DE60110893T2

DE60110893T2 - Kabeljau-spezifische urazil-dna glykosilase, dafür kodierendes gen, selbiges gen beinhaltende, rekombinante dna oder operative teile davon, ein verfahren zur herstellung des proteins und die anwendung des proteins oder der operativen teile zur überwachung und kontrolle der pcr

Info

Publication number: DE60110893T2
Application number: DE60110893T
Authority: DE
Inventors: Olav Lanes; Peder Nils WILLASEN; Henrik Per GUDDAL; Rune Dag GJELLESVIK
Original assignee: Biotec Pharmacon ASA
Current assignee: Arcticzymes Technologies ASA
Priority date: 2000-01-12
Filing date: 2001-01-10
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2021-01-11
Also published as: EP1246908A1; NO314091B1; US7037703B2; DE60110893D1; JP2003519490A; AU784783B2; NO20005428D0; US20020155573A1; EP1246908B1; ATE295878T1; AU2559601A; NO20005428L; WO2001051623A1; JP4808352B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Enzym, das in der Kabefjauleber vorliegt, eine DNA-Sequenz, die das Enzym oder operative oder biologisch aktive Teile davon kodiert, eine neue rekombinante DNA, die das Gen oder die operativen Teile davon umfasst, ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms aus der Kabefjauleber und aus Bakterien, die das Gen tragen, wobei die Bakterien das Gen an sich tragen, und die Verwendung des Proteins zur Überwachung und/oder Kontrolle der PCR oder verwandter Reaktionssysteme.
Beschreibung des Stands der Technik
Uracil in der DNA kann das Ergebnis des Einbaus von dUTP anstelle von dTTP während der Replikation oder der Desaminierung von Cytosin in der DNA sein. Letzteres hat im Ergebnis eine Mutation im nächsten Durchlauf der Replikation. Das Enzym Urazil-DNA-Glykosilase (UDG, EC 3.2.2.3) arbeitet als Reparaturenzym für solche Schäden der DNA, indem die Urazilbase aus dem DNA-Grundgerüst herausgeschnitten wird (Lindahl 1994), wobei eine apyrimidinische Stelle erzeugt wird, welche durch andere DNA-Reparaturenzyme erkannt wird. Dieses Enzym ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Integrität der DNA, und ist deshalb in einer Vielzahl von Organismen gefunden worden; Virus, Prokaryoten und Eukaryoten.
Die Urazil-DNA-Glykosilase (UNG oder UDG) katalysiert die Hydrolyse der N-glykosidischen Bindung zwischen dem Desoxyribosezucker und der Base in der Urazil enthaltenden DNA und wurde zuerst aus Escherichia Coli (1) isoliert und charakterisiert. Dieses ist der erste Schritt im Basenexcisionsreparatur- (BER-) Weg des Entfernens des Urazils aus der DNA (2), und die erzeugte apyrimidinische Stelle wird danach durch eine AP-Endonuclease, Phosphodiesterase, DNA-Polymerase und DNA-Ligase (andere Enzyme) im BER-Weg (3–5) repariert.
Mehrere Arten von Urazil-DNA-Glykosilasen (UDG) sind beschrieben worden. Die hauptsächliche zelluläre Form von UNG ist UNG, die durch das UNG-Gen (6) kodiert wird. Andere Arten umfassen cyclin-ähnliche menschliche UDG2 (7, 8), Einzelstrang selektive monofunktionelle UDG SMUG1 des Menschen und Xenopus (9), G/T:U-spezifische DNA-Fehlpaarungs-Glykosilase (MUG), isoliert aus E. Coli (10, 11) und Thermotoga maritima UDG (TMUDG) (12).
UNG ist ein monomeres Protein, das etwa 25–35 kDa groß ist. Es ist von keinen Cofaktoren oder zweiwertigen Kationen abhängig und ist unter verschiedener Spezies (13) hochkonserviert. UNG wird jedoch durch die Ionenstärke beeinflusst. Es ist gezeigt worden, dass das UNG-Enzym in einem prozessiven „Gleitmechanismus", wo es vor der Dissoziation von der DNA (14, 15) aufeinanderfolgende Urazil-Reste lokalisiert, und einem distributiven „Zufallsschlag"-Mechanismus (16) wirkt. UNG ist zuvor aus Rattenleber (17–19), menschlichen Zellen und Geweben (20–28), Kalbsthymus (29, 30), Schleimpilz (Dictyostelium discoideum) (31), Hefe (32), Pflanzen (33, 34), Salzwasserkrebs (Artemia Salina) (35), Prokaryoten (1,36–45) und Viren (46, 47) isoliert und charakterisiert worden.
Aus Mensch und Ratte sind sowohl Mitochondrien- als auch Kern-UNG isoliert worden (18, 25). In Menschen- (und Maus) Zellen sind diese beiden durch dasselbe Gen (UNG) kodiert (48, 49). Durch zwei verschiedene Transskriptionsstartstellen und alternatives Spleißen werden zwei Formen erzeugt, welche sich nur in der N-terminalen Signalsequenz unterscheiden, welches das Enzym auf den Kern (UNG2) beziehungsweise die Mitochondrien (UNG1) zielrichtet (49). Vor kurzem sind mehrere Studien durchgeführt worden, um die N-terminale Signalsequenz und das Zielrichten von UNG auf den Kern und die Mitochondrien (50–52) weiter zu studieren, wobei sich zeigen ließ, dass die Kern-UNG2 phosphoryliert ist (26). Die Kristallstrukturen von UNG vom Menschen, Herpes-simplex-Virus und von E. Coli sind gelöst worden (53–55). Die Reste der aktiven Stelle sind konserviert und die Wirkungsweise in diesen Enzymen scheint dieselbe zu sein wie der Nukleotidflippingmechanismus zum Entfernen von Urazil aus der DNA (56, 57).
Enzyme von Kälte angepassten Organismen, wie dem atlantischen Kabeljau (Gadus morhua), müssen die Verringerung der chemischen Reaktionsgeschwindigkeiten bei niedrigen Temperaturen kompensieren, um ausreichende metabolische Aktivitäten aufrechtzuerhalten. Dieses kann durch höhere Transkriptions/Translationsspiegel oder verbesserte katalytische Wirksamkeit (k_cat/K_M) getan werden. Höhere katalytische Wirksamkeiten können durch eine flexiblere Struktur als bei ihren mesophilen Gegenstücken erreicht werden, welche eine gesteigerte Fähigkeit bereitstellt, Konformationsänderungen während der Katalyse durchzumachen. Die verringerte Stabilität gegenüber pH-Wert, Temperatur und Denaturierungsmitteln wird als Folge der Konformationsflexibilität betrachtet (58).
Die vorliegende Erfindung betrifft die Reinigung und Charakterisierung einer hitzelabilen Urazil-DNA-Glykosilase aus einem Kälte-angepassten Organismus, und welche Verwendung als Enzym aufweist, das bei der Verhinderung von Verschleppungen (Carry-over-Verhinderung) in DNA-kopierenden Reaktionen wirksam ist (PCR, LCR usw.). Das isolierte Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung weist ähnliche Eigenschaften auf wie die vorher beschriebenen UNGs hinsichtlich Molekulargewicht, isoelektrischem Punkt, pH-Wert und NaCl-Optimum. Es ist jedoch gezeigt worden, dass das Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung pH-labiler und hitzelabiler ist und eine höhere relative Aktivität bei niedrigen Temperaturen aufweist als eine rekombinante mesophile menschliche UNG, was es zu einem besseren Kandidaten bei Tests auf Carry-over-Verhinderung macht, wie vorstehend angezeigt.
UNG (oder UDG) von Escherichia Coli ist zur Verwendung in der Carry-over-Verhinderung im Handel erhältlich, wenn DNA-Material amplifiziert wird.
Verschiedene Verfahren können verwendet werden, um spezifische DNA-Sequenzen auf Grundlage einer DNA-Matrize zu amplifizieren. Gewöhnliche Verfahren sind das System der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (US-Patente Nr. 4.683.195; 4.683.202; und 4.965.188), das Ligase-Amplifikationssystem (PCT-Offenlegungsschrift Nr. 89/09835), das sich selbsterhaltende Sequenzreplikationssystem (EP-Nr. 329.822 und PCT-Offenlegungsschrift Nr. 90/06995), das transkriptionsbasierte Amplifikationssystem (PCT-Offenlegungsschrift Nr. 89/01050 und EP-Nr. 310.229) und das Qâ-RNA-Replikasesystem (US-Patent Nr. 4.957.858). Diese Verfahren sind dadurch sehr empfindlich, dass sie nachweisbare DNA-Mengen aus sehr wenigen Kopien einer Ziel-DNA-Sequenz erzeugen können. Demgemäß sind die Verfahren sehr empfindlich gegenüber Kontamination durch DNA aus der Umgebung. Die Hauptquelle von Kontamination sind Produkte aus vorher durchgeführten Up-scaling-Reaktionen, z.B. PCR-Reaktionen (59).
Um dieses Problem zu überwinden, ist ein Verfahren entwickelt worden, das zwischen Ziel DNA und kontaminierender DNA aus vorherigen Reaktionen, z.B. PCR Produkt DNA, unterscheidet (60). Im Wesentlichen werden alle Amplifikationsreaktionen unter Verwendung von dUTP durchgeführt, um dTTP zu ersetzen, wobei folglich Urazil an Stelle von Thymidin in die DNA eingebaut wird. Alle nachfolgenden Redaktionsgemische werden dann mit UDG (oder UNG) behandelt. Folgende Wärmebehandlung baut die kontaminierende DNA durch Hydrolyse der Phosphodiesterbindung an abasischen Stellen ab. Folglich soll die Wärmebehandlung das UDG-Enzym inaktivieren.
Jedoch wird das UDG- (oder UNG-) Enzym von E. Coli nicht vollständig durch Wärmebehandlung inaktiviert, und die Inaktivierung ist nicht vollständig irreversibel (60). Dieses beeinflusst die Integrität des Produkts der Up-scaling-Reaktion, z.B. PCR-Reaktion, weil die Produkte durch UDG-Enzymrestaktivität abgebaut werden. Um dieses zu vermeiden, ist die nachfolgende Zugabe eines Enzyminhibitors für UDG verwendet worden (US-Patent Nr. 5.536.649).
Es wäre jedoch zu bevorzugen, die Verwendung des nachfolgenden Inhibitors zu vermeiden, weil dies einen zusätzlichen Schritt im Reaktionsverfahren darstellt, Restkontamination durch den Inhibitor in nachfolgenden Reaktionen vorliegen kann und der Erwerb des Inhibitors Extrakosten darstellt, wenn eine PCR Redaktion durchgeführt wird, wie vorstehend offenbart.
Folglich wäre es bevorzugt, ein UNG-(oder UDG-) Enzym zu verwenden, welches durch die Wärmebehandlung im Anschluss an die PCR Reaktion mit Sicherheit zerstört inaktiviert wird, wobei folglich die Zugabe von spezifischen chemischen Inhibitoren für das UDG Enzym vermieden wird.
Genauere Beschreibung der Figuren
1 zeigt die pI-Bestimmung des UNG des atlantischen Kabeljaus (cUNG). Im Anschluss an die isoelektrische Fokussierung unter Verwendung von Phast Gel IEF 3–9 wurde das Gel in Stücke von 2 mm geschnitten. Jedes Stück wurde in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Aktivität wurde dann, wie in Material und Methoden beschrieben, gemessen.
2 zeigt Produkthemmung von cUNG mit freiem Urazil. Verschiedene Urazil-Konzentrationen wurden zum Assaygemisch zugegeben und der Assay, wie i Material und Methoden beschrieben, durchgeführt.
3 zeigt Hemmung von cUNG mit einem Urazil-DNA-Glykosilaseinhibitor (Ugi) aus dem Bacillus subtilis-Bakteriophagen. 6,65·10^–4 U von cUNG wurden mit 1,25·10³ U bis 2,00·10² U von Ugi unter Verwendung von Standardassaybedingungen inkubiert, wie in Material und Methoden beschrieben. Eine Unit von Ugi hemmt eine Unit der UNG-Aktivität, wobei die UNG-Aktivität als Freisetzung von 60 pmol Urazil pro min bei 37°C definiert ist.
4 zeigt den pH-Wert und das NaCl-Optimum von cUNG. Die Aktivität von cUNG wurde mit unterschiedlichen Natriumchlorid-Konzentrationen in verschiedenen pH-Reihen gemessen, wie in Material und Methoden beschrieben. Die UNG-Aktivität in Prozent wird ins Verhältnis zu dem höchsten gemessenen Wert, pH-Wert 7,5 mit 50 mM NaCl, gesetzt.
5 zeigt das Temperaturoptimum von cUNG. Wegen verlängerter Inkubation der Enzymprobe auf Eis während des Experimentes wird die Aktivität hinsichtlich der Stabilität des Enzyms korrigiert, wie in Material und Methoden beschrieben.
6 zeigt das Temperaturprofil von cUNG (Ä) und rhUNG (?). Die Enzymaktivität wurde, wie in Material und Methoden beschrieben, gemessen. Die UNG-Aktivität in Prozent wird ins Verhältnis zu dem höchsten Wert für cUNG (45°C) beziehungsweise rhUNG (50°C) gesetzt. Wegen verlängerter Inkubation der Enzymprobe auf Eis während des Experimentes wird die Aktivität hinsichtlich der Stabilität der Enzyme korrigiert, wie in Material und Methoden beschrieben.
7 zeigt die pH-Stabilität der UNG des atlantischen Kabeljaus (cUNG) und der rekombinanten menschlichen UNG (rhUNG). In verschiedenen pH-Puffern wurden 1 U cUNG (Ä) oder rhUNG (?) 10 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Dann wurden 5 μl-Aliquots in das Assaygemisch überführt, und die Restaktivität wurde unter Verwendung von Standardassaybedingungen gemessen, wie in Materialien und Methoden beschrieben. Eine Aktivität von 100% wurde direkt von einer Probe gemessen, die bei pH 8,0 ohne irgendeinen Inkubationschritt verdünnt wurde.
8 zeigt die Temperaturstabilität der UNG des atlantischen Kabeljaus (cUNG) (Ä) und der rekombinanten menschlichen UNG (rhUNG) (?).
Das Enzym (1 U) wurde bei 50°C, 37°C, 25°C und 4°C inkubiert, und 5 μl-Aliquots wurden nach verschiedenen Zeitabständen in das Assaygemisch überführt, und Standardassays wurden durchgeführt, wie in Material und Methoden beschrieben. Halbwertszeiten wurden bei 0,5 min (50°C), 20 min (37°C), 60 min (25°C) und 2 h (4°C) für cUNG und bei 8 min (50°C) 30 min (37°C), 150 min (25°C) und 2,6 h (4°C) für rhUNG bestimmt.
9 zeigt ein Agarosegel, das PCR-Produkte vom Test auf Carry-over-Verhinderung unter Verwendung von rekombinanter Kabeljau-UNG (rcUNG) zeigt. Spurbeschreibungen: die Spuren 1 und 8: DNA-Kontrolle; Spur 2: T-enthaltende Matrize, kein UNG; Spur 3: T-enthaltende Matrize, 1,7 × 10^–3 U rcUNG; Spur 4: U-enthaltende Matrize, 4 × 10^–4 U rcUNG; Spur 5: U-enthaltende Matrize, 1,7 × 10^–3 U rcUNG; Spur 6: U-enthaltende Matrize, 4 × 10^–4 U E. Coli-UNG; Spur 7: U-enthaltende Matrize, kein UNG.
Aufgaben der Erfindung
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues UNG-(oder UDG-) Enzym bereitzustellen, welches bei Verfahren zur Carry-over-Verhinderung für DNA Amplifikationsreaktionen, z.B. PCR, vorstehend angezeigt, funktionell ist, und welches durch die Wärmebehandlung, die normalerweise bei PCR Reaktionszyklen durchgeführt wird, vollständig und irreversibel inaktiviert wird.
Außerdem ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine DNA Sequenz, die solch ein Enzym oder einen aktiven Teil davon kodiert, einen Vektor oder Vektorsystem (z.B. ein Virus, ein Plasmid, ein Cosmid usw.), das solch eine DNA Sequenz trägt, und einen Mikroorganismus bereitzustellen, der solch einen Vektor einschließt.
Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur wirksamen Herstellung des Enzyms oder eines aktiven Teils davon unter Verwendung von gentechnischen Verfahren bereitzustellen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Enzyme von Kälte angepassten Organismen, die in kalten Lebensräumen leben, wie dem atlantischen Kabeljau (Gadus morhua), müssen die Verringerung der chemischen Reaktionsgeschwindigkeiten bei niedrigen Temperaturen kompensieren, um ausreichende metabolische Aktivitäten aufrechtzuerhalten. Dieses kann durch höhere Transkriptions/Translationsspiegel oder verbesserte katalytische Wirksamkeit (k_cat/K_M) getan werden. Diese höhere Wirksamkeit wird durch eine flexiblere Struktur als bei ihren mesophilen Gegenstücken erreicht, welche eine gesteigerte Fähigkeit bereitstellt, Konformationsänderungen während der Katalyse durchzumachen. Die verringerte Stabilität gegenüber pH-Wert, Temperatur und Denaturierungsmitteln wird als Folge der Konformationsflexibilität betrachtet (58).
Angesichts der Nachteile mit Kontaminationen von UDG gemäß dem Stand der Technik in den Verfahren zur Verhinderung von Verschleppungen, wenn DNA-Sequenzen amplifiziert werden (PCR, LCR), wäre es sehr günstig, ein UDG- (oder UNG-) Enzym bereitzustellen, welches durch einfache Wärmebehandlung zu 100% abgebaut wird. Es ist nun festgestellt worden, dass ein UNG- (oder UDG-) Enzym, das aus Kabeljau isoliert wurde, diese wertvolle Eigenschaft aufweist. Das isolierte Kabeljau-UNG-Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung weist ein ähnliches Molekulargewicht, isoelektrischen Punkt, pH- und NaCl-Optimum wie vorher beschriebene UNGs auf, aber die vorliegende Kabeljau-UNG ist pH-labiler und hitzelabiler und weist eine höhere relative Aktivität bei niedrigen Temperaturen auf als eine rekombinante mesophile menschliche UNG.
Das Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung weist Urazil-DNA-Glykosilase-Aktivität auf und wird vollständig inaktiviert, wenn es über etwa 60°C erwärmt wird. Es muss selbstverständlich sein, dass diese Temperaturschwelle innerhalb eines Bereichs einiger Grad variieren kann. Das Enzym gemäß der Erfindung weist eine Aminosäuresequenz, wie in den SEQ ID NR. 1 oder 2 gezeigt, oder einen biologisch funktionellen Teil davon auf.
Das Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung stammt vorzugsweise aus einem Organismus, der an eine kalte Umgebung angepasst ist, stärker bevorzugt ist der Organismus eukaryotisch, und am meisten bevorzugt ist der Organismus atlantischer Kabeljau.
Eine DNA-Sequenz, die das neue Enzym kodiert, weiste eine Nukleotidsequenz auf, wie in den SEQ ID NR. 1 oder 2 angegeben. Die DNA-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung schließt vorzugsweise einen Promotor ein und ist in einem Expressionsvektor, wie einem Plasmid, Cosmid oder Virus, enthalten.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung sind ein Mikroorganismus, der die DNA-Sequenz der Erfindung umfasst, wie in den Ansprüchen dargelegt, und die Verwendung des Enzyms bei der Überwachung und/oder Kontrolle eines Reaktionssystems, das DNA-Sequenzen multipliziert, wie PCR oder LCR. Insbesondere wird das Enzym der Erfindung in einem Verfahren zur Verhinderung von Verschleppungen verwendet.
Nachstehend ist ein Isolierungsverfahren für das relevante Kabeljau-UNG-Protein gemäß der Erfindung offenbart, ebenso ist die Isolierung von DNA, die dieses Protein kodiert, auch seine Verwendung in Mikroorganismen zur rekombinanten Herstellung des relevanten UNG-Enzyms gemäß der Erfindung offenbart.
Beispiel 1
Extraktion, Reinigung und Charakterisierung von Kabeljau-UNG (cUNG)
Reinigung von cUNG
Die Herstellung des Rohextraktes und alle Reinigungschritte wurden bei 4°C durchgeführt. Die folgenden Materialien wurden verwendet; Q-Sepharose FF, S-Sepharose FF, Heparinsepharose HP (Hi-trap 5 ml), Poly-U-Sepharose 4B, Superdex 75 HR10/30, Phast system und Phast IEF Gele (3–9) und LMW-Gelfiltrations-Kalibrierungskit wurden von Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden) erhalten. Desoxy[5-³H]uridin-5'-triphosphat (19,3 Ci/mmol) wurde von Amersham (Vereinigtes Königreich) erworben. Urazil-DNA-Glykosilase-Inhibitor (Ugi) wurde von New England Biolabs (Beverly, MA) erworben, Enzyme wurden von Promega (Madison, WI) erworben. Protease-Inhibitoren, Kalbsthymus-DNA (D-1501), Urazil, Desoxyuridin und Desoxyuridinmonophosphat wurden von Sigma (St. Louis, MO) erworben. Alle anderen Reagenzien und Puffer wurden von Sigma und Merck (Darmstadt, Deutschland) erworben.
Herstellung des Rohextraktes
Zu 600 ml-Extraktionspuffer (25 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% Glycerin, pH 8,0 (25°C) wurden 200 g frische Kabeljauleber zugegeben und in einem Atomix Homogenisierer (MSE, England) homogenisiert. Vor der Homogenisierung wurde das folgende Protease-Inhibitor-Gemisch zum Extraktionspuffer zugegeben: 1 mM PMSF, 1 μM Pepstatin, 1 μM Leupeptin, 10 μM TPCK und 10 μM TLCK (Endkonzentrationen). Das Homogenat wurde 15 min lang bei 28.000 × g zentrifugiert, und der Überstand wurde durch Glaswolle filtriert. Schließlich wurde Glycerin zu 30% (v/v) zugegeben, und der Kabeljauleber-Rohextrakt wurde bei –70°C eingefroren.
Q-Sepharose Fast Flow
1 Liter Rohextrakt wurde mit 1 Liter Puffer A (25 mM Tris/HCl, 10 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Glycerin, pH 8,0) verdünnt (Fraktion 1). Die Probe wurde in zwei Teilen (je 1 Liter) auf eine Q-Sepharose FF-Säule (5,0/15) aufgetragen, mit Puffer A equilibriert und dann mit 250 ml Puffer A gewaschen, unter Verwendung einer Flussrate von 10 ml/min. Die Proteine, die an der Säule gebunden waren, wurden mit 200 ml Puffer A + 1,0 M NaCl eluiert, und die Säule wurde mit Puffer A reequilibriert, bevor der nächste Teil der Probe aufgetragen wurde, wie vorstehend erwähnt. Der UNG-enthaltende Durchfluss und die Waschfraktionen von den beiden Durchläufen wurden vereinigt (Fraktion 2, 2340 ml).
S-Sepharose Fast Flow
Fraktion 2 wurde auf eine S-Sepharose FF-Säule (1,6/10), equilibriert mit Puffer A, Flussrate 10 ml/min, aufgetragen. Die Säule wurde mit 300 ml Puffer A + 60 mM NaCl gewaschen und unter Verwendung von 200 ml eines linearen Gradienten von 0,06–0,4 M NaCl in Puffer A, Flussrate 5 ml/min eluiert. UNG-enthaltende Fraktionen wurden vereinigt (55 ml) und über Nacht in Puffer A (Fraktion 3) dialysiert.
Hochleistungsheparinsepharose (Heparinsepharose High Performance)
Fraktion 3 wurde auf eine Heparinsepharose HP Hi-Trap-Säule (1,6/2,5), equilibriert mit Puffer A, aufgetragen. Die Säule wurde mit 50 ml Puffer A + 60 mM NaCl gewaschen und wurde mit 50 ml eines linearen Gradienten von 0,06–0,4 M NaCl in Puffer A, Flussrate 1 ml/min, eluiert. UNG-enthaltende Fraktionen wurden vereinigt (Fraktion 4, 20 ml).
Poly-U-Sepharose (4B)
Fraktion 4 wurde dann 5mal mit Puffer A verdünnt, und auf eine Poly-U-Sepharose-Säule (1,6/10), equilibriert mit Puffer A, aufgetragen. Die Säule wurde mit 60 ml Puffer A + 60 mM NaCl gewaschen und wurde mit 200 ml eines linearen Gradienten von 0,06–0,4 M NaCl in Puffer A, Flussrate 1 ml/min, eluiert. UNG-enthaltende Fraktionen wurden vereinigt (Fraktion 5, 70 ml).
Superdex 75
Fraktion 5 wurde unter Verwendung von Ultrafree 15 und Ultrafree-MC-Ultrazentrifugationsfiltern (Millipore), Ausschluss 5 K, auf 200 μl konzentriert und mit einer Flussrate von 0,5 ml/min auf die Gelfiltrationsäule (HR 1,0/30), equilibriert mit Puffer A, aufgetragen. Fraktionen (350 μl) wurden gesammelt und solche, die UNG-Aktivität enthalten, wurden vereinigt (Fraktion 6, 3 ml).
Herstellung des Substrats durch Nick-Translation
³H-dUMP-DNA durch Nick-Translation und Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erzeugt. Das nick-translatierte Substrat wurde in einem Gesamtvolumen von 1 ml hergestellt und enthielt 50 mM Tris/HCl, pH 7,2, 10 mM MgSO₄, 1 mM DTT, 250 μg Kalbsthymus-DNA (vor der Verwendung durch Phenol/Chloroform-Extraktion gereinigt und mit Ethanol gefällt), 0,1 mM dATP, dCTP, dGTP und dUTP, wobei 3 μM des dUTP [³H]-dUTP (19,3 Ci/mmol) waren. Dann wurden 0,1 ng (5,35 × 10⁴ U) DNase I (Rinderpankreas, Promega) und 30 Sekunden später 25 U E. Coli-DNA-Polymerase zugegeben, und das Nick-Translationsgemisch wurde 24 Stunden lang bei 21°C inkubiert. Die nick-translatierte DNA wurde durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung gereinigt. Die DNA wurde in 50 μl TE-Puffer resuspendiert und mit einer NAP-5-Säule (AP Biotech), equilibriert mit TE-Puffer (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) gereinigt, um nichteingebaute Nukleotide zu entfernen. Die Spezifische Aktivität des Nick-Substrats betrug 1,8 × 10⁵ dpm/μg (425 cpm/pmol).
Herstellung des Substrats durch PCR
Das PCR-erzeugte Substrat wurde für alle Charakterisierungsexperimente verwendet und bestand aus einem 761 bp-Fragment, das von kationischem Trypsinogen (sstrpIV) aus atlantischem Lachs (Salmo salar) erzeugt wurde (61). Die PCR wurde in einem Volumen von 50 μl in einem Perkin Elmer Cetus-Thermocycler durchgeführt. Das PCR-Gemisch enthielt 10 mM Tris/HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 6 mM MgCl₂, 0,37 mM dATP, dCTP, dGTP und dUTP, wobei 10,4 μM des dUTP [³H]-dUTP (17,0 Ci/mmol, Amersham) waren, 700 pg Matrizen-DNA (sstrpIV in einem pgem7zt-Vektor), 2,5 μM Stromaufwärts- und Stromabwärts-Primern und 2 U Taq-Polymerase (Roche, Schweiz). Die PCR-Reaktion wurde mit 30 Zyklen bei 94°C 1 min lang, 45°C 1 min lang und 72°C 1 min lang durchgeführt. Dann wurden zusätzliche 2 U Taq-Polymerase zugegeben, und die PCR-Reaktion wurde mit 30 neuen Zyklen, wie beschrieben, fortgesetzt. Das PCR-Substrat wurde mit QIAquick PCR-Reinigungskit (Qiagen), wie vom Hersteller beschrieben, gereinigt, und in 50X verdünntem TE-Puffer, pH 8,0 eluiert. Die spezifische Aktivität des PCR-Substrats betrug 5.9 × 10⁵ dpm/μg (451 cpm/pmol). Alle Charakterisierungsexperimente wurden unter Verwendung des PCR-Substrats durchgeführt.
Detektion der Urazil-DNA-Glykosilase-Aktivität (Standardassay)
Die Urazil-DNA-Glykosilase-Aktivität wurde in einem Endvolumen von 20 μl gemessen, das 70 mM Tris/HCl, 10 mM NaCl, 1 mM EDTA, 100 μg/ml BSA und 230 ng Nick-Substrat oder 71 ng PCR-Substrat enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde 10 min lang bei 37°C inkubiert und durch die Zugabe von 20 μl eiskalter Einzelstrang-Kalbsthymus-DNA (1 mg/ml) und 500 μl 10% (w/v) TCA terminiert. Proben wurden 15 min lang auf Eis inkubiert und bei 16.000 g 10 min lang zentrifugiert. Überstände mit säurelöslichem ³H-Urazil wurden unter Verwendung eines Flüssigszintillationszähler analysiert.
Eine Unit Aktivität ist definiert als die Menge Enzym, die erforderlich ist, um 1 nmol säurelösliches Urazil pro Minute bei 37°C freizusetzen.
Analyse der Assayprodukte mit Dünnschicht-Chromatographie
Die Reaktionsprodukte nach den Assays wurden mit 20 nmol Urazil, Desoxyuridin und Desoxyuridinmonophosphat gemischt. Die Dünnschicht-Chromatographie wurde gemäß dem Verfahren von Wang und Wang mit Polyamidschichtplatten (BDH) und Tetrachlormethan, Essigsäure und Aceton (4:1:4, Volumen) als Lösungsmittel (62) durchgeführt. Stellen, die unter UV-Licht detektiert wurden, wurden aus der Platte geschnitten, und die Radioaktivität wurde in einem Flüssigszintillationszähler gemessen.
Molekulargewichtsbestimmung
Das Molekulargewicht wurde durch Gel-Filtration bestimmt und wurde mit einer Superdex 75-Säule (1,0/30) equilibriert mit einem Puffer, der 25 mM Tris/HCl, 1,0 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% Glycerin, pH 8,0 enthält, durchgeführt. Die Flussrate betrug 0,5 ml/min, und die Aktivität wurde in den gesammelten Fraktionen (250 μl) gemessen. Rinderserumalbumin (BSA 67 kDa), Ovalbumin (43 kDa), Chymotrypsinogen A (25 kDa) und Ribonuclease A (13,7 kDa) wurden als Standards verwendet. Blue Dextran und Natriumchlorid wurden verwendet, um das Hohlraum- (V₀) beziehungsweise Eigenvolumen (V_i) zu bestimmen.
Proteinbestimmung
Proteinkonzentrationen wurden mit Coomassie^®-Proteinassayreagens G-250 (Pierce, New York, NY) mit dem Verfahren von Bradford (63) mit dem Mikrotiterplattenprotokoll, wie vom Hersteller beschrieben, unter Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA) als Standard bestimmt.
Bestimmung des Isoelektrischen Punktes
Die Bestimmung des Isoelektrischen Punktes wurde mit dem Phast-System, dem isoelektrischen Fokussiergel 3–9 und silbergefärbt gemäß den Verfahren, die vom Hersteller beschrieben wurden, durchgeführt. Die verwendeten Standards waren Phycocyanin (4,45, 4,65, 4,75), â-Laktoglobulin B (5,10), Rindercarboanhydrase (6,00), menschliche Carboanhydrase (6,50), Pferdemyoglobin (7,00), menschliches Hämoglobin A (7,10), menschliches Hämoglobin C (7,50), Linsenlektin (7,8, 8,0. 8,2), Cytochrom c (9,6), (pI-Bereich der IEF-Standards 4,45–9,6, BIO-RAD). Nach der Fokussierung wurde das Gel in 2 mm große Stücke geschnitten und jedes in 250 μl Extraktionspuffer (50 mM Tris/HCl, 0,2 M NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 1% Glycerin (v/v), pH 8,0) über Nacht inkubiert. Aliquots von 5 μl wurden in die Assaygemische überführt und die Aktivität unter Verwendung von Standardassaybedingungen gemessenen.
Bestimmung des pH/NaCl-Optimums
Assays wurden in einem Volumen von 20 μl, wie im Standardassay beschrieben, unter Verwendung des PCR-erzeugten Substrats und einer NaCl-Konzentration von 0–200 mM mit 25 mM Abständen, und einem pH, der im Bereich von 9,5–6,5 mit Abständen von 0,5 pH-Einheiten liegt, durchgeführt. Alle Puffer wurden mit 100 μg/ml BSA und 1 mM EDTA ergänzt. Die verwendeten Puffer waren Diethanolamin/HCl (9,5–8,5), Tris/HCl (8,5–7,5) und MOPS/NaOH (7,5–6,5). Alle Puffer wurden bei 37° pH-eingestellt und im Assay in einer Konzentration von 25 mM verwendet.
Bestimmung des Temperaturoptimums
Die Assays wurden in einem Volumen von 20 μl, wie im Standardassay beschrieben, unter Verwendung des PCR-erzeugten Substrats durchgeführt. Die Assaygemische waren, wie in den Standardassaybedingungen beschrieben, und wurden für alle Temperaturen auf pH 8,0 eingestellt. Der verwendete Temperaturbereich betrug 5°C bis 60°C. Die Aktivität wurde auf eine sequentielle Art und Weise mit 15 min-Abständen zwischen jeder Temperatur gemessen. Die verwendeten Enzyme wurden in Standardverdünnungspuffer (5 mM Tris/HCl, 10 mM NaCl, 1% Glycerin (v/v), pH 8,0) verdünnt und auf Eis gestellt. Wegen der Instabilität der Enzymprobe auf Eis über einen längeren Zeitraum, wurden die Ergebnisse hinsichtlich der Stabilität der Enzyme, die in Verdünnungspuffer auf Eis inkubiert wurden, mit der Formel N_(t) = cpm/e^{–0693(t/ë)} korrigiert, wobei die Halbwertzeit (ë) von cUNG und rhUNG 2,0 Stunden beziehungsweise 2,6 Stunden beträgt.
Effekt von pH-Wert und Temperatur auf die Stabilität
pH: UNG (0,01 U) wurde (in einem Gesamtvolumen von 75 μl) 10 min lang bei 37°C in Puffern, die 10 mM Puffer, 10 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Glycerin enthalten, mit einem pH, der im Bereich von 9,5–6,5 mit Abständen von 0,5 pH-Einheiten liegt, unter Verwendung von Diethanolamin/HCl (9,5–8,5), Tris/HCl (8,5–7,5), MOPS/NaOH (7,5–6,5) und MES/NaOH (6,5–5,5) als Pufferkomponenten vorinkubiert. Aliquots von 5 μl wurden in die Assaygemische überführt, und die Restaktivität wurde unter Verwendung von Standardassaybedingungen gemessen.
Temperatur: UNG (0,01 U) wurde (in einem Gesamtvolumen von 75 μl) in 10 mM Tris/HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Glycerin, pH 8,0 (eingestellt bei jeder Temperatur) vorinkubiert. Nach verschiedenen Zeitabständen, wie in den Figurlegenden angezeigt, wurden 5 μl-Aliquots in die Assaygemisch überführt, und die Restaktivität wurde unter Verwendung von Standardassaybedingungen gemessen.
Substratspezifität gegenüber ss/dsDNA
PCR- und nick-translatiertes Substrat wurden 3 min lang bei 100°C inkubiert und danach schnell auf Eis abgekühlt, um ssDNA zu erzeugen. Im Anschluss an die Denaturierung wurden die ssDNA-Substrate unter Standardassaybedingung mit 6,65·10^–4 U gereinigtem cUNG verwendet. Die Enzymaktivität wurde auch unter Verwendung von dsDNA-Substraten sowohl für Nick- als auch PCR-Substraten gemessen und als Referenzen verwendet.
Ugi-Inhibitor- und Urazil-Produkthemmung
Die Aktivitätsmessungen unter Verwendung von PCR-Substrat wurden mit 6,65·10^–4 U gereinigtem cUNG durchgeführt. Verschiedene Urazil-Konzentrationen (0, 1, 2 und 5 mM) oder Ugi-Inhibitor (1,25·10³ U bis 2,00·10² U) wurden zu den Assaygemischen (auf Eis) zugegeben. Die Aktivität wurde dann, wie unter Standardassaybedingungen beschrieben, gemessen.
ERGEBNISSE
Reinigung von cUNG
Die UNG von atlantischem Kabeljau wurde 17.000-fach mit einer Wiedergewinnung von 2% gereinigt, wie in Tabelle 1 gezeigt. Trotz des hohen Reinigungsfaktors wurde das Enzym nur teilweise gereinigt, wie durch SDS-PAGE bestimmt. Auch die Ausbeute war wegen vieler Reinigungsschritte und der Konzentrierung der verdünnten Proteinprobe vor dem Gel-Filtrationsschritt gering.
Molekulargewicht und pI-Bestimmung
Das Molekulargewicht wurde durch Gelfiltration aus drei getrennten Experimenten zu 25 kDa ±2 bestimmt. Die Bestimmung des isoelektrischen Punkts wurde mit einem IEF-Phast Gel mit IEF-Standards, die im Bereich von 4,42–9,6 lagen, durchgeführt. Im Anschluss an die IEF wurde die cUNG-Aktivität aus den Gelfragmenten eluiert und die Aktivität gemessen, wie in Material und Methoden beschrieben. Die cUNG-Aktivität eluierte zusammen mit Cytochrom c, einem Standard mit einem isoelektrischen Punkt von 9,6, wie in 1 gezeigt. Die Cytochrom c- und cUNG-Aktivität wurden gefunden, wo die Elektrode mit dem Gel in Kontakt kommt, deshalb können wir nur schließen, dass der pI größer als 9,0 ist, welches der höchste messbare Wert unter Verwendung dieses Systems ist.
Substratspezifität
Die cUNG-Aktivität wurde unter Verwendung sowohl von ssDNA als auch dsDNA gemessen. Eine 1,8- und 1,9-fach höhere Aktivität für ssDNA als dsDNA wurde unter Verwendung von Nick- beziehungsweise PCR-Substraten gefunden, wie in Tabelle 2 gezeigt. Assayprodukte wurden durch Dünnschicht-Chromatographie analysiert, und der Hauptteil der Radioaktivität wurde als Urazil identifiziert. Jedoch wurde etwas Radioaktivität auch zusammen mit dem Desoxyuridinmarker lokalisiert, aber dieses könnte an der teilweisen Überlappung der beiden Marker liegen. Außerdem zeigte die gereinigte cUNG keine wesentliche Hydrolyse von ³H-Adenin-markierter DNA, weshalb Nukleasen als verantwortlich für das Hydrolysieren der DNA ausgeschlossen wurden.
Studien zur Hemmung
Produkthemmung durch freies Urazil wurde untersucht und ergab mehr als 50% Hemmung mit 1 mM Urazil im Assaygemisch, wie in 2 gezeigt. Beim Zugeben von 5 mM freiem Urazil zum Assaygemisch wurde eine 78%ige Hemmung der Aktivität beobachtet. Die Wirkung von Ugi auf cUNG wurde durch Zugabe von Ugi zum Assaygemisch gemessen. cUNG wurde klar von Ugi gehemmt, wie in 3 gezeigt.
pH-Wert und NaCl-Optimum
Das pH- und Natriumchlorid-Optimum wurde durch Messen der Enzym-Aktivität bei verschiedenen pH-Werten unter Verwendung einer NaCl-Konzentration von 0–200 mM untersucht, wie in 4 gezeigt. Das Enzym zeigte ein breites pH-Optimum mit maximaler Aktivität zwischen pH 7,0–9,0 und 25–50 mM NaCl. Eine Verschiebung des NaCl-Optimums wurde beobachtet, wenn sich die optimale NaCl-Konzentration von niedrigen Konzentrationen bei hohem pH zu höheren Konzentrationen bei niedrigem pH ändert. Bei pH 9,5 wurde die cUNG durch NaCl gehemmt.
Temperaturoptimum
Das Temperaturoptimum von cUNG wurde zu 41°C bestimmt (5). Um die Aktivität von cUNG mit der mesophilen rhUNG bei niedrigen Temperaturen zu vergleichen, wurde die Enzymaktivität von 5–60°C gemessen und die Aktivität bei niedrigen Temperaturen mit ihrer jeweiligen optimalen Temperatur verglichen (6). Das Aktivitätsprofil dieser beiden Enzyme zeigte bei 5–15°C wenig Unterschied. Jedoch wurde bei Temperaturen von 20–40°C, eine höhere relative Aktivität mit cUNG als mit rhUNG beobachtet, wohingegen bei hohen Temperaturen (50–60°C) das Entgegengesetzte beobachtet wurde.
Stabilität
Die Stabilität der beiden UNG-Enzyme wurde durch Vorinkubieren der Enzyme bei verschiedenen pH-Werten verglichen. Es wurde gezeigt, dass die UNG von atlantischem Kabeljau zwischen pH 7,0–8,5 am stabilsten war. Bei pH 5,5 und pH 10,0 wies sie weniger als 1% Restaktivität auf. rhUNG war zwischen pH 7,0–9,5 am stabilsten. Bei pH 5,5 verblieben 3% Restaktivität, aber bei pH 10,0 verblieben mindestens 66% der Aktivität, wie in 7 gezeigt. Die Temperaturstabilität der beiden UNG-Enzyme wurde bei 4°C, 25°C, 37°C und 50°C verglichen. Bei 50°C wurde die Halbwertzeit zu 0,5 min und 8 min für cUNG beziehungsweise rhUNG bestimmt. Bei allen untersuchten Temperaturen war rhUNG stabiler als cUNG. Die bestimmten Halbwertzeiten waren 20 min (37°C), 60 min (25°C) und 2 h (4°C) für cUNG und 30 min (37°C), 150 min (25°C) und 2,6 h (4°C) für rhUNG, aber der größte Unterschied bezüglich der Halbwertzeit wurde bei der höchsten Temperatur bestimmt, wie in 8 gezeigt.
DISKUSSION
Reinigung und Molekulargewicht
Die Urazil-DNA-Glykosilase aus der Leber des atlantischen Kabeljaus (Gadus morhua) wurde unter Verwendung verschiedener Chromatographieverfahren 17.679-fach gereinigt. Noch immer war das Enzym nur teilweise gereinigt, weil mehrere andere Banden auf dem SDS-PAGE-Gel gesehen wurden. Es ist gezeigt worden, dass menschliche Kern- und mitochondriale Urazil-DNA-Glykosilasen durch alternatives Spleißen erzeugt werden und ein ORF von 313 beziehungsweise 304 Aminosäuren aufweisen (49). Das Molekulargewicht von cUNG wurde zu 25 kDa bestimmt. Dieses ist ungefähr dasselbe Molekulargewicht wie für die UNG aus der menschlichen Plazenta (29 kDa) und die rhUNG (UNGÄ84) (27 kDa) bestimmt, welchen 77 beziehungsweise 84 der ersten N-terminalen Aminosäuren fehlen, wie vom mitochondrialen ORF (21, 64) vorausgesagt. Dieses legt nahe, dass die N-terminale Signalsequenz im gereinigten cUNG verarbeitet wird oder während der Reinigung künstlich geschnitten wird, oder dass die UNG des atlantischen Kabeljaus keine N-terminale Signalsequenz hat. Während der Reinigung sahen wir kein Zeichen für zwei verschiedene UNGs, wie vorher während der Reinigung von UNG aus der Ratte oder aus menschlichen Quellen (18, 23) beschrieben. Aber man sollte erwarten, dass der atlantische Kabeljau als Wirbeltier sowohl eine Kern- als auch eine mitochondriale Form von UNG besitzt, aber bis jetzt ist keine Anstrengung unternommen worden, diese Angelegenheit in Übereinstimmung zu bringen.
Die Urazil-DNA-Glykosilase aus atlantischem Kabeljau war hinsichtlich des hohen pI (19) und der zweifachen Präferenz für ssDNA gegenüber dsDNA (19) anderen, vorher gereinigten und charakterisierten Urazil-DNA-Glykosilasen ähnlich.
Hemmung durch Ugi und Urazil
UDG-Inhibitor (Ugi) aus dem Bacillus subtilis-Bakteriophagen PBS2 hemmt UNG durch Bildung eines stabilen Komplexes mit UNG bei physiologischen Bedingungen). Ugi bindet an menschliche UNG durch Einschieben eines â-Strangs in die konservierte DNA-Bindungsfurche (67), und wirkt durch das Nachahmen von DNA (68). Dieses zeigt an, dass die Struktur der Substratbindungsstelle von cUNG anderen UNGs ähnlich ist, die durch den Ugi-Inhibitor gehemmt werden. Hemmung mit freiem Urazil war in Übereinstimmung mit den vorher berichteten Werten (19).
Optimale Bedingungen
Es wurde gezeigt, dass cUNG ein breites pH-Optimum von 7,0–9,0 aufweist, und die Aktivität wurde durch die NaCl-Konzentration stark beeinflusst. Von der breiten optimalen Aktivität wird vorher für mehrere andere charakterisierte UNGs (23, 31, 40, 47) berichtet. Interessanterweise nimmt das NaCl-Optimum für cUNG zu, wenn der pH-Wert abnimmt. Es ist vorher dargelegt worden, dass UNG in einer prozessiven Art und Weise bei niedriger Ionenstärke arbeitet, welches einschließt, dass, wenn die NaCl-Konzentration zunimmt, das Enzym zu einem distributiven Mechanismus (14, 15) wechselt. Jedoch berichteten Purmal et al. vom Entgegengesetzten, dass UNG bei niedriger Ionenstärke in einem distributiven Mechanismus arbeitet. Der prozessive Mechanismus ist ein allgemeines Merkmal unter mehreren DNA-wechselwirkenden Proteinen (Polymerasen, Repressoren, Restriktions-/Modifikationsenzymen, DNA-Reparaturenzymen), und die Wechselwirkungen sind allgemein von elektrostatischer Natur (67–71). Es ist gezeigt worden, dass auch in einer UV-Endonuclease aus Micrococcus luteus der prozessive Mechanismus pH-abhängig ist (72). Deshalb legen wir nahe, dass die Verschiebung des NaCl-Optimums bei Zunahme des pH-Werts die prozessive-/distributive Natur von cUNG reflektiert. Und es könnte sein, dass die Kontroverse in den vorhergehenden Berichten auch wegen verschiedener Pufferkomponenten und -pH-Wert, zusätzlich zu den bereits besprochenen Unterschieden liegen.
Es wurde festgestellt, dass das Temperaturoptimum (41°C) etwas niedriger ist als das der mesophilen rhUNG (45°C) (64). Die relative Aktivität bei einer Temperatur von 5–45°C war für cUNG höher als für rhUNG. Bei Temperaturen größer als 45°C zeigt rhUNG eine höhere relative Aktivität als cUNG, vermutlich als Folge der geringen Temperaturstabilität von cUNG.
Temperatur- und pH-Stabilität
Es ist festgestellt worden, dass Enzyme, die aus Kälte-angepassten Spezies charakterisiert wurden, Temperatur und pH-labiler sind, vermutlich wegen ihrer flexiblen Struktur, um die enzymatische Aktivität bei niedrigen Temperaturen aufrechtzuerhalten (73). Es wurde festgestellt, dass cUNG sowohl pH- als auch Temperatur-labiler ist als die rhUNG, welches bekannte Merkmale für andere Kälte-angepasste Enzyme (73, 74) sind.
Eine psychrophile UNG aus einem marinen Bakterium ist vor kurzen isoliert worden und wurde mit E. Coli-UNG hinsichtlich der Temperaturstabilität verglichen (45). Diese prokaryotische UNG wies eine Halbwertzeit von 2 min bei 40°C und 0,5 min bei 45°C auf, verglichen mit 27 und 8 min für die E. Coli-UNG. cUNG wurde mit der rhUNG hinsichtlich sowohl der Temperatur- als auch der pH-Stabilität verglichen. Bei 50°C wies rhUNG eine Halbwertzeit von 8 min auf, verglichen mit 0,5 min für cUNG. Bei niedrigerer Temperatur war der Unterschied bezüglich der Halbwertzeit kleiner, obwohl rhUNG bei allen untersuchten Temperaturen stabiler war als cUNG. Es wurde gezeigt, dass beide Enzyme bei niedrigem pH-Wert labil sind, wohingegen bei hohem pH-Wert rhUNG stabiler war als cUNG.
Schließlich wurde gezeigt, dass die Urazil-DNA-Glykosilase aus atlantischem Kabeljau hinsichtlich des Molekulargewichts, hohen pI, eines breiten pH-Optimums und der zweifachen Präferenz für ssDNA gegenüber dsDNA anderen, vorher gereinigten und charakterisierten Urazil-DNA-Glykosilasen ähnlich ist. Jedoch wurde gezeigt, dass die cUNG Temperatur- und pH-labiler ist und eine höhere relative Aktivität bei niedrigen Temperaturen als die mesophile rhUNG aufweist.
Beispiel 2
Isolierung des Urazil-DNA-Glykosilase-Gens aus Gadus Morhua
Die folgenden Materialien wurden verwendet; SuperScript^TM II RNase H^–-Reverse Transkriptase (Gibco BRL), Packagene^® Lambda-DNA Verpackungssystem wurde von Promega (Madison, WI) erworben, Desoxy[5-³H]uridin-5'-triphosphat (17,0 Ci/mmol) wurde von Amersham (England) erworben, der Expressionsvektor pTrc99A wurde von Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden) erworben, Restriktionenzyme wurden von New England Biolabs (Beverly, MA) erworben, SMART^TM-PCR-cDNA-Library Construction Kit und Marathon^TM cDNA-Amplifikationskit wurden von Clontech (Palo Alto, CA) erworben.
Escherichia Coli NR8052 [Ä(pro-lac), thi-, ara, trpE9777, ung1] (75, 76) und gereinigte rekombinante menschliche UNG (UNGÄ84) (64) wurden von Dr. Hans E. Krokan, Institute for Cancer Research and Molecular Biology, Norwegian University of Science and Technology, bereitgestellt.
Isolierung von mRNA
mRNA wurde aus 250 mg Kabeljauleber unter Verwendung von Oligotex direct mRNA Midi Kit (Qiagen) isoliert, wobei die Anweisungen im Herstellerprotokoll befolgt wurden.
Herstellung von DNA
cDNA wurde aus 250 ng isolierter Poly-A⁺-RNA unter Verwendung des SMART^TM PCR cDNA Library Construction Kit (Clontech) gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll hergestellt. In Kürze, der erste Strang cDNA wurde durch Kombinieren von 250 ng Poly-A⁺-RNA mit 10 pmol SMART Oligonucleotide (5'-TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAAGGG-3') und 10 pmol PCR-Primer CDS/3' (Oligo(dT)30 N – 1 N (N = A, G, C oder T; N – 1 = A, G oder C)) in einem Endvolumen von 5 μl hergestellt und bei 72°C 2 min lang inkubiert und dann 2 min lang direkt auf Eis gelegt, um die RNA zu denaturieren. Dann wurden Enzym und Puffer zum Reaktionsgemisch zu einem Endvolumen von 10 μl zugegeben, das aus 50 mM Tris/HCl, pH 8,3, 6 mM MgCl₂, 75 mM KCl, 2 mM DTT, jeweils 1 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP und 200 U SuperScript^TM II Reverse Transkriptase (Gibco BRL) bestand, und dann bei 42°C 1 h lang inkubiert. Die Synthese des zweiten Strangs wurde durch PCR in einem Endvolumen von 100 μl durchgeführt, das 2 μl aus der Reaktion des ersten Strangs als Matrize, 40 mM Tricin/KOH pH 9,2 (25°C), 15 mM KOAc, 3,5 mM Mg(OAc)₂, 3,75 μg/ml BSA, jeweils 0,2 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 1 U Advantage cDNA Polymerase Mix (Clontech), jeweils 0,2 μM 5'-PCR-Primer (5'-TACGGCTCCGAGAAGACGACAGAA-3') und CDS/3'-PCR-Primer enthielt.
Die PCR-Amplifikation wurde in einem GeneAmp 9700-Thermocycler (Perkin Elmer) bei 95°C 1 min lang, gefolgt von 16 Zyklen bei 95°C 15 sek lang und 68°C 5 min lang, durchgeführt.
ds-cDNA-Reinigung: Zu 50 μl der amplifizierten ds-cDNA wurden 40 μg Proteinase K zugegeben und bei 45°C 1 h lang inkubiert. Proteinase K wurde durch 8 min langes Inkubieren des Gemisches bei 90°C inaktiviert. Um die ds-cDNA mit glatten Enden zu versehen, wurden 15 U T4 DNA-Polymerase zugegeben und bei 16°C 30 min lang und bei 72°C 10 min lang inkubiert. Schließlich wurde die ds-cDNA mit Ethanol gefällt und in 10 μl H₂O resuspendiert. Alle Röhrchen wurden auf Eis gehalten, wenn nichts anderes angegeben ist.
Erzeugung eines 300 bp-Fragments des cUNG-Gens
Degenerierte Oligonukleotidprimer wurden von zwei konservierten Regionen (GQDPYH und VFLLWG) von bekannten UNG-Aminosäuresequenzen entworfen. Die Codonverwendung für atlantischen Kabeljau wurde auch berücksichtigt, als die Primer entworfen wurden. Das UNG-Fragment wurde durch PCR mit Kabeljauleber-cDNA als Matrize in einem Endvolumen von 50 μl erzeugt, das 10 mM Tris/HCl pH 9,0 (25°C), 50 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 10 ng cDNA, jeweils 0,2 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, jeweils 2,0 μM Stromaufwärts-Primer (5'-GGH-CAR-GAY-CCC-TAY-CA-3') und Stromabwärts-Primer (5'-DCC-CCA-SAG-SAG-RAA-VAC-3')¹ und 2,5 U Taq-Polymerase (Promega) enthielt. Die PCR wurde bei 94°C 4 min lang, 30 Zyklen bei 94°C 1 min lang, 60°C 1 min lang und 72°C 1 min lang und einem abschließenden Verlängerungsschritt bei 72°C 5 min lang durchgeführt.
Die verwendeten Nukleotidsymbole sind wie folgt; A = Adenin; C = Cytosin; G = Guanin; T = Thymin; D = A + G + T; R = A + G; S = C + G; V = A + C + G; Y = C + T
DNA-Sequenzierung
Die DNA-Sequenzierung wurde mit dem Amersham Pharmacia Biotech Thermo Sequenaee Cy5 Dye Terminator Kit, ALFexpress^TM DNA-Sequenzer und ALFwin-Sequenzanalysator Version 2.10 durchgeführt. Gele wurden mit dem Reprogel^TM Long Read and Reproset UV-Polymerisierer hergestellt. Alle Gegenstände wurden von Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden) erworben.
RACE-Verfahren
Ligierung von Adaptern an die cDNA wurde durchgeführt, wie im Protokoll des Hersteller beschrieben. In Kürze, die RACE-Adapter wurden in einem Gesamtvolumen von 10 μl an die cDNA ligiert, das 50 mM Tris-HCl (pH 7,8) enthält, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 0,75 μg cDNA, 2 μM Marathon cDNA-Adapter (Clontech), 400 U T4-DNA-Ligase enthielt. Die Reaktion wurde bei 16°C 16 h lang und 5 min lang bei 70°C inkubiert, um die Ligase zu inaktivieren. Vor RACE wurde die Adapter-ligierte cDNA 50-fach in TE-Puffer verdünnt und bei 100°C 2 min lang denaturiert und direkt auf Eis gestellt.
Die Sequenz, die von dem 300 bp-Fragment des UNG-Gens abgeleitet wurde, wurde verwendet, um zwei Primer sowohl für die 3'- als auch 5'-Rapid-Amplifikation von cDNA- Enden zu entwerfen (RACE), wobei eine kleine Überlappungsregion zwischen den beiden Fragmenten erzeugt wurden. Sowohl 3'- als auch 5'-RACE-Reaktionen wurden in einem Volumen von 50 μl mit 1 μl verdünnter cDNA mit RACE-Adaptern als Matrize, jeweils 0,2 μM internen 3'-(5'-TGTACCGACATTGATGGCTTCAAGCAT-3') oder 5'-(5'-CCCATCCGCTTAGATCTCCATGTCCAG-3')-RACE-Primern 0,2 μM AP1-Primer (geliefert vom Hersteller) (5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'), 40 mM Tricin/KOH pH 9,2 (25°C), 15 mM KOAc, 3,5 mM Mg(OAc)₂, 3,75 μg/ml BSA, jeweils 0,2 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP und 1 U Advantage cDNA Polymerase Mix (Clontech) durchgeführt. Die Amplifikation wurde in einem GeneAmp 9700-Thermocycler (Perkin Elmer), bei 94°C 30 sek lang, gefolgt von 5 Zyklen bei 94°C 5 sek lang und 72°C 3 min lang, 5 Zyklen bei 94°C 5 sek lang und 70°C 3 min lang und 20 Zyklen bei 94°C 5 sek lang und 68°C 3 min lang durchgeführt.
(Einzelne Banden wurden aus einem Agarosegel gereinigt und als Matrize in einer neuen PCR-Reaktion mit denselben Bedingungen wie vorstehend verwendet, um mehr DNA zu erzeugen.)
Isolierung von zwei verschiedenen UNG-Genen
Beide erzeugten RACE-Fragmente wurden mit ihren jeweiligen internen RACE-Primern sequenziert.
Das Untersuchen der Sequenz des 5'-RACE-Fragments zeigte eine schwierig zu lesende Doppelsequenz nahe den 5'-Enden des Fragments an. Jedoch erschien am Ende des Fragments wegen einem langen UTR in einer der UNG-Sequenzen nur eine Sequenz aber nicht die andere. Ein neues Primer-Komplementär zu diesem 5'-Ende wurde entworfen (5'-ATGGAATTCGATTGAGATTGGCGCCTTTGG-3') und eine neue PCR-Reaktion wurde mit diesem und dem internen 5'-RACE-Primer, mit dem 5'-RACE-Fragment als Matrize durchgeführt. Die PCR wurde in einem Endvolumen von 50 μl mit 40 mM Tricin/KOH pH 9,2 (25°C), 15 mM KOAc, 3,5 mM Mg(OAc)₂, 3,75 μg/ml BSA, jeweils 0,2 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 1 U Advantage cDNA Polymerase Mix (Clontech), 10 ng cDNA als Matrize und jeweils 0,2 μM Stromaufwärts- und Stromabwärts-Primern durchgeführt. Die Amplifikation wurde in einem GeneAmp 9700-Thermocycler (Perkin Elmer) bei 94°C 1 min lang, gefolgt von 30 Zyklen bei 94°C 30 sek lang, 60°C 1 min lang und 72°C 1 min lang, durchgeführt.
Das Fragment wurde unter Verwendung des internen RACE-Primers sequenziert, und die Sequenz wurde von der vorstehend beschriebenen Doppelsequenzregion subtrahiert. Ein Primer-Komplementär zum 5p-Ende der zugrundeliegenden Sequenz wurde entworfen (bestehend sowohl aus Nukleotiden von der SMART-Sequenz als auch der restlichen UNG-Sequenz), und eine PCR-Reaktion mit diesem und dem internen 5'-RACE-Primer wurde durchgeführt. Das neue Fragment wurde, wie vorstehend beschrieben, sequenziert. Von den beiden verschiedenen UNG-Sequenzen in dem 5'-RACE-Fragment wurden zwei Endprimer (UNG1 und UNG2) hergestellt, um die volle Länge UNG1 beziehungsweise UNG2 unter Verwendung von cDNA als Matrize und denselben PCR-Bedingungen, wie vorstehend beschrieben, zu isolieren.
Konstruktion der Expressionsvektoren
Die katalytische Domäne des UNG-Gens wurde in den Expressionsvektor pTrc99A kloniert, der einen starken trc-Promotor, stromaufwärts von einer Mehrfachklonierungsstelle, enthielt. Mehrere verschiedene Konstrukte wurde durch PCR-Amplifikation des Gens unter Verwendung von cDNA als Matrize mit Stromaufwärts- und Stromabwärts-Primern, die EcoRI- beziehungsweise Sall-Restriktionsstellen enthielten, hergestellt. Die DNA-Fragmente wurden gereinigt, mit EcoRI und Sall verdaut und in den pTrc99A-Expressionsvektor ligiert. In Kürze, die PCR-Fragmente mit Restriktionsstellen wurden in einer PCR-Reaktion (50 μl) erzeugt, die 40 mM Tricin/KOH pH 9,2 (25°C), 15 mM KOAc, 3,5 mM Mg(OAc)₂, 3,75 μg/ml BSA, jeweils 0,2 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 1 U Advantage cDNA Polymerase Mix (Clontech), 10 ng cDNA als Matrize und jeweils 0,2 μM Stromaufwärts- und Stromabwärts-Primer enthielt. Die Amplifikation wurde in einem GeneAmp 9700-Thermocycler (Perkin Elmer) bei 94°C 1 min lang, gefolgt von 30 Zyklen bei 94°C 30 sek lang, 60°C 1 min lang und 72°C 2 min lang und einem abschließenden Verlängerungsschritt von 72°C 5 min lang durchgeführt. Einzelne Banden wurden vom Agarosegel gereinigt und als Matrize in einer neuen PCR-Reaktion mit denselben Bedingungen, wie vorstehend beschrieben, verwendet, um mehr DNA zu erzeugen. Die DNA wurde unter Verwendung eines Quiaquick PCR-Reinigungskit (Millipore), wie vom Hersteller beschrieben, gereinigt und in TE-Puffer, pH 8,0, eluiert. Der Restriktionsenzymverdau wurde in einem Endvolumen von 30 μl durchgeführt, das 1 μg Insertions-DNA oder 0,25 μg pTrc99A-Vektor, 6 mM Tris/HCl, pH 7,9, 6 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 1 mM DTT (Puffer D, Promega) und 3U EcoRI und Sall enthielt. Die Gemische wurden 3 h lang bei 37°C inkubiert, gefolgt von zweimaliger Phenol/Chloroform-Extraktion, Ethanolfällung, und in 5 μl H₂O resuspendiert. Ligierungen wurden in einem Gesamtvolumen von 10 μl durchgeführt, das 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 100 U T4-DNA-Ligase, 250 ng Vektor-DNA und 1 μl Insertions-DNA enthielt und bei 16°C 16 h lang inkubiert.
Kompetente E. Coli JM105 (200 μl) wurden mit Ligierungsgemischen transformiert und auf LB + -Platten, die 100 μg/ml Ampicillin enthielten, bei 37°C wachsen gelassen. Die Plasmid-DNA wurde aus den positiven Klonen erneut isoliert und in E. Coli NR8052 transformiert, die für die Expression von rekombinanter UNG verwendet wurden.
Vier verschiedenes Konstrukte wurden hergestellt, rcUNGÄ74 und rcUNGÄ74o und rcUNGÄ81 und rcUNGÄ81o, wobei 74 beziehungsweise 81 der N-terminalen Aminosäuren entfernt wurden. Diese weisen dieselbe Länge wie die menschliche Ä77 beziehungsweise Ä84 auf (64). Die Ä74o und Ä81o-Konstrukte weisen die Codons auf, die Arginin 87 und 88 kodieren, die für Expression in E. Coli optimiert sind, durch Änderung davon von AGA zu CGT. Alle Konstrukte wurden durch PCR, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung der folgenden Primer und Matrize hergestellt: rcUNGÄ74: UDGL77 (5'-ACCATGGAATTCGCAAAAGCAACGCCTGCA-3') und UDGEND2 (5'-GAGCTCGTCGACTTAGAGTGCCTCTCCAGTTTATAGG-3') und 10 ng cDNA als Matrize.
rcUNGÄ81: UDGL84 (5'-ACCATGGAATTCTTCGGAGAGACTTGGAGAAGA-3') und UDGEND2 und 10 ng cDNA als Matrize.
rcUNGÄ74o:
(5'-ATGGAATTCGCAAAAGCAACGCCTGCAGGTTTCGGAGAGACTTGGCGTCGTGAG-3') und UDGEND2 und 1 ng rcUNGÄ81o als Matrize.
rcUNGÄ81o:
(5'-ATGGAATTCTTCGGAGAGACTTGGCGTCGTGAGCTGGCTGC-3') und UDGEND2 und 10 ng cDNA als Matrize.
Expression von Urazil-DNA-Glykosilase im kleinen Maßstab
Die Optimierung der Expression wurde in 1 l-Baffle-Erlenmeyerkolben mit 100 ml LB + -Medium mit 100 μg/ml Ampicillin, geimpft mit 5 ml Vorkultur, durchgeführt. Zellen wurden mit 1 mM IPTG bei OD600 = 2.0 induziert, und bei verschiedenen Längen induziert. Die Expression wurde unter Verwendung verschiedener Temperaturen (20°C, 25°C, 30°C und 37°C) untersucht.
Die vorstehenden Bedingungen wurden auch verwendet, um die Expression bei verschiedenen IPTG-Konzentrationen (1 mM, 0,5 mM, 0,1 mM und 0,01 mM) zu induzieren.
Fermentationsbedingungen
Die Fermentation wurde in einem 10 l-Chemap CF 3000-Fermenter (Schweiz) durchgeführt. Eine 200 ml Vorkultur von E. Coli NR8052 mit dem pTrc99A oÄ84-Konstrukt wurde zu 7 l LB-Medium, ergänzt mit 20 mM Glukose und 100 μg/ml Ampicillin, geimpft. Die Zellen wurden zu einer OD600 von 2,0 wachsen gelassen und 8 h lang mit 1 mM IPTG induziert. Zusätzliche Glukose (3·50 ml 20% (w/v) Glukose) wurde während der Fermentation ergänzt, um Glukosemangel zu vermeiden. Die Zellen wurden geerntet und bei 10.000 × g 10 Minuten lang zentrifugiert. Die Zellpaste wurde bei –70°C eingefroren.
Reinigung der rekombinanten Kabeljau-UNG
Rohextrakt
Von der Fermentation wurden 4 l E. Coli NR8052-Zellen (68 g Nassgewicht) in 400 ml Extraktionspuffer (25 mM Tris/HCl, 10 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Glycerin, 1 mM DTT, 1 mM PMSF pH 8,0) resuspendiert. Die Zellen wurden durch fünfmaliges Unterziehen durch den Zerstäuber unter Verwendung von 100 psi Stickstoff aufgebrochen. Der Extrakt wurde bei 25.000 × g 10 min lang zentrifugiert und der Überstand entfernt. Das Pellet wurde in 100 ml Puffer A resuspendiert, und erneut zentrifugiert, wie vorstehend beschrieben. Die Überstände wurden vereinigt und durch Glaswolle filtriert (460 ml).
Protaminsulfat
Zum Rohextrakt (460 ml) wurden 60 ml 2% Protaminsulfat in Puffer A (25 mM Tris/HCl, 10 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Glycerin, pH 8,0) zugegeben und bei 4°C 5 min lang unter Rühren inkubiert. Die Lösung wurde bei 25.000 × g 10 min lang zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt, 510 ml (Fraktion 1).
Q/S-Sepharose
Die Protaminsulfat-Fraktion wurde auf eine Q-Sepharose-Säule (5,0/10), die mit einer S-Sepharose-Säule (2,6/10) verbunden war, wobei beide mit Puffer A equilibriert wurden, unter Verwendung einer Flussrate von 10 ml/min aufgetragen. Dann wurden die Säulen mit 750 ml Puffer A gewaschen, und die Q-Sepharose-Säule wurde dann entfernt. Die S-Sepharose-Säule wurde mit zusätzlichen 550 ml Puffer A + 60 mM NaCl gewaschen, und ein Gradienten von 60 bis 400 mM NaCl in Puffer A wurde, um die Säule zu eluieren, unter Verwendung einer Flussrate von 5 ml/min aufgetragen. Fraktionen von 10 ml wurden gesammelt, und die Fraktionen, die UNG-Aktivität enthielten, wurden vereinigt (Fraktion 2, 115 ml).
Blaue Sepharose FF
Fraktion 2 wurde zweimal in Puffer A verdünnt und direkt auf eine Blaue Sepharose-Säule (1,6/5,0) mit einer Flussrate von 4 ml/min aufgetragen. Die Säule wurde dann mit 30 ml Puffer A und 60 ml Puffer A + 110 mM NaCl gewaschen und mit 60 ml Puffer A + 0,7 M NaCl eluiert. UNG-enthaltende Fraktionen wurden vereinigt (Fraktion 3, 24 ml).
Superdex 75
Fraktion 3 wurde unter Verwendung einer Ultrafree 15-Einheit (Millipore) auf 3 ml konzentriert und auf eine Superdex 75-Säule (2,6/60) aufgetragen, die mit Puffer A + 0,15 M NaCl equilibriert wurde. Eine Flussrate von 2 ml/min wurde verwendet, und Fraktionen von 5 ml wurden gesammelt. Die Fraktionen, die UNG-Aktivität enthielten, wurden vereinigt (Fraktion 4, 30 ml).
Source 15Q
Die Superdex 75-Fraktion wurde in einer Ultrafree 15-Einheit (Millipore) diafiltriert, und ungefähr 2/3 der Superdex 75-Fraktion wurde auf die Source 15Q-Säule (2,6/3,0) aufgetragen, die mit Puffer A bei Raumtemperatur equilibriert wurde. Die Säule wurde mit 60 ml Puffer A + 60 mM NaCl gewaschen, und dann wurde ein Gradient von 60 bis 210 mM NaCl in Puffer A aufgetragen, um die Säule zu eluieren. Die Fraktionen wurden auf Eis gesammelt, und UNG-enthaltende Fraktionen wurden vereinigt (UNG-Aktivität eluierte zwischen 105 bis 145 mM NaCl).
Ergebnisse
Die Nukleotid- sowie Einbuchstabencode-Aminosäuresequenzen für cUNG1 beziehungsweise cUNG2 sind in den beiliegenden Sequenzauflistungen, SEQ. ID. NR. 1 und 2 angegeben.
Expression
Die Expression von rcUNG durch das pTrc99A-Ä81o-Konstrukt in der 7 Liter-Maßstab-Fermentation erbrachte eine Gesamtmenge von 413.480 Units rcUNG, das im Rohextrakt enthalten ist.
Reinigung der rekombinanten Kabeljau-UNG
Die Reinigung der rekombinanten cUNG (Ä81o) (rcUNG) wurde durchgeführt. Aus einer 4 l-Fermentationscharge wurden 4,8 mg rekombinanter UNG zu einer offensichtlichen Homogenität gereinigt, und das Molekulargewicht wurde durch SDS-PAGE zu 28 kDa bestimmt. Die spezifische Aktivität des Enzyms wurde unter Verwendung des nick-erzeugten Substrats mit Standardassaybedingungen zu 30.092 U/mg bestimmt. Es wurde festgestellt, dass diese Herstellung keine nachweisbaren Mengen von DNA-Endodesoxyribonukleasen oder -exodesoxyribonukleasen gemäß den Standardverfahren enthielten.
Beispiel 3
Messung von Restaktivität/Reaktivierung nach thermischer Inaktivierung
11,5 Units rcUNG (ungefähr 0,38 μg) in 50 μl „Taq-Puffer" (10 mM Tris-HCl (pH = 9,0 bei 25°C), 50 mM KCl, 0,1% Triton X-100) wurden 10 min lang bei 94°C inaktiviert und in zwei gleiche Teile geteilt. Ein Teil wurde bei 4°C gehalten, und der andere Teil wurde bei 25°C gehalten, bevor die Restaktivität bei 1 und 16 Stunden nach der Inaktivierung unter Verwendung von 15 μl eines unverdünnten inaktivierten Gemisches in einem Standardassay gemessen wurde. Vor der Inaktivierung wurden 2 μl herausgenommen und 1:2000 verdünnte, bevor die Aktivität (100%-Kontrolle) gemessen wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass das inaktivierte Enzym keine Freisetzung von radioaktiv-markiertem Urazil vom Substrat verursachte, das oberhalb der Detektionsgrenze lag (Leerwert + 2 × Standardabweichung). Bei diesen Bedingungen würde die 100%-Kontrolle 7.000.000 Cpm Ausbeute betragen, während die 2 × Hintergrund-Standardabweichung 46 Cpm betrug. Folglich betrug die Restaktivität von rcUNG weniger als 0,0006% der Anfangsaktivität nach thermischer Inaktivierung bei diesen Bedingungen. Es gab keine wesentliche Reaktivierung des Enzyms nach 16 Stunden, weder bei 4°C noch bei 25°C.
Die Ergebnisse zeigen, dass rcUNG nach der thermischen Inaktivierung keine praktische Restaktivität aufweist und dass es nicht reaktiviert. Das Enzym rcUNG unterscheidet sich deshalb von vorher isolierter UNG aus dem marinen Bakterium, BMTU (45), von der gezeigt wurde, dass sie einen kleinen Grad an Reaktivierung oder Restaktivität nach thermischer Inaktivierung aufweist.
Beispiel 4
Carry-over-Verhinderung
Es wird getestet, ob cUNG wirksam ist, kontaminierende Urazil-enthaltende DNA in einer Reaktion zur Carry-over-Verhinderung abzubauen.
Verfahren
Als Kontaminierungsmittel wurden 0,5 ng Urazil-enthaltende Matrize-DNA (761 bp-Fragment, das aus kationischem Trypsinogen aus atlantischem Lachs (Salmo salar) (61) erzeugt wurde, zum PCR-Gemisch in einem Endvolumen von 50 μl zugegeben, das 10 mM Tris/HCl pH 9,0 (25°C), 50 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 10 ng cDNA, jeweils 0,2 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, jeweils 2,0 μM Stromaufwärts- (OP5) und Stromabwärts-Primer (NP2) und 1,0 U Taq-Polymerase (Promega) enthielt. UNG (4 × 10^–3 oder 1,7 × 10^–2 U) wurde zum PCR-Gemisch zugegeben und bei Umgebungstemperatur (RT) 10 Minuten lang inkubiert.
Als Negativkontrollen enthielt ein PCR-Reaktionsgemisch Matrize mit Thymidin, das Urazil ersetzte, und in einem Gemisch ersetzte Wasser die UNG. Ebenfalls wurden als Positivkontrolle 1,7 × 10^–3 U UNG von E. Coli anstelle von rcUNG verwendet.
Dann wurde die PCR bei 94°C 4 min lang, 30 Zyklen bei 94°C 1 min lang, 60°C 1 min lang und 72°C 1 min lang durchgeführt. Nach der PCR wurden die Produkte durch Agarosegel-Elektrophorese analysiert.
PCR-Primer-Sequenzen: OP5:
NP2:
Ergebnis
Das Ergebnis des Experimentes gemäß dem Beispiel ist in 9 gezeigt. Die Urazil-enthaltenden Matrizen wurden durch UNG in allen PCR-Reaktionen abgebaut, während die Reaktionen entweder ohne UNG oder mit Thymin-enthaltenden Matrizen das erwartete PCR-Produkt erbrachten. Die Ergebnisse in 9 sind als Figur eines Agarosegels gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass rcUNG wirksam ist, die kontaminierende Urazil-enthaltende DNA in einer PCR-Reaktion abzubauen. Tabelle 1: Reinigung von Urazil-DNA-Glykosilase aus der Leber des atlantischen Kabeljaus (rcUNG).

a) Enzym-Aktivität wurde, wie unter Standardassay in Material und Methoden beschrieben, unter Verwendung von Nick-Substrat, in Beispiel 2, gemessen.
b) die Protein-Konzentration wurde, wie in Material und Methoden beschrieben, bestimmt.
c) die Protein-Konzentration war zu gering, um bestimmt zu werden.

Die vorliegenden Ergebnisse zeigen zum ersten Mal Isolierung und Verwendung bei der Carry-over-Verhinderung in DNA-Kopierreaktionen einer UNG aus einem Kälte-angepassten eukaryotischen Organismus. Die vorher bekannten UNG-Enzyme, die aus E. Coli (60) oder BMTU (45) isoliert wurden, zur Verwendung in PCR-Reaktionen sind prokaryotischen Ursprungs.
Die cUNG wird vollständig inaktiviert, wenn über 60°C erwärmt wird, und die Deaktivierung ist vollständig irreversibel (weil es nach Wärmebehandlung kein nachweisbares Restenzym gibt). Diese Qualität macht cUNG zu einem besseren Kandidaten als Enzym zur Verwendung bei der Carry-over-Verhinderung in DNA-Kopierreaktionen (PCR, LCR usw.) als Enzyme, die vorher auf diesem Gebiet bekannt waren, wie E. Coli-UNG oder UNG von BMTU, welche nach Wärmebehandlung nicht vollständig und irreversibel inaktiviert wurden. Wegen der vollständigen und irreversiblen Deaktivierung von cUNG durch Wärmebehandlung, die normalerweise in PCR-Reaktionszyklen durchgeführt wird, gibt es kein nachweisbares Restenzym nach Wärmebehandlung. Dann gibt es keinen unerwünschten Abbau des DNA-Produktes in der Upscaling-Reaktion durch UDG-Enzymrestaktivität und selbstverständlich gibt es keine Notwendigkeit, Enzym-Inhibitor zuzufügen, um den Abbau von DNA durch derartige UDG-Enzymrestaktivität zu vermeiden.
Es ist gezeigt worden, dass die rekombinante cUNG (rcUNG) dieselben Qualitäten/Funktionen aufweist wie die aus der Kabeljauleber isolierte cUNG. Kabeljauleber enthält nur kleine Mengen cUNG. Wenn cUNG rekombinant erzeugt wird, können größere Mengen cUNG hergestellt werden als die Menge von cUNG, die durch Extraktion aus Kabeljauleber erzeugt wird.
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Sequenzverzeichnis

Claims

Isoliertes Enzym mit Urazil-DNA Glykosilaseaktivität, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym die Aminosäuresequenz, wie in SEQ. ID. NR. 1 oder SEQ. ID. NR. 2 gezeigt, oder funktionelle Teile davon mit derselben biologischen Aktivität aufweist, und wobei das Enzym vollständig und irreversibel inaktiviert wird, wenn es auf über etwa 60°C erwärmt wird.
Isoliertes Enzym gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich von einem Organismus ableitet, der an eine kalte Umgebung angepasst ist.
Isoliertes Enzym gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich von einem eukaryotischen Organismus ableitet, vorzugsweise vom atlantischen Kabeljau (Gadus morhua).
Isoliertes Enzym gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es eine detektierbare Markierung umfasst.
Isolierte DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie das Enzym gemäß einem der Ansprüche 1–4 kodiert.
Isolierte DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Nukleotidsequenz umfasst, die in der SEQ. ID. NR. 1 oder SEQ. ID. NR. 2 gegeben ist.
Isolierte DNA-Sequenz gemäß Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Promotor einschließt.
Isolierte DNA-Sequenz gemäß Anspruch 5, 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie in einem Expressionsvektor, wie einem Plasmid, Cosmid oder Virus, enthalten ist.
Isolierte DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 5–8, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine detektierbare Markierung umfasst.
Vektor, der die DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 5 bis 9 umfasst.
Vektor gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor pTrc99A ist.
Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass er den Vektor entweder gemäß Anspruch 10 oder 11 umfasst.
Mikroorganismus gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Säugetierzelle oder ein Bakterium ist.
Mikroorganismus gemäß Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass er ein E. coli-Stamm ist.
Verfahren zur Herstellung eines Enzyms gemäß den Ansprüchen 1–4, dadurch gekennzeichnet, dass es durch Extraktion aus natürlich vorkommenden Quellen oder durch rekombinante DNA-Technologie, Isolierung aus einem so erhaltenen Gemisch und Reinigung hergestellt wird.
Verwendung eines Enzyms gemäß einem der Ansprüche 1–4 zur Überwachung und/oder Kontrolle eines Reaktionssytems, das DNA-Sequenzen vervielfältigt, wie eine PCR oder LCR.
Verwendung eines Enzyms gemäß einem der Ansprüche 1–4 bei Verfahren zur Verhinderung von Verschleppungen.