, 176, 178, 179, 182, 183, 185, 187, 188, 191, 192, 193, 194, 195, 197, 198, 201, 202, 203, 208, 209, 211, 212, 213, 215, 217, 218, 220, 221, 224, 225, 226, 229, 232, 233, 234, 236, 237, 238, 240, 242, 243, 244, 245, 246, 248, 249, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 259, 260, 262, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 275, 277, 279, 281, 282, 283, 284, 285, 287, 288, 289, 291, 292, 294, 296, 298, 301, 302, 303, 304, 305, 312, 313, 315, 316, 318, 319, 320, 321, 324, 325, 328, 329, 330, 331, 333, 337, 338, 339, 340, 342, 346; Tyr wurde zu Phe an den Positionen 104, 125, 127, 156, 159, 204, 239, 297, 306 und 336 verändert.
Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm ER2683 transformiert.
Selektion von Banl-HF
Die Selektion von Banl-HF erfolgte mit Hilfe eines Vergleichs der Aktivität in Wasser und NEB4 gegenüber Glycerol und NEB-Exol-Puffer unter Verwendung von lambda-DNA als Substrat. Mutanten mit so viel oder mehr Aktivität als der WT in NEB4 wurden selektiert, wenn sie auch eine Veränderung in der Stern-Aktivität beim Testen unter Glycerol-Bedingungen zeigten. Ein anderer Indikator, der beim Selektieren dieser Mutanten verwendet wurde, war die Tatsache, dass das Entfernen der Stern-Aktivität eine langsame Stelle bei der kognaten Spaltung erschafft. Von zahlreichen Mutanten wurde gefunden, dass sie Änderungen in der Stern-Aktivität und die resultierende Langsam-Stelle aufweisen: N016A, S33A, P36A, H76A, P87A, N89A, R90A, T138A, K141A, K143A, Q221A, Q224A, N253A, Q292A, R296A, T152I, G326A und T324A. Banl(Q292A) wird als Banl-HF bezeichnet.
Reinigung von Banl-HF
Zwei Liter der Zelle ER2683(pUC19-Banl(P154A), pACYC184-BanIM)) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp und 33 µg/ml Cam bei 37°C über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl-Schritt. Die eluierten Fraktionen wurden dann auf Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden mittels Vivaspin® 15R (Vivascience, heute Sartorius Vivascience GmbH, Göttingen, Deutschland) weiter aufkonzentriert. Das konzentrierte Banl-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen Glycerol zugesetzt und bei -20°C aufbewahrt.
Vergleich von Banl-HF und Banl-WT

Die Fls von Banl-HF und WT-Banl sind separat auf lambda-DNA in vier NEB-Puffern mit Verdünnungsmittel A bestimmt worden. Das Ergebnis ist in Tabelle 30 (nachstehend) aufgelistet. Tabelle 30: Vergleich von Banl-HF und Banl-WT

Puffer	Banl-HF		Banl-WT
Puffer	Aktivität	Fl	Aktivität	Fl	Verbesserungsfaktor
NEB1	50%	≥ 1000	25%	4	≥250
NEB2	12,5%	≥ 250	25%	4	≥63
NEB3	0,4%	≥8	6,3%	2	≥4
NEB4	100%	≥ 2000	100%	16	≥125

Banl-HF zeigte die beste Leistung in NEB4, in welchem der Fl ≥ 2000 war; WT-Banl zeigte ebenfalls die beste Leistung in NEB4, aber der Fl betrug nur 16. Der Gesamt-Verbesserungsfaktor ist ≥ 2000/16= ≥ 125.
Vergleichsbeispiel 29: Konstruieren von HF-Kasl
Expression von Kasl
Kasl wurde in E. coli exprimiert, der transformiert war mit placZZ-KasIR und pACY-SfoIM, welcher jeweils das Kasl-Endonuklease- und -Methylase-Gen enthält. Die Zellen wurden bei 30°C über Nacht in LB mit Amp und Cam wachsen gelassen.
Mutagenese von Kasl-HF
Alle Reste Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr wurden zu Ala an den folgenden Positionen verändert 7, 8, 9, 11, 13, 14, 17, 18, 21, 24, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 34, 36, 37, 39, 42, 43, 44, 47, 48, 51, 52, 54, 55, 56, 58, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 69, 70, 73, 76, 77, 78, 79, 83, 85, 86, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 98, 100, 101, 102, 103, 104, 108, 110, 111, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 122, 123, 124, 125, 126, 128, 129, 134, 137, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 145, 146, 149, 150, 152, 153, 154, 156, 158, 161, 162, 163, 164, 165, 167, 168, 173, 177, 178, 180, 181, 182\, 184, 185, 188, 189, 190, 191, 192, 195, 197, 198, 200, 202, 203, 204, 210, 211, 212, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 225, 226, 228, 229, 231, 234, 237, 238, 241, 243, 244, 245, 246, 248, 251, 253, 255, 257, 258, 259, 260, 261, 263, 264, 265, 266, 269, 270, 271, 274, 275, 276, 277 und 278; Tyr wurde zu Phe an den Positionen 19, 41, 74, 80, 95, 207 und 256 verändert.
Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm ER2683 transformiert.
Selektion von Kasl-HF
Die Selektion von Kasl-HF wurde mit Hilfe eines Vergleichs der Aktivität in NEB3 und NEB4 unter Verwendung von pBR322-DNA als Substrat bewerkstelligt. Mutanten mit mehr Aktivität als WT in NEB4 wurden selektiert, da eine erhöhte Aktivität in NEB4 ein Indikator von verbesserter Genauigkeit ist. Von den folgenden Mutanten wurde gefunden, mehr Aktivität in NEB4 aufzuweisen: K024A, P214A, E146A, N251A und Y095F. Kasl(N251A) wird als Kasl-HF bezeichnet.
Reinigung von Kasl-HF
Zwei Liter der Zelle ER2683(pLacZZ-Kasl(M251A), pACYC-SfoIM)) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp und 33 µg/ml Cam bei 30°C über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin-HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl-Schritt. Die eluierten Fraktionen wurden dann hinsichtlich Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden mittels Vivaspin® 15R (Vivascience, heute Sartorius Vivascience GmbH, Göttingen, Deutschland) weiter aufkonzentriert. Die konzentrierte Kasl-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen Glycerol zugesetzt und bei -20°C aufbewahrt.
Vergleich von Kasl-HF und Kasl-WT

Die Fls von Kasl-HF und Kasl-WT sind separat auf pBR322-DNA in vier NEB-Puffern mit Verdünnungsmittel B bestimmt worden. Das Ergebnis ist in der Tabelle 31 (nachstehend) aufgelistet. Tabelle 31: Vergleich von Kasl-HF und Kasl-WT

Puffer	Kasl-HF		Kasl-WT
Puffer	Aktivität	Fl	Aktivität	Fl	Verbesserungsfaktor
NEB1	50%	≥ 8000	100%	1	≥8000
NEB2	100%	≥ 16000	100%	8	≥2000
NEB3	12,5%	≥ 2000	100%	8	≥250
NEB4	100%	≥ 16000	100%	4	≥4000

Kasl-HF zeigte die beste Leistung in NEB2 und NEB4, in welchen der Fl ≥ 16000 ist; Kasl-WT zeigte die gleiche Leistung in allen Puffern, in welchen der beste Fl 8 beträgt. Der Gesamt-Verbesserungsfaktor ist ≥ 16000/8= ≥ 2000.
Vergleichsbeispiel 30: Konstruieren von HF-Nrul
Expression von Nrul
Nrul wurde in E. coli exprimiert, der mit pUC19-NruIR und pACYC-Sbo131M, welches jeweilig das Nrul-Endonuklease- und -Methylase-Gen enthält, transformiert war. Die Zellen wurden bei 37°C über Nacht in LB mit Amp und Cam wachsen gelassen.
Mutagenese von Nrul-HF
Alle Reste Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr wurden zu Ala an den folgenden Positionen verändert 8, 10, 12, 13, 15, 16, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 26, 30, 34, 36, 38, 39, 44, 45, 46, 47, 49, 50, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 68, 70, 71, 72, 73, 75, 77, 79, 80, 82, 83, 84, 85, 87, 89, 90, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 99, 101, 103, 104, 106, 107, 112, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 124, 125, 127, 132, 134, 137, 138, 139, 141, 146, 147, 148, 149, 152, 154, 155, 157, 158, 159, 162, 163, 165, 166, 168, 169, 170, 171, 174, 175, 177, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 189, 190, 191, 193, 196, 197, 200, 201, 202, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 211 und 213; Tyr wurde zu Phe an the Positionen 11, 31, 52, 69, 98, 64 und 187 verändert.
Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm ER2683 transformiert.
Selektion von Nrul-HF
Die Selektion von Nrul-HF wurde mit Hilfe eines Vergleichs der Aktivität in NEB3 und NEB4 unter Verwendung von dam- lambda-DNA als Substrat bewerkstelligt. Mutanten mit mehr Aktivität als WT in NEB4 wurden selektiert, da erhöhte Aktivität in NEB4 ein Indikator für verbesserte Genauigkeit ist. Es wurde festgestellt, dass die folgenden Mutanten mehr Aktivität in NEB4 aufweisen: G075A, Q099A, G155A und P022A/R90A. P154A Nrul(P022A/R90A) wird als Nrul-HF bezeichnet.
Reinigung von Nrul-HF
Zwei Liter der Zelle ER2683(pUC19-Nrul(P022AR90A), pACYC184-Sbo131M) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp und 33 µg/ml Cam bei 37°C über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl-Schritt. Die eluierten Fraktionen wurden dann auf Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden mittels Vivaspin® 15R (Vivascience, heute Sartorius Vivascience GmbH, Göttingen, Deutschland) weiter aufkonzentriert. Das konzentrierte Nrul-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen Glycerol zugesetzt und bei -20°C aufbewahrt.
Vergleich von Nrul-HF und Nrul-WT

Die Fls von Nrul-HF und Nrul-WT sind separat auf dam- Lambda-DNA in vier NEB-Puffern mit Verdünnungsmittel A bestimmt worden. Das Ergebnis ist in der Tabelle 32 (nachstehend) aufgelistet. Tabelle 32: Vergleich von Nrul-HF und Nrul-WT

Puffer	Nrul-HF		Nrul-WT
Puffer	Aktivität	Fl	Aktivität	Fl	Verbesserungsfaktor
NEB1	0.4%	≥ 64	12,5%	64	≥1
NEB2	6,3%	≥ 1000	50%	250	≥4
NEB3	6,3%	≥ 1000	100%	500	≥2
NEB4	100%	≥ 16000	12,5%	32	≥32

Nrul-HF zeigte die beste Leistung in NEB4, in welchem der Fl ≥ 16000 war; Nrul-WT zeigte die beste Leistung in NEB3, in welchem der Fl 500 betrug. Der Gesamt-Verbesserungsfaktor ist ≥ 16000/500= ≥ 32.
Vergleichsbeispiel 31: Konstruieren von High-Fidelity-Nspl
Expression von Nspl
Nspl wurde in E. coli exprimiert, das mit pUC19-NspIR und pACYC-FatIM transformiert war, welcher jeweilig das Nspl-Endonuklease- und -Methylase-Gen enthält. Die Zellen wurden bei 37°C über Nacht in LB mit Amp und Cam wachsen gelassen.
Mutagenese von Nspl-HF
Alle Reste Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr wurden zu Ala an den folgenden Positionen verändert 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 26, 29, 30, 31, 32, 34, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 46, 47, 50, 51, 52, 53, 55, 56, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 70, 71, 72, 73, 74, 77, 78, 80, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 96, 97, 99, 100, 102, 104, 107, 108, 111, 114, 116, 117, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 132, 133, 134, 136, 138, 139, 141, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 150, 152, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 175, 176, 177, 178, 180, 181, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 191, 193, 195, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 206, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 215, 216, 217, 220, 222, 225, 227, 230, 231, 234, 235, 236 und 238; Tyr wurde zu Phe an the Positionen 48, 75, 113, 115, 198 und 224 verändert.
Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm ER2566 transformiert.
Selektion von Nspl-HF
Die Selektion von Nspl-HF wurde mit Hilfe eines Vergleichs der Aktivität in NEB3 und NEB4 unter Verwendung von pBR322-DNA als Substrat bewerkstelligt. Mutanten mit mehr Aktivität als WT in NEB4 wurden selektiert, da eine erhöhte Aktivität in NEB4 ein Indikator für verbesserte Genauigkeit ist. Es wurde festgestellt, dass die folgenden Mutanten mehr Aktivität in NEB4 aufweisen: S097A und E125A. Nspl(S097A) wird als Nspl-HF bezeichnet.
Reinigung von Nspl-HF
Zwei Liter der Zelle ER2566(pUC19-Nspl(S097A), pACYC-FatIM)) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp und 33 µg/ml Cam bei 37°C über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1M NaCI-Schritt. Die eluierten Fraktionen wurden dann hinsichtlich Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden mittels Vivaspin® 15R (Vivascience, heute Sartorius Vivascience GmbH, Göttingen, Deutschland) weiter aufkonzentriert. Das konzentrierte Nspl-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen Glycerol zugesetzt und bei -20°C aufbewahrt.
Vergleich von Nspl-HF und Nspl-WT

Die Fls von Nspl-HF und Nspl-WT sind separat auf pUC19-DNA in vier NEB-Puffern mit Verdünnungsmittel A mit BSA bestimmt worden. Der Vergleich ist in 16 gezeigt, und das Ergebnis ist in der Tabelle 33 (nachstehend) aufgelistet. Tabelle 33: Vergleich von Nspl-HF und Nspl-WT

Puffer	Nspl-HF		Nspl-WT
Puffer	Aktivität	Fl	Aktivität	Fl	Verbesserungsfaktor
NEB1	100%	≥ 4000	100%	250	≥16
NEB2	100%	≥ 500	100%	16	≥32
NEB3	12,5%	≥ 250	25%	120	≥50
NEB4	100%	500	50%	32	≥16

Nspl-HF zeigte die beste Leistung in NEB1 und NEB4, in welchen der beste Fl ≥ 4000 war; WT-Nspl zeigte die beste Leistung in NEB1 und NEB2, in welchen der beste Fl 250 war. Der Gesamt-Verbesserungsfaktor ist ≥ 4000/250= ≥ 16.
Vergleichsbeispiel 32: Konstruieren von HF-BsrFl
Expression von BsrFl
BsrFl wurde in E. coli exprimiert, der transformiert war mit pBAD-BsrFIR und pSYX33-HpallM, welches jeweilig das BsrFl-Endonuklease- und -Methylase-Gen enthält. Die Zellen wurden bei 37°C über Nacht in LB mit Amp und Kan mit Arabinose-Induktion wachsen gelassen.
Mutagenese von BsrFI-HF
Alle Reste Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr wurden zu Ala an den folgenden Positionen verändert 7, 8, 9, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 25, 26, 28, 32, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 46, 48, 49, 51, 52, 56, 59, 61, 62, 64, 65, 66, 68, 72, 73, 74,75, 76, 77, 80, 86, 87, 89, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 103, 105, 106, 108, 109, 111, 113, 114, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 126, 128, 129, 130, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 142, 143, 144, 145, 146, 151, 152, 153, 154, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 168, 169, 170, 171, 173, 174, 177, 180, 181, 183, 184, 185, 187, 189, 190, 194, 196, 198, 199, 200, 202, 203, 204, 205, 206, 208, 211, 212, 213, 214, 217, 218, 222, 224, 226, 229, 230, 231, 233, 235, 238, 240, 241, 242, 243, 245, 246, 248, 249, 250, 253, 254, 257, 258, 259, 262, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 272, 273, 276, 278, 279, 281, 282, 284 und 285; Tyr wird zu Phe an den Positionen 14, 34, 53, 90, 96, 99, 125, 160, 227, 236, 237 verändert.
Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm ER2566 transformiert.
Selektion von BsrFI-HF
Die Selektion von BsrFI-HF wurde mit Hilfe eines Vergleichs der Aktivität in NEB3 und NEB4 unter Verwendung von pBR322-DNA als Substrat bewerkstelligt. Mutanten mit mehr Aktivität als WT in NEB4 wurden selektiert, da erhöhte Aktivität in NEB4 ein Indikator für verbesserte Genauigkeit ist. Es wurde festgestellt, dass die folgenden Mutanten mehr Aktivität in NEB4 aufweisen: K021A/1031R und T120A. BsrFl(K021A/l031R) wird als BsrFI-HF bezeichnet.
Reinigung von BsrFI-HF
Zwei Liter der Zelle ER2566(pBAD-BsrFl(K021A/l031R), pSYX33-HpallM) wurden in LB mit 100 µg/ml Amp und 33 µg/ml Kan bei 37°C über Nacht mit 0,2% Arabinose-Induktion nach 8 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl schallbehandelt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 15000 U/min wurde der Überstand durch Spritzeninjektion auf die 5 ml große HiTrap™-Heparin HP-Säule (GE Healthcare, heute Pfizer, Inc., Piscataway, NJ), die mittels desselben Puffers vorbalanciert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann auf dem System durch die folgende Prozedur beladen: 48 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, linearer 50mM-1M NaCl-Gradient und anschließend ein 10 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl-Schritt. Die eluierten Fraktionen wurden dann auf Aktivität getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden mittels Vivaspin® 15R (Vivascience, heute Sartorius Vivascience GmbH, Göttingen, Deutschland) weiter aufkonzentriert. Das konzentrierte BsrFl-HF wurde dann zu einem gleichen Volumen Glycerol zugesetzt und bei - 20°C aufbewahrt.
Vergleich von BsrFI-HF und WT-BsrFl

Die Fls von BsrFI-HF und BsrFI-WT sind separat auf pBR322-DNA in vier NEB-Puffern mit Verdünnungsmittel A bestimmt worden. Der Vergleich ist in 17 gezeigt, und das Ergebnis ist in Tabelle 35 (nachstehend) aufgelistet. Tabelle 35: Vergleich von BsrFI-HF und BsrFI-WT

Puffer	BsrFI-HF		BsrFI-WT
Puffer	Aktivität	Fl	Aktivität	Fl	Verbesserungsfaktor
NEB1	100%	≥ 500	25%	16	≥32
NEB2	12,5%	≥ 64	100%	4	≥500
NEB3	NC	NC	3,1%	8	≥-8
NEB4	100%	≥ 500	50%	16	≥32

BsrFI-HF zeigte die beste Leistung in NEB1 und NEB4, in welchen der Fl ≥ 500 war; BsrFI-WT zeigte die beste Leistung in NEB2, in welchem der Fl 4 war. Der Gesamt-Verbesserungsfaktor is ≥ 500/4= ≥ 120.
Vergleichsbeispiel 33: Konstruieren von HF-BspEI
Expression von BspEI (SEQ ID Nr. 34)
BspEI wurde in E. coli exprimiert, der mit pLazz1-BspEIR und pACYC184-BspEIM transformiert war, welche jeweilig das BspEl-Endonuklease- bzw. -Methylase-Gen enthalten. Die Zellen wurden bei 37°C über Nacht in LB mit Amp und Cam wachsen gelassen.
Mutagenese von BspEI-HF
Alle Reste Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr wurden zu Ala an den folgenden Positionen verändert 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 27, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 48, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 66, 67, 68, 71, 72, 73, 74, 75, 78, 79, 81, 82, 84, 85, 88, 89, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 101, 102, 103, 106, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 121, 122, 124, 126, 127, 128, 129, 132, 133, 135, 136, 137, 138, 140, 141, 148, 149, 151, 153, 155, 156, 157, 160, 162, 164, 166, 167, 168, 169, 172, 174, 175, 176, 177, 178, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 189, 192, 193, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 203, 204, 208, 209, 212, 213, 214, 216, 217, 218, 219, 221, 222, 228, 229, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 242, 244, 245, 246, 250, 251, 253, 254, 255, 256, 258, 260, 261, 263, 264, 266, 267, 269, 270, 271, 272, 273, 275, 276, 277, 281, 282, 283, 285, 286, 288, 289, 293, 294.
Bei den Mutagenese-Verfahren handelte es sich um inverse PCR mit gepaarten Primern, gefolgt von Dpnl-Verdau. Das behandelte Produkt wurde dann in den E. coli-Stamm ER3081 transformiert.
Selektion von BspEI-HF
Die Selektion von BspEI-HF erfolgte mit Hilfe eines Vergleichs der Aktivität in NEB3 und NEB4 unter Verwendung von unmethylierter lambda (λ^-)-DNA als Substrat. WT-BspEI besitzt mehr Aktivität in NEB3, wobei diejenige mit mehr Aktivität in NEB4 selektiert wurden. Es wird bei 6 Mutanten festgestellt, dass sie mehr Aktivität in NEB4 aufweisen: K7A, T10A, N11A, N14A, Q232A und T199A. T199A weist eine wesentlich höhere Aktivität als WT in NEB4 auf. BspEl(T199A) wird als BspEI-HF bezeichnet.
Vergleichsbeispiel 34: Konstruieren von High-Fidelity-BamHI (zusätzliche Mutanten)
BamHI (SEQ ID Nr. 35) erkennt und verdaut bei G/GATCC, wie im Beispiel 1 der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 2009/009797 beschrieben. Eine Mutante BamHI(E163A/E167T) wurde als die Hochgenauigkeitsversion der BamHI ausgewählt.
Eine vollständige Mutations-Abdeckung wurde bei BamHI vorgenommen. Neben den Resten, die in den früheren Patenten und Anmeldungen berichtet worden sind, wurde der Rest von den Resten ebenfalls zu Ala an den Positionen 3, 7, 8, 15, 16, 21, 22, 23, 24, 27, 29, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 45, 47, 48, 49, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 63, 64, 67, 68, 73, 74, 79, 80, 82, 83, 85, 90, 91, 92, 93, 95, 99, 100, 102, 105, 108, 109, 110, 112, 115, 116, 117, 124, 125, 127, 128, 129, 130, 131, 134, 136, 138, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 147, 148, 151, 152, 156, 158, 159, 162, 164, 166, 168, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 185, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 194, 197, 198, 203, 206, 210 und 212 mutiert.
Unter diesen Mutanten besitzen P92A, P144A, G197A und M198A eine höhere Genauigkeit als das Wildtyp-BamHI. P92A kann eine alternative Hochgenauigkeits-BamHI sein.

Claims

Zusammensetzung, umfassend: ein Enzym, das die SEQ ID Nr. 2 umfasst, worin eine oder mehrere Aminosäure(n) mutiert worden sind, wobei die Position einer Mutation Q148 und die Aminosäuremutation Q1481 ist.
Enzym wie in Anspruch 1 definiert.
Nukleinsäuremolekül, das das Enzym nach Anspruch 2 codiert.
Vektor umfassend das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 3.
Wirtszelle umfassend das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 3 oder den Vektor nach Anspruch 4, wobei humane embryonale Stammzellen, bei deren Gewinnung Embryonen zerstört wurden, ausgeschlossen sind.