JP4808352B2 - タラウラシル−ｄｎａグリコシラーゼ、これをコードする遺伝子、該遺伝子またはその機能性部分を含有する組換えｄｎａ、該タンパク質の調製法と、ｐｃｒの追跡もしくは調節における該タンパク質またはその機能性部分の使用 - Google Patents
タラウラシル−ｄｎａグリコシラーゼ、これをコードする遺伝子、該遺伝子またはその機能性部分を含有する組換えｄｎａ、該タンパク質の調製法と、ｐｃｒの追跡もしくは調節における該タンパク質またはその機能性部分の使用 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、タラの肝臓中に存在する新規酵素、その酵素またはその機能性（生物活性）部分をコードするＤＮＡ配列、該遺伝子またはその機能性部分を含有する新規組換えＤＮＡ、タラの肝臓および該遺伝子を有する細菌からの該酵素の調製方法、その遺伝子自体を有する細菌、およびＰＣＲもしくは関連する反応系の追跡および／または調節における該タンパク質の使用に関する。
【０００２】
（先行技術の説明）
ＤＮＡ中のウラシルは、ＤＮＡ中のシトシンの複製または脱アミノ化中の、ｄＴＴＰではなくｄＵＴＰの取り込みにより得られる。後者は、次のラウンドの複製で突然変異を引き起こす。酵素ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ、ＥＣ３．２．２．３）は、ＤＮＡ骨格からウラシル塩基が切り出され（リンダール（Lindahl）、１９９４）、アピリミジン部位を作成し、これが他のＤＮＡ修復酵素により認識されるという意味で、修復酵素として機能する。この酵素は、ＤＮＡの完全性を維持するのに決定的に重要であり、従って、多様な生物（ウイルス、原核生物、真核生物）中で見いだされている。
【０００３】
ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧまたはＵＤＧ）は、ウラシル含有ＤＮＡ中のデオキシリボース糖と塩基の間のＮ−グリコシル結合の加水分解を触媒し、大腸菌（Escherichia coli）から初めて単離され性状解析された（１）。これは、ＤＮＡからウラシルを除去する塩基切り出し修復（ＢＥＲ）の第１工程（２）であり、従って、作成されたアピリミジン部位は、ＢＥＲ経路中のＡＰエンドヌクレアーゼ、ホスホジエステラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡリガーゼ（他の酵素）により修復される（３〜５）。
【０００４】
数種類のクラスのウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）が開示されている。主要な型のＵＮＧは、ＵＮＧ−遺伝子によりコードされるＵＮＧである（６）。他のクラスは、サイクリン様ＵＤＧ２（７，８）、ヒトとアフリカツメガエル（Xenopus）（９）からの１本鎖選択性単官能性ＵＤＧ ＳＭＵＧ１、大腸菌（E. coli）（１０，１１）とサーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）ＵＤＧ（ＴＭＵＤＧ）（１２）から単離されたＧ／Ｔ：Ｕ特異的ミスマッチＤＮＡグリコシラーゼ（ＭＵＧ）を含む。
【０００５】
ＵＮＧは、モノマータンパク質で約２５〜３５ｋＤのサイズである。これは、補助因子や２価陽イオンに依存せず、異なる種の間で高度に保存されている（１３）。しかしＵＮＧは、イオン強度に影響を受ける。ＵＮＧ酵素は、前進型「スライド機構」（ここでは、ＤＮＡから解離する前に連続的ウラシル残基を配置する（１４，１５））と、明確な「ランダムヒット」機構（１６）で作用することが証明されている。ＵＮＧは、ラット肝臓（１７−１９）、ヒト細胞および組織（２０〜２８）、子ウシ胸腺（２９，３０）、変形菌（３１）、酵母（３２）、植物（３３，３４）、ブラインシュリンプ（３５）、原核生物（１，３６〜４５）、およびウイルス（４６，４７）から、すでに単離され、性状解析されている。
【０００６】
ヒトおよびラットの両方で、ミトコンドリアと核ＵＮＧが単離されている（１８，２５）。ヒト（およびマウス）細胞では、これらの２つは、同じ遺伝子（ＵＮＧ）によりコードされている（４８，４９）。２つの異なる翻訳開始部位と代替スプライシングにより、Ｎ末端シグナル配列のみが異なる２つの型が作成され、これは酵素を、それぞれ核（ＵＮＧ２）とミトコンドリア（ＵＮＧ１）に向ける（４９）。最近、Ｎ末端シグナル配列と、核とミトコンドリアへのＵＮＧのターゲティングについてさらなる研究が行われており（５０〜５２）、核ＵＮＧ２がリン酸化されていることが明らかになっている（２６）。ヒト、単純ヘルペスウイルスおよび大腸菌（E. coli）からＵＮＧの結晶構造が解明されている（５３〜５５）。活性部位残基は保存されており、これらの酵素中の作用モードは、ヌクレオチドフリップ機構と同じでＤＮＡからウラシルを除去するようである（５６，５７）。
【０００７】
例えばニシマダラ（Gadus morhua）のような低温順応した生物は、充分な代謝活性を維持するために、低温での化学反応速度の低下を補償しなければならない。これは、より高い転写／翻訳レベルまたは改良された触媒効率（ｋcat／ＫM）により行われる。より高い触媒効率は、中温性のものと比較してより柔軟な構造により達成され、これは、触媒中にコンフォメーション変化を受ける能力の上昇を提供する。ｐＨ、温度および変性剤に対する安定性の低下は、コンフォメーションの柔軟性の結果であると考えられる（５８）。
【０００８】
本発明は、低温順応した生物からの熱不安定性ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼの精製と性状解析に関し、これは、ＤＮＡコピー反応（ＰＣＲ、ＬＣＲなど）でのキャリーオーバーを防止するのに効率的な酵素として有用である。本発明に従って単離された酵素は、分子量、等電点、最適ｐＨおよび最適ＮａＣｌに関して、既に記載されているＵＮＧと同様の特徴を有する。しかし本発明の酵素は、組換え中温性ヒトＵＮＧと比較して、よりｐＨ不安定性かつ熱不安定性であり、低温で相対的に活性が高く、前記したようにキャリーオーバー防止における優れた候補となっている。
【０００９】
大腸菌（Escherichia coli）からのＵＮＧ（またはＵＤＧ）は、ＤＮＡ材料を増幅する時のキャリーオーバー防止に使用するために市販されている。
【００１０】
ＤＮＡ鋳型に基づいて特異的ＤＮＡ配列を増幅するために、種々の方法が使用される。一般的な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）系（米国特許第４，６８３，１９５号；４，６８３，２０２号；および４，９６５，１８８号）、リガーゼ増幅系（ＰＣＴ特許公報第８９／０９８３５号）、自立性配列複製系（ＥＰ第３２９，８２２号、およびＰＣＴ特許公報第９０／０６９９５号）、転写ベースの増幅系（ＰＣＴ特許公報第８９／０１０５０号およびＥＰ第３１０，２２９号）、およびＱβ ＲＮＡレプリカーゼ系（米国特許第４，９５７，８５８号）である。これらの方法は、非常に高感度であり、非常に少数の標的ＤＮＡ配列のコピーから、検出可能な量のＤＮＡを生成することができる。従ってこの方法は、環境からのＤＮＡによる汚染に対して非常に感受性である。主要な汚染源は、すでに行ったスケールアップ反応（例えば、ＰＣＲ反応（５９））からの生成物である。
【００１１】
この問題を克服するために、標的ＤＮＡと前の反応からの汚染ＤＮＡ（例えば、ＰＣＲ生成物ＤＮＡ）とを区別する方法が開発されている（６０）。基本的に、すべての増幅反応は、ｄＵＴＰとｄＴＴＰとを使用して行われ、こうしてウラシルをチミジンの代わりにＤＮＡ中に取り込む。次に、すべての以後の反応混合物をＵＤＧ（またはＵＮＧ）で処理する。以下の熱処理は、非塩基性部位でのホスホジエステル結合の加水分解により、汚染ＤＮＡを分解させる。また熱処理は、ＵＤＧ酵素を不活性化させると考えられる。
【００１２】
しかし、大腸菌（E. coli）のＵＤＧ（またはＵＮＧ）酵素は、熱処理により完全に不活性化され、不活性化は完全には不可逆的ではない（６０）。これは、生成物は残存するＵＤＧ酵素活性により分解されるため、スケールアップ反応（例えば、ＰＣＲ反応）の生成物の完全性に影響を与える。これを避けるため、次に酵素インヒビターがＵＤＧに添加されている（米国特許第５，５３６，６４９号）。
【００１３】
しかし、これは反応の余分の工程であり、インヒビターにより残存する汚染が以後の反応に存在し、インヒビターの購入は、前記したようにＰＣＲ反応を行う時に余分のコストとなるため、以後のインヒビターを使用して避けることが好ましい。
【００１４】
すなわち、ＰＣＲ反応後に熱処理により破壊／不活性化されることが確実なＵＮＧ（またはＵＤＧ）酵素を使用し、こうしてＵＤＧ酵素の特異的化学インヒビターの添加を避けることが好ましいであろう。
【００１５】
（図面の詳細な説明）
図１は、ニシマダラのＵＮＧ（ｃＵＮＧ）のｐＩ測定を示す。ファストゲル（Phast Gel）ＩＥＦ３−９を使用して等電点電気泳動を行った後、ゲルを２mmの切片に切断する。各片をエッペンドルフ試験管に移し、４℃で一晩インキュベートした。次に、材料と方法に記載するように活性を測定した。
【００１６】
図２は、遊離のウラシルによるｃＵＮＧの生成物阻害を示す。異なる濃度のウラシルを測定混合物に加え、材料と方法に記載するように測定を行った。
【００１７】
図３は、枯草菌（Bacillus subtilis）バクテリオファージウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（Ｕｇｉ）によるｃＵＮＧの阻害を示す。標準測定条件を使用して材料と方法に記載のように、６．６５×１０-4ＵのｃＵＮＧを１．２５×１０3Ｕ〜２．００×１０2ＵのＵｇｉとインキュベートした。１単位のＵｇｉは、１単位のＵＮＧ活性を阻害し、ここでＵＮＧ活性は、３７℃で１分間に６０pmolのウラシルを放出するものと定義する。
【００１８】
図４は、ｃＵＮＧのｐＨと最適ＮａＣｌを示す。ｃＵＮＧの活性を、材料と方法に記載するように、種々の塩化ナトリウムと異なるｐＨシリーズで測定した。ＵＮＧ活性パーセントは、５０mMのＮａＣｌでｐＨ７．５で測定した最も高い値に対するものである。
【００１９】
図５は、ｃＵＮＧの最適温度を示す。実験中に酵素試料を氷上で長時間インキュベートしたため、材料と方法に記載のように酵素の安定性に関して酵素の活性が補正される。
【００２０】
図６は、ｃＵＮＧ（△）とｒｈＵＮＧ（□）の温度プロフィールを示す。酵素活性は、材料と方法に記載のように測定した。ＵＮＧ活性パーセントは、ｃＵＮＧ（４５℃）とｒｈＵＮＧ（５０℃）についての最も高い値に対するものである。実験中に酵素試料を氷上で長時間インキュベートしたため、材料と方法に記載のように酵素の安定性に関して酵素の活性が補正される。
【００２１】
図７は、ニシマダラＵＮＧ（ｃＵＮＧ）と組換えヒトＵＮＧ（ｒｈＵＮＧ）のｐＨ安定性を示す。異なるｐＨ緩衝液で、１ＵのｃＵＮＧ（△）とｒｈＵＮＧ（□）を、３７℃で１０分間インキュベートした。次に５μｌのアリコートを測定混合物に移し、材料と方法に記載のように標準測定条件を使用して、残存活性を測定した。ｐＨ８．０で希釈した試料を、インキュベーション工程無しで、直接１００パーセント活性を測定した。
【００２２】
図８は、ニシマダラＵＮＧ（ｃＵＮＧ）（△）と組換えヒトＵＮＧ（ｒｈＵＮＧ）（□）の温度安定性を示す。
酵素（１Ｕ）を、５０℃、３７℃、２５℃、および４℃でインキュベートし、５μｌのアリコートを、異なる時間間隔後に測定混合物に移し、材料と方法に記載のように標準測定を行った。半減期は、ｃＵＮＧについて０．５分（５０℃）、２０分（３７℃）、６０分（２５℃）および２時間（４℃）であり、ｒｈＵＮＧについて８分（５０℃）、３０分（３７℃）、１５０分（２５℃）および２．６時間（４℃）と決定された。
【００２３】
図９は、組換えタラＵＮＧ（ｒｃＵＮＧ）を使用して、キャリーオーバー防止試験からのＰＣＲ産物を示すアガロースゲルである。レーンの説明：レーン１と８：ＤＮＡラダー；レーン２：Ｔ−含有鋳型、ＵＮＧ無し；レーン３：Ｔ−含有鋳型、１．７×１０-3Ｕ ｒｃＵＮＧ；レーン４：Ｕ−含有鋳型、４×１０-4Ｕ ｒｃＵＮＧ；レーン５：Ｕ−含有鋳型、１．７×１０-3Ｕ ｒｃＵＮＧ；レーン６：Ｕ−含有鋳型、４×１０-4Ｕ 大腸菌（E. coli）ＵＮＧ；レーン７：Ｕ−含有鋳型、ＵＮＧ無し。
【００２４】
（本発明の目的）
本発明の目的は、ＤＮＡ増幅反応（例えば、前述したＰＣＲ）ためのキャリーオーバー防止法で機能し、かつＰＣＲ反応サイクルで通常行われる熱処理により完全かつ不可逆的に不活性化される新規ＵＮＧ（またはＵＤＧ）酵素を提供する。
【００２５】
さらに本発明の目的は、そのような酵素またはその活性部分をコードするＤＮＡ配列、そのようなＤＮＡ配列を有するベクターもしくはベクター系（例えば、ウイルス、プラスミド、コスミドなど）、およびそのようなベクターを含む微生物を提供することである。
【００２６】
また本発明の目的は、遺伝子操作法を使用して、酵素またはその活性部分を効率的に産生する方法を提供することである。
【００２７】
（発明の詳細な説明）
低温環境に生きている低温に順応した生物（例えば、ニシマダラ（Gadus morhua））の酵素は、充分な代謝活性を維持するために低温での化学反応速度の低下を補わなければならない。これは、より高い転写／翻訳レベル、または改良された触媒効率（ｋcat／ＫM）により行うことができる。このより高い効率は、中温性のものと比較してより柔軟な構造により達成され、これは、触媒中にコンフォメーション変化を受ける能力の上昇を提供する。ｐＨ、温度および変性剤に対する安定性の低下は、コンフォメーションの柔軟性の結果であると考えられる（５８）。
【００２８】
ＤＮＡ配列を増殖（ＰＣＲ、ＬＣＲ）する時のキャリーオーバー防止法において先行技術のＵＤＧによる汚染の欠点を考えると、簡単な熱処理により１００％分解されたＵＤＧ（またはＵＮＧ）酵素を提供することが非常に好ましいであろう。タラから単離されたＵＮＧ（またはＵＤＧ）酵素は、この貴重な性質を有することがわかった。本発明に従って単離されたタラＵＮＧ酵素は、分子量、等電点、最適ｐＨおよび最適ＮａＣｌに関して、既に記載されているＵＮＧと同様の特徴を有するが、本発明のタラＵＮＧは、組換え中温性ヒトＵＮＧと比較して、よりｐＨ不安定性かつ熱不安定性であり低温で相対的に活性が高い。
【００２９】
本発明の酵素は、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性を有し、約６０℃より高温に加熱されると完全に不活性化される。この温度閾値は、数度の範囲で変動することを理解されたい。
【００３０】
本発明の酵素は好ましくは、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的機能性部分を有する。
【００３１】
本発明の酵素は、好ましくは低温環境に順応した生物から得られ、さらに好ましくは生物は真核生物であり、最も好ましくは生物はニシマダラである。
【００３２】
本請求項で定義される新規酵素をコードするＤＮＡ配列は、本発明の別の態様である。好ましくはＤＮＡ配列は、配列番号１または２に記載のヌクレオチド配列を有する。本発明のＤＮＡ配列は、好ましくはプロモーターを含有し、発現ベクター（例えば、プラスミド、コスミドまたはウイルス）中で含有される。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、請求項に記載の本発明のＤＮＡ配列を含む微生物、およびＤＮＡ配列を増殖させる反応系（例えば、ＰＣＲまたはＬＣＲ）の追跡および／または調節における酵素の使用である。特に本発明の酵素は、キャリーオーバー防止法において使用される。
【００３４】
以下に、本発明の関連するタラＵＮＧタンパク質の単離、ならびにこのタンパク質をコードするＤＮＡの単離、および本発明の関連するＵＮＧ酵素を組換え法で産生するための微生物におけるその使用が開示される。
【００３５】
例１
タラＵＮＧ（ｃＵＮＧ）の抽出、精製および性状解析
【００３６】
ｃＵＮＧの精製
粗抽出物の調製とすべての精製工程は、４℃で行った。以下の材料を使用した：Ｑ−セファロースＦＦ、Ｓ−セファロースＦＦ、ヘパリンセファロースＨＰ（ハイトラップ（Ｈｉ−ｔｒａｐ）５ml）、ポリ−Ｕ−セファロース４Ｂ、スーパーデックス７５ＨＲ１０／３０、ファストシステム（Phast system）とファスト（Phast）ＩＥＦゲル（３〜９）およびＬＭＷゲルろ過較正キットは、アマシャムファルマシアバイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）（ウプサラ（Uppsala）、スエーデン）から得た。デオキシ［５−3Ｈ］ウリジン５’−三リン酸（１９．３Ci/mmol）は、アマシャム（Amersham）（英国）から購入した。ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（Ｕｇｉ）は、ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs）（ビバリー、マサチューセッツ州）から得て、酵素はプロメガ（Promega）（マジソン、ウィスコンシン州）から購入した。プロテアーゼインヒビター、子ウシ胸腺ＤＮＡ（Ｄ−１５０１）、ウラシル、デオキシウリジン、およびデオキシウリジン−一リン酸は、シグマ（Sigma）（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。すべての他の試薬と緩衝液は、シグマ（Sigma）とメルク（Merch）（ダルムシュタット（Darmstadt）、ドイツ）から購入した。
【００３７】
粗抽出物の調製
６００mlの抽出緩衝液（２５mM トリス／塩酸、１００mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１mM ＤＴＴ、１０％グリセロール、ｐＨ８．０（２５℃））に、２００ｇの新鮮なタラの肝臓を加え、アトミックス（Atomix）ホモジナイザー（ＭＳＥ、イングランド）中でホモジナイズした。ホモジナイズの前に、以下のプロテアーゼインヒビター混合物を各緩衝液に加えた：１mM ＰＭＳＦ、１μＭペプスタチン、１μＭロイペプチン、１０μＭ ＴＰＣＫおよび１０μＭ ＴＬＣＫ（最終濃度）を加えた。ホモジネートを２８，０００ｇで１５分遠心分離し、上清をガラスウールでろ過した。最後にグリセロールを３０％（v/v）になるように加え、タラ肝臓の粗抽出物を−７０℃で凍結した。
【００３８】
Ｑ−セファロースファーストフロー（Q-sepharose Fast Flow）
１リットルの粗抽出物を１リットルの緩衝液Ａ（２５mM トリス／塩酸、１０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１％グリセロール、ｐＨ８．０）で希釈した（画分１）。緩衝液Ａで平衡化したＱ−セファロースＦＦカラム（５．０／１５）に、試料を２回（各１リットル）で適用し、次に２５０mlの緩衝液Ａで流速１０ml／分で洗浄した。カラムに結合したタンパク質を２００mlの緩衝液Ａ＋１．０Ｍ ＮａＣｌで溶出し、カラムを緩衝液Ａで再平衡化した後、前記したように試料の次の部分を適用した。ＵＮＧ含有フロースローと２つのランの洗浄画分をプールした（画分２、２３４０ml）。
【００３９】
Ｓ−セファロースファーストフロー（S-sepharose Fast Flow）
画分２を、緩衝液Ａで流速１０ml／分で平衡化したＳ−セファロースＦＦカラム（１．６／１０）に加えた。カラムを３００mlの緩衝液Ａ＋６０mM ＮａＣｌで洗浄し、緩衝液Ａ中０．０６〜０．４Ｍ ＮａＣｌの２００mlの線形勾配で５ml／分を使用して溶出した。ＵＮＧ含有画分をプール（５５ml）し、緩衝液Ａで一晩透析した（画分３）。
【００４０】
ヘパリンセファロースハイパフォーマンス
画分３を、緩衝液Ａで平衡化したヘパリンセファロースＨＰハイトラップカラム（１．６／２．５）に適用した。カラムを５０mlの緩衝液Ａ＋６０mM ＮａＣｌで洗浄し、緩衝液Ａ中０．０６〜０．４Ｍ ＮａＣｌの５０mlの線形勾配で流速１ml／分で溶出した。ＵＮＧ含有画分をプールした（画分４、２０ml）。
【００４１】
ポリ−Ｕセファロース（４Ｂ）
次に画分４を緩衝液Ａで５倍に希釈し、緩衝液Ａで平衡化したポリ−Ｕセファロースカラム（１．６／１０）に適用した。カラムを６０ml緩衝液Ａ＋６０mM ＮａＣｌで洗浄し、緩衝液Ａ中０．０６〜０．４Ｍ ＮａＣｌの２００mlの線形勾配で流速１ml／分で溶出した。ＵＮＧ含有画分をプールした（画分５、７０ml）。
【００４２】
スーパーデックス７５
画分５を、ウルトラフリー（Ultrafree）１５とウルトラフリー−ＭＣ（Ultrafree-MC）超遠心分離フィルター（ミリポア（Millipore））（カットオフ５Ｋ）を使用して２００μｌに濃縮し、緩衝液Ａで平衡化したゲルろ過カラム（ＨＲ１．０／３０）に、流速０．５ml／分で適用した。画分（３５０μｌ）を集め、ＵＮＧ活性を有するものをプールした（画分６、３ml）。
【００４３】
ニックトランスレーションによる基質の調製
ニックトランスレーションとポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により3Ｈ−ｄＵＭＰ ＤＮＡを調製した。ニックトランスレーションした基質を、総量１mlで作成し、５０mM トリス／塩酸、ｐＨ７．２、１０mM ＭｇＳＯ4、１mM ＤＴＴ、２５０μｇ子ウシ胸腺ＤＮＡ（フェノール／クロロホルムにより精製し、エタノール沈殿してから使用した）、０．１mM ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ（ここで、３μＭのｄＵＴＰは［3Ｈ］−ｄＵＴＰであった、１９．３Ci/mmol）を含有した。次に０．１ng（５．３５×１０-4Ｕ）のＤＮａｓｅＩ（ウシ膵臓、プロメガ（Promega））を加え、３０秒後２５Ｕの大腸菌（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼとニックトランスレーション混合物を２１℃で２４時間インキュベートした。ニックトランスレーションしたＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出により精製し、エタノール沈殿した。ＤＮＡを、５０μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁し、ＴＥ緩衝液（１０mM トリス／塩酸、１mM ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で平衡化したＮＡＰ−５カラム（エーピーバイオテク（AP Biotech））で精製して、取り込まれなかったヌクレオチドを除去した。ニック基質の比活性は１．８×１０5 dpm/μｇ（４２５cpm/pmol）であった。
【００４４】
ＰＣＲによる基質の調製
ＰＣＲ産生した基質を、すべての解析実験に使用し、これはタイセイヨウサケ （サルモ・サラー（Salmo salar））の陽イオン性トリプシノーゲン（ｓｓｔｒｐＩＶ）から作成した７６１bp断片からなっていた（６１）。パーキンエルマーシータス（Perkin Elmer Cetus）サーマルサイクラー中で５０μｌの容量で、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ混合物は、１０mM トリス／塩酸、ｐＨ８．３、５０mM ＫＣｌ、６mM ＭｇＣｌ2、０．３７mM ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＵＴＰ（ここで、１０．４μＭのｄＵＴＰは［3Ｈ］−ｄＵＴＰであった、１７．０Ci/mmol、アマシャム（Amersham））、７００pgの鋳型ＤＮＡ（ｐｇｅｍ７ｚｔ−ベクター中のｓｓｔｒｐＩＶ）、２．５μＭの上流プライマーと下流プライマー、および２ＵのＴａｑポリメラーゼ（ロッシュ（Roche）、スイス）を含有した。ＰＣＲ反応は、９４℃１分、４５℃１分、７２℃１分を３０サイクル行った。次にさらに２ＵのＴａｑポリメラーゼを加え、ＰＣＲ反応を前記したように新しい３０サイクル続けた。ＰＣＲ基質を、製造業者の説明に従って、キアクイック（QIAquick）ＰＣＲ精製キット（キアゲン（Quiagen））で精製し、５０×希釈ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出した。ＰＣＲ基質の比活性は、５．９×１０5 dpm/μｇ（４５１cpm/pmol）であった。すべての解析実験は、ＰＣＲ基質を使用して行った。
【００４５】
ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性の検出（標準測定法）
ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性を、７０mMトリス／塩酸、１０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１００μg/ml ＢＳＡおよび２３０ngのニック基質または７１ngのＰＣＲ基質を含有する最終容量２０μｌで測定した。反応混合物を３７℃で１０分インキュベートし、２０μｌの氷冷１本鎖子ウシ胸腺ＤＮＡ（１mg/ml）と５００μｌの１０％（w/v）ＴＣＡを加えて停止させた。試料を氷上で１５分インキュベートし、１６，０００ｇで１０分遠心分離した。酸溶解性3Ｈ−ウラシルを有する上清を、液体シンチレーションカウンターを使用して分析した。
１単位の活性は、３７℃で１分間に１nmolの酸可溶性ウラシルを放出させる酵素の量と定義する。
【００４６】
薄層クロマトグラフィーによる測定生成物の分析
測定後の反応生成物を２０nmolのウラシル、デオキシウリジンおよびデオキシウリジン−一リン酸と混合した。ワングとワング（Wang and Wang）の方法に従って、ポリアミド層プレート（ＢＤＨ）とテトラクロロメタン、酢酸、およびアセトン（４：１：４、容量）を溶媒として使用して、薄層クロマトグラフィーを行った（６２）。ＵＶ光により検出されたスポットをプレートから切り出し、液体シンチレーションカウンターで放射能を測定した。
【００４７】
分子量測定
ゲルろ過により分子量を測定し、２５mMトリス／塩酸、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１％グリセロール（ｐＨ８．０）を含有する緩衝液で平衡化したスーパーデックス７５カラム（１．０／３０）で行った。流速は０．５ml／分であり、採取した画分で活性を測定した（２５０μｌ）。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、６７ｋＤ）、オバルブミン（４３ｋＤ）、キモトリプシノーゲンＡ（２５ｋＤ）およびリボヌクレアーゼＡ（１３．７ｋＤ）を、標準物質として使用した。ブルーデキストランと塩化ナトリウムを使用して、それぞれボイド（Ｖ0）容量と内部容量（Ｖi）を決定した。
【００４８】
タンパク質測定
タンパク質濃度は、クマシー（登録商標）プロテインアッセイ試薬Ｇ−２５０（ピアス（Pierce）、ニューヨーク、ニューヨーク州）を用いて、ブラッドフォード（Bradford）の方法（６３）により測定し、マイクロタイタープレートプロトコールは製造業者の説明書に従って、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準物質として使用して測定した。
【００４９】
等電点測定
等電点測定は、ファーストシステム（Phast-system）、等電点電気泳動ゲル３−９を用いて、製造業者が記載する方法に従って銀染色して行った。使用した標準物質は、フィコシアニン（４．４５、４．６５、４．７５）、β−ラクトグロブリンＢ（５．１０）、ウシカーボニックアンヒドラーゼ（６．００）、ヒトカーボニックアンヒドラーゼ（６．５０）、ウマミオグロビン（７．００）、ヒトヘモグロビンＡ（７．１０）、ヒトヘモグロビンＣ（７．５０）、レンチルレシチン（７．８、８．０、８．２）、チトクロムｃ（９．６）、（ＩＥＦ標準物質ｐＩ範囲 ４．４５〜９．６、バイオラッド（Bio-Rad））である。電気泳動後、ゲルを２mm片に切断し、それぞれ２５０μｌの抽出緩衝液（５０mMトリス／塩酸、０．２Ｍ ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１％（v/v）グリセロール、ｐＨ８．０）で一晩インキュベートした。５μｌのアリコートを測定混合物に移し、標準測定条件を使用して活性を測定した。
【００５０】
最適ｐＨ／ＮａＣｌの測定
測定は、標準測定法に記載したように２０μｌの容量で、ＰＣＲ作成基質と、０〜２００mMの濃度のＮａＣｌ（２５mMの間隔）を使用して、ｐＨ範囲は９．５〜６．５（０．５ｐＨ単位の間隔）で行った。使用したすべての緩衝液は、ジエタノールアミン／ＨＣｌ（９．５〜８．５）、トリス／塩酸（８．５〜７．５）、およびＭＯＰＳ／ＮａＯＨ（７．５〜６．５）である。すべての緩衝液とｐＨは、３７℃で調整し、測定中２５mM濃度で使用した。
【００５１】
最適温度の測定
測定は、標準測定法に記載したように２０μｌの容量で、ＰＣＲ作成基質を使用して行った。測定混合物は、標準測定条件で記載したものであり、すべての温度についてｐＨ８．０に調整した。使用した温度範囲は、５℃〜６０℃であった。活性は、各温度の間に１５分間の間隔で、連続的に測定した。使用した酵素は、標準希釈緩衝液（５mMトリス／塩酸、１０mM ＮａＣｌ、１％（v/v）グリセロール、ｐＨ８．０）で希釈し、氷上に置いた。氷上に長時間置くと酵素試料が不安定なため、結果は、氷上で希釈緩衝液中の酵素の安定性に関して、
【外１】
（ここで、ｃＵＮＧとｒｈＵＮＧの半減期（λ）はそれぞれ２．０時間と２．６時間である）を用いて補正した。
【００５２】
ｐＨと温度の安定性への影響
ｐＨ： ＵＮＧ（０．０１Ｕ）を、１０mM緩衝液、１０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１％グリセロールを含有する緩衝液中で、ジエタノールアミン／ＨＣｌ（９．５〜８．５）、トリス／塩酸（８．５〜７．５）、ＭＯＰＳ／ＮａＯＨ（７．５〜６．５）およびＭＥＳ／ＮａＯＨ（６．５〜５．５）を緩衝液成分として使用して、ｐＨ範囲９．５〜６．５で（０．５ｐＨ単位の間隔）で、３７℃で１０分間プレインキュベートした（総量７５μｌ）。５μｌのアリコートを測定混合物中に移し、標準測定条件を使用して残存活性を測定した。
【００５３】
温度： ＵＮＧ（０．０１Ｕ）を、１０mMトリス／塩酸、５０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１％グリセロール、ｐＨ８．０（各温度で調整した）中で１０分間プレインキュベートした（総量７５μｌ）。図の凡例に示すように、異なる時間間隔後、５μｌのアリコートを測定混合物に移し、標準測定条件を使用して残存活性を測定した。
【００５４】
ｓｓ／ｄｓＤＮＡに対する基質特異性
ＰＣＲとニックトランスレーションした基質を、１００℃で３分間インキュベートし、次に氷上で急速に冷却してｓｓＤＮＡを作成した。変性後、ｓｓＤＮＡ−基質を、６．６５×１０-4Ｕの精製ｃＵＮＧを用いる標準測定条件で使用した。酵素活性もまた、ニック−およびＰＣＲ−基質の両方についてｄｓＤＮＡ−基質を使用して測定し、標準として使用した。
【００５５】
Ｕｇｉインヒビター−およびウラシル生成物阻害
ＰＣＲ−基質を使用する活性測定を、６．６５×１０-4Ｕの精製ｃＵＮＧを用いて行った。種々の濃度のウラシル（０、１、２および５mM）のＵｇｉ−インヒビター（１．２５×１０3 Ｕ〜２．００×１０2Ｕ）を測定混合物に加えた（氷上）。次に、標準測定条件に記載したように活性を測定した。
【００５６】
結果
ｃＵＮＧの精製
表１に示すようにニシマダラＵＮＧを、回収率２％で１７，０００倍精製した。高い精製倍数にもかかわらず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定すると酵素は部分的にしか精製されなかった。また、精製工程が多いことと、ゲルろ過工程前の希釈タンパク質試料の濃縮のため、収率は低かった。
【００５７】
分子量とｐＩ測定
分子量は、ゲルろ過により３つの異なる実験から、２５ｋＤ±２であると決定された。４．４２〜９．６の範囲のＩＥＦ標準物質を用いてＩＥＦファーストゲル（Phast Gel）で、等電点測定を行った。ＩＥＦ後、ゲル断片からｃＵＮＧ活性を溶出し、活性を材料と方法に記載のように測定した。図１に示すように、ｃＵＮＧ活性はチトクロムｃ（等電点９．６の標準物質）と同時溶出された。電極がゲルと接触するところでは、チトクロムｃとｃＵＮＧ活性が見いだされ、従ってｐＩは９．０より大きいとしか結論できず、これは、このシステムを使用して測定可能な最も高い値である。
【００５８】
基質特異性
ｓｓＤＮＡとｄｓＤＮＡの両方を使用して、ｃＵＮＧ活性を測定した。表２に示すように、ニック−およびＰＣＲ−基質を使用して、それぞれ１．８倍と１．９倍高い活性が見いだされた。測定生成物を薄層クロマトグラフィーにより解析すると、放射能の主要な部分はウラシルとして同定された。しかし一部の放射能は、デオキシウリジンマーカーとともに局在化されたが、これは、２つのマーカーが部分的に重複するためであった。さらに、精製したｃＵＮＧは、3Ｈ−アデニン標識ＤＮＡの有意な加水分解を示さず、従ってＤＮＡを加水分解するのに関与するとしてヌクレアーゼは除外される。
【００５９】
阻害試験
遊離のウラシルによる生成物阻害を試験し、図２に示すように測定混合物中で１mMのウラシルで５０％を越える阻害が得られた。測定混合物に５mMの遊離のウラシルを与えると、活性の７８％阻害が観察された。測定混合物にＵｇｉを加えて、ｃＵＮＧへのＵｇｉの作用を測定した。図３に示すように、ｃＵＮＧはＵｇｉにより明らかに阻害された。
【００６０】
最適ｐＨとＮａＣｌ
図４に示すように、０〜２００mMのＮａＣｌ濃度を使用して、異なるｐＨで酵素活性を測定して、最適なｐＨと塩化ナトリウム濃度を調べた。酵素は広い最適ｐＨを示し、最大活性はｐＨ７．０〜９．０で２５〜５０mMのＮａＣｌであった。最適ＮａＣｌのシフトが観察され、最適ＮａＣｌ濃度は、高ｐＨの低濃度から低ｐＨの高濃度へ変化した。ｐＨ９．５でｃＵＮＧはＮａＣｌにより阻害された。
【００６１】
最適温度
ｃＵＮＧの最適温度は、４１℃であると決定された（図５）。低温でｃＵＮＧの活性を中温性ｒｈＵＮＧと比較するために、５〜６０℃で酵素活性を測定し、低温での活性は、各最適温度に匹敵した（図６）。これら２つの酵素の活性プロフィールは、５〜１５℃でほとんど差はなかった。しかし２０〜４０℃の温度では、ｒｈＵＮＧよりｃＵＮＧでより相対的に高い活性が観察され、高温（５０〜６０℃）では、逆が観察された。
【００６２】
安定性
異なるｐＨで酵素をインキュベートすることにより、２つのＵＮＧ酵素の安定性を比較した。ニシマダラＵＮＧは、ｐＨ７．０〜８．５で最も安定であった。ｐＨ５．５とｐＨ１０．０では、１％未満の残存活性であった。ｒｈＵＮＧは、ｐＨ７．０〜９．５で最も安定であった。図７に示すように、ｐＨ５．５では、３％の活性が残存したが、ｐＨ１０．０では６６％もの活性が残存した。２つのＵＮＧ酵素の温度安定性を、４℃、２５℃、３７℃、および５０℃で比較した。５０℃では半減期は、ｃＵＮＧとｒｈＵＮＧについてそれぞれ０．５分と８分であった。調べたすべての温度で、ｒｈＵＮＧはｃＵＮＧより安定であった。測定された半減期は、ｃＵＮＧについて２０分（３７℃）、６０分（２５℃）、および２時間（４℃）であり、ｒｈＵＮＧについては３０分（３７℃）、１５０分（２５℃）および２．６時間（４℃）であったが、図８に示すように、高温で半減期の大きな差が見られた。
【００６３】
考察
精製と分子量
ニシマダラ（Gadus morhua）の肝臓からのウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを、数種類のクロマトグラフィー法を使用して１７，６７９倍精製した。それでも酵素はわずかに精製されたのみであり、いくつかの他のバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に見られた。
【００６４】
ヒトの核およびミトコンドリアウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼは、代替スプライシングにより産生され、それぞれ３１３と３０４アミノ酸のＯＲＦを有する（４９）。ｃＵＮＧの分子量は、２５ｋＤであると測定された。これは、ヒト胎盤（２９ｋＤ）とｒｈＵＮＧ（ＵＮＧΔ８４）（２７ｋＤ）について測定したものとほぼ同じ分子量であり、ミトコンドリアＯＲＦ（２１、６４）から予測されるように、最初のＮ末端アミノ酸がそれぞれ７７と８４個が欠如していた。これは、精製ｃＵＮＧ中のＮ末端シグナル配列が、プロセシングされるかまたは精製中に人工的に切断されるか、またはニシマダラＵＮＧが、Ｎ末端シグナル配列を持たないことを示唆している。精製中に、ラットまたはヒト起源（１８、２３）のＵＮＧの精製中に既に記載されているような２つの異なるＵＮＧの兆候はなかった。しかし脊椎動物として、ニシマダラは核とミトコンドリア型の両方のＵＮＧを有することが予測されるが、これまでのところこれを確認する試みはなされていない。
【００６５】
ニシマダラからのウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼは、すでに精製され高ｐＩ（１９）について性状解析された他のウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼと似ており、ｄｓＤＮＡよりｓｓＤＮＡに対して２倍の選択性があった（１９）。
【００６６】
Ｕｇｉとウラシルによる阻害
枯草菌（Bacillus subtilis）バクテリオファージＰＢＳ２ ＵＤＧ−インヒビター（Ｕｇｉ）は、生理学的条件下でＵＮＧと安定な複合体を形成することにより、ＵＮＧを阻害する。Ｕｇｉは、保存されたＤＮＡ結合グルーブにベータ鎖を挿入することによりヒトＵＮＧに結合し（６７）、ＤＮＡを模倣する（６８）ことにより作用する。これは、ｃＵＮＧの基質結合部位の構造が、Ｕｇｉインヒビターにより阻害される他のＵＮＧに似ていることを示す。遊離のウラシルによる阻害は、すでに報告されている値（１９）と一致した。
【００６７】
最適条件
ｃＵＮＧは、７．０〜９．０の広い最適ｐＨを有することが証明され、活性はＮａＣｌ濃度により強く影響を受けた。広い最適活性は、性状解析されたいくつかの他のＵＮＧですでに報告されている（２３、３１、４０、４７）。興味深いことにｃＵＮＧの最適ＮａＣｌは、ｐＨが低下すると上昇する。ＵＮＧは低イオン強度で前進型で機能することがすでに証明されており、これは、ＮａＣｌ濃度が上昇すると、酵素が分散性機構にスイッチする（１４、１５）。しかしプルマル（Purmal）らは、反対のことを報告し、ＵＮＧは低イオン強度では分散性機構で作用するとしている。前進性機構は、いくつかのＤＮＡ相互作用性タンパク質（ポリメラーゼ、レプレッサー、制限酵素／修飾酵素、ＤＮＡ修復酵素）で共通の特徴であり、相互作用は一般的に自然界では静電的である（６７〜７１）。ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）からのＵＶエンドヌクレアーゼでは、前進性機構はｐＨ依存性であることが証明されている（７２）。従って我々は、ｐＨの上昇による最適ＮａＣｌのシフトは、ｃＵＮＧの前進性／分散性を反映していると考えている。以前の報告の議論はまた、すでに考察した差違以外に、異なる緩衝液成分によるかも知れない。
【００６８】
最適温度（４１℃）は、中温性ｒｈＵＮＧ（４５℃）よりわずかに低かった（６４）。５〜４５℃の温度での相対活性は、ｒｈＵＮＧよりｃＵＮＧについて高かった。４５℃より高い温度では、ｒｈＵＮＧは、おそらくｃＵＮＧの低温での安定性の結果として、ｃＵＮＧより高い相対活性を示す。
【００６９】
温度とｐＨ安定性
低温順応した種から解析された酵素は、おそらく低温での酵素活性を維持するためのその柔軟性のある構造のために、より温度不安定性かつｐＨ不安定性であることがわかった（７３）。ｃＵＮＧは、ｒｈＵＮＧよりｐＨと温度に対して不安定であることがわかり、これは、他の低温順応酵素の公知の特徴である（７３、７４）。
【００７０】
海洋微生物からの好冷ＵＮＧは、すでに単離されており、温度安定性に関して大腸菌（E. coli）ＵＮＧに匹敵した（４５）。この原核生物ＵＮＧは、４０℃で半減期が２分であり、４５℃で０．５分で、大腸菌（E. coli）ＵＮＧについての２７分と８分に匹敵した。温度とｐＨ安定性の両方について、ｃＵＮＧをｒｈＵＮＧと比較した。５０℃では、ｒｈＵＮＧは半減期が８分であり、ｃＵＮＧでは０．５分であった。より低い温度では、半減期の差は小さかったが、すべての調べた温度でｒｈＵＮＧはｃＵＮＧより安定であった。両方の酵素とも、低ｐＨでは不安定であり、高ｐＨでは、ｃＵＮＧよりｒｈＵＮＧがより安定であった。
【００７１】
結論として、ニシマダラからのＵＤＧは、分子量、高ｐＩ、広い最適ｐＨおよびｄｓＤＮＡよりｓｓＤＮＡに対する２倍の選択性に関して、すでに精製され性状解析されている他のウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼに似ていることが証明された。しかしｃＵＮＧは、温度とｐＨに対してより不安定であり、低温では中温性ｒｈＵＮＧより高い相対活性を有することが証明された。
【００７２】
例２
ニシマダラ（Gadus morhua）からのウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子の単離
以下の材料を使用した：スーパースクリプト（SuperScript）（登録商標）II ＲｎａｓｅＨ-逆転写酵素（ギブコビーアールエル（Gibco BRL））、パッケージーン（Packagene）（登録商標）ラムダＤＮＡパッケージシステムは、プロメガ（Promega）（マジソン、ウィスコンシン州）から購入し、デオキシ［５−3Ｈ］ウリジン５’−三リン酸（１７．０Ci/mmol）は、アマシャム（Amersham）（英国）から購入し、発現ベクターpTrc99Aは、アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）（ウプサラ、スエーデン）から購入し、制限酵素は、ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs）（ビバリー、マサチューセッツ州）から購入し、スマート（SMART）（登録商標）ＰＣＲ ｃＤＮＡライブラリー構築キットとマラソン（Marathon）（登録商標）ｃＤＮＡ増幅キットは、クロンテク（Clontech）（パロアルト、カリホルニア州）から購入した。大腸菌（Escherichia coli）ＮＲ８０５２［Δ（pro-lac）、thi-、ara、trpE9777、ung1］（７５、７６）と精製組換えヒトＵＮＧ（ＵＮＧΔ８４）（６４）は、ハンス・イー・クロカン（Hans E. Krokan）博士（癌研究と分子生物学研究所（Institute for Cancer Research and Moleecular Biology）、ノルウェー科学技術大学（Norwegian University of Science and Technology））により提供された。
【００７３】
ｍＲＮＡの単離
オリゴテックス（Oligotex）直接ｍＲＮＡミディキット（キアゲン（Quiagen））を使用して、製造業者のプロトコールの指示に従って、２５０mgのタラ肝臓からｍＲＮＡを単離した。
【００７４】
ｃＤＮＡの調製
スマート（SMART）（登録商標）ＰＣＲ ｃＤＮＡライブラリー構築キット（クロンテク（Clontech））を使用して、製造業者の薦めるプロトコールに従って、２５０ngの単離したポリＡ+ ＲＮＡからｃＤＮＡを作成した。簡単に説明すると、２５０ngのポリＡ+ ＲＮＡを１０pmolのスマート（SMART）オリゴヌクレオチド（５‘−ＴＡＣＧＧＣＴＧＣＧＡＧＡＡＧＡＣＧＡＣＡＧＡＡＧＧＧ−３’）と１０pmolのＣＤＳ／３’ＰＣＲプライマー（オリゴ（ｄＴ）３０ Ｎ−１Ｎ（Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，またはＴ；Ｎ−１＝Ａ，Ｇ，またはＣ））と、最終容量５μｌで一緒にし、７２℃で２分インキュベートし、次に直接氷上に２分おいてＲＮＡを変性させて、第１鎖ｃＤＮＡを作成した。次に酵素と緩衝液を、反応混合物に最終容量１０μｌ（５０mMトリス／塩酸、ｐＨ８．３、６mM ＭｇＣｌ2、７５mM ＫＣｌ、２mM ＤＴ、それぞれ１mM ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、および２００Ｕのスーパースクリプト（SuperScript）（登録商標）II ＲｎａｓｅＨ-逆転写酵素（ギブコビーアールエル（Gibco BRL））からなる）で加え、次に４２℃で１時間インキュベートした。第２鎖の合成は、鋳型として２μｌの第１鎖、４０mM トリシン／ＫＯＨ ｐＨ９．２（２５℃）、１５mM ＫＯＡｃ、３．５mM Ｍｇ（ＯＡｃ）2、３．７５μg/mlのＢＳＡ、それぞれ０．２mMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１Ｕのアドバンテージ（Advantage）ｃＤＮＡポリメラーゼミックス（クロンテク（Clontech））、０．２μＭ ５’−ＰＣＲプライマー（５’−ＴＡＣＧＧＣＴＧＣＧＡＧＡＡＧＡＣＧＡＣＡＧＡＡ−３’）とＣＤＳ／３’−ＰＣＲプライマーを含有する最終容量１００μｌで、ＰＣＲにより行った。
【００７５】
ＰＣＲ増幅は、ジーンアンプ（GeneAmp）９７００サーマルサイクラー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer））中で、９５℃で１分、次に９５℃で１５秒と６８℃で５分を１６サイクル行った。
【００７６】
ｄｓ ｃＤＮＡポリッシング。増幅したｄｓ ｃＤＮＡ ５０μｌに、４０μｇのプロテイナーゼＫを加え、４５℃で１時間インキュベートした。混合物を９０℃で８分インキュベートして、プロテイナーゼＫを不活性化した。ｄｓ ｃＤＮＡを平滑末端化するために、１５ＵのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを加え、１６℃で３０分と７２℃で１０分インキュベートした。最後にｄｓ ｃＤＮＡをエタノール沈殿させ、１０μｌの水に再懸濁した。特に明記しない場合は、すべての試験管を氷の上に置いた。
【００７７】
ｃＵＮＧ−遺伝子の３００bp断片の作成
既知のＵＮＧ−アミノ酸配列からの２つの保存領域（ＧＱＤＰＹＨとＶＦＬＬＷＧ）から、縮重したオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。プライマーを設計する時に、ニシマダラのコドン使用を考慮した。ＵＮＧ断片は、鋳型としてタラの肝臓のｃＤＮＡを用いて、１０mMのトリス／塩酸 ｐＨ９．２（２５℃）、５０mM ＫＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００、１０ng ｃＤＮＡ、それぞれ０．２mMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、２．０μＭの上流プライマー（５’−ＧＧＨ−ＣＡＲ−ＧＡＹ−ＣＣＣ−ＴＡＹ−ＣＡ−３’）と下流プライマー（５’−ＤＣＣ−ＣＣＡ−ＳＡＧ−ＳＡＧ−ＲＡＡ−ＶＡＣ−３’）、および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（プロメガ（Promega））を含有する最終容量５０μｌで、ＰＣＲにより作成した。ＰＣＲは、９４℃で４分後に、９４℃で１分、６０℃で１分、７２℃で１分を３０サイクル行い、次に最後の伸長工程を７２℃で５分行った。
【００７８】
使用したヌクレオチド記号は以下の通りである：Ａ＝アデニン；Ｃ＝シトシン；Ｇ＝グアニン；Ｔ＝チアミン；Ｄ＝Ａ＋Ｇ＋Ｔ；Ｒ＝Ａ＋Ｇ；Ｓ＝Ｃ＋Ｇ；Ｖ＝Ａ＋Ｃ＋Ｇ；Ｙ＝Ｃ＋Ｔ。
【００７９】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列決定は、アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）サーモシーケナーゼＣｙ５ダイターミネーター（Dye Terminator Kit）キット、アルフェクスプレス（ALFexpress）（登録商標）ＤＮＡシ−ケンサーおよびアルフウィン（ALFwin）配列アナライザーバージョン２．１０を用いて行った。ゲルは、レプロゲル（Reprogel）（登録商標）ロングリード（Long Read）とレプロセットＵＶ−ポリメライザー（Reproset UV-polymerizer）を用いて作成した。すべての部材は、アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）（ウプサラ、スエーデン）から購入した。
【００８０】
ＲＡＣＥ法
アダプターのｃＤＮＡへの連結は、製造業者のプロトコールに記載のように行った。簡単に説明すると、５０mMトリス／塩酸（ｐＨ７．８）、１０mM ＭｇＣｌ2、１０mM ＤＴＴ、１mM ＡＴＰ、０．７５μｇ ｃＤＮＡ、２μＭ マラソンｃＤＮＡアダプター（クロンテク（Clontech））、４００Ｕ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを含有する総量１０μｌで、ＲＡＣＥ−アダプターをｃＤＮＡに連結した。反応物を１６℃で６時間と７０℃で５分インキュベートして、リガーゼを不活性化した。ＲＡＣＥの前に、アダプターが連結したｃＤＮＡをＴＥ緩衝液で５０倍希釈し、１００℃で２分変性させ、氷上に直接置いた。
【００８１】
ＵＮＧ−遺伝子の３００bpの断片から推定される配列を使用して、ｃＤＮＡ末端の３’−と５−迅速増幅ための２つのプライマーを設計し、作成した２つの断片の間に小さな重複領域を作成した。３’−と５’−反応の両方とも、鋳型としてＲＡＣＥアダプターを有する１μｌの希釈ｃＤＮＡ、それぞれ０．２μＭの内部３’−（５’−ＴＧＴＡＣＣＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＧＣＴＴＣＡＡＧＣＡＴ−３’）または５’−（５’ＣＣＣＡＴＣＣＧＣＴＴＡＧＡＴＣＴＣＣＡＴＧＴＣＣＡＧ−３’）ＲＡＣＥプライマー、０．２μＭのＡＰ１−プライマー（製造業者から供給された）（５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’）、４０mMのトリシン／ＫＯＨ ｐＨ９．２（２５℃）、１５mM ＫＯＡｃ、３．５mMのＭｇ（ＯＡｃ）2、３．７５μg/mlのＢＳＡ、０．２mMの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１Ｕのアドバンテージ（Advantage）ｃＤＮＡポリメラーゼミックス（クロンテク（Clontech））を有する５０μｌ容量中で行った。増幅は、ジーンアンプ（GeneAmp）９７００サーマルサイクラー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer））中で、９４℃で３０秒の後、９４℃で５秒と７２℃で３分を５サイクル、９４℃で５秒と７０℃で３分を５サイクル、および９４℃で５秒と６８℃で３分を２０サイクル行った。
（個々のバンドを、アガロースゲルから精製し、鋳型として使用して新しいＰＣＲ反応で上記と同じ条件を使用して、より多くのＤＮＡを作成した。）
【００８２】
２つの異なるＵＮＧ遺伝子の単離
作成したＲＡＣＥ断片を、その各内部ＲＡＣＥプライマーを使用して配列決定した。５’−ＲＡＣＥ断片の配列を調べると、断片の５’末端の近くで、読むのが困難な２本鎖を示した。しかしＵＮＧ配列（別の配列ではない）の１つの中の長いＵＴＲのために、断片の末端に１つの配列だけが現れた。この５’末端に相補的な新しいプライマーを設計（５’−ＡＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＴＧＡＧＡＴＴＧＧＣＧＣＣＴＴＴＧＧ−３’）し、これと、５’−ＲＡＣＥ内部プライマーと、鋳型として５’−ＲＡＣＥ断片を用いて、新しいＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは、４０mMのトリシン／ＫＯＨ ｐＨ９．２（２５℃）、１５mM ＫＯＡｃ、３．５mMのＭｇ（ＯＡｃ）2、３．７５μg/mlのＢＳＡ、０．２mMの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１Ｕのアドバンテージ（Advantage）ｃＤＮＡポリメラーゼミックス（クロンテク（Clontech））、鋳型として１０ngのｃＤＮＡ、およびそれぞれ０．２μＭの上流プライマーと下流プライマーを有する５０μｌに最終容量中で行った。増幅は、ジーンアンプ（GeneAmp）９７００サーマルサイクラー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer））中で、９４℃で１分の後、９４℃で３０秒、６０℃で１分、および７２℃で１分を３０サイクル行った。
【００８３】
断片は、内部ＲＡＣＥプライマーを使用して配列決定し、配列を、上記２本鎖配列領域から差し引いた。基本配列の５ｐ末端に相補的なプライマーを設計（ＳＭＡＲＴ配列と残りのＵＮＧ配列からの両方のヌクレオチドからなる）し、これと５’−ＲＡＣＥプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。新しい断片を、上記のように配列決定した。５’−ＲＡＣＥ断片中の２つの異なるＵＮＧ配列から２つの最終プライマー（ＵＮＧ１とＵＮＧ２）を作成して、ｃＤＮＡを鋳型として、上記の同じＰＣＲ条件で、それぞれ完全長ＵＮＧ１とＵＮＧ２を単離した。
【００８４】
発現ベクターの構築
ＵＮＧ−遺伝子の触媒ドメインを、複クローニング部位（７７）の上流に強いｔｒｃプロモーターを含有する発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ中にクローン化した。ｃＤＮＡを鋳型として使用して、それぞれＥｃｏＲＩとＳａｌＩ制限部位を含有する上流プライマーと下流プライマーを用いて遺伝子をＰＣＲ増幅して、いくつかの異なる構築体を作成した。ＤＮＡ断片を精製し、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化し、ｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクターに連結した。簡単に説明すると、制限部位を有するＰＣＲ断片を、４０mMのトリシン／ＫＯＨ ｐＨ９．２（２５℃）、１５mM ＫＯＡｃ、３．５mMのＭｇ（ＯＡｃ）2、３．７５μg/mlのＢＳＡ、０．２mMの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１Ｕのアドバンテージ（Advantage）ｃＤＮＡポリメラーゼミックス（クロンテク（Clontech））、鋳型として１０ngのｃＤＮＡ、およびそれぞれ０．２μＭの上流プライマーと下流プライマーを有するＰＣＲ反応物（５０μｌ）中で作成した。増幅は、ジーンアンプ（GeneAmp）９７００サーマルサイクラー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer））中で、９４℃で１分の後、９４℃で３０秒と６０℃で１分、および７２℃で２分を３０サイクル行い、７２℃で５分の最後の伸長工程を行った。個々のバンドを、アガロースゲルから精製し、鋳型として使用して新しいＰＣＲ反応で上記と同じ条件を使用して、より多くのＤＮＡを作成した。ＤＮＡを、キアクイック（Quiaquick）ＰＣＲ精製キット（ミリポア（Millipore））を使用して精製し、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出した。制限酵素消化は、１μｇの挿入ＤＮＡまたは０．２５μｇのｐＴｒｃ９９Ａベクター、６mMトリス／塩酸、ｐＨ７．９、６mM ＭｇＣｌ2、１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＤＴＴ（バッファーＤ、プロメガ（Promega））および３ＵのＥｃｏＲＩとＳａｌＩを含有する３０μｌの最終容量中で行った。混合物を３７℃で３時間インキュベートし、次にフェノール／クロロホルムで２回抽出し、エタノール沈殿させ、５μｌの水に再懸濁した。連結は、５０mMトリス／塩酸（ｐＨ７．８）、１０mM ＭｇＣｌ2、１０mM ＤＴＴ、１mM ＡＴＰ、１００ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、２５０ngのベクターＤＮＡおよび１μｇの挿入ＤＮＡを含有する１０μｌの最終容量で行い、１６℃で１６時間インキュベートした。
【００８５】
コンピタントな大腸菌（E. coli）ＪＭ１０５（２００μｌ）を連結混合物で形質転換し、１００μg/mlのアンピシリンを含有するＬＢ＋プレート上で３７℃で増殖させた。陽性クローンからプラスミドＤＮＡを再単離し、組換えＵＮＧの発現のために使用した大腸菌（E. coli）ＮＲ８０５２中で形質転換した。
【００８６】
４つの異なる構築体を作成した：ｒｃＵＮＧΔ７４とｒｃＵＮＧΔ７４ｏとｃＵＮＧΔ８１とｒｃＵＮＧΔ８１ｏ（ここで、それぞれＮ末端アミノ酸の７４および８１を除去した）。これらは、それぞれヒトΔ７７とΔ８４と同じ長さを有する（６４）。Δ７４ｏとΔ８１ｏ構築体は、ＡＧＡからＣＧＴに変化させることにより、大腸菌（E. coli）中での発現について最適化されたアルギニン８７と８８をコードするコドンを有する。すべての構築体は、上記のようにＰＣＲにより作成し、以下のプライマーと鋳型を使用した：
【００８７】
ｒｃＵＮＧΔ７４：ＵＤＧＬ７７（５’−ＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＴＣＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＣＧＣＣＴＧＣＡ−３’）およびＵＤＧＥＮＤ２（５’−ＧＡＧＣＴＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＡＧＴＧＣＣＴＣＴＣＣＡＧＴＴＴＡＴＡＧＧ−３’）および鋳型として１０ngのｃＤＮＡ。
ｒｃＵＮＧΔ８１：ＵＤＧＬ８４（５’−ＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＧＧＡＧＡＧＡＣＴＴＧＧＡＧＡＡＧＡ−３’）およびＵＮＤＧＥＮＤ２と鋳型として１０ngのｃＤＮＡ。
ｒｃＵＮＧΔ７４ｏ：（５’−ＡＴＧＧＡＡＴＴＣＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＴＣＧＧＡＧＡＧＡＣＴＴＧＧＣＧＴＣＧＴＧＡＧ−３’）およびＵＤＧＥＮＤと鋳型として１ngのｒｃＵＮＧΔ８１ｏ．
ｒｃＵＮＧΔ８１ｏ：（５’−ＡＴＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＧＧＡＧＡＧＡＣＴＴＧＧＣＧＴＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＣＴＧＣ−３’）およびＵＤＧＥＮＤ２と鋳型として１０ngのｃＤＮＡ。
【００８８】
ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼの小スケール発現
１００μg/mlのアンピシリンを有する１００mlのＬＢ＋培地に５mlのプレカルチャを接種して、１リットルの邪魔板付き三角フラスコ中で発現の最適化を行った。細胞を１mMのＩＰＴＧでＯＤ６００≒２．０で誘導し、種々の長さで誘導した。種々の温度（２０℃、２５℃、３０℃および３７℃）を使用して、発現を調べた。
上記条件は、種々のＩＰＴＧ濃度（１mM、０．５mM、０．１mM、および０．０１mM）で発現を誘導するのにも使用した。
【００８９】
発酵条件
発酵は、１０リットルのチェマップ（Chemap）ＣＦ３０００ファーメンター（スイス）中で行った。ｐＴｒｃ９９Ａ ｏΔ８４構築体を有する２００mlの大腸菌（E. coli）ＮＲ８０５２のプレカルチャーを、２０mMグルコースと１００μg/mlアンピシリンを補足した７リットルのＬＢ培地に接種した。細胞をＯＤ６００が２．０まで増殖させ、１mM ＩＰＴＧで８時間誘導した。発酵中に追加のグルコース（３×５０mlの２０％グルコース（w/v））を補足して、グルコースが枯渇するのに避けた。細胞を採取し、１０，０００ｇで１０分遠心分離した。細胞ペーストを−７０℃で凍結した。
【００９０】
組換えタラＵＮＧの精製
粗抽出物
発酵から４リットルの大腸菌（E. coli）ＮＲ８０５２細胞（６８ｇの湿重量）を、４００mlの抽出緩衝液（２５mMトリス／塩酸、１０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１％グリセロール、１mM ＤＴＴ、１mM ＰＭＳＦ ｐＨ８．０）に再懸濁した。１００psiの窒素を使用してネブライザーに５回通して、細胞を破砕した。抽出物を２５，０００ｇで１０分遠心分離し、上清を除去した。ペレットを１０mlの緩衝液Ａに再懸濁し、前記したように再遠心分離した。上清を一緒にし、ガラスウール（４６０ml）に通してろ過した。
【００９１】
プロタミン硫酸
粗抽出物（４６０ml）に、緩衝液Ａ（２５mMトリス／塩酸、１０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１％グリセロール、ｐＨ８．０）中の２％プロタミン硫酸６０mlを加え、４℃で５分攪拌しながらインキュベートした。溶液を２５，０００ｇで１０分遠心分離し、上清を除去した、５１０ml（画分１）。
【００９２】
Ｑ／Ｓ−セファロース
プロタミン硫酸画分を、Ｓ−セファロースカラム（２．６／１０）に結合したＱ−セファロースカラム（５．０／１０）（両方とも、１０ml／分の流速を使用して緩衝液Ａで平衡化されている）に適用した。次にカラムを７５０mlの緩衝液Ａで洗浄し、次にＱ−セファロースカラムを除去した。Ｓ−セファロースカラムをさらに５５０ml緩衝液Ａ＋６０mM ＮａＣｌで洗浄し、緩衝液Ａ中６０〜４００mM ＮａＣｌの勾配を適用して流速５ml／分でカラムを溶出した。１０mlの画分を集め、ＵＮＧ−活性を含有する画分をプールした（画分２、１１５ml）。
【００９３】
ブルーセファロースＦＦ
画分２を、緩衝液Ａで２倍に希釈し、流速４ml／分でブルーセファロースカラム（１．６／５０）に直接適用した。次にカラムを３０mlの緩衝液Ａおよび６０mlの緩衝液Ａ＋１１０mM ＮａＣｌで洗浄し、６０mlの緩衝液Ａ＋０．７Ｍ ＮａＣｌで溶出した。ＵＮＧ含有画分をプールした（画分３、２４ml）。
【００９４】
スーパーデックス７５
画分３をウルトラフリー（Ultrafree）１５ユニット（ミリポア（Millipore））を使用して３mlに濃縮し、緩衝液Ａ＋０．１５Ｍ ＮａＣｌで平衡化したスーパーデックス７５カラム（２．６／６０）に適用した。流速２ml／分を使用し、５mlの画分を集めた。ＵＮＧ活性画分をプールした（画分４、３０ml）。
【００９５】
ソース１５Ｑ
スーパーデックス７５画分をウルトラフリー（Ultrafree）１５ユニット（ミリポア（Millipore））を使用して透析ろ過し、スーパーデックス７５画分の約２／３を、室温で緩衝液Ａで平衡化したソース１５Ｑカラム（２．６／３．０）に適用した。カラムを６０mlの緩衝液Ａ＋６０mlのＮａＣｌで洗浄し、次に緩衝液Ａ中６０〜２１０mMのＮａＣｌの勾配を適用して、カラムを溶出させた。画分を氷上に集め、ＵＮＧ含有画分をプールした（ＵＮＧ活性は、１０５〜１４５mM ＮａＣｌで溶出した）。
【００９６】
結果
ｃＵＮＧ１とｃＵＮＧ２についてのそれぞれヌクレオチド配列と一文字コードアミノ酸配列を、同封の配列リストに配列番号１と２として示す。
【００９７】
発現
７リットルスケールの発酵でのｐＴｒｃ９９Ａ−Δ８１ｏ構築体によるｒｃＵＮＧの発現により、粗抽出物に含有される全部で４１３，４８０単位のｒｃＵＮＧが得られた。
【００９８】
組換えタラＵＮＧの精製
組換えｃＵＮＧ（Δ８１ｏ）（ｒｃＵＮＧ）の精製を行った。４リットルの発酵バッチから、４．８mgの組換えＵＮＧをほぼ均一になるまで精製し、分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより２８ｋＤとして決定した。酵素の比活性は、標準測定条件でニック作成基質を使用して、３０，０９２u/mgであると測定された。この調製物は、標準方法で、検出可能なレベルのＤＮＡ−エンドデオキ
【００９９】
例３
熱不活性化後の残存活性／再活性化の測定
５０μｌの「Ｔａｑ緩衝液」（１０mMトリス／塩酸（２５℃でｐＨ＝９．０）、５０mM ＫＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００）中の１１．５単位のｒｃＵＮＧ（約０．３８μｇ）を、９４℃で１０分不活性化し、二等分した。片方を４℃で維持し、もう一方を２５℃で維持した後、不活性化の１時間と１６時間後に、標準方法で１５μｌの未希釈不活性化混合物を使用して、残存活性を測定した。不活性化の前に２μｌを取って、１：２０００に希釈後、活性を測定した（１００％対照）。結果は、不活性化した酵素は、検出限界（ブランク対照＋２×標準偏差）以上に、基質から放射能標識ウラシルの放出を引き起こさないことを示した。これらの条件で、１００％対照は７，０００，０００cpmを与え、一方２×バックグランド標準偏差は４６cpmであった。従ってｒｃＵＮＧの残存活性は、これらの条件下で熱不活性化後、初期活性の０．０００６％未満であった。４℃または２５℃で１６時間後に、酵素の有意な再活性化はなかった。
【０１００】
結果は、熱不活性化後にｒｃＵＮＧは実質的な残存活性が無く、再活性化もしないことを示す。従って酵素ｒｃＵＮＧは、海洋細菌からあらかじめ単離したＵＮＧ（熱不活性化後にわずかな程度の再活性化または残存活性を有することが証明されているＢＭＴＵ（４５））とは異なる。
【０１０１】
例４
キャリーオーバー防止
ｃＵＮＧがキャリーオーバー防止反応で、ウラシル含有ＤＮＡを分解するのに有効であるかどうかを試験した。
【０１０２】
方法
汚染物質として０．５ｇのウラシル含有鋳型ＤＮＡ（タイセイヨウサケ （サルモ・サラー（Salmo salar））からの陽イオン性トリプシノーゲンから作成した７６１bp断片）（６１）を、１０mMのトリス／塩酸 ｐＨ９．０（２５℃）、５０mM ＫＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００、１０ng ｃＤＮＡ、それぞれ０．２mMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、２．０μＭの上流プライマー（ＯＰ５）と下流プライマー（ＮＰ２）、および１．０ＵのＴａｑポリメラーゼ（プロメガ（Promega））を含有する最終容量５０μｌ中のＰＣＲ混合物に加えた。ＵＮＧ（４×１０-3または１．７×１０-2Ｕ）をＰＣＲ混合物に加え、周囲温度（ＲＴ）で１０分インキュベートした。
【０１０３】
陰性対照として、１つのＰＣＲ反応混合物は、ウラシルの代わりにチミジンを有する鋳型を含有し、１つの混合物では、ＵＮＧの代わりに水を含有した。また陽性対照として、大腸菌（E. coli）から１．７×１０-3Ｕ ＵＮＧを、ｒｃＵＮＧの代わりに使用した。
【０１０４】
ＰＣＲを９４℃で４分と、次に９４℃で１分、６０℃で１分、および７２℃で１分を３０サイクル行った。ＰＣＲ後、生成物をアガロースゲル電気泳動で分析した。
【０１０５】
ＰＣＲプライマー配列：
ＯＰ５：
５’−ＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＣＴＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡ−３’
ＮＰ２：
５’−ＧＴＡＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＣＴＡＧＡＴ−３’
【０１０６】
結果
本例の実験の結果を図９に示す。ウラシル含有鋳型は、すべてのＰＣＲ反応でＵＮＧにより分解され、一方ＵＮＧを含まないかまたはチミジン含有鋳型を有する反応物では、予測されたＰＣＲ産物が得られた。図９の結果は、アガロースゲルの図として示す。結果は、ＰＣＲ反応における混入しているウラシル含有ＤＮＡを分解するのにｒｃＵＮＧが有効であることを示している。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
ａ）酵素活性は、材料と方法に記載の標準方法により、ニック活性基質を使用して、例２に記載のように測定した。
ｂ）タンパク質濃度は、材料と方法に記載のように測定した。
ｃ）タンパク質濃度は、低すぎて測定できなかった。
【０１０９】
【表２】
表２：基質特異性ｓｓＤＮＡ対ｄｓＤＮＡ
基質 cpm 活性％ 倍
ｄｓニック 586 54 1.0
ｓｓニック 1078 100 1.8
ｄｓＰＣＲ 1158 52 1.0
ｓｓＰＣＲ 2214 100 1.9
【０１１０】
本結果は、低温順応真核生物からのＵＮＧの、単離と、ＤＮＡコピー反応におけるキャリーオーバー防止での使用を初めて示す。ＰＣＲ反応に使用される大腸菌（E. coli）から単離された従来既知のＵＮＧ酵素（６０）またはＢＭＴＵ（４５）は、原核生物に由来する。
【０１１１】
ｃＵＮＧは、６０℃以上に加熱されると完全に不活性化され、不活性化は完全に不可逆的である（熱処理後に、検出可能な残存酵素が無いため）。この性質は、大腸菌（E. coli）ＵＮＧまたはＢＭＴＵからのＵＮＧのような、従来この分野で公知の酵素（これらは、熱処理後に完全に不可逆的に不活性化されなかった）と比較して、ｃＵＮＧを、ＤＮＡコピー反応（ＰＣＲ、ＬＣＲなど）におけるキャリーオーバー防止で使用するための酵素としてより優れた候補としている。ＰＣＲ反応サイクルで通常行われる熱処理による完全かつ不可逆的不活性化のために、熱処理後に検出可能な残存酵素は無い。スケールアップ反応おいて、残存ＵＤＧ酵素活性によるＤＮＡ産物の不要な分解はなく、もちろんそのような残存ＵＤＧ酵素活性によるＤＮＡの分解を避けるために、酵素インヒビターを加える必要は無いであろう。
【０１１２】
組換えｃＵＮＧ（ｒｃＵＮＧ）は、タラの肝臓から単離されるｃＵＮＧと同じ性質／機能を有することが証明された。タラの肝臓は、ほんの少量のｃＵＮＧのみを含有する。ｃＵＮＧが組換え法で産生される時、タラの肝臓から抽出により産生されるｃＵＮＧの量と比較して、より多量のｃＵＮＧ作成することができる。
【０１１３】
文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】 ニシマダラのＵＮＧ（ｃＵＮＧ）のｐＩ測定を示す。
【図２】 遊離のウラシルによるｃＵＮＧの生成物阻害を示す。
【図３】 枯草菌（Bacillus subtilis）バクテリオファージウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（Ｕｇｉ）によるｃＵＮＧの阻害を示す。
【図４】 ｃＵＮＧのｐＨと最適ＮａＣｌを示す。
【図５】 ｃＵＮＧの最適温度を示す。
【図６】 ｃＵＮＧ（△）とｒｈＵＮＧ（□）の温度プロフィールを示す。
【図７】 ニシマダラＵＮＧ（ｃＵＮＧ）と組換えヒトＵＮＧ（ｒｈＵＮＧ）のｐＨ安定性を示す。
【図８】 ニシマダラＵＮＧ（ｃＵＮＧ）（△）と組換えヒトＵＮＧ（ｒｈＵＮＧ）（□）の温度安定性を示す。
【図９】 図９は、組換えタラＵＮＧ（ｒｃＵＮＧ）を使用して、キャリーオーバー防止試験からのＰＣＲ産物を示すアガロースゲルである。
【配列表】
（発明の分野）
本発明は、タラの肝臓中に存在する新規酵素、その酵素またはその機能性（生物活性）部分をコードするＤＮＡ配列、該遺伝子またはその機能性部分を含有する新規組換えＤＮＡ、タラの肝臓および該遺伝子を有する細菌からの該酵素の調製方法、その遺伝子自体を有する細菌、およびＰＣＲもしくは関連する反応系の追跡および／または調節における該タンパク質の使用に関する。
【０００２】
（先行技術の説明）
ＤＮＡ中のウラシルは、ＤＮＡ中のシトシンの複製または脱アミノ化中の、ｄＴＴＰではなくｄＵＴＰの取り込みにより得られる。後者は、次のラウンドの複製で突然変異を引き起こす。酵素ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ、ＥＣ３．２．２．３）は、ＤＮＡ骨格からウラシル塩基が切り出され（リンダール（Lindahl）、１９９４）、アピリミジン部位を作成し、これが他のＤＮＡ修復酵素により認識されるという意味で、修復酵素として機能する。この酵素は、ＤＮＡの完全性を維持するのに決定的に重要であり、従って、多様な生物（ウイルス、原核生物、真核生物）中で見いだされている。
【０００３】
ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧまたはＵＤＧ）は、ウラシル含有ＤＮＡ中のデオキシリボース糖と塩基の間のＮ−グリコシル結合の加水分解を触媒し、大腸菌（Escherichia coli）から初めて単離され性状解析された（１）。これは、ＤＮＡからウラシルを除去する塩基切り出し修復（ＢＥＲ）の第１工程（２）であり、従って、作成されたアピリミジン部位は、ＢＥＲ経路中のＡＰエンドヌクレアーゼ、ホスホジエステラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡリガーゼ（他の酵素）により修復される（３〜５）。
【０００４】
数種類のクラスのウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）が開示されている。主要な型のＵＮＧは、ＵＮＧ−遺伝子によりコードされるＵＮＧである（６）。他のクラスは、サイクリン様ＵＤＧ２（７，８）、ヒトとアフリカツメガエル（Xenopus）（９）からの１本鎖選択性単官能性ＵＤＧ ＳＭＵＧ１、大腸菌（E. coli）（１０，１１）とサーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）ＵＤＧ（ＴＭＵＤＧ）（１２）から単離されたＧ／Ｔ：Ｕ特異的ミスマッチＤＮＡグリコシラーゼ（ＭＵＧ）を含む。
【０００５】
ＵＮＧは、モノマータンパク質で約２５〜３５ｋＤのサイズである。これは、補助因子や２価陽イオンに依存せず、異なる種の間で高度に保存されている（１３）。しかしＵＮＧは、イオン強度に影響を受ける。ＵＮＧ酵素は、前進型「スライド機構」（ここでは、ＤＮＡから解離する前に連続的ウラシル残基を配置する（１４，１５））と、明確な「ランダムヒット」機構（１６）で作用することが証明されている。ＵＮＧは、ラット肝臓（１７−１９）、ヒト細胞および組織（２０〜２８）、子ウシ胸腺（２９，３０）、変形菌（３１）、酵母（３２）、植物（３３，３４）、ブラインシュリンプ（３５）、原核生物（１，３６〜４５）、およびウイルス（４６，４７）から、すでに単離され、性状解析されている。
【０００６】
ヒトおよびラットの両方で、ミトコンドリアと核ＵＮＧが単離されている（１８，２５）。ヒト（およびマウス）細胞では、これらの２つは、同じ遺伝子（ＵＮＧ）によりコードされている（４８，４９）。２つの異なる翻訳開始部位と代替スプライシングにより、Ｎ末端シグナル配列のみが異なる２つの型が作成され、これは酵素を、それぞれ核（ＵＮＧ２）とミトコンドリア（ＵＮＧ１）に向ける（４９）。最近、Ｎ末端シグナル配列と、核とミトコンドリアへのＵＮＧのターゲティングについてさらなる研究が行われており（５０〜５２）、核ＵＮＧ２がリン酸化されていることが明らかになっている（２６）。ヒト、単純ヘルペスウイルスおよび大腸菌（E. coli）からＵＮＧの結晶構造が解明されている（５３〜５５）。活性部位残基は保存されており、これらの酵素中の作用モードは、ヌクレオチドフリップ機構と同じでＤＮＡからウラシルを除去するようである（５６，５７）。
【０００７】
例えばニシマダラ（Gadus morhua）のような低温順応した生物は、充分な代謝活性を維持するために、低温での化学反応速度の低下を補償しなければならない。これは、より高い転写／翻訳レベルまたは改良された触媒効率（ｋcat／ＫM）により行われる。より高い触媒効率は、中温性のものと比較してより柔軟な構造により達成され、これは、触媒中にコンフォメーション変化を受ける能力の上昇を提供する。ｐＨ、温度および変性剤に対する安定性の低下は、コンフォメーションの柔軟性の結果であると考えられる（５８）。
【０００８】
本発明は、低温順応した生物からの熱不安定性ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼの精製と性状解析に関し、これは、ＤＮＡコピー反応（ＰＣＲ、ＬＣＲなど）でのキャリーオーバーを防止するのに効率的な酵素として有用である。本発明に従って単離された酵素は、分子量、等電点、最適ｐＨおよび最適ＮａＣｌに関して、既に記載されているＵＮＧと同様の特徴を有する。しかし本発明の酵素は、組換え中温性ヒトＵＮＧと比較して、よりｐＨ不安定性かつ熱不安定性であり、低温で相対的に活性が高く、前記したようにキャリーオーバー防止における優れた候補となっている。
【０００９】
大腸菌（Escherichia coli）からのＵＮＧ（またはＵＤＧ）は、ＤＮＡ材料を増幅する時のキャリーオーバー防止に使用するために市販されている。
【００１０】
ＤＮＡ鋳型に基づいて特異的ＤＮＡ配列を増幅するために、種々の方法が使用される。一般的な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）系（米国特許第４，６８３，１９５号；４，６８３，２０２号；および４，９６５，１８８号）、リガーゼ増幅系（ＰＣＴ特許公報第８９／０９８３５号）、自立性配列複製系（ＥＰ第３２９，８２２号、およびＰＣＴ特許公報第９０／０６９９５号）、転写ベースの増幅系（ＰＣＴ特許公報第８９／０１０５０号およびＥＰ第３１０，２２９号）、およびＱβ ＲＮＡレプリカーゼ系（米国特許第４，９５７，８５８号）である。これらの方法は、非常に高感度であり、非常に少数の標的ＤＮＡ配列のコピーから、検出可能な量のＤＮＡを生成することができる。従ってこの方法は、環境からのＤＮＡによる汚染に対して非常に感受性である。主要な汚染源は、すでに行ったスケールアップ反応（例えば、ＰＣＲ反応（５９））からの生成物である。
【００１１】
この問題を克服するために、標的ＤＮＡと前の反応からの汚染ＤＮＡ（例えば、ＰＣＲ生成物ＤＮＡ）とを区別する方法が開発されている（６０）。基本的に、すべての増幅反応は、ｄＵＴＰとｄＴＴＰとを使用して行われ、こうしてウラシルをチミジンの代わりにＤＮＡ中に取り込む。次に、すべての以後の反応混合物をＵＤＧ（またはＵＮＧ）で処理する。以下の熱処理は、非塩基性部位でのホスホジエステル結合の加水分解により、汚染ＤＮＡを分解させる。また熱処理は、ＵＤＧ酵素を不活性化させると考えられる。
【００１２】
しかし、大腸菌（E. coli）のＵＤＧ（またはＵＮＧ）酵素は、熱処理により完全に不活性化され、不活性化は完全には不可逆的ではない（６０）。これは、生成物は残存するＵＤＧ酵素活性により分解されるため、スケールアップ反応（例えば、ＰＣＲ反応）の生成物の完全性に影響を与える。これを避けるため、次に酵素インヒビターがＵＤＧに添加されている（米国特許第５，５３６，６４９号）。
【００１３】
しかし、これは反応の余分の工程であり、インヒビターにより残存する汚染が以後の反応に存在し、インヒビターの購入は、前記したようにＰＣＲ反応を行う時に余分のコストとなるため、以後のインヒビターを使用して避けることが好ましい。
【００１４】
すなわち、ＰＣＲ反応後に熱処理により破壊／不活性化されることが確実なＵＮＧ（またはＵＤＧ）酵素を使用し、こうしてＵＤＧ酵素の特異的化学インヒビターの添加を避けることが好ましいであろう。
【００１５】
（図面の詳細な説明）
図１は、ニシマダラのＵＮＧ（ｃＵＮＧ）のｐＩ測定を示す。ファストゲル（Phast Gel）ＩＥＦ３−９を使用して等電点電気泳動を行った後、ゲルを２mmの切片に切断する。各片をエッペンドルフ試験管に移し、４℃で一晩インキュベートした。次に、材料と方法に記載するように活性を測定した。
【００１６】
図２は、遊離のウラシルによるｃＵＮＧの生成物阻害を示す。異なる濃度のウラシルを測定混合物に加え、材料と方法に記載するように測定を行った。
【００１７】
図３は、枯草菌（Bacillus subtilis）バクテリオファージウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（Ｕｇｉ）によるｃＵＮＧの阻害を示す。標準測定条件を使用して材料と方法に記載のように、６．６５×１０-4ＵのｃＵＮＧを１．２５×１０3Ｕ〜２．００×１０2ＵのＵｇｉとインキュベートした。１単位のＵｇｉは、１単位のＵＮＧ活性を阻害し、ここでＵＮＧ活性は、３７℃で１分間に６０pmolのウラシルを放出するものと定義する。
【００１８】
図４は、ｃＵＮＧのｐＨと最適ＮａＣｌを示す。ｃＵＮＧの活性を、材料と方法に記載するように、種々の塩化ナトリウムと異なるｐＨシリーズで測定した。ＵＮＧ活性パーセントは、５０mMのＮａＣｌでｐＨ７．５で測定した最も高い値に対するものである。
【００１９】
図５は、ｃＵＮＧの最適温度を示す。実験中に酵素試料を氷上で長時間インキュベートしたため、材料と方法に記載のように酵素の安定性に関して酵素の活性が補正される。
【００２０】
図６は、ｃＵＮＧ（△）とｒｈＵＮＧ（□）の温度プロフィールを示す。酵素活性は、材料と方法に記載のように測定した。ＵＮＧ活性パーセントは、ｃＵＮＧ（４５℃）とｒｈＵＮＧ（５０℃）についての最も高い値に対するものである。実験中に酵素試料を氷上で長時間インキュベートしたため、材料と方法に記載のように酵素の安定性に関して酵素の活性が補正される。
【００２１】
図７は、ニシマダラＵＮＧ（ｃＵＮＧ）と組換えヒトＵＮＧ（ｒｈＵＮＧ）のｐＨ安定性を示す。異なるｐＨ緩衝液で、１ＵのｃＵＮＧ（△）とｒｈＵＮＧ（□）を、３７℃で１０分間インキュベートした。次に５μｌのアリコートを測定混合物に移し、材料と方法に記載のように標準測定条件を使用して、残存活性を測定した。ｐＨ８．０で希釈した試料を、インキュベーション工程無しで、直接１００パーセント活性を測定した。
【００２２】
図８は、ニシマダラＵＮＧ（ｃＵＮＧ）（△）と組換えヒトＵＮＧ（ｒｈＵＮＧ）（□）の温度安定性を示す。
酵素（１Ｕ）を、５０℃、３７℃、２５℃、および４℃でインキュベートし、５μｌのアリコートを、異なる時間間隔後に測定混合物に移し、材料と方法に記載のように標準測定を行った。半減期は、ｃＵＮＧについて０．５分（５０℃）、２０分（３７℃）、６０分（２５℃）および２時間（４℃）であり、ｒｈＵＮＧについて８分（５０℃）、３０分（３７℃）、１５０分（２５℃）および２．６時間（４℃）と決定された。
【００２３】
図９は、組換えタラＵＮＧ（ｒｃＵＮＧ）を使用して、キャリーオーバー防止試験からのＰＣＲ産物を示すアガロースゲルである。レーンの説明：レーン１と８：ＤＮＡラダー；レーン２：Ｔ−含有鋳型、ＵＮＧ無し；レーン３：Ｔ−含有鋳型、１．７×１０-3Ｕ ｒｃＵＮＧ；レーン４：Ｕ−含有鋳型、４×１０-4Ｕ ｒｃＵＮＧ；レーン５：Ｕ−含有鋳型、１．７×１０-3Ｕ ｒｃＵＮＧ；レーン６：Ｕ−含有鋳型、４×１０-4Ｕ 大腸菌（E. coli）ＵＮＧ；レーン７：Ｕ−含有鋳型、ＵＮＧ無し。
【００２４】
（本発明の目的）
本発明の目的は、ＤＮＡ増幅反応（例えば、前述したＰＣＲ）ためのキャリーオーバー防止法で機能し、かつＰＣＲ反応サイクルで通常行われる熱処理により完全かつ不可逆的に不活性化される新規ＵＮＧ（またはＵＤＧ）酵素を提供する。
【００２５】
さらに本発明の目的は、そのような酵素またはその活性部分をコードするＤＮＡ配列、そのようなＤＮＡ配列を有するベクターもしくはベクター系（例えば、ウイルス、プラスミド、コスミドなど）、およびそのようなベクターを含む微生物を提供することである。
【００２６】
また本発明の目的は、遺伝子操作法を使用して、酵素またはその活性部分を効率的に産生する方法を提供することである。
【００２７】
（発明の詳細な説明）
低温環境に生きている低温に順応した生物（例えば、ニシマダラ（Gadus morhua））の酵素は、充分な代謝活性を維持するために低温での化学反応速度の低下を補わなければならない。これは、より高い転写／翻訳レベル、または改良された触媒効率（ｋcat／ＫM）により行うことができる。このより高い効率は、中温性のものと比較してより柔軟な構造により達成され、これは、触媒中にコンフォメーション変化を受ける能力の上昇を提供する。ｐＨ、温度および変性剤に対する安定性の低下は、コンフォメーションの柔軟性の結果であると考えられる（５８）。
【００２８】
ＤＮＡ配列を増殖（ＰＣＲ、ＬＣＲ）する時のキャリーオーバー防止法において先行技術のＵＤＧによる汚染の欠点を考えると、簡単な熱処理により１００％分解されたＵＤＧ（またはＵＮＧ）酵素を提供することが非常に好ましいであろう。タラから単離されたＵＮＧ（またはＵＤＧ）酵素は、この貴重な性質を有することがわかった。本発明に従って単離されたタラＵＮＧ酵素は、分子量、等電点、最適ｐＨおよび最適ＮａＣｌに関して、既に記載されているＵＮＧと同様の特徴を有するが、本発明のタラＵＮＧは、組換え中温性ヒトＵＮＧと比較して、よりｐＨ不安定性かつ熱不安定性であり低温で相対的に活性が高い。
【００２９】
本発明の酵素は、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性を有し、約６０℃より高温に加熱されると完全に不活性化される。この温度閾値は、数度の範囲で変動することを理解されたい。
【００３０】
本発明の酵素は好ましくは、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列、またはその生物学的機能性部分を有する。
【００３１】
本発明の酵素は、好ましくは低温環境に順応した生物から得られ、さらに好ましくは生物は真核生物であり、最も好ましくは生物はニシマダラである。
【００３２】
本請求項で定義される新規酵素をコードするＤＮＡ配列は、本発明の別の態様である。好ましくはＤＮＡ配列は、配列番号１または２に記載のヌクレオチド配列を有する。本発明のＤＮＡ配列は、好ましくはプロモーターを含有し、発現ベクター（例えば、プラスミド、コスミドまたはウイルス）中で含有される。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、請求項に記載の本発明のＤＮＡ配列を含む微生物、およびＤＮＡ配列を増殖させる反応系（例えば、ＰＣＲまたはＬＣＲ）の追跡および／または調節における酵素の使用である。特に本発明の酵素は、キャリーオーバー防止法において使用される。
【００３４】
以下に、本発明の関連するタラＵＮＧタンパク質の単離、ならびにこのタンパク質をコードするＤＮＡの単離、および本発明の関連するＵＮＧ酵素を組換え法で産生するための微生物におけるその使用が開示される。
【００３５】
例１
タラＵＮＧ（ｃＵＮＧ）の抽出、精製および性状解析
【００３６】
ｃＵＮＧの精製
粗抽出物の調製とすべての精製工程は、４℃で行った。以下の材料を使用した：Ｑ−セファロースＦＦ、Ｓ−セファロースＦＦ、ヘパリンセファロースＨＰ（ハイトラップ（Ｈｉ−ｔｒａｐ）５ml）、ポリ−Ｕ−セファロース４Ｂ、スーパーデックス７５ＨＲ１０／３０、ファストシステム（Phast system）とファスト（Phast）ＩＥＦゲル（３〜９）およびＬＭＷゲルろ過較正キットは、アマシャムファルマシアバイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）（ウプサラ（Uppsala）、スエーデン）から得た。デオキシ［５−3Ｈ］ウリジン５’−三リン酸（１９．３Ci/mmol）は、アマシャム（Amersham）（英国）から購入した。ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（Ｕｇｉ）は、ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs）（ビバリー、マサチューセッツ州）から得て、酵素はプロメガ（Promega）（マジソン、ウィスコンシン州）から購入した。プロテアーゼインヒビター、子ウシ胸腺ＤＮＡ（Ｄ−１５０１）、ウラシル、デオキシウリジン、およびデオキシウリジン−一リン酸は、シグマ（Sigma）（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。すべての他の試薬と緩衝液は、シグマ（Sigma）とメルク（Merch）（ダルムシュタット（Darmstadt）、ドイツ）から購入した。
【００３７】
粗抽出物の調製
６００mlの抽出緩衝液（２５mM トリス／塩酸、１００mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１mM ＤＴＴ、１０％グリセロール、ｐＨ８．０（２５℃））に、２００ｇの新鮮なタラの肝臓を加え、アトミックス（Atomix）ホモジナイザー（ＭＳＥ、イングランド）中でホモジナイズした。ホモジナイズの前に、以下のプロテアーゼインヒビター混合物を各緩衝液に加えた：１mM ＰＭＳＦ、１μＭペプスタチン、１μＭロイペプチン、１０μＭ ＴＰＣＫおよび１０μＭ ＴＬＣＫ（最終濃度）を加えた。ホモジネートを２８，０００ｇで１５分遠心分離し、上清をガラスウールでろ過した。最後にグリセロールを３０％（v/v）になるように加え、タラ肝臓の粗抽出物を−７０℃で凍結した。
【００３８】
Ｑ−セファロースファーストフロー（Q-sepharose Fast Flow）
１リットルの粗抽出物を１リットルの緩衝液Ａ（２５mM トリス／塩酸、１０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１％グリセロール、ｐＨ８．０）で希釈した（画分１）。緩衝液Ａで平衡化したＱ−セファロースＦＦカラム（５．０／１５）に、試料を２回（各１リットル）で適用し、次に２５０mlの緩衝液Ａで流速１０ml／分で洗浄した。カラムに結合したタンパク質を２００mlの緩衝液Ａ＋１．０Ｍ ＮａＣｌで溶出し、カラムを緩衝液Ａで再平衡化した後、前記したように試料の次の部分を適用した。ＵＮＧ含有フロースローと２つのランの洗浄画分をプールした（画分２、２３４０ml）。
【００３９】
Ｓ−セファロースファーストフロー（S-sepharose Fast Flow）
画分２を、緩衝液Ａで流速１０ml／分で平衡化したＳ−セファロースＦＦカラム（１．６／１０）に加えた。カラムを３００mlの緩衝液Ａ＋６０mM ＮａＣｌで洗浄し、緩衝液Ａ中０．０６〜０．４Ｍ ＮａＣｌの２００mlの線形勾配で５ml／分を使用して溶出した。ＵＮＧ含有画分をプール（５５ml）し、緩衝液Ａで一晩透析した（画分３）。
【００４０】
ヘパリンセファロースハイパフォーマンス
画分３を、緩衝液Ａで平衡化したヘパリンセファロースＨＰハイトラップカラム（１．６／２．５）に適用した。カラムを５０mlの緩衝液Ａ＋６０mM ＮａＣｌで洗浄し、緩衝液Ａ中０．０６〜０．４Ｍ ＮａＣｌの５０mlの線形勾配で流速１ml／分で溶出した。ＵＮＧ含有画分をプールした（画分４、２０ml）。
【００４１】
ポリ−Ｕセファロース（４Ｂ）
次に画分４を緩衝液Ａで５倍に希釈し、緩衝液Ａで平衡化したポリ−Ｕセファロースカラム（１．６／１０）に適用した。カラムを６０ml緩衝液Ａ＋６０mM ＮａＣｌで洗浄し、緩衝液Ａ中０．０６〜０．４Ｍ ＮａＣｌの２００mlの線形勾配で流速１ml／分で溶出した。ＵＮＧ含有画分をプールした（画分５、７０ml）。
【００４２】
スーパーデックス７５
画分５を、ウルトラフリー（Ultrafree）１５とウルトラフリー−ＭＣ（Ultrafree-MC）超遠心分離フィルター（ミリポア（Millipore））（カットオフ５Ｋ）を使用して２００μｌに濃縮し、緩衝液Ａで平衡化したゲルろ過カラム（ＨＲ１．０／３０）に、流速０．５ml／分で適用した。画分（３５０μｌ）を集め、ＵＮＧ活性を有するものをプールした（画分６、３ml）。
【００４３】
ニックトランスレーションによる基質の調製
ニックトランスレーションとポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により3Ｈ−ｄＵＭＰ ＤＮＡを調製した。ニックトランスレーションした基質を、総量１mlで作成し、５０mM トリス／塩酸、ｐＨ７．２、１０mM ＭｇＳＯ4、１mM ＤＴＴ、２５０μｇ子ウシ胸腺ＤＮＡ（フェノール／クロロホルムにより精製し、エタノール沈殿してから使用した）、０．１mM ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ（ここで、３μＭのｄＵＴＰは［3Ｈ］−ｄＵＴＰであった、１９．３Ci/mmol）を含有した。次に０．１ng（５．３５×１０-4Ｕ）のＤＮａｓｅＩ（ウシ膵臓、プロメガ（Promega））を加え、３０秒後２５Ｕの大腸菌（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼとニックトランスレーション混合物を２１℃で２４時間インキュベートした。ニックトランスレーションしたＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出により精製し、エタノール沈殿した。ＤＮＡを、５０μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁し、ＴＥ緩衝液（１０mM トリス／塩酸、１mM ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で平衡化したＮＡＰ−５カラム（エーピーバイオテク（AP Biotech））で精製して、取り込まれなかったヌクレオチドを除去した。ニック基質の比活性は１．８×１０5 dpm/μｇ（４２５cpm/pmol）であった。
【００４４】
ＰＣＲによる基質の調製
ＰＣＲ産生した基質を、すべての解析実験に使用し、これはタイセイヨウサケ （サルモ・サラー（Salmo salar））の陽イオン性トリプシノーゲン（ｓｓｔｒｐＩＶ）から作成した７６１bp断片からなっていた（６１）。パーキンエルマーシータス（Perkin Elmer Cetus）サーマルサイクラー中で５０μｌの容量で、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ混合物は、１０mM トリス／塩酸、ｐＨ８．３、５０mM ＫＣｌ、６mM ＭｇＣｌ2、０．３７mM ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＵＴＰ（ここで、１０．４μＭのｄＵＴＰは［3Ｈ］−ｄＵＴＰであった、１７．０Ci/mmol、アマシャム（Amersham））、７００pgの鋳型ＤＮＡ（ｐｇｅｍ７ｚｔ−ベクター中のｓｓｔｒｐＩＶ）、２．５μＭの上流プライマーと下流プライマー、および２ＵのＴａｑポリメラーゼ（ロッシュ（Roche）、スイス）を含有した。ＰＣＲ反応は、９４℃１分、４５℃１分、７２℃１分を３０サイクル行った。次にさらに２ＵのＴａｑポリメラーゼを加え、ＰＣＲ反応を前記したように新しい３０サイクル続けた。ＰＣＲ基質を、製造業者の説明に従って、キアクイック（QIAquick）ＰＣＲ精製キット（キアゲン（Quiagen））で精製し、５０×希釈ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出した。ＰＣＲ基質の比活性は、５．９×１０5 dpm/μｇ（４５１cpm/pmol）であった。すべての解析実験は、ＰＣＲ基質を使用して行った。
【００４５】
ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性の検出（標準測定法）
ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性を、７０mMトリス／塩酸、１０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１００μg/ml ＢＳＡおよび２３０ngのニック基質または７１ngのＰＣＲ基質を含有する最終容量２０μｌで測定した。反応混合物を３７℃で１０分インキュベートし、２０μｌの氷冷１本鎖子ウシ胸腺ＤＮＡ（１mg/ml）と５００μｌの１０％（w/v）ＴＣＡを加えて停止させた。試料を氷上で１５分インキュベートし、１６，０００ｇで１０分遠心分離した。酸溶解性3Ｈ−ウラシルを有する上清を、液体シンチレーションカウンターを使用して分析した。
１単位の活性は、３７℃で１分間に１nmolの酸可溶性ウラシルを放出させる酵素の量と定義する。
【００４６】
薄層クロマトグラフィーによる測定生成物の分析
測定後の反応生成物を２０nmolのウラシル、デオキシウリジンおよびデオキシウリジン−一リン酸と混合した。ワングとワング（Wang and Wang）の方法に従って、ポリアミド層プレート（ＢＤＨ）とテトラクロロメタン、酢酸、およびアセトン（４：１：４、容量）を溶媒として使用して、薄層クロマトグラフィーを行った（６２）。ＵＶ光により検出されたスポットをプレートから切り出し、液体シンチレーションカウンターで放射能を測定した。
【００４７】
分子量測定
ゲルろ過により分子量を測定し、２５mMトリス／塩酸、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１％グリセロール（ｐＨ８．０）を含有する緩衝液で平衡化したスーパーデックス７５カラム（１．０／３０）で行った。流速は０．５ml／分であり、採取した画分で活性を測定した（２５０μｌ）。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、６７ｋＤ）、オバルブミン（４３ｋＤ）、キモトリプシノーゲンＡ（２５ｋＤ）およびリボヌクレアーゼＡ（１３．７ｋＤ）を、標準物質として使用した。ブルーデキストランと塩化ナトリウムを使用して、それぞれボイド（Ｖ0）容量と内部容量（Ｖi）を決定した。
【００４８】
タンパク質測定
タンパク質濃度は、クマシー（登録商標）プロテインアッセイ試薬Ｇ−２５０（ピアス（Pierce）、ニューヨーク、ニューヨーク州）を用いて、ブラッドフォード（Bradford）の方法（６３）により測定し、マイクロタイタープレートプロトコールは製造業者の説明書に従って、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準物質として使用して測定した。
【００４９】
等電点測定
等電点測定は、ファーストシステム（Phast-system）、等電点電気泳動ゲル３−９を用いて、製造業者が記載する方法に従って銀染色して行った。使用した標準物質は、フィコシアニン（４．４５、４．６５、４．７５）、β−ラクトグロブリンＢ（５．１０）、ウシカーボニックアンヒドラーゼ（６．００）、ヒトカーボニックアンヒドラーゼ（６．５０）、ウマミオグロビン（７．００）、ヒトヘモグロビンＡ（７．１０）、ヒトヘモグロビンＣ（７．５０）、レンチルレシチン（７．８、８．０、８．２）、チトクロムｃ（９．６）、（ＩＥＦ標準物質ｐＩ範囲 ４．４５〜９．６、バイオラッド（Bio-Rad））である。電気泳動後、ゲルを２mm片に切断し、それぞれ２５０μｌの抽出緩衝液（５０mMトリス／塩酸、０．２Ｍ ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１％（v/v）グリセロール、ｐＨ８．０）で一晩インキュベートした。５μｌのアリコートを測定混合物に移し、標準測定条件を使用して活性を測定した。
【００５０】
最適ｐＨ／ＮａＣｌの測定
測定は、標準測定法に記載したように２０μｌの容量で、ＰＣＲ作成基質と、０〜２００mMの濃度のＮａＣｌ（２５mMの間隔）を使用して、ｐＨ範囲は９．５〜６．５（０．５ｐＨ単位の間隔）で行った。使用したすべての緩衝液は、ジエタノールアミン／ＨＣｌ（９．５〜８．５）、トリス／塩酸（８．５〜７．５）、およびＭＯＰＳ／ＮａＯＨ（７．５〜６．５）である。すべての緩衝液とｐＨは、３７℃で調整し、測定中２５mM濃度で使用した。
【００５１】
最適温度の測定
測定は、標準測定法に記載したように２０μｌの容量で、ＰＣＲ作成基質を使用して行った。測定混合物は、標準測定条件で記載したものであり、すべての温度についてｐＨ８．０に調整した。使用した温度範囲は、５℃〜６０℃であった。活性は、各温度の間に１５分間の間隔で、連続的に測定した。使用した酵素は、標準希釈緩衝液（５mMトリス／塩酸、１０mM ＮａＣｌ、１％（v/v）グリセロール、ｐＨ８．０）で希釈し、氷上に置いた。氷上に長時間置くと酵素試料が不安定なため、結果は、氷上で希釈緩衝液中の酵素の安定性に関して、
【外１】
【００５２】
ｐＨと温度の安定性への影響
ｐＨ： ＵＮＧ（０．０１Ｕ）を、１０mM緩衝液、１０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１％グリセロールを含有する緩衝液中で、ジエタノールアミン／ＨＣｌ（９．５〜８．５）、トリス／塩酸（８．５〜７．５）、ＭＯＰＳ／ＮａＯＨ（７．５〜６．５）およびＭＥＳ／ＮａＯＨ（６．５〜５．５）を緩衝液成分として使用して、ｐＨ範囲９．５〜６．５で（０．５ｐＨ単位の間隔）で、３７℃で１０分間プレインキュベートした（総量７５μｌ）。５μｌのアリコートを測定混合物中に移し、標準測定条件を使用して残存活性を測定した。
【００５３】
温度： ＵＮＧ（０．０１Ｕ）を、１０mMトリス／塩酸、５０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１％グリセロール、ｐＨ８．０（各温度で調整した）中で１０分間プレインキュベートした（総量７５μｌ）。図の凡例に示すように、異なる時間間隔後、５μｌのアリコートを測定混合物に移し、標準測定条件を使用して残存活性を測定した。
【００５４】
ｓｓ／ｄｓＤＮＡに対する基質特異性
ＰＣＲとニックトランスレーションした基質を、１００℃で３分間インキュベートし、次に氷上で急速に冷却してｓｓＤＮＡを作成した。変性後、ｓｓＤＮＡ−基質を、６．６５×１０-4Ｕの精製ｃＵＮＧを用いる標準測定条件で使用した。酵素活性もまた、ニック−およびＰＣＲ−基質の両方についてｄｓＤＮＡ−基質を使用して測定し、標準として使用した。
【００５５】
Ｕｇｉインヒビター−およびウラシル生成物阻害
ＰＣＲ−基質を使用する活性測定を、６．６５×１０-4Ｕの精製ｃＵＮＧを用いて行った。種々の濃度のウラシル（０、１、２および５mM）のＵｇｉ−インヒビター（１．２５×１０3 Ｕ〜２．００×１０2Ｕ）を測定混合物に加えた（氷上）。次に、標準測定条件に記載したように活性を測定した。
【００５６】
結果
ｃＵＮＧの精製
表１に示すようにニシマダラＵＮＧを、回収率２％で１７，０００倍精製した。高い精製倍数にもかかわらず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定すると酵素は部分的にしか精製されなかった。また、精製工程が多いことと、ゲルろ過工程前の希釈タンパク質試料の濃縮のため、収率は低かった。
【００５７】
分子量とｐＩ測定
分子量は、ゲルろ過により３つの異なる実験から、２５ｋＤ±２であると決定された。４．４２〜９．６の範囲のＩＥＦ標準物質を用いてＩＥＦファーストゲル（Phast Gel）で、等電点測定を行った。ＩＥＦ後、ゲル断片からｃＵＮＧ活性を溶出し、活性を材料と方法に記載のように測定した。図１に示すように、ｃＵＮＧ活性はチトクロムｃ（等電点９．６の標準物質）と同時溶出された。電極がゲルと接触するところでは、チトクロムｃとｃＵＮＧ活性が見いだされ、従ってｐＩは９．０より大きいとしか結論できず、これは、このシステムを使用して測定可能な最も高い値である。
【００５８】
基質特異性
ｓｓＤＮＡとｄｓＤＮＡの両方を使用して、ｃＵＮＧ活性を測定した。表２に示すように、ニック−およびＰＣＲ−基質を使用して、それぞれ１．８倍と１．９倍高い活性が見いだされた。測定生成物を薄層クロマトグラフィーにより解析すると、放射能の主要な部分はウラシルとして同定された。しかし一部の放射能は、デオキシウリジンマーカーとともに局在化されたが、これは、２つのマーカーが部分的に重複するためであった。さらに、精製したｃＵＮＧは、3Ｈ−アデニン標識ＤＮＡの有意な加水分解を示さず、従ってＤＮＡを加水分解するのに関与するとしてヌクレアーゼは除外される。
【００５９】
阻害試験
遊離のウラシルによる生成物阻害を試験し、図２に示すように測定混合物中で１mMのウラシルで５０％を越える阻害が得られた。測定混合物に５mMの遊離のウラシルを与えると、活性の７８％阻害が観察された。測定混合物にＵｇｉを加えて、ｃＵＮＧへのＵｇｉの作用を測定した。図３に示すように、ｃＵＮＧはＵｇｉにより明らかに阻害された。
【００６０】
最適ｐＨとＮａＣｌ
図４に示すように、０〜２００mMのＮａＣｌ濃度を使用して、異なるｐＨで酵素活性を測定して、最適なｐＨと塩化ナトリウム濃度を調べた。酵素は広い最適ｐＨを示し、最大活性はｐＨ７．０〜９．０で２５〜５０mMのＮａＣｌであった。最適ＮａＣｌのシフトが観察され、最適ＮａＣｌ濃度は、高ｐＨの低濃度から低ｐＨの高濃度へ変化した。ｐＨ９．５でｃＵＮＧはＮａＣｌにより阻害された。
【００６１】
最適温度
ｃＵＮＧの最適温度は、４１℃であると決定された（図５）。低温でｃＵＮＧの活性を中温性ｒｈＵＮＧと比較するために、５〜６０℃で酵素活性を測定し、低温での活性は、各最適温度に匹敵した（図６）。これら２つの酵素の活性プロフィールは、５〜１５℃でほとんど差はなかった。しかし２０〜４０℃の温度では、ｒｈＵＮＧよりｃＵＮＧでより相対的に高い活性が観察され、高温（５０〜６０℃）では、逆が観察された。
【００６２】
安定性
異なるｐＨで酵素をインキュベートすることにより、２つのＵＮＧ酵素の安定性を比較した。ニシマダラＵＮＧは、ｐＨ７．０〜８．５で最も安定であった。ｐＨ５．５とｐＨ１０．０では、１％未満の残存活性であった。ｒｈＵＮＧは、ｐＨ７．０〜９．５で最も安定であった。図７に示すように、ｐＨ５．５では、３％の活性が残存したが、ｐＨ１０．０では６６％もの活性が残存した。２つのＵＮＧ酵素の温度安定性を、４℃、２５℃、３７℃、および５０℃で比較した。５０℃では半減期は、ｃＵＮＧとｒｈＵＮＧについてそれぞれ０．５分と８分であった。調べたすべての温度で、ｒｈＵＮＧはｃＵＮＧより安定であった。測定された半減期は、ｃＵＮＧについて２０分（３７℃）、６０分（２５℃）、および２時間（４℃）であり、ｒｈＵＮＧについては３０分（３７℃）、１５０分（２５℃）および２．６時間（４℃）であったが、図８に示すように、高温で半減期の大きな差が見られた。
【００６３】
考察
精製と分子量
ニシマダラ（Gadus morhua）の肝臓からのウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを、数種類のクロマトグラフィー法を使用して１７，６７９倍精製した。それでも酵素はわずかに精製されたのみであり、いくつかの他のバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に見られた。
【００６４】
ヒトの核およびミトコンドリアウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼは、代替スプライシングにより産生され、それぞれ３１３と３０４アミノ酸のＯＲＦを有する（４９）。ｃＵＮＧの分子量は、２５ｋＤであると測定された。これは、ヒト胎盤（２９ｋＤ）とｒｈＵＮＧ（ＵＮＧΔ８４）（２７ｋＤ）について測定したものとほぼ同じ分子量であり、ミトコンドリアＯＲＦ（２１、６４）から予測されるように、最初のＮ末端アミノ酸がそれぞれ７７と８４個が欠如していた。これは、精製ｃＵＮＧ中のＮ末端シグナル配列が、プロセシングされるかまたは精製中に人工的に切断されるか、またはニシマダラＵＮＧが、Ｎ末端シグナル配列を持たないことを示唆している。精製中に、ラットまたはヒト起源（１８、２３）のＵＮＧの精製中に既に記載されているような２つの異なるＵＮＧの兆候はなかった。しかし脊椎動物として、ニシマダラは核とミトコンドリア型の両方のＵＮＧを有することが予測されるが、これまでのところこれを確認する試みはなされていない。
【００６５】
ニシマダラからのウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼは、すでに精製され高ｐＩ（１９）について性状解析された他のウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼと似ており、ｄｓＤＮＡよりｓｓＤＮＡに対して２倍の選択性があった（１９）。
【００６６】
Ｕｇｉとウラシルによる阻害
枯草菌（Bacillus subtilis）バクテリオファージＰＢＳ２ ＵＤＧ−インヒビター（Ｕｇｉ）は、生理学的条件下でＵＮＧと安定な複合体を形成することにより、ＵＮＧを阻害する。Ｕｇｉは、保存されたＤＮＡ結合グルーブにベータ鎖を挿入することによりヒトＵＮＧに結合し（６７）、ＤＮＡを模倣する（６８）ことにより作用する。これは、ｃＵＮＧの基質結合部位の構造が、Ｕｇｉインヒビターにより阻害される他のＵＮＧに似ていることを示す。遊離のウラシルによる阻害は、すでに報告されている値（１９）と一致した。
【００６７】
最適条件
ｃＵＮＧは、７．０〜９．０の広い最適ｐＨを有することが証明され、活性はＮａＣｌ濃度により強く影響を受けた。広い最適活性は、性状解析されたいくつかの他のＵＮＧですでに報告されている（２３、３１、４０、４７）。興味深いことにｃＵＮＧの最適ＮａＣｌは、ｐＨが低下すると上昇する。ＵＮＧは低イオン強度で前進型で機能することがすでに証明されており、これは、ＮａＣｌ濃度が上昇すると、酵素が分散性機構にスイッチする（１４、１５）。しかしプルマル（Purmal）らは、反対のことを報告し、ＵＮＧは低イオン強度では分散性機構で作用するとしている。前進性機構は、いくつかのＤＮＡ相互作用性タンパク質（ポリメラーゼ、レプレッサー、制限酵素／修飾酵素、ＤＮＡ修復酵素）で共通の特徴であり、相互作用は一般的に自然界では静電的である（６７〜７１）。ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）からのＵＶエンドヌクレアーゼでは、前進性機構はｐＨ依存性であることが証明されている（７２）。従って我々は、ｐＨの上昇による最適ＮａＣｌのシフトは、ｃＵＮＧの前進性／分散性を反映していると考えている。以前の報告の議論はまた、すでに考察した差違以外に、異なる緩衝液成分によるかも知れない。
【００６８】
最適温度（４１℃）は、中温性ｒｈＵＮＧ（４５℃）よりわずかに低かった（６４）。５〜４５℃の温度での相対活性は、ｒｈＵＮＧよりｃＵＮＧについて高かった。４５℃より高い温度では、ｒｈＵＮＧは、おそらくｃＵＮＧの低温での安定性の結果として、ｃＵＮＧより高い相対活性を示す。
【００６９】
温度とｐＨ安定性
低温順応した種から解析された酵素は、おそらく低温での酵素活性を維持するためのその柔軟性のある構造のために、より温度不安定性かつｐＨ不安定性であることがわかった（７３）。ｃＵＮＧは、ｒｈＵＮＧよりｐＨと温度に対して不安定であることがわかり、これは、他の低温順応酵素の公知の特徴である（７３、７４）。
【００７０】
海洋微生物からの好冷ＵＮＧは、すでに単離されており、温度安定性に関して大腸菌（E. coli）ＵＮＧに匹敵した（４５）。この原核生物ＵＮＧは、４０℃で半減期が２分であり、４５℃で０．５分で、大腸菌（E. coli）ＵＮＧについての２７分と８分に匹敵した。温度とｐＨ安定性の両方について、ｃＵＮＧをｒｈＵＮＧと比較した。５０℃では、ｒｈＵＮＧは半減期が８分であり、ｃＵＮＧでは０．５分であった。より低い温度では、半減期の差は小さかったが、すべての調べた温度でｒｈＵＮＧはｃＵＮＧより安定であった。両方の酵素とも、低ｐＨでは不安定であり、高ｐＨでは、ｃＵＮＧよりｒｈＵＮＧがより安定であった。
【００７１】
結論として、ニシマダラからのＵＤＧは、分子量、高ｐＩ、広い最適ｐＨおよびｄｓＤＮＡよりｓｓＤＮＡに対する２倍の選択性に関して、すでに精製され性状解析されている他のウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼに似ていることが証明された。しかしｃＵＮＧは、温度とｐＨに対してより不安定であり、低温では中温性ｒｈＵＮＧより高い相対活性を有することが証明された。
【００７２】
例２
ニシマダラ（Gadus morhua）からのウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子の単離
以下の材料を使用した：スーパースクリプト（SuperScript）（登録商標）II ＲｎａｓｅＨ-逆転写酵素（ギブコビーアールエル（Gibco BRL））、パッケージーン（Packagene）（登録商標）ラムダＤＮＡパッケージシステムは、プロメガ（Promega）（マジソン、ウィスコンシン州）から購入し、デオキシ［５−3Ｈ］ウリジン５’−三リン酸（１７．０Ci/mmol）は、アマシャム（Amersham）（英国）から購入し、発現ベクターpTrc99Aは、アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）（ウプサラ、スエーデン）から購入し、制限酵素は、ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs）（ビバリー、マサチューセッツ州）から購入し、スマート（SMART）（登録商標）ＰＣＲ ｃＤＮＡライブラリー構築キットとマラソン（Marathon）（登録商標）ｃＤＮＡ増幅キットは、クロンテク（Clontech）（パロアルト、カリホルニア州）から購入した。大腸菌（Escherichia coli）ＮＲ８０５２［Δ（pro-lac）、thi-、ara、trpE9777、ung1］（７５、７６）と精製組換えヒトＵＮＧ（ＵＮＧΔ８４）（６４）は、ハンス・イー・クロカン（Hans E. Krokan）博士（癌研究と分子生物学研究所（Institute for Cancer Research and Moleecular Biology）、ノルウェー科学技術大学（Norwegian University of Science and Technology））により提供された。
【００７３】
ｍＲＮＡの単離
オリゴテックス（Oligotex）直接ｍＲＮＡミディキット（キアゲン（Quiagen））を使用して、製造業者のプロトコールの指示に従って、２５０mgのタラ肝臓からｍＲＮＡを単離した。
【００７４】
ｃＤＮＡの調製
スマート（SMART）（登録商標）ＰＣＲ ｃＤＮＡライブラリー構築キット（クロンテク（Clontech））を使用して、製造業者の薦めるプロトコールに従って、２５０ngの単離したポリＡ+ ＲＮＡからｃＤＮＡを作成した。簡単に説明すると、２５０ngのポリＡ+ ＲＮＡを１０pmolのスマート（SMART）オリゴヌクレオチド（５‘−ＴＡＣＧＧＣＴＧＣＧＡＧＡＡＧＡＣＧＡＣＡＧＡＡＧＧＧ−３’）と１０pmolのＣＤＳ／３’ＰＣＲプライマー（オリゴ（ｄＴ）３０ Ｎ−１Ｎ（Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，またはＴ；Ｎ−１＝Ａ，Ｇ，またはＣ））と、最終容量５μｌで一緒にし、７２℃で２分インキュベートし、次に直接氷上に２分おいてＲＮＡを変性させて、第１鎖ｃＤＮＡを作成した。次に酵素と緩衝液を、反応混合物に最終容量１０μｌ（５０mMトリス／塩酸、ｐＨ８．３、６mM ＭｇＣｌ2、７５mM ＫＣｌ、２mM ＤＴ、それぞれ１mM ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、および２００Ｕのスーパースクリプト（SuperScript）（登録商標）II ＲｎａｓｅＨ-逆転写酵素（ギブコビーアールエル（Gibco BRL））からなる）で加え、次に４２℃で１時間インキュベートした。第２鎖の合成は、鋳型として２μｌの第１鎖、４０mM トリシン／ＫＯＨ ｐＨ９．２（２５℃）、１５mM ＫＯＡｃ、３．５mM Ｍｇ（ＯＡｃ）2、３．７５μg/mlのＢＳＡ、それぞれ０．２mMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１Ｕのアドバンテージ（Advantage）ｃＤＮＡポリメラーゼミックス（クロンテク（Clontech））、０．２μＭ ５’−ＰＣＲプライマー（５’−ＴＡＣＧＧＣＴＧＣＧＡＧＡＡＧＡＣＧＡＣＡＧＡＡ−３’）とＣＤＳ／３’−ＰＣＲプライマーを含有する最終容量１００μｌで、ＰＣＲにより行った。
【００７５】
ＰＣＲ増幅は、ジーンアンプ（GeneAmp）９７００サーマルサイクラー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer））中で、９５℃で１分、次に９５℃で１５秒と６８℃で５分を１６サイクル行った。
【００７６】
ｄｓ ｃＤＮＡポリッシング。増幅したｄｓ ｃＤＮＡ ５０μｌに、４０μｇのプロテイナーゼＫを加え、４５℃で１時間インキュベートした。混合物を９０℃で８分インキュベートして、プロテイナーゼＫを不活性化した。ｄｓ ｃＤＮＡを平滑末端化するために、１５ＵのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを加え、１６℃で３０分と７２℃で１０分インキュベートした。最後にｄｓ ｃＤＮＡをエタノール沈殿させ、１０μｌの水に再懸濁した。特に明記しない場合は、すべての試験管を氷の上に置いた。
【００７７】
ｃＵＮＧ−遺伝子の３００bp断片の作成
既知のＵＮＧ−アミノ酸配列からの２つの保存領域（ＧＱＤＰＹＨとＶＦＬＬＷＧ）から、縮重したオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。プライマーを設計する時に、ニシマダラのコドン使用を考慮した。ＵＮＧ断片は、鋳型としてタラの肝臓のｃＤＮＡを用いて、１０mMのトリス／塩酸 ｐＨ９．２（２５℃）、５０mM ＫＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００、１０ng ｃＤＮＡ、それぞれ０．２mMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、２．０μＭの上流プライマー（５’−ＧＧＨ−ＣＡＲ−ＧＡＹ−ＣＣＣ−ＴＡＹ−ＣＡ−３’）と下流プライマー（５’−ＤＣＣ−ＣＣＡ−ＳＡＧ−ＳＡＧ−ＲＡＡ−ＶＡＣ−３’）、および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（プロメガ（Promega））を含有する最終容量５０μｌで、ＰＣＲにより作成した。ＰＣＲは、９４℃で４分後に、９４℃で１分、６０℃で１分、７２℃で１分を３０サイクル行い、次に最後の伸長工程を７２℃で５分行った。
【００７８】
使用したヌクレオチド記号は以下の通りである：Ａ＝アデニン；Ｃ＝シトシン；Ｇ＝グアニン；Ｔ＝チアミン；Ｄ＝Ａ＋Ｇ＋Ｔ；Ｒ＝Ａ＋Ｇ；Ｓ＝Ｃ＋Ｇ；Ｖ＝Ａ＋Ｃ＋Ｇ；Ｙ＝Ｃ＋Ｔ。
【００７９】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列決定は、アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）サーモシーケナーゼＣｙ５ダイターミネーター（Dye Terminator Kit）キット、アルフェクスプレス（ALFexpress）（登録商標）ＤＮＡシ−ケンサーおよびアルフウィン（ALFwin）配列アナライザーバージョン２．１０を用いて行った。ゲルは、レプロゲル（Reprogel）（登録商標）ロングリード（Long Read）とレプロセットＵＶ−ポリメライザー（Reproset UV-polymerizer）を用いて作成した。すべての部材は、アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）（ウプサラ、スエーデン）から購入した。
【００８０】
ＲＡＣＥ法
アダプターのｃＤＮＡへの連結は、製造業者のプロトコールに記載のように行った。簡単に説明すると、５０mMトリス／塩酸（ｐＨ７．８）、１０mM ＭｇＣｌ2、１０mM ＤＴＴ、１mM ＡＴＰ、０．７５μｇ ｃＤＮＡ、２μＭ マラソンｃＤＮＡアダプター（クロンテク（Clontech））、４００Ｕ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを含有する総量１０μｌで、ＲＡＣＥ−アダプターをｃＤＮＡに連結した。反応物を１６℃で６時間と７０℃で５分インキュベートして、リガーゼを不活性化した。ＲＡＣＥの前に、アダプターが連結したｃＤＮＡをＴＥ緩衝液で５０倍希釈し、１００℃で２分変性させ、氷上に直接置いた。
【００８１】
ＵＮＧ−遺伝子の３００bpの断片から推定される配列を使用して、ｃＤＮＡ末端の３’−と５−迅速増幅ための２つのプライマーを設計し、作成した２つの断片の間に小さな重複領域を作成した。３’−と５’−反応の両方とも、鋳型としてＲＡＣＥアダプターを有する１μｌの希釈ｃＤＮＡ、それぞれ０．２μＭの内部３’−（５’−ＴＧＴＡＣＣＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＧＣＴＴＣＡＡＧＣＡＴ−３’）または５’−（５’ＣＣＣＡＴＣＣＧＣＴＴＡＧＡＴＣＴＣＣＡＴＧＴＣＣＡＧ−３’）ＲＡＣＥプライマー、０．２μＭのＡＰ１−プライマー（製造業者から供給された）（５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’）、４０mMのトリシン／ＫＯＨ ｐＨ９．２（２５℃）、１５mM ＫＯＡｃ、３．５mMのＭｇ（ＯＡｃ）2、３．７５μg/mlのＢＳＡ、０．２mMの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１Ｕのアドバンテージ（Advantage）ｃＤＮＡポリメラーゼミックス（クロンテク（Clontech））を有する５０μｌ容量中で行った。増幅は、ジーンアンプ（GeneAmp）９７００サーマルサイクラー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer））中で、９４℃で３０秒の後、９４℃で５秒と７２℃で３分を５サイクル、９４℃で５秒と７０℃で３分を５サイクル、および９４℃で５秒と６８℃で３分を２０サイクル行った。
（個々のバンドを、アガロースゲルから精製し、鋳型として使用して新しいＰＣＲ反応で上記と同じ条件を使用して、より多くのＤＮＡを作成した。）
【００８２】
２つの異なるＵＮＧ遺伝子の単離
作成したＲＡＣＥ断片を、その各内部ＲＡＣＥプライマーを使用して配列決定した。５’−ＲＡＣＥ断片の配列を調べると、断片の５’末端の近くで、読むのが困難な２本鎖を示した。しかしＵＮＧ配列（別の配列ではない）の１つの中の長いＵＴＲのために、断片の末端に１つの配列だけが現れた。この５’末端に相補的な新しいプライマーを設計（５’−ＡＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＴＧＡＧＡＴＴＧＧＣＧＣＣＴＴＴＧＧ−３’）し、これと、５’−ＲＡＣＥ内部プライマーと、鋳型として５’−ＲＡＣＥ断片を用いて、新しいＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは、４０mMのトリシン／ＫＯＨ ｐＨ９．２（２５℃）、１５mM ＫＯＡｃ、３．５mMのＭｇ（ＯＡｃ）2、３．７５μg/mlのＢＳＡ、０．２mMの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１Ｕのアドバンテージ（Advantage）ｃＤＮＡポリメラーゼミックス（クロンテク（Clontech））、鋳型として１０ngのｃＤＮＡ、およびそれぞれ０．２μＭの上流プライマーと下流プライマーを有する５０μｌに最終容量中で行った。増幅は、ジーンアンプ（GeneAmp）９７００サーマルサイクラー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer））中で、９４℃で１分の後、９４℃で３０秒、６０℃で１分、および７２℃で１分を３０サイクル行った。
【００８３】
断片は、内部ＲＡＣＥプライマーを使用して配列決定し、配列を、上記２本鎖配列領域から差し引いた。基本配列の５ｐ末端に相補的なプライマーを設計（ＳＭＡＲＴ配列と残りのＵＮＧ配列からの両方のヌクレオチドからなる）し、これと５’−ＲＡＣＥプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。新しい断片を、上記のように配列決定した。５’−ＲＡＣＥ断片中の２つの異なるＵＮＧ配列から２つの最終プライマー（ＵＮＧ１とＵＮＧ２）を作成して、ｃＤＮＡを鋳型として、上記の同じＰＣＲ条件で、それぞれ完全長ＵＮＧ１とＵＮＧ２を単離した。
【００８４】
発現ベクターの構築
ＵＮＧ−遺伝子の触媒ドメインを、複クローニング部位（７７）の上流に強いｔｒｃプロモーターを含有する発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ中にクローン化した。ｃＤＮＡを鋳型として使用して、それぞれＥｃｏＲＩとＳａｌＩ制限部位を含有する上流プライマーと下流プライマーを用いて遺伝子をＰＣＲ増幅して、いくつかの異なる構築体を作成した。ＤＮＡ断片を精製し、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化し、ｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクターに連結した。簡単に説明すると、制限部位を有するＰＣＲ断片を、４０mMのトリシン／ＫＯＨ ｐＨ９．２（２５℃）、１５mM ＫＯＡｃ、３．５mMのＭｇ（ＯＡｃ）2、３．７５μg/mlのＢＳＡ、０．２mMの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１Ｕのアドバンテージ（Advantage）ｃＤＮＡポリメラーゼミックス（クロンテク（Clontech））、鋳型として１０ngのｃＤＮＡ、およびそれぞれ０．２μＭの上流プライマーと下流プライマーを有するＰＣＲ反応物（５０μｌ）中で作成した。増幅は、ジーンアンプ（GeneAmp）９７００サーマルサイクラー（パーキン・エルマー（Perkin-Elmer））中で、９４℃で１分の後、９４℃で３０秒と６０℃で１分、および７２℃で２分を３０サイクル行い、７２℃で５分の最後の伸長工程を行った。個々のバンドを、アガロースゲルから精製し、鋳型として使用して新しいＰＣＲ反応で上記と同じ条件を使用して、より多くのＤＮＡを作成した。ＤＮＡを、キアクイック（Quiaquick）ＰＣＲ精製キット（ミリポア（Millipore））を使用して精製し、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出した。制限酵素消化は、１μｇの挿入ＤＮＡまたは０．２５μｇのｐＴｒｃ９９Ａベクター、６mMトリス／塩酸、ｐＨ７．９、６mM ＭｇＣｌ2、１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＤＴＴ（バッファーＤ、プロメガ（Promega））および３ＵのＥｃｏＲＩとＳａｌＩを含有する３０μｌの最終容量中で行った。混合物を３７℃で３時間インキュベートし、次にフェノール／クロロホルムで２回抽出し、エタノール沈殿させ、５μｌの水に再懸濁した。連結は、５０mMトリス／塩酸（ｐＨ７．８）、１０mM ＭｇＣｌ2、１０mM ＤＴＴ、１mM ＡＴＰ、１００ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、２５０ngのベクターＤＮＡおよび１μｇの挿入ＤＮＡを含有する１０μｌの最終容量で行い、１６℃で１６時間インキュベートした。
【００８５】
コンピタントな大腸菌（E. coli）ＪＭ１０５（２００μｌ）を連結混合物で形質転換し、１００μg/mlのアンピシリンを含有するＬＢ＋プレート上で３７℃で増殖させた。陽性クローンからプラスミドＤＮＡを再単離し、組換えＵＮＧの発現のために使用した大腸菌（E. coli）ＮＲ８０５２中で形質転換した。
【００８６】
４つの異なる構築体を作成した：ｒｃＵＮＧΔ７４とｒｃＵＮＧΔ７４ｏとｃＵＮＧΔ８１とｒｃＵＮＧΔ８１ｏ（ここで、それぞれＮ末端アミノ酸の７４および８１を除去した）。これらは、それぞれヒトΔ７７とΔ８４と同じ長さを有する（６４）。Δ７４ｏとΔ８１ｏ構築体は、ＡＧＡからＣＧＴに変化させることにより、大腸菌（E. coli）中での発現について最適化されたアルギニン８７と８８をコードするコドンを有する。すべての構築体は、上記のようにＰＣＲにより作成し、以下のプライマーと鋳型を使用した：
【００８７】
ｒｃＵＮＧΔ７４：ＵＤＧＬ７７（５’−ＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＴＣＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＣＧＣＣＴＧＣＡ−３’）およびＵＤＧＥＮＤ２（５’−ＧＡＧＣＴＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＡＧＴＧＣＣＴＣＴＣＣＡＧＴＴＴＡＴＡＧＧ−３’）および鋳型として１０ngのｃＤＮＡ。
ｒｃＵＮＧΔ８１：ＵＤＧＬ８４（５’−ＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＧＧＡＧＡＧＡＣＴＴＧＧＡＧＡＡＧＡ−３’）およびＵＮＤＧＥＮＤ２と鋳型として１０ngのｃＤＮＡ。
ｒｃＵＮＧΔ７４ｏ：（５’−ＡＴＧＧＡＡＴＴＣＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＴＣＧＧＡＧＡＧＡＣＴＴＧＧＣＧＴＣＧＴＧＡＧ−３’）およびＵＤＧＥＮＤと鋳型として１ngのｒｃＵＮＧΔ８１ｏ．
ｒｃＵＮＧΔ８１ｏ：（５’−ＡＴＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＧＧＡＧＡＧＡＣＴＴＧＧＣＧＴＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＣＴＧＣ−３’）およびＵＤＧＥＮＤ２と鋳型として１０ngのｃＤＮＡ。
【００８８】
ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼの小スケール発現
１００μg/mlのアンピシリンを有する１００mlのＬＢ＋培地に５mlのプレカルチャを接種して、１リットルの邪魔板付き三角フラスコ中で発現の最適化を行った。細胞を１mMのＩＰＴＧでＯＤ６００≒２．０で誘導し、種々の長さで誘導した。種々の温度（２０℃、２５℃、３０℃および３７℃）を使用して、発現を調べた。
上記条件は、種々のＩＰＴＧ濃度（１mM、０．５mM、０．１mM、および０．０１mM）で発現を誘導するのにも使用した。
【００８９】
発酵条件
発酵は、１０リットルのチェマップ（Chemap）ＣＦ３０００ファーメンター（スイス）中で行った。ｐＴｒｃ９９Ａ ｏΔ８４構築体を有する２００mlの大腸菌（E. coli）ＮＲ８０５２のプレカルチャーを、２０mMグルコースと１００μg/mlアンピシリンを補足した７リットルのＬＢ培地に接種した。細胞をＯＤ６００が２．０まで増殖させ、１mM ＩＰＴＧで８時間誘導した。発酵中に追加のグルコース（３×５０mlの２０％グルコース（w/v））を補足して、グルコースが枯渇するのに避けた。細胞を採取し、１０，０００ｇで１０分遠心分離した。細胞ペーストを−７０℃で凍結した。
【００９０】
組換えタラＵＮＧの精製
粗抽出物
発酵から４リットルの大腸菌（E. coli）ＮＲ８０５２細胞（６８ｇの湿重量）を、４００mlの抽出緩衝液（２５mMトリス／塩酸、１０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１％グリセロール、１mM ＤＴＴ、１mM ＰＭＳＦ ｐＨ８．０）に再懸濁した。１００psiの窒素を使用してネブライザーに５回通して、細胞を破砕した。抽出物を２５，０００ｇで１０分遠心分離し、上清を除去した。ペレットを１０mlの緩衝液Ａに再懸濁し、前記したように再遠心分離した。上清を一緒にし、ガラスウール（４６０ml）に通してろ過した。
【００９１】
プロタミン硫酸
粗抽出物（４６０ml）に、緩衝液Ａ（２５mMトリス／塩酸、１０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１％グリセロール、ｐＨ８．０）中の２％プロタミン硫酸６０mlを加え、４℃で５分攪拌しながらインキュベートした。溶液を２５，０００ｇで１０分遠心分離し、上清を除去した、５１０ml（画分１）。
【００９２】
Ｑ／Ｓ−セファロース
プロタミン硫酸画分を、Ｓ−セファロースカラム（２．６／１０）に結合したＱ−セファロースカラム（５．０／１０）（両方とも、１０ml／分の流速を使用して緩衝液Ａで平衡化されている）に適用した。次にカラムを７５０mlの緩衝液Ａで洗浄し、次にＱ−セファロースカラムを除去した。Ｓ−セファロースカラムをさらに５５０ml緩衝液Ａ＋６０mM ＮａＣｌで洗浄し、緩衝液Ａ中６０〜４００mM ＮａＣｌの勾配を適用して流速５ml／分でカラムを溶出した。１０mlの画分を集め、ＵＮＧ−活性を含有する画分をプールした（画分２、１１５ml）。
【００９３】
ブルーセファロースＦＦ
画分２を、緩衝液Ａで２倍に希釈し、流速４ml／分でブルーセファロースカラム（１．６／５０）に直接適用した。次にカラムを３０mlの緩衝液Ａおよび６０mlの緩衝液Ａ＋１１０mM ＮａＣｌで洗浄し、６０mlの緩衝液Ａ＋０．７Ｍ ＮａＣｌで溶出した。ＵＮＧ含有画分をプールした（画分３、２４ml）。
【００９４】
スーパーデックス７５
画分３をウルトラフリー（Ultrafree）１５ユニット（ミリポア（Millipore））を使用して３mlに濃縮し、緩衝液Ａ＋０．１５Ｍ ＮａＣｌで平衡化したスーパーデックス７５カラム（２．６／６０）に適用した。流速２ml／分を使用し、５mlの画分を集めた。ＵＮＧ活性画分をプールした（画分４、３０ml）。
【００９５】
ソース１５Ｑ
スーパーデックス７５画分をウルトラフリー（Ultrafree）１５ユニット（ミリポア（Millipore））を使用して透析ろ過し、スーパーデックス７５画分の約２／３を、室温で緩衝液Ａで平衡化したソース１５Ｑカラム（２．６／３．０）に適用した。カラムを６０mlの緩衝液Ａ＋６０mlのＮａＣｌで洗浄し、次に緩衝液Ａ中６０〜２１０mMのＮａＣｌの勾配を適用して、カラムを溶出させた。画分を氷上に集め、ＵＮＧ含有画分をプールした（ＵＮＧ活性は、１０５〜１４５mM ＮａＣｌで溶出した）。
【００９６】
結果
ｃＵＮＧ１とｃＵＮＧ２についてのそれぞれヌクレオチド配列と一文字コードアミノ酸配列を、同封の配列リストに配列番号１と２として示す。
【００９７】
発現
７リットルスケールの発酵でのｐＴｒｃ９９Ａ−Δ８１ｏ構築体によるｒｃＵＮＧの発現により、粗抽出物に含有される全部で４１３，４８０単位のｒｃＵＮＧが得られた。
【００９８】
組換えタラＵＮＧの精製
組換えｃＵＮＧ（Δ８１ｏ）（ｒｃＵＮＧ）の精製を行った。４リットルの発酵バッチから、４．８mgの組換えＵＮＧをほぼ均一になるまで精製し、分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより２８ｋＤとして決定した。酵素の比活性は、標準測定条件でニック作成基質を使用して、３０，０９２u/mgであると測定された。この調製物は、標準方法で、検出可能なレベルのＤＮＡ−エンドデオキ
【００９９】
例３
熱不活性化後の残存活性／再活性化の測定
５０μｌの「Ｔａｑ緩衝液」（１０mMトリス／塩酸（２５℃でｐＨ＝９．０）、５０mM ＫＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００）中の１１．５単位のｒｃＵＮＧ（約０．３８μｇ）を、９４℃で１０分不活性化し、二等分した。片方を４℃で維持し、もう一方を２５℃で維持した後、不活性化の１時間と１６時間後に、標準方法で１５μｌの未希釈不活性化混合物を使用して、残存活性を測定した。不活性化の前に２μｌを取って、１：２０００に希釈後、活性を測定した（１００％対照）。結果は、不活性化した酵素は、検出限界（ブランク対照＋２×標準偏差）以上に、基質から放射能標識ウラシルの放出を引き起こさないことを示した。これらの条件で、１００％対照は７，０００，０００cpmを与え、一方２×バックグランド標準偏差は４６cpmであった。従ってｒｃＵＮＧの残存活性は、これらの条件下で熱不活性化後、初期活性の０．０００６％未満であった。４℃または２５℃で１６時間後に、酵素の有意な再活性化はなかった。
【０１００】
結果は、熱不活性化後にｒｃＵＮＧは実質的な残存活性が無く、再活性化もしないことを示す。従って酵素ｒｃＵＮＧは、海洋細菌からあらかじめ単離したＵＮＧ（熱不活性化後にわずかな程度の再活性化または残存活性を有することが証明されているＢＭＴＵ（４５））とは異なる。
【０１０１】
例４
キャリーオーバー防止
ｃＵＮＧがキャリーオーバー防止反応で、ウラシル含有ＤＮＡを分解するのに有効であるかどうかを試験した。
【０１０２】
方法
汚染物質として０．５ｇのウラシル含有鋳型ＤＮＡ（タイセイヨウサケ （サルモ・サラー（Salmo salar））からの陽イオン性トリプシノーゲンから作成した７６１bp断片）（６１）を、１０mMのトリス／塩酸 ｐＨ９．０（２５℃）、５０mM ＫＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００、１０ng ｃＤＮＡ、それぞれ０．２mMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、２．０μＭの上流プライマー（ＯＰ５）と下流プライマー（ＮＰ２）、および１．０ＵのＴａｑポリメラーゼ（プロメガ（Promega））を含有する最終容量５０μｌ中のＰＣＲ混合物に加えた。ＵＮＧ（４×１０-3または１．７×１０-2Ｕ）をＰＣＲ混合物に加え、周囲温度（ＲＴ）で１０分インキュベートした。
【０１０３】
陰性対照として、１つのＰＣＲ反応混合物は、ウラシルの代わりにチミジンを有する鋳型を含有し、１つの混合物では、ＵＮＧの代わりに水を含有した。また陽性対照として、大腸菌（E. coli）から１．７×１０-3Ｕ ＵＮＧを、ｒｃＵＮＧの代わりに使用した。
【０１０４】
ＰＣＲを９４℃で４分と、次に９４℃で１分、６０℃で１分、および７２℃で１分を３０サイクル行った。ＰＣＲ後、生成物をアガロースゲル電気泳動で分析した。
【０１０５】
ＰＣＲプライマー配列：
ＯＰ５：
５’−ＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＣＴＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡ−３’
ＮＰ２：
５’−ＧＴＡＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＣＴＡＧＡＴ−３’
【０１０６】
結果
本例の実験の結果を図９に示す。ウラシル含有鋳型は、すべてのＰＣＲ反応でＵＮＧにより分解され、一方ＵＮＧを含まないかまたはチミジン含有鋳型を有する反応物では、予測されたＰＣＲ産物が得られた。図９の結果は、アガロースゲルの図として示す。結果は、ＰＣＲ反応における混入しているウラシル含有ＤＮＡを分解するのにｒｃＵＮＧが有効であることを示している。
【０１０７】
【表１】
ａ）酵素活性は、材料と方法に記載の標準方法により、ニック活性基質を使用して、例２に記載のように測定した。
ｂ）タンパク質濃度は、材料と方法に記載のように測定した。
ｃ）タンパク質濃度は、低すぎて測定できなかった。
【０１０９】
【表２】
表２：基質特異性ｓｓＤＮＡ対ｄｓＤＮＡ
基質 cpm 活性％ 倍
ｄｓニック 586 54 1.0
ｓｓニック 1078 100 1.8
ｄｓＰＣＲ 1158 52 1.0
ｓｓＰＣＲ 2214 100 1.9
【０１１０】
本結果は、低温順応真核生物からのＵＮＧの、単離と、ＤＮＡコピー反応におけるキャリーオーバー防止での使用を初めて示す。ＰＣＲ反応に使用される大腸菌（E. coli）から単離された従来既知のＵＮＧ酵素（６０）またはＢＭＴＵ（４５）は、原核生物に由来する。
【０１１１】
ｃＵＮＧは、６０℃以上に加熱されると完全に不活性化され、不活性化は完全に不可逆的である（熱処理後に、検出可能な残存酵素が無いため）。この性質は、大腸菌（E. coli）ＵＮＧまたはＢＭＴＵからのＵＮＧのような、従来この分野で公知の酵素（これらは、熱処理後に完全に不可逆的に不活性化されなかった）と比較して、ｃＵＮＧを、ＤＮＡコピー反応（ＰＣＲ、ＬＣＲなど）におけるキャリーオーバー防止で使用するための酵素としてより優れた候補としている。ＰＣＲ反応サイクルで通常行われる熱処理による完全かつ不可逆的不活性化のために、熱処理後に検出可能な残存酵素は無い。スケールアップ反応おいて、残存ＵＤＧ酵素活性によるＤＮＡ産物の不要な分解はなく、もちろんそのような残存ＵＤＧ酵素活性によるＤＮＡの分解を避けるために、酵素インヒビターを加える必要は無いであろう。
【０１１２】
組換えｃＵＮＧ（ｒｃＵＮＧ）は、タラの肝臓から単離されるｃＵＮＧと同じ性質／機能を有することが証明された。タラの肝臓は、ほんの少量のｃＵＮＧのみを含有する。ｃＵＮＧが組換え法で産生される時、タラの肝臓から抽出により産生されるｃＵＮＧの量と比較して、より多量のｃＵＮＧ作成することができる。
【０１１３】
文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】 ニシマダラのＵＮＧ（ｃＵＮＧ）のｐＩ測定を示す。
【図２】 遊離のウラシルによるｃＵＮＧの生成物阻害を示す。
【図３】 枯草菌（Bacillus subtilis）バクテリオファージウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（Ｕｇｉ）によるｃＵＮＧの阻害を示す。
【図４】 ｃＵＮＧのｐＨと最適ＮａＣｌを示す。
【図５】 ｃＵＮＧの最適温度を示す。
【図６】 ｃＵＮＧ（△）とｒｈＵＮＧ（□）の温度プロフィールを示す。
【図７】 ニシマダラＵＮＧ（ｃＵＮＧ）と組換えヒトＵＮＧ（ｒｈＵＮＧ）のｐＨ安定性を示す。
【図８】 ニシマダラＵＮＧ（ｃＵＮＧ）（△）と組換えヒトＵＮＧ（ｒｈＵＮＧ）（□）の温度安定性を示す。
【図９】 図９は、組換えタラＵＮＧ（ｒｃＵＮＧ）を使用して、キャリーオーバー防止試験からのＰＣＲ産物を示すアガロースゲルである。
【配列表】
Claims (16)
- ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ活性を有し、６０℃以上に加熱すると完全に不活性化される酵素であって、配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列を持つ、酵素。
- ニシマダラ（Gadus morhua）から得られる、請求項１に記載の酵素。
- 検出可能な標識物を含む、請求項１または２に記載の酵素。
- 請求項１〜３までのいずれかに記載の酵素をコードするＤＮＡ配列からなるＤＮＡ分子。
- 配列番号１または配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ配列からなるＤＮＡ分子。
- プロモーターを含む、請求項４または５に記載のＤＮＡ分子。
- 発現ベクターに含まれる、請求項５または６に記載のＤＮＡ分子。
- 前記発現ベクターがプラスミド、コスミドまたはウイルスである、請求項７に記載のＤＮＡ分子。
- 検出可能な標識物を含む、請求項４〜８のいずれかに記載のＤＮＡ分子。
- 請求項４〜９までのいずれかに記載のＤＮＡ分子を含む、微生物または哺乳動物細胞。
- 細菌である、請求項１０に記載の微生物。
- 大腸菌（E. coli）株である、請求項１０または１１に記載の微生物。
- 天然に存在する供給源からのまたは組換えＤＮＡ技術による抽出、生じる混合物からの単離、および精製により調製される、請求項１〜３のいずれかに記載の酵素の調製法。
- ＤＮＡ分子を増殖させる反応系のモニターおよび／または制御における、請求項１〜３のいずれかに記載の酵素の使用。
- 前記反応系がＰＣＲまたはＬＣＲである、請求項１４に記載の使用。
- キャリーオーバー防止法における、請求項１〜３のいずれかに記載の酵素の使用。
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