BR112013025758B1 - Monitoramento de misturas de amplificação de recombinase polimerase - Google Patents

Monitoramento de misturas de amplificação de recombinase polimerase Download PDF

Info

Publication number
BR112013025758B1
BR112013025758B1 BR112013025758-0A BR112013025758A BR112013025758B1 BR 112013025758 B1 BR112013025758 B1 BR 112013025758B1 BR 112013025758 A BR112013025758 A BR 112013025758A BR 112013025758 B1 BR112013025758 B1 BR 112013025758B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
particles
nucleic acid
mixture
recombinase
protein
Prior art date
Application number
BR112013025758-0A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112013025758A2 (pt
Inventor
Niall A. Armes
Olaf Piepenburg
Catherine Jean Greenwood
Original Assignee
Abbott Diagnostics Scarborough, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbott Diagnostics Scarborough, Inc. filed Critical Abbott Diagnostics Scarborough, Inc.
Publication of BR112013025758A2 publication Critical patent/BR112013025758A2/pt
Publication of BR112013025758B1 publication Critical patent/BR112013025758B1/pt

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6432—Quenching
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

monitoramento de misturas de amplificação de recombinase polimerase. um processo que inclui fornecer uma mistura que inclui uma recombinase, uma proteína de ligação de fita única, e um ou mais oligonucleotídeos; e detecção de partículas na mistura de reação.

Description

MONITORAMENTO DE MISTURAS DE AMPLIFICAÇÃO DE RECOMBINASE POLIMERASE CAMPO TÉCNICO
Esta divulgação refere-se a métodos e composições para a detecção de ácido nucleico, amplificação e quantificação.
FUNDAMENTO
Certos métodos de amplificação isotérmica são capazes de amplificar ácido nucleico molde (alvo) de uma maneira especifica a partir de traços a níveis muito elevados e níveis detectáveis dentro de uma questão de minutos. Tais métodos isotérmicos, por exemplo, Amplificação de Recombinase Polimerase (RPA), pode ampliar a aplicação de diagnósticos baseados em ácidos nucleicos em áreas emergentes, tais como testes no ponto de tratamento, e testes de campo e consumidor. A natureza isotérmica e ampla gama de temperaturas das tecnologias pode permitir aos utilizadores evitar a utilização de instrumentação complexa de exigência de potência.
SUMÁRIO
Esta divulgação é baseada, pelo menos em parte, na observação das partículas dentro de misturas RPA. Em algumas formas de realização, estas partículas podem incluir ácidos nucleicos (por exemplo, oligonucleotídeos) e/ou componentes proteicos da reação RPA. Esta descoberta fornece novos métodos de monitoramento e detecção relativos à RPA.
Em um aspecto, esta descrição apresenta processos que incluem: (a) fornecer uma mistura que inclui um ou mais de (por exemplo, dois ou mais, ou todos) uma recombinase, uma proteína de ligação de ADN de fita única, e um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, oligonucleotídeos) (em qualquer combinação) , e (b) detectar partículas na mistura de reação. Em algumas formas de realização, a mistura inclui um agente de aglomeração, por exemplo, um ou mais de polietilenoglicol (por exemplo, PEG1450, PEG3000, PEG8000, PEG 10000, PEG14000, PEG15000, PEG20000, PEG250000, PEG30000, PEG35000, PEG40000, composto PEG com peso molecular entre 15.000 e 20.000 daltons, ou combinações dos mesmos), álcool polivinílico, dextrano e ficol. Em algumas formas de realização, o agente de aglomeração está presente na mistura de reação a uma concentração entre 1 a 12% por peso ou volume da mistura de reação, por exemplo, entre dois valores de concentração escolhidos entre 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5 %, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 5,5%, 6,0%, 6,5%, 7,0%, 7,5%, 8,0%, 8,5%, 9,0%, 9,5%, 10,0%, 10,5%, 11,0%, 11,5%, e 12,0%.
Em algumas formas de realização de todos os aspectos, a recombinase inclui uma RecA ou UvsX recombinase. Em algumas formas de realização de todos os aspectos, a proteína de ligação de ADN de fita única inclui uma proteína SSB procariótica ou uma proteína gp32. Em algumas formas de realização de todos os aspectos, pelo menos, um dos um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, oligonucleotídeos) inclui um marcador detectável.
Em algumas formas de realização de todos os aspectos, as partículas incluem um ou mais (por exemplo, dois ou mais, ou todos) de uma recombinase, uma proteína de ligação de fita única, e, pelo menos, um dos um ou mais ácidos nucleicos (em qualquer combinação) . Em algumas formas de realização de todos os aspectos, a mistura de reação inclui uma recombinase, uma proteína de ligação de fita única, uma polimerase, dNTPs, ATP, um iniciador, e um ácido nucleico molde.
Em algumas formas de realização de todos os aspectos, a mistura inclui um ou mais (por exemplo, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, ou todos) de uma recombinase, um ADN polimerase, uma proteína de ligação de fita única, uma proteína de carregamento recombinase, ATP, dNTPs ou uma mistura de dNTPs e ddNTPs, um agente redutor, creatinoquinase, uma nuclease (por exemplo, uma exonuclease III ou endonuclease IV) , uma transcriptase reversa, uma sonda de ácido nucleico, um iniciador de ácido nucleico, e um ácido nucleico molde (em qualquer combinação).
Em algumas formas de realização de todos os aspectos, as partículas incluem uma polimerase, dNTP, ATP, um iniciador, e um ácido nucleico molde. Em algumas formas de realização de todos os aspectos, as partículas incluem uma recombinase, uma polimerase, dNTP, ATP, um iniciador, e um ácido nucleico molde. Em algumas formas de realização de todos os aspectos, as partículas incluem uma recombinase, uma proteína de ligação de fita única, uma polimerase, dNTP, ATP, um iniciador, e um ácido nucleico molde. Em algumas formas de realização de todos os aspectos, as partículas incluem uma polimerase, dNTP, e ATP, e um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, ou seis) agentes adicionais selecionados de entre o grupo de uma sonda, um iniciador, um proteína de ligação de fita única, ddNTPs, um agente redutor, creatinoquinase, uma nuclease e uma transcriptase reversa. Em algumas formas de realização de todos os aspectos, as partículas incluem uma recombinase, uma polimerase, uma transcriptase reversa, dNTP, ATP, um iniciador, e um ácido nucleico molde.
Em algumas formas de realização de todos os aspectos, as partículas são de cerca de 0,5-20 μm em tamanho, por exemplo, entre cerca de quaisquer dois tamanhos selecionados a partir de 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 12, 15, 18, e 20 μm (por exemplo, cerca de 1-10 μm em tamanho).
Em algumas formas de realização de todos os aspectos, aproximadamente 10 a 5000 partículas /nL, por exemplo, entre quaisquer dois números de partículas selecionados de entre 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 e 5000 partículas por nL, são detectados.
Em algumas formas de realização de todos os aspectos, a detecção de partículas na mistura inclui a utilização de um ou mais de microscopia, um dispositivo microfluídico, citometria de fluxo, e uma câmara. Em algumas formas de realização de todos os aspectos, as partículas são detectadas utilizando detecção de carga acoplada (CCD).
Em outro aspecto, a divulgação apresenta um processo que inclui: (a) fornecer uma mistura de reação de amplificação com recombinase polimerase, (b) manter a mistura de reação sob condições que permitam a produção de produtos de amplificação de ácidos nucleicos na mistura de reação, e (c) detecção de partículas associadas com os produtos de amplificação de ácidos nucleicos na mistura de reação. Em algumas formas de realização, a detecção é realizada dentro de 10 minutos (por exemplo, cerca de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1,5, ou 1 minuto) a partir de quando começa a manutenção.
Em algumas formas de realização de todos os aspectos, a mistura de reação inclui um agente de aglomeração, por exemplo, um ou mais de polietilenoglicol (por exemplo, PEG1450, PEG3000, PEG8000, PEG10000, PEG14000, PEG15000, PEG20000, PEG250000, PEG30000, PEG35000, PEG40000, o composto PEG com peso molecular entre 15.000 e 20.000 daltons, ou suas combinações), álcool polivinilico, dextrano e ficol. Em algumas formas de realização, a mistura de reação contém polietilenoglicol como um agente de aglomeração (por exemplo, qualquer um dos compostos de PEG aqui descritos ou conhecidos na técnica). Em algumas formas de realização, a mistura de reação contém álcool polivinilico como um agente de aglomeração. Em algumas formas de realização, o agente de aglomeração está presente na mistura de reação a uma concentração entre 1 a 12% por peso ou volume da mistura de reação, por exemplo, entre dois valores de concentração selecionados a partir de 1,0%, 1, 5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 5,5%, 6,0%, 6,5%, 7,0%, 7,5%, 8,0%, 8,5%, 9,0%, 9,5%, 10,0%, 10,5%, 11, 0%, 11,5% e 12,0%. Em algumas formas de realização, o agente de aglomeração está presente na mistura de reação a uma concentração que é suficiente para aumentar a quantidade de amplificação na mistura de reação.
Em algumas formas de realização de todos os aspectos, as partículas incluem um ou mais (por exemplo, dois ou mais ou todos) da recombinase, a proteína de ligação de fita única, e, pelo menos, um dos um ou mais ácidos nucleicos (em qualquer combinação).
Em algumas formas de realização de todos os aspectos, a mistura de reação inclui um ou mais (por exemplo, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, ou todos) de uma ADN polimerase, uma proteína de carregamento recombinase, ATP, dNTP ou uma mistura de dNTPs e ddNTPs, um agente redutor, creatinoquinase, uma nuclease (por exemplo, uma exonuclease III ou endonuclease IV) , uma proteína de ligação de fita única, um iniciador de ácido nucleico, uma sonda de ácido nucleico, transcriptase reversa, e um ácido nucleico molde (em qualquer combinação).
Em algumas formas de realização de todos os aspectos, a mistura de reação contém uma recombinase, uma proteína de ligação de fita única, e um ou mais oligonucleotídeos. Em algumas formas de realização de todos os aspectos, a mistura de reação inclui uma recombinase, uma proteina de ligação de fita única, uma polimerase, dNTP, ATP, um iniciador, e um ácido nucleico molde.
Em algumas formas de realização de todos os aspectos, a mistura de reação inclui uma polimerase, dNTPs, ATP, um iniciador, e um ácido nucleico molde. Em algumas formas de realização de todos os aspectos, a mistura de reação inclui uma recombinase, uma polimerase, dNTP, ATP, um iniciador, e um ácido nucleico molde. Em algumas formas de realização de todos os aspectos, a mistura de reação inclui uma recombinase, uma proteína de ligação de fita única, uma polimerase, dNTP, ATP, um iniciador, e um ácido nucleico molde. Em algumas formas de realização de todos os aspectos, a mistura de reação inclui uma polimerase, dNTP, e ATP, e de um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco ou seis) agentes adicionais selecionados de entre o grupo de uma sonda, um iniciador, uma proteína de ligação de fita única, ddNTPs, um agente redutor, creatinoquinase, uma nuclease e uma transcriptase reversa. Em algumas formas de realização de todos os aspectos, a mistura de reação inclui uma recombinase, uma polimerase, uma transcriptase reversa, dNTPs, ATP, um iniciador, e um ácido nucleico molde. Em algumas formas de realização de todos os aspectos, as partículas são cerca de 0,5-20 μm em tamanho, por exemplo, entre cerca de quaisquer dois tamanhos selecionados a partir de 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, e 20 μm (por exemplo, cerca de 1-10 μm em tamanho).
Em algumas formas de realização de todos os aspectos, aproximadamente 10 a 5000 partículas /nL, por exemplo, entre dois números de partículas selecionados entre 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 e 5000 partículas por nL, são detectados.
Em algumas formas de realização de todos os aspectos, a detecção compreende a determinação de um número ou proporção de partículas associadas com os produtos de amplificação de ácidos nucleicos na mistura de reação e, opcionalmente, desse modo determinar ou estimar a concentração de ácido nucleico molde na mistura original. Em algumas formas de realização, a detecção compreende a detecção de partículas individuais associados a dois ou mais produtos distintos de amplificação de ácidos nucleicos.
Em outro aspecto, a divulgação apresenta composições que incluem (a) uma primeira população de partículas, que inclui uma primeira recombinase, uma primeira proteína de ligação de ADN de fita única, e um primeiro oligonucleotideo, e (b) uma segunda população de partículas que inclui uma segunda recombinase, uma segunda proteína de ligação de ADN de fita única, e um segundo oligonucleotídeo, em que os primeiro e segundo oligonucleotídeos são diferentes. Em algumas formas de realização, pelo menos um dos primeiro e segundo oligonucleotídeos inclui um marcador detectável. Em algumas formas de realização, o primeiro e segundo oligonucleotídeos incluem os mesmos ou diferentes marcadores detectáveis. A primeira e segunda proteínas de ligação de ADN de fita única podem ser iguais ou diferentes umas das outras. A primeira e segunda recombinases podem ser iguais ou diferentes umas das outras.
Em algumas formas de realização de todos os aspectos, as partículas são cerca de 0,5-20 μm em tamanho, por exemplo, entre cerca de quaisquer dois tamanhos selecionados a partir de 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 12, 15, 18, e 20 μm (por exemplo, cerca de 1-10 μm em tamanho).
Em algumas formas de realização de todos os aspectos, aproximadamente 10 a 5000 partículas/nL, por exemplo, entre dois números de partículas selecionados de entre 1, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 e 5000 partículas por nL, estão presentes nas composições.
Em algumas formas de realização de todos os aspectos, as composições incluem um agente de aglomeração, por exemplo, um ou mais de polietilenoglicol (por exemplo, PEG1450, PEG3000, PEG8000, PEG10000, PEG14000, PEG15000, PEG20000, PEG250000, PEG30000, PEG35000, PEG40000, composto PEG com peso molecular entre 15.000 e 20.000 daltons, ou suas combinações), álcool polivinílico, dextrano e ficol. Em algumas formas de realização, o agente de aglomeração está presente na composição numa concentração entre 1 e 12% por peso ou volume da mistura de reação, por exemplo, entre quaisquer dois valores de concentração selecionados a partir de 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 5,5%, 6,0%, 6,5%, 7,0%, 7,5%, 8,0%, 8,5%, 9,0%, 9,5%, 10,0%, 10,5%, 11,0%, 11,5%, e 12,0%.
Em algumas formas de realização de todos os aspectos, as composições incluem ainda um ou mais (por exemplo, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, ou todos) de uma ADN polimerase, uma proteína de carregamento recombinase, ATP, dNTPs ou uma mistura de dNTPs e ddNTPs, um agente redutor, creatinoquinase, uma nuclease (por exemplo, uma exonuclease III ou endonuclease IV), uma sonda de ácido nucleico com e um ácido nucleico molde (em qualquer combinação).
Em alguns aspectos, a divulgação apresenta composições que incluem um ou mais oligonucleotídeos descritos aqui e as suas variantes. Em algumas formas de realização, os oligonucleotídeos podem ser utilizados como iniciadores e/ou sondas de detecção dos métodos de amplificação de ácidos nucleicos (por exemplo, a amplificação isotérmica de ácidos nucleicos, tal como RPA) . Os oligonucleotídeos aqui descritos podem incluir um ou mais marcadores detectáveis. Onde um oligonucleotídeo é divulgado como incluindo um ou mais marcadores detectáveis, marcadores alternativos podem ser utilizados nas mesmas posições, ou em posições diferentes dentro do oligonucleotídeo (por exemplo, a uma posição dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases 5' ou 3' da posição divulgada). Em algumas formas de realização, os oligonucleotídeos podem incluir um ou mais sítios miméticos abásicos. Onde um oligonucleotídeo inclui um ou mais sítios miméticos abásicos, sítios miméticos abásicos alternativos podem ser incluídos na mesma posição ou em posições diferentes dentro do oligonucleotídeo (por exemplo, a uma posição dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases 5' ou 3' da posição divulgada). Em algumas formas de realização, uma variante de um oligonucleotídeo aqui descrita tem doze ou menos (por exemplo, onze ou menos, dez ou menos, nove ou menos, oito ou menos, sete ou menos, seis ou menos, cinco ou menos, quatro ou menos, três ou menos, duas ou menos, ou uma ou menos), inserções, deleções, substituições e/ou adições em relação à sequência de oligonucleotídeo divulgada. Em algumas formas de realização, uma variante de um oligonucleotídeo aqui descrita possui uma sequência de pelo menos 80% (por exemplo, 85%, 90% ou 95%), idêntica à sequência de oligonucleotídeo divulgada.
Em algumas formas de realização, as partículas são detectadas utilizando fluorescência das partículas.
Em certas formas de realização, as partículas são detectadas sem a utilização de fluorescência das partículas.
Em algumas formas de realização, as partículas são detectadas utilizando fluorescência das partículas, microscopia de contraste de fase, detecção luminescente, detecção espectral (cor), detecção de radioisótopos, detecção magnética, e/ou detecção eletroquímica. Em algumas formas de realização as partículas podem ser detectadas utilizando uma combinação de dois dos mais (por exemplo, dois, três ou quatro) de fluorescência das partículas , microscopia de contraste de fase, detecção luminescente, detecção espectral (cor), detecção de radioisótopos, detecção magnética, e eletroquímica de detecção.
Em algumas formas de realização, algumas das partículas são detectadas utilizando fluorescência dessas partículas, e outra das partículas são detectadas sem a utilização de fluorescência destas outras partículas. Por exemplo, as partículas incluem um primeiro subconjunto de partículas e um segundo subconjunto de partículas. O primeiro subconjunto de partículas é detectado utilizando a fluorescência do primeiro subconjunto de partículas, e o segundo subconjunto de partículas é detectado sem a utilização de fluorescência do segundo subconjunto de partículas (por exemplo, microscopia de contraste de fase, detecção luminescente, detecção espectral (cor), detecção magnética, detecção de radioisótopos e/ou detecção eletroquímica).
Em outro aspecto, a divulgação apresenta uma população de partículas que inclui uma recombinase, uma proteína de ligação de ADN de fita única, e um oligonucleotídeo, em que algumas das partículas são detectadas utilizando a fluorescência dessas partículas, e outras das partículas são detectadas sem a utilização fluorescência destas outras partículas.
Também são fornecidos kits incluindo uma recombinase, uma proteína de ligação de ADN de fita única, e um oligonucleotídeo para uso em qualquer dos métodos aqui descritos. Também são fornecidos kits incluindo qualquer das partículas ou composições aqui descritas e instruções para realizar qualquer um dos métodos aqui descritos.
Os processos e composições aqui descritos podem ser utilizados para a detecção de ácidos nucleicos, por exemplo, ácidos nucleicos bacterianos, ácidos nucleicos mamíferos, ácidos nucleicos virais, ácidos nucleicos de fungos ou ácidos nucleicos de protozoários, e para o diagnóstico de distúrbios ou doenças associados com tais ácidos nucleicos.
Tal como aqui usado o "tamanho" de uma partícula refere-se à maior dimensão da secção transversal da partícula.
Tal como aqui utilizado, um "oligonucleotídeo" refere-se a um polímero de ácido nucleico contendo pelo menos 10 (por exemplo, pelo menos 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100) unidades de base. Em algumas formas de realização, o oligonucleotídeo contém um total de menos de 1 kb, 900 unidades de base, 800 unidades de base, 700 unidades de base, 600 unidades de base, 500 unidades de base, 400 unidades de base, 300 unidades de base, 200 unidades de base, ou 100 unidades de base. Em algumas formas de realização, um oligonucleotídeo pode ter 90 ou menos, 80 ou menos, 70 ou menos, 60 ou menos, 50 ou menos, 40 ou menos, 30 ou menos ou 20 ou menos unidades de base. Em algumas formas de realização, um oligonucleotídeo tem pelo menos 10, 12, 14, 16, 18 ou 20 unidades de base.
Tal como aqui utilizado, "citometria" refere-se a métodos e composições para detectar, visualizar e analisar as propriedades das partículas. O termo, como aqui usado, não denota a presença de células. No entanto, os métodos e composições utilizados para detectar, visualizar e analisar as propriedades das células podem ser aplicados para as partículas aqui descritas.
Em algumas formas de realização, o carbono 1' da porção de açúcar ou açúcar modificado está covalentemente ligado a outro carbono que não está na base de uma estrutura cíclica. Em algumas formas de realização, o carbono 1' da porção de açúcar ou açúcar modificado está covalentemente ligado a uma estrutura de ligante não-cíclico. Em algumas formas de realização, um sítio mimético abásico é reconhecido por uma enzima que modifica e processa sítio mimético abásico devido à semelhança estrutural com um sítio não básico (isto é, falta de um grupo de base volumoso ligado ao açúcar).
Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes, e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência na sua totalidade. Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo definições, irá controlar. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitativos.
Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada, e a partir das reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
FiG. 1A-1C são micrografias que descrevem um único campo de uma mistura incluindo partículas. A barra de escala indica 100 μm. IA, contraste de interferência diferencial (DIC). 1B, fluorescência. 1C, mistura.
FIG. 2A-2C são micrografias que descrevem um campo único de uma mistura incluindo partículas e um ácido nucleico molde. A barra de escala indica 100 μm. 2A, DIC. 2B, fluorescência. 2C, mistura.
FIG. 3A-3H são micrografias de fluorescência representando misturas incluindo as concentrações indicadas de polietilenoglicol (PEG).
FIG. 4A-4F são micrografias que descrevem misturas incluindo partículas. 4A e 4B são uma mistura padrão, 4C e 4D são a mistura padrão excluindo UvsX. 4E e 4F são a mistura padrão excluindo gp32. 4A, 4C, 4E, DIC. 4B, 4D, 4F, fluorescência.
FIG. 5A-5H são micrografias que descrevem misturas incluindo partículas. 5A e 5B são a mistura padrão como no 4A e 4B, mas excluindo UvsY. 5C e 5D são a mistura padrão excluindo polimerase. 5E e 5F são a mistura padrão excluindo creatinoquinase. 5G e 5H são a mistura padrão excluindo exonuclease III. 5A, 5C, 5E, 5G, DIC. 5B, 5D, 5F, 5H, fluorescência.
FIG. 6A-6C são um conjunto de micrografias que descrevem misturas. 6A, dois campos mostrando mistura completa. 6B, dois campos mostrando mistura completa excluindo gp32 e UvsY. 6C, dois campos mostrando mistura completa excluindo gp32, UvsY e Emix (Fosfocreatina 50 mM, ATP 2,5 mM) . Para cada conjunto: topo, DIC; fundo, fluorescência.
FIG. 7A a 7F são micrografias que descrevem uma mistura incluindo partículas preparadas com dois oligonucleotídeos marcados. 7A, fluorescência vermelho Texas. 7B, DIC e vermelho Texas misturados. 7C, fluorescência FAM. 7D, DIC e FAM misturados. 7E, DIC. 7F, vermelho Texas e FAM misturados.
FIG. 8A-8F são micrografias que descrevem uma mistura incluindo dois conjuntos de partículas com dois oligonucleotídeos marcados preparados de forma independente e, em seguida, misturados. 8A, fluorescência vermelho Texas. 8B, DIC e vermelho Texas misturados. 8C, fluorescência FAM. 8D, DIC e FAM misturados. 8E, DIC. 8F, Texas vermelho e FAM misturados.
FIG. 9 é um curso de tempo de micrografias representando partículas durante uma reação de amplificação.
FIG. 10 é um curso de tempo de micrografias representando partículas durante uma reação de amplificação.
FIG. 11 é um curso de tempo de micrografias que descrevem as partículas, durante uma reação de amplificação, visualizado por DIC/FAM e DIC/vermelho Texas.
FIG. 12A-12D são micrografias que descrevem conjuntos de partículas , incluindo misturas de 20X de ampliação. 12A, mistura incluindo T6 H66S UvsX e UvsY. 12B, mistura incluindo T6 H66S UvsX sem UvsY. 12C, mistura incluindo T6 UvsX e UvsY. 12D, mistura incluindo T6 UvsX sem UvsY. Para cada conjunto: topo, DIC; fundo, fluorescência.
FIG. 13A-13D são micrografias que descrevem conjuntos de partículas , incluindo misturas de 40X de ampliação. 13 A, mistura incluindo T6 H66S UvsX e UvsY. 13B, mistura incluindo T6 H66S UvsX sem UvsY. 13C, mistura incluindo T6 UvsX e UvsY. 13D, mistura incluindo T6 UvsX sem UvsY. Para cada conjunto: topo, DIC; fundo, fluorescência.
FIG. 14A-14B são gráficos de linha mostrando reações de amplificação em misturas incluindo T6 H66S UvsX e UvsY (UvsX padrão + UvsY) , T6 H66S UvsX sem UvsY (UvsX padrão -UvsY) , T6 UvsX e UvsY (T6 UvsX + UvsY) e T6 UvsX sem UvsY (T6 UvsX - UvsY) . 14A, 500 cópias de molde. 14B, 50 cópias do molde.
FIG. 15 é um gráfico de linha que descreve reações de amplificação em misturas incluindo T6 H66S UvsX e UvsY (UvsX padrão + UvsY) , T6 H66S UvsX sem UvsY (UvsX padrão -UvsY) , T6 UvsX e UvsY (T6 UvsX + UvsY) e T6 UvsX sem UvsY (T6 UvsX - UvsY).
FIG. 16A-16B são gráficos de linha mostrando reações de amplificação em misturas incluindo T6 H66S UvsX e UvsY (UvsX padrão + UvsY) , T6 H66S UvsX sem UvsY (UvsX padrão -UvsY) , T6 UvsX e UvsY (T6 UvsX + UvsY) e T6 UvsX sem UvsY (T6 UvsX - UvsY).
DESCRIÇÃO DETALHADA
Em observação microscópica, estruturas com a aparência de partículas foram observadas dentro de misturas RPA. Durante o progresso da reação de amplificação do ácido nucleico de RPA, as partículas estão associadas com loci de amplificação ativa.
As partículas observadas estavam tipicamente no intervalo de 1-10 μm em tamanho, e estavam presentes em cerca de 100-500 partículas/nL. As partículas foram encontradas conter os oligonucleotídeos presentes nas misturas. A formação de partículas não requer a presença de magnésio. No entanto, as partículas formadas na ausência de uma recombinase ou uma proteína de ligação de ADN de fita única tinham uma morfologia alterada. A formação das partículas, na ausência de outros agentes, tais como a proteína de carregamento recombinase, ADN polimerase, creatinoquinase, ou exonucleases, não afeta significativamente a morfologia das partículas. Além disso, a formação da partícula foi mais eficiente na presença de agentes de aglomeração.
As partículas foram observadas serem relativamente estável em solução. Populações separadas de partículas podem ser misturadas e permanecem distintas por um período de tempo após a mistura.
Amplificação de Recombinase Polimerase
RPA é um método para a amplificação (por exemplo, a amplificação isotérmica) de ácidos nucleicos. Em geral, em um primeiro passo de RPA uma recombinase é contatada com um primeiro e um segundo iniciador de ácido nucleico para formar primeiro e segundo iniciadores de nucleoproteína. Em geral, num segundo passo, o primeiro e segundo iniciadores de nucleoproteína são contatados com um ácido nucleico molde de fita dupla de modo a formar uma primeira estrutura de fita dupla em uma primeira porção da primeira fita do ácido nucleico molde e uma segunda estrutura de fita dupla em uma segunda porção da segunda fita do ácido nucleico molde, de tal modo que as extremidades 3' do primeiro iniciador de ácido nucleico e o segundo iniciador de ácido nucleico são orientados em relação uns aos outros sobre uma dada molécula de ADN. Em geral, em um terceiro passo a extremidade 3' do primeiro e o segundo iniciador de nucleoproteinas são estendidos por ADN polimerases para gerar primeiro e segundo ácidos nucleicos de fita dupla, e uma primeira e segunda fitas deslocadas de ácido nucleico. Geralmente, o segundo e terceiro passos podem ser repetidos até que um grau desejado de amplificação seja atingido.
Tal como aqui descrito, RPA emprega enzimas, conhecidas como recombinases, que são capazes de emparelhamento de iniciadores de oligonucleotideos com sequências homólogas em ADN molde de fita dupla. Deste modo, a síntese de ADN é dirigida a pontos definidos em um ADN molde de fita dupla. Utilizando dois ou mais iniciadores de sequência específica (por exemplo, específicos de gene), uma reação de amplificação exponencial é iniciada se o ácido nucleico molde estiver presente. A reação progride rapidamente e resulta na amplificação específica de uma sequência presente no interior do ADN molde de fita dupla a partir de apenas algumas cópias do ADN molde para níveis detectáveis dos produtos amplificados em poucos minutos. Métodos RPA são divulgados, por exemplo, no EUA 7.270.981; EUA 7.399.590, EUA 7.666.598, EUA 7.435.561, EUA 2009/0029421 e WO 2010/141940, todos os quais são aqui incorporados por referência.
Reações RPA contem uma mistura de proteínas e de outros fatores que suportam a atividade do elemento de recombinação do sistema, bem como aqueles que suportam a síntese de ADN de extremidades 3' dos oligonucleotídeos complementares emparelhados aos substratos. Em algumas formas de realização, a reação RPA contém uma mistura de uma recombinase, uma proteína de ligação de fita única, uma polimerase, dNTP, ATP, um iniciador, e um ácido nucleico 4 molde. Em algumas formas de realização, a reação RPA pode . incluir um ou mais dos seguintes (em qualquer combinação): " pelo menos uma recombinase, pelo menos, uma proteína de ligação de ADN de fita simples, pelo menos uma ADN polimerase, dNTPs ou uma mistura de dNTPs e ddNTPs, um agente de aglomeração, um tampão, um agente de redução; ATP ou análogo de ATP, pelo menos uma proteína de carregamento recombinase, um primeiro iniciador e, opcionalmente, um segundo iniciador, uma sonda, uma transcriptase reversa, e uma molécula de ácido nucleico molde, por exemplo, um de fita simples (por exemplo, ARN), ou ácido nucleico em fita dupla. Em algumas formas de realização, as reações RPA podem conter, por exemplo, uma transcriptase reversa. Exemplos adicionais não limitativos de misturas de reação RPA são aqui descritos.
Em algumas formas de realização, as reações RPA podem conter uma proteína UvsX, uma proteína gp32, e uma proteína UvsY. Qualquer um dos processos, composições ou partículas aqui descritas podem conter, em parte, por exemplo, uma proteína UvsX, uma proteína gp32, e uma proteína UvsY. Por exemplo, qualquer um dos processos, composições, ou partículas aqui descritas podem conter, em parte, T6H66S UvsX, Rb69 gp32 e Rb69 UvsY.
Em algumas formas de realização, as reações RPA podem conter uma proteína UvsX e uma proteína gp32. Por exemplo, qualquer um dos processos, composições, ou partículas aqui descritas podem conter, em parte, por exemplo, uma proteína UvsX e uma proteína gp32.
Um componente proteico de uma reação RPA é uma recombinase, que pode provir de origem procariótica, virai ou eucariótica. Recombinases exemplares incluem RecA e UvsX (por exemplo, uma proteína RecA ou proteína UvsX obtida de quaisquer espécies), e fragmentos ou mutações destes, e suas combinações. Fragmentos RecA e UvsX ou proteínas mutantes podes ser obtidas a partir de qualquer espécie. Fragmentos RecA e UvsX ou proteínas mutantes podem também ser produzidos usando a proteína RecA e UvsS disponível e as sequências de ácidos nucleicos, e técnicas de biologia molecular (ver, por exemplo, as formas mutantes de UvsX descritas na Patente dos EUA N° 8.071.308). Proteínas UvsX exemplares incluem aquelas derivadas a partir de fagos de Myoviridae, tais como T4, T2, T6, Rb69, Aehl, KVP40, fago de Acinetobacter 133, fago de Aeromonas 65, cianófago P-SSM2, cianófago PSSM4, cianófago S-PM2, Rbl4, Rb32, fago de Aeromonas 25, fago de Vibrio nt-1, phi-1, Rbl6, Rb43, fago 31, fago 44RR2.8t, Rb49, fago Rb3, e fago LZ2. Proteínas recombinase exemplares adicionais incluem arqueabactéria RADA e proteínas RADB e eucarióticas (por exemplo, planta, mamífero, e fungos) proteínas Rad51 (por exemplo, RAD51, RAD51B, RAD51C, RAD51D, DMC1, XRCC2, XRCC3 e recA) (ver, por exemplo, Lin et al., Proc. Acad. Sei. EUA 103:1032810333, 2006).
Em todo o processo da presente divulgação, a recombinase (por exemplo, UvsX) pode ser uma recombinase mutante ou híbrida. Em algumas formas de realização, o UvsX mutante é um Rb69 UvsX que inclui pelo menos uma mutação na sequência de aminoácidos UvsX Rb69, em que a mutação é selecionada do grupo consistindo de (a) um aminoácido que não seja a histidina na posição 64, um serina na posição 64, a adição de um ou mais resíduos de ácido glutâmico na posição C-terminal, a adição de um ou mais resíduos de ácido aspártico na região C-terminal, e uma combinação destes. Em outras formas de realização, o UvsX mutante é um T6 UvsX tendo pelo menos uma mutação na sequência de aminoácidos T6 UvsX, em que a mutação é selecionada do grupo consistindo de (a) um aminoácido que não seja a histidina na posição 66, (b) uma serina na posição 66, (c) a adição de um ou mais resíduos de ácido glutâmico na posição C-terminal, (d) a adição de um ou mais resíduos de ácido aspártico na região C-terminal, e (e) uma combinação destes métodos. Onde é utilizada uma proteína recombinase híbrida, a proteína híbrida pode ser, por exemplo, uma proteína UvsX que inclui pelo menos uma região que inclui uma sequência de aminoácidos derivada de uma espécie UvsX diferente. A região pode ser, por exemplo, a região de ligação de ADN loop 2 de UvsX.
Além disso, uma ou mais proteínas de ligação de ADN de fita simples podem ser usadas para estabilizar os ácidos nucleicos durante as várias reações de permuta que estão em curso na reação. As uma ou mais proteínas de ligação de ADN de fita simples podem ser derivadas ou obtidas a partir de quaisquer espécies, por exemplo, a partir de uma espécie virai, procariótica ou eucariótica. Exemplares não limitativos de proteínas de ligação de ADN de fita simples incluem E. coli SSB e aqueles derivados de fagos de Myoviridae, tais como T4, T2, Τ6, Rb69, Aehl, KVP40, Fago de Acinetobacter 133, Fago de Aeromonas 65, cianófago P-SSM2, cianófago PSSM4, cianófago S-PM2, Rbl4, Rb32, Fago de Aeromonas 25, fago de Vibrio nt-1, phi-1, Rbl6, Rb43, fago 31, os fagos 44RR2.8t, Rb49, fago Rb3, e fago LZ2. Outros exemplos de proteínas de ligação de ADN de fita simples incluem A. denitrifleans Alide_2047, Burkholderia thailandensis BthaB_33951, Prevotella pallens HMPREF9144_0124, e proteína A de replicação de proteínas de ligação de ADN de fita única eucarióticas.
O ADN polimerase pode ser uma polimerase eucariótica ou procariótica. Exemplos de polimerases eucarióticas incluem pol-alfa, pol-beta, pol-delta, pol-epsilon, e mutantes ou fragmentos destes, ou combinações dos mesmos. Exemplos de polimerase procariótica incluem E. coli ADN polimerase I (por exemplo, fragmento de Klenow), bacteriófago T4 gp43 ADN polimerase, Bacillus stearothermophilus polimerase I fragmento grande, Phi-29 ADN polimerase, T7 ADN polimerase, Bacillus subtilis Pol I, Staphylococcus aureus Pol I, ADN polimerase I de E. coli, ADN-polimerase II de E. coli, ADN polimerase III de E. coli, ADN polimerase IV de E. coli, ADN polimerase V de E. coli, e os mutantes ou fragmentos destes, ou combinações dos mesmos. Em algumas formas de realização, a polimerase de ADN não tem atividade de exonuclease 3'-5'. Em algumas formas de realização, a ADN polimerase tem propriedades de fita de deslocamento, por exemplo, grandes fragmentos de polimerases procarióticas de classe I ou pol V.
Qualquer um dos processos da presente divulgação pode ser realizado na presença de um agente de aglomeração. Em algumas formas de realização, o agente de aglomeração pode incluir um ou mais de polietileno glicol, óxido de polietileno, álcool polivinilico, poliestireno, Ficoll, dextrano, poli (vinilpirrolidona) (PVP), e albumina. Em algumas formas de realização, o agente de aglomeração tem um peso molecular inferior a 200.000 daltons. Além disso, o agente de aglomeração pode estar presente, por exemplo, numa quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 15% em peso por volume (p/v).
Se uma proteína de carregamento recombinase é usada, a proteína de carregamento recombinase pode ser de origem procariótica, eucariótica ou virai. Proteínas de carregamento recombinase exemplares incluem E. coli RecO, E. coli RecR, UvsY, e mutantes ou fragmentos destes, ou combinações dos mesmos. Proteínas UvsY exemplares incluem aquelas derivadas a partir de fagos de Myoviridae, tais como T4, T2, T6, Rb69, Aehl, KVP40, Fago de Acinetobacter 133, Fago de Aeromonas 65, cianófago P-SSM2, cianófago PSSM4, cianófago S-PM2, Rbl4, Rb32, Fago de Aeromonas 25, fago de Vibrio nt-1, phi-1, Rbl6, Rb43, fago 31, fagos 44RR2.8t, Rb49, fago Rb3 e fago LZ2. Em qualquer um dos processos da presente divulgação, o agente de carregamento recombinase pode ser derivado de um fago de Myoviridae. O fago de Myoviridae pode ser, por exemplo, T4, T2, T6, Rb69, Aehl, KVP40, Fago de Acinetobacter 133, Fago de Aeromonas 65, cianófago P-SSM2, cianófago PSSM4, cianófago S-PM2, Rbl4, Rb32, Fago de Aeromonas 25, fago de Vibrio nt-1, phi-1, Rbl6, Rb43, fago 31, fagos 44RR2.8t, Rb49, fago Rb3 ou fago LZ2.
Além disso, qualquer um dos processos da presente divulgação pode ser realizado com um iniciador bloqueado. Um iniciador bloqueado é um iniciador que não permite o alongamento com uma polimerase. Quando um iniciador bloqueado é utilizado, um agente de desbloqueio pode ser usado para desbloquear o iniciador para permitir alongamento. O agente de desbloqueio pode ser uma endonuclease ou exonuclease que é capaz de clivar o grupo de bloqueio do iniciador. Exemplos de agentes de desbloqueio incluem E. coli exonuclease III e E. coli endonuclease IV.
Em algumas formas de realização, os processos da presente divulgação, podem incluir: contatar uma recombinase com um primeiro e um segundo iniciador de ácido nucleico e um terceiro iniciador bloqueado de extensão, que contém um ou mais resíduos internos não complementares ou modificados de modo a formar um primeiro, segundo e terceiro iniciador de nucleoproteína; contatando o primeiro e segundo iniciadores de nucleoproteína ao ácido nucleico alvo de fita dupla para formar uma primeira estrutura de fita dupla entre o primeiro iniciador de nucleoproteína e a primeira fita de ADN numa primeira porção da primeira fita (formando um loop D) e uma segunda estrutura de fita dupla entre o segundo iniciador de nucleoproteína e a segunda fita de ADN a uma segunda porção da segunda fita (formando um loop D), de tal modo que as extremidades 3' do primeiro iniciador de nucleoproteína e do segundo iniciador de nucleoproteína sejam orientados em direção um ou outro na mesma molécula de ácido nucleico alvo com uma terceira porção de ácido nucleico alvo presente entre os 5' terminais do primeiro e do segundo iniciador, e que se estende da extremidade 3' do primeiro iniciador de nucleoproteina e do segundo iniciador de nucleoproteina com uma ou mais polimerases e dNTPs para gerar um primeiro ácido nucleico alvo amplificado; contatando o primeiro ácido nucleico alvo amplificado ao terceiro iniciador de nucleoproteina de modo a formar uma terceira estrutura de fita dupla no primeiro ácido nucleico alvo amplificado (formando um loop D) , na presença de uma nuclease, onde a nuclease cliva especificamente o resíduo interno não complementar apenas após a formação da terceira estrutura de fita dupla para formar um terceiro iniciador 5' e um terceiro iniciador bloqueado de extensão 3', e estendendo-se o 3' terminal do terceiro iniciador 5' com uma ou mais polimerase e dNTP para gerar um segundo ácido nucleico amplificado de fita dupla.
Em algumas formas de realização, os processos incluem um primeiro e segundo iniciador para amplificar uma primeira porção presente dentro de um ácido nucleico alvo de fita dupla para gerar um primeiro produto amplificado, e pelo menos um iniciador adicional que pode ser usado para amplificar uma sequência contígua presente dentro do primeiro produto amplificado (por exemplo, um terceiro iniciador adicional que pode ser usado em combinação com, por exemplo, o primeiro ou o segundo iniciador, para amplificar uma sequência contígua presente dentro do primeiro produto amplificado). Em algumas formas de realização, os processos incluem um primeiro e segundo iniciador para amplificar uma primeira porção presente dentro de um ácido nucleico alvo de fita dupla para gerar um primeiro produto amplificado, e um terceiro e quarto iniciador que podem ser usados para amplificar uma sequência contígua presente dentro o primeiro produto amplificado.
Em algumas formas de realização, os processos podem incluir, por exemplo, um iniciador direto e um iniciador inverso. Em algumas formas de realização, os processos podem incluir pelo menos um iniciador bloqueado, que compreende um ou mais resíduos internos não complementares ou modificados (por exemplo, um ou mais resíduos internos não complementares ou modificados que podem ser reconhecidos e cortados por uma nuclease, por exemplo, ADN glicosilase, AP endonucleases, fpg, Nth, MutY, MutS, MutM, E. coli. MUG, MUG humano, Oggl humano, um vertebrado tipo Nei (Neil) glicosilase, Nfo, exonuclease III, ou uracila glicosilase). Exemplos adicionais não limitativos de ácidos nucleicos (por exemplo, os iniciadores e as sondas) que podem ser incluídos no processo são descritos a seguir.
Em algumas formas de realização, os processos podem incluir uma sonda ou iniciador que é resistente a nuclease, por exemplo, um iniciador ou sonda que contenha pelo menos uma (por exemplo, pelo menos duas, três, quatro, cinco, seis, sete, ou oito) ligação fosforotioato.
Qualquer um dos processos da presente divulgação pode ser realizado na presença de heparina. A heparina pode servir como um agente para reduzir o nível de ruído de iniciador não específico, e para aumentar a capacidade de E. coli com exonuclease III ou E. coli endonuclease IV para polir rapidamente grupos de bloqueio 3' ou resíduos terminais de recombinação intermediários.
Com base no tipo particular de reação, a mistura também pode conter um ou mais dos tampões, sais, e nucleotideos. A mistura de reação pode ser mantida a uma temperatura ou faixa de temperatura especifica adequada à reação. Em algumas formas de realização, a temperatura é mantida a ou abaixo de 80°C, por exemplo, a ou abaixo de 70°C, a ou abaixo de 60°C, a ou abaixo de 50°C, a ou abaixo de 40°C, a ou abaixo de 37°C, a ou abaixo de 30°C, ou a ou abaixo da temperatura ambiente. Em algumas formas de realização, a temperatura é mantida a ou acima de 4°C, a ou acima de 10°C, a ou acima de 15°C, a ou acima de 20°C, a ou acima da temperatura ambiente, ou acima de 25°C, a ou acima de 30°C, a ou acima de 37°C, a ou acima de 40°C, a ou acima de 50°C, a ou acima de 60°C, a ou acima de 70°C. em algumas formas de realização, a mistura de reação é mantida a temperatura do cômodo ou ambiente. Em algumas formas de realização, a escala de temperatura Celsius da mistura varia em menos de 25% (por exemplo, menos de 20%, menos de 15%, menos de 10%, ou menos de 5%) durante todo o tempo de reação e/ou a temperatura da mistura é variada por menos de 15°C (por exemplo, menos de 10°C, menos de 5°C, menos de 2°C, ou menos de 1°C) durante todo o tempo de reação.
Detecção de amplificação, por exemplo, em tempo real, pode ser realizada por qualquer método conhecido na arte. Em algumas formas de realização, um ou mais iniciadores ou sondas (por exemplo, sondas de guia molecular) são marcados com um ou mais marcadores detectáveis. Exemplos de marcadores detectáveis incluem enzimas, substratos de enzimas, coenzimas, inibidores de enzimas, marcadores fluorescentes, supressores, cromóforos, partículas ou grânulos magnéticos, porções sensíveis redox (por exemplo, porções ativas eletroquimicamente), marcadores luminescentes, radioisótopos (incluindo radionucleotideos) e membros de pares de ligação. Exemplos mais específicos incluem fluoresceina, ficobiliproteina, tetraetil rodamina, e beta-galactosidase. Pares de ligação podem incluir biotina/avidina, biotina/estreptavidina, antigênio/anticorpo, ligante/receptor, e análogos e mutantes dos pares de ligação.
Deve ser notado que um agente supressor de fluorescência é também considerado um marcador detectável. Por exemplo, o agente supressor de fluorescência pode ser contatado com um corante fluorescente e a quantidade de arrefecimento é detectada.
Detecção de partículas
A detecção e monitorização das partículas podem ser realizadas utilizando qualquer método adequado. Exemplos de métodos incluem a microscopia, dispersão de luz, citometria de fluxo, e os métodos microfluídicos.
Em algumas formas de realização, as partículas podem ser detectadas usando microscopia, por exemplo, a diferença de contraste de interferência ou microscopia de fluorescência, para observar diretamente as partículas à alta ampliação. Com o auxílio de um computador, as imagens do microscópio podem ser automaticamente obtidas e analisadas. Além disso, a microscopia pode permitir a monitorização contínua ou frequente de pelo menos uma porção de uma mistura contendo partículas.
Em algumas formas de realização, as partículas podem ser detectadas por citometria de fluxo. Em citometria de fluxo, um ou mais feixes de luz, por exemplo, cada um de um úico comprimento de onda, são dirigidos para um fluxo hidrodinamicamente focado de fluido. As partículas em suspensão que passam através dos feixes dispersos de luz, e produtos químicos fluorescentes encontrados na partícula ou ligado à partícula podem ser excitados. A luz dispersa e/ou fluorescente é captada por detectores dentro do dispositivo, a partir do qual informação sobre o tamanho de partícula e fluorescência pode ser determinado. Citomêtros de fluxo modernos podem analisar vários milhares de partículas por segundo, em "tempo real" e podem ativamente separar e isolar partículas com propriedades específicas.
Em algumas formas de realização, as partículas podem ser detectadas utilizando métodos de citometria, dispositivos e sistemas tal como divulgado em EUA 2009/0079963, EUA 2010/0179068 e WO 2009/1 12594.
Em algumas formas de realização, as partículas podem ser detectadas utilizando métodos microfluídicos, dispositivos e sistemas. Por exemplo, as partículas podem ser detectadas usando um dispositivo ou sistema lab-on-a-chip, ou semelhantes. Ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente dos EUA N— 2009/0326903 e 2009/0297733.
Em algumas formas de realização, as partículas podem ser detectadas usando um dispositivo ou sistema apropriado para o ponto de tratamento, de campo, ou uso do consumidor. Por exemplo, um dispositivo (por exemplo, um dispositivo de lab-on-a-chip) pode incluir uma recombinase, uma polimerase, uma proteína de ligação de fita única, ATP, dNTPs, e um iniciador ou sonda. Em algumas formas de realização, um dispositivo pode ser fornecido que contém uma recombinase, uma polimerase, uma proteína de ligação de fita única, ATP, dNTPs, e um iniciador ou sonda, onde um de a recombinase, a polimerase, o iniciador ou sonda, ou recombinase senod ligado covalentemente ou não covalentemente (por exemplo, através do uso de uma marca de afinidade), a uma superfície. Em algumas formas de realização, as partículas podem ser colocadas em múltiplos poços individuais numa placa de multi poços.
Em qualquer dos métodos divulgados, quando desejado, as partículas podem ser fixadas antes da detecção. Por exemplo, as partículas podem ser fixadas por meio de tratamento com um aldeído (por exemplo, formaldeído, paraformaldeído ou glutaraldeído) para reticular proteínas e ácidos nucleicos presentes na amostra, parar de forma eficaz o progresso das reações da mistura e permitir a observação do partículas no estado, no qual a reação foi interrompida. Ao fixar as misturas, as partículas podem ser detectadas num ponto posterior no tempo, potencialmente simplificando o processamento e detecção.
Oligonucleotídeos
Oligonucleotídeos tais como aqui descritos podem servir como iniciadores de amplificação e/ou sondas de detecção. Em algumas formas de realização, os oligonucleotídeos são fornecidos como um conjunto de dois ou mais (por exemplo, dois, três, quatro ou mais) oligonucleotídeos, por exemplo, para utilização num método de amplificação (por exemplo, tal como aqui descrito).
Oligonucleotídeos podem ser sintetizados de acordo com a química de fosforoamidate padrão, ou de outra forma. Bases modificadas e/ou químicas de espinha dorsal ligante pode ser desejável e funcional e, em alguns casos, pode ser incorporado durante a síntese. Além disso, os oligonucleotídeos podem ser modificados com grupos que servem vários propósitos, por exemplo, grupos fluorescentes, supressores, grupos (reversível ou não) de proteção (bloqueio), marcadores magnéticos, proteínas, etc..
Em algumas formas de realização, o oligonucleotídeo aqui utilizado pode conter uma sequência contígua (por exemplo, pelo menos 10 unidades de base) que é pelo menos 90% idêntica (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) a uma sequência contígua presente dentro de um ácido nucleico alvo. A porcentagem de identidade ou de homologia entre duas sequências pode ser determinada utilizando um algoritmo matemático. Um exemplo não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 87:2264-68, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 90:5873-77. Tal algoritmo está incorporado no programa NBLAST de Altschul, et ai., (1990); J. Mol. Biol. 215:403-410. Para obter alinhamentos Gapped para fins de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et ai., (1997) Nucleic Acids Res, 25:3389-3402. Quando utilizando BLAST e programas Gapped BLAST, os parâmetros padrão do programa NBLAST podem ser usados. Veja on-line em ncbi.nlm.nih.gov.
Os oligonucleotídeos podem incluir um ou mais marcadores detectáveis. O marcador detectável pode ser um fluoróforo, uma enzima, um supressor, um inibidor de enzima, um marcador radioativo, uma porção sensível de redox (por exemplo, uma porção eletroquimicamente ativa), um membro de um par de ligação e uma combinação destes. Em algumas formas de realização, os oligonucleotideos podem incluir tanto um fluoróforo quanto um supressor. O agente de supressão pode ser perto do fluoróforo para suprimir a fluorescência do fluoróforo. Por exemplo, a separação entre o fluoróforo e o supressor pode ser de 0 a 2 bases, 0 a 5 bases, 0 a 8 bases, 0 a 10 bases, 3 a 5 bases, 6 a 8 bases, e 8 a 10 bases. 0 fluoróforo e o supressor podem ser qualquer fluoróforo e supressor conhecido para trabalhar em conjunto, incluindo, mas não limitado a, o fluoróforo e supressores de quaisquer dos fluoróforos descritos nesta divulgação. Quando o marcador detectável é um fluoróforo ou um supressor, ele pode ser ligado ao oligonucleotideo por um resíduo fluoróforo-dT amidite ou resíduo supressor-dT amidite respectivamente. Outras ligações são possíveis e amplamente conhecidas.
Em outro aspecto, quer o fluoróforo ou o supressor podem estar ligados a um resíduo interno modificado e o fluoróforo e supressor podem ser separados seguindo clivagem do resíduo interno modificado pela nuclease.
Embora qualquer fluoróforo possa funcionar para os métodos do invento, fluoresceína, FAM, TAMRA, e fluoróforos vermelho Texas são exemplares. Supressores exemplares incluem um supressor escuro, que pode ser, por exemplo, Dark Quencher 1, Dark Quencher 2, Black Hole Quencher 1 ou Black Hole Quencher 2.
Em algumas formas de realização, os oligonucleotideos podem incluir um resíduo interno modificado. 0 resíduo interna modificado pode ser qualquer estrutura química (resíduo) que não pode formar uma estrutura de emparelhamento de bases de Watson-Crick com a sua correspondente base de uma estrutura de ácido nucleico de fita dupla. O termo "resíduo modificado interno" também inclui, pelo menos, qualquer resíduo que não é normalmente encontrado em ADN, que é qualquer resíduo, o qual não é um "A", "L", "C" ou "T", tal como, por exemplo, uracila ou inosina. Em algumas formas de realização, o resíduo interno modificado é inosina, uracila, 8-oxoguanina, timina glicol, ou um sítio mimético abásico. Preferido sítio mimético abásico inclui um resíduo de tetrahidrofurano ou D-espaçador (que pode ser produzido como um produto do emprego de um 5'-O-dimetoxitritil-1',2'-Didesoxiribose-3'-[ (2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidito, durante a síntese de oligonucleotídeos.
Em algumas formas de realização, os oligonucleotídeos são bloqueados de extensão. Um oligonucleotideo bloqueado de extensão é bloqueado na sua extremidade 3' de modo que não pode, normalmente, ser alongado pela polimerase e dNTP, mesmo na presença de um modelo complementar. Métodos de bloquear um oligonucleotídeo são bem conhecidos e inclui, pelo menos, a inclusão de um nucleotídeo 3' bloqueado. O nucleotídeo 3' bloqueado pode conter, por exemplo, um grupo de bloqueio que impede extensão de polimerase. Geralmente, os grupos bloqueadores são anexados aos locais 3' ou 2' do resíduo de açúcar 3', mas outros locais de ligação são possíveis. Um dos métodos mais comuns de bloqueio 3' é colocar um didesoxi açúcar na terminação 3' de um oligonucleotídeo. O grupo de bloqueio pode ser, por exemplo, um marcador detectável.
Em algumas formas de realização, os oligonucleotídeos aqui descritos podem ser modificados pela incorporação de um ou mais marcadores detectáveis, resíduos modificados (por exemplo, os resíduos internos modificados), e grupos de bloqueio. Quando o oligonucleotídeo aqui divulgado inclui um ou mais marcadores detectáveis, resíduos modificados (por exemplo, os resíduos internos modificados), e grupos de bloqueio, o oligonucleotídeo sem tais modificações ou com modificações adicionais também está incluído na descrição. Além disso, um oligonucleotídeo, tal como aqui descrito, que inclui um ou mais marcadores detectáveis, resíduos modificados (por exemplo, resíduos internos modificados), e os grupos de bloqueio pode ter um tal radical substituído por outro marcador detectável, resíduo modificado (por exemplo, resíduos internos modificados), ou grupo de bloqueio, por exemplo, um marcador detectável, resíduo modificado (por exemplo, resíduo interno modificado), ou um grupo de bloqueio, tal como aqui divulgado.
Aplicações
Os métodos e composições aqui descritos podem ser utilizados, por exemplo, para detectar o número de cópias de um ácido nucleico alvo e para monitorar a amplificação de uma sequência presente num ácido nucleico alvo. Em algumas formas de realização do presente método, os ácidos nucleicos alvo podem ser detectados em números de cópias baixos e em amostras relativamente em bruto. Em algumas formas de realização, o ácido nucleico detectado é um ácido nucleico bacteriano, por exemplo, a partir de uma bactéria selecionada a partir de Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorreia, Estreptococos Grupo A, Estreptococos Grupo B, Clostridium difficile, Escherichia coli, Mycobacterium tuberculosis, Helicobacter pylori, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, Mobiluncus spp., Prevotella spp. e Porphyromonas spp, ou a partir de uma outra bactéria aqui descrita ou conhecida na arte. Em algumas formas de realização, o ácido nucleico detectado é um ácido nucleico de mamífero, por exemplo, um ácido nucleico que está associado com as células tumorais. Em algumas formas de realização, o ácido nucleico detectado é um ácido nucleico virai, por exemplo, a partir de HIV, vírus da influenza, ou vírus da dengue, ou de um outro vírus. Em algumas formas de realização, o ácido nucleico detectado é um ácido nucleico de fungos, por exemplo, de Candida albicans ou de outro fungo. Em algumas formas de realização, o ácido nucleico detectado é um ácido nucleico protozoário, por exemplo, a partir de Trichomonas ou outro protozoário. Os métodos e composições aqui descritos podem ser usados no diagnóstico de uma doença ou estado associado com um ácido nucleico detectado, por exemplo, um ácido nucleico bacteriano, ácido nucleico de mamíferos, ácido nucleico virai, ácido nucleico de fungos, ou ácido nucleico de protozoários (por exemplo, como aqui revelado). Por exemplo, os métodos e composições aqui fornecidos podem ser usados para diagnosticar uma infecção bacteriana, uma infecção virai, uma infecção fúngica ou uma infecção parasitária. Em algumas formas de realização, o ácido nucleico detectado é um ácido nucleico a partir de: influenza A ou uma sua variante, influenza B ou uma sua variante, Staphlococcus aureus resistente a meticilina (MRSA), C. difficile, M. tuberculosis, espécies de Chlamydia (por exemplo, Chlamydia trachomatis), N. gonorrhoeae, Treponema pallidum, virus do papiloma humano (HPV) (por exemplo, variantes de HPV tipo 16 e tipo 18), virus da hepatite (por exemplo, hepatite A, B, e C), ou uma célula circulante cancerosa. Em algumas formas de realização, os métodos e composições aqui fornecidos podem ser utilizados para diagnosticar infecção por MRSA, infecção por C. difficile, tuberculose, infecção por clamidia, gonorreia, sifilis, infecção por HPV, infecção por vírus da hepatite, ou infecção por HPV. Os métodos e composições aqui descritos podem ser utilizados na quantificação dos ácidos nucleicos. "Digitalização" de reações de amplificação/detecção de ácido nucleico é uma abordagem recente para permitir a contagem precisa de moléculas molde (ver, por exemplo, Vogelstein, 1999, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 96:9236). Tipicamente nestes métodos, a separação espacial da mistura de reação para os micro compartimentos requeridos (tipicamente na faixa de nanolitro) é alcançada separando fisicamente uma reação de amplificação, por exemplo, esmagando-o sob pressão em cassetes microfluídicos adequados ou dispersndo-o numa emulsão adequada. Sem querer estar limitado pela teoria, se as partículas aqui descritas são centros ativos de amplificação, então a presença das partículas constitui uma compartimentação inerente da mistura de reação que pode ser utilizada na quantificação. Por exemplo, através da contagem do número de partículas RPA "ativas" (por exemplo, aquelas associados com a geração de um sinal fluorescente) se pode medir ou estimar o número de moléculas de ácido nucleico molde presente na mistura de reação.
Os métodos também podem ser usados para detectar a ligação física de dois ou mais ácidos nucleicos. Em muitas aplicações de biologia molecular, a detecção de ligação física de dois marcadores genéticos diferentes presentes em uma dada amostra é importante. Por exemplo, a simples presença de um marcador de espécie bacteriana e um marcador de resistência a antibióticos numa dada amostra não fornece informação sobre se os dois marcadores estão presentes nas mesmas bactérias (por exemplo, no mesmo ácido nucleico), ou se os marcadores estão presentes em diferentes espécies de bactérias co-colonizadoras. Demonstrando que os dois marcadores são ligados a um único pedaço de ADN genômico associados à resistência aos antibióticos com um agente patogênico específico. A co-localização dos dois marcadores podem fornecer informações de diagnóstico vital nesse cenário.
Os métodos e composições aqui descritos podem ser utilizados para demonstrar que os locais ou posições de dois eventos de amplificação para dois ácidos nucleicos são sobrepostos, fornecendo informações sobre a ligação física dos ácidos nucleicos. Em contraste, os eventos de amplificação desmontável pode indicar a presença de ambos os ácidos nucleicos, mas em segmentos distintos de ADN (por exemplo, em duas espécies co-colonizadoras de bactérias). Em algumas formas de realização, a ligação das duas sequências de ácidos nucleicos pode ser detectada através da observação dos produtos de amplificação ativos de ambos localizados a uma única partícula num mistura de reação. Em outras formas de realização, a ligação das duas sequências de ácidos nucleicos sobre um único segmento de ADN pode ser detectada pela observação de "vinculação" de duas partículas, cada uma amplificando um dos ácidos nucleicos, pelo segmento de ADN.
Em algumas formas de realização, a observação das partículas aqui descritas pode ser usada em métodos de controle de qualidade. Por exemplo, uma relação entre o aparecimento de partículas (número, tamanho, densidade) e desempenho RPA pode ser usado para gerar um parâmetro de qualidade analítica para prever reação RPA antes da amplificação. Isto poderia ser utilizado para fins de controle de qualidade em geral (por exemplo, para determinar que tipo/número de partículas estão presentes numa dada mistura de reação) , ou para monitorar o efeito das alterações dos procedimentos de produção (por exemplo, processos de estabilização) ou em condições de armazenamento, etc.
Em algumas formas de realização, os métodos e composições aqui descritos podem ser utilizados para obter os resultados de reações de amplificação (por exemplo, dentro de minutos, a cerca de 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1,5, ou 1 minuto) a partir do início da reação. Tipicamente, monitoramento de reações de amplificação por meio da detecção da acumulação de sinal de fluorescência é realizado "em massa", ou seja, os sinais gerados pelas moléculas de molde individuais estão integrados por todo o volume determinado de reação, produzindo uma resposta de fluorescência detectável em 5-8 minutos. Em contraste, observando-se o sinal de fluorescência gerado em partículas RPA pode também, em princípio, ser utilizado para encurtar o tempo para resultar em uma reação. Este resultado é devido, pelo menos em parte, à maior sensibilidade de detecção sob alta ampliação em loci definidos (por exemplo, partículas).
A intensidade do sinal de fluorescência das reações RPA padrão, tipicamente realizada e controlada "em massa", faz ganho a partir de passos de mistura realizados durante o período de incubação, especialmente se quantidades muito pequenas do material de partida de molde são usadas. Observando-se reações de amplificação diretamente a partículas pode reduzir qualquer variação introduzida por mistura.
EXEMPLOS Exemplo 1. Partículas em Misturas de amplificação de Recombinase Polimerase
Este exemplo descreve a observação de partículas contendo oligonucleotídeos dentro de misturas RPA. Misturas secas congeladas de componentes de reação RPA, incluindo oligonucleotídeos marcados FAM, foram obtidas por preparação de uma mistura contendo 2,96 μg Creatinoquinase, 13,1 μg de Rb69 gp32, 18,1 μg de T6 H66S UvsX, 5,15 μg de Rb69 UvsY, 5,38 μg de Exonuclease ΙΠ e 5,0 μg de ADN Polimerase (grande fragmento de S. aureus polimerase I) em 80 μL de Tris Acetato 9,38 mM, pH 8,3, DTT 3,13 mM, 2,5% de PEG, 3,75% de trealose, fosfocreatina 31,3 mM, ATP 1,56 mM, dNTPmix 750 μM (188 μM cada um de dATP, dTTP, dCTP e dGTP), Spyl258F2 388 nM (CACAGACACACTGCACAAGTCCTCAATCAAACCTTG, SEQ ID NO:1), Spyl258R2 363 nm (CAGAAATCCTTGATGAGTTGCGGAAATTTGAGGT, SEQ ID NO: 2) e Spyl258exoPl 75 nM (CCTTGTCCTACCTTATAGAACATAGAGAATQTHFAACCGCACTCGCTAC; F = FAM-dT, H = THF (sítio mimético abásico), Q = BHQ-l-dT, 3' = bloco c3spacer; SEQ ID NO: 3) e liofilizanado a mistura em tubos de 0,2 ml. Os reagentes secos foram ressuspensos em 46,5 μL de tampão de reidratação (48 mM de Tris acetato, KOAc 133,8 mM, PEG 2%) + 3,5 μL de água e agitados. Estas misturas não continha ácido nucleico molde ou magnésio. Dez microlitros da mistura foram transferidos para uma lâmina de microscópio e fotografados usando contraste de interferência diferencial (DIG) e microscopia de fluorescência com uma ampliação de 40x (Fig. 1A-1C) . As partículas de cerca de 1-10 microns em tamanho foram observadas usando DIC (Fig. IA) , ou fluorescência (Figura 1B), e quando as duas imagens foram fundidas (Fig. 1C). Aproximadamente 100-500 partículas/nL foram observadas (campo de visão com uma ampliação de 40x foi equivalente a 1,55 nL da mistura).
Numa experiência em separado, as misturas foram preparadas como acima, mas substituindo 2,5 mL de água e 1 μL de uma preparação de ADN genômico de Estreptococos pyogenes (100 cópias/pL) por 3,5 μL de água. A mistura foi agitada em vórtex e espelhada como acima (Fig. 2A-2C). Partículas semelhantes, como acima foram observadas utilizando DIG (Fig. 2A) ou fluorescência (Fig. 2B) e quando as duas imagens foram fundidas (Fig. 2C).
Este exemplo demonstra que as partículas são formadas em misturas RPA, e que as partículas não são dependentes da inclusão de molde ou magnésio.
Exemplo 2. Agentes de Aglomeração de Estimulação a Formação de Partículas
Para determinar os efeitos de agentes de aglomeração na formação de partículas, misturas RPA frescas foram preparadas contendo 2,96, μg de creatinoquinase, 13,1 μg de Rb69 gp32, 18,8 μg de T6 H66S UvsX, 2,5 μg de Rb69 UvsY, 5,38 μg de Exonuclease III e 5,0 μg de ADN Polimerase em 50 mM de Tris acetato, pH 8,3, KOAc 100 mM, DTT 5 mM, mistura de dNTP 1,2 mM, (300 μM cada um de dATP, dTTP, dCTP e dGTP), 50 mM de fosfocreatina, ATP 2,5 mM, 6% de trealose, MgAc 14 mM, HIV p2LFtexas 30 nM (oligo AOAATTACAAAAACAAAT TACAAAAAT TCA5AATTTTCGGGTTT marcado vermelho Texas, 3' dA bloqueado, 5' vermelho Texas, 5 = dSpacer; SEQ ID NO: 4), Spyl258F2420 nM (CACAGACACTCGACAAGTCCTCAATCAAACCTTG: SEQ ID NO: 5) e Spyl258R2 390 nm (CAGAAATCCTTGATGAGTTGCGGAAATTTGAGGT: SEQ ID NO: 6). PEG foi incluído em cada mistura a 0%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 5,5%, ou 8%. As misturas foram misturadas com uma pipeta e 10 μL de cada foram transferidos para uma lâmina de microscópio. As imagens foram obtidas utilizando um contraste de interferência diferencial (DIG) e microscopia de fluorescência e aumento de 40x. O número de partículas observado aumentou com o aumento da concentração de PEG até 5,5% (Figuras 3A-3G) . Menos partículas foram observadas e 8% PEG (Fig. 3H) .
Este exemplo demonstra que o PEG pode melhorar a formação de partículas em misturas RPA.
Exemplo 3. Contribuição dos componentes da mistura para a formação de partículas
Para determinar a contribuição dos componentes da mistura para a formação de partículas RPA, as misturas foram preparadas como no Exemplo 2 com 5,5% de PEG, à exceção de que os componentes individuais foram excluídos em cada reação. As misturas foram fotografadas tal como acima utilizando DIG e microscopia de fluorescência. Quando todos os componentes estavam presentes, partículas formadas na mistura como descrito acima (Figuras 4A-4B). As partículas formadas na ausência de UvsX apareceram diferentes em tamanho dos que são formados na presença de UvsX e não foram facilmente observáveis por DIG (FIG. 4C-4D). As partículas formadas na ausência de gp32 apareceram diferentes em forma e tamanho das que são formadas na presença de gp32 (Fig. 4E-4F). Estruturas formadas na ausência de outros componentes RPA (UvsY, ADN polimerase, creatinoquinase, ou exonuclease III) paraceram semelhante às formadas numa reação RPA completa (Fig. 5A-5H). A ausência de UcsY pareceu provocar uma ligeira redução no número de partículas e um aumento no tamanho de partícula (Fig. 5A-5B).
Misturas adicionais foram preparadas a exclusão dos dois ou três componentes da reação. Uma mistura RPA controle foi preparada contendo 2,96 μg de creatinoquinase, 13,1 μg de Rb69 gp32, 18,8 μg de T6 H66S UvsX, 5,15 μg de UvsY, 8,26 μg de Exonuclease III e 5,0 μg de ADN polimerase em Tris acetato 50 mM, pH 8,3, KOAc 100 mM, DTT 5 mM, 0,2 mM de uma mistura de dNTP (300 μM cada um de dATP, dTTP, dCTP e dGTP), fosfocreatina 50 mM, ATP 2,5 mM, trealose 6%, MgAc 14 mM, PEG 5,5%, M2intFAM 120 nM (sonda marcada com FAM 5'-tectcatatccattctgTcgaatatcatcaaaagc-3', T = carboxifluoresceína-dT; SEQ ID NO: 19) , 420 nM cada SpaF3 (CGCTTTGTTGATCTTTGTTGAAGTTATTTTGTTGC: SEQ ID NO: 7) e SpaRlO+l (TTAAAGATGATCCAAGCCAAAGTCCTAACGTTTTA; SEQ ID NO: 8). Foram preparadas misturas paralelas que faltava (i) gp32 e UvsY, (ii) UvsX e UvsY, (iii) UvsX e gp32, (iv) UvsX, UvsY, e gp32, ou (iv) gp32, UvsY e Emix (fosf ocreatina e ATP). Nenhuma partícula foi observada nas misturas faltando UvsX e pelo menos um outro componente. Nas misturas que faltam UvsY e gp32 foram observados organismos fluorescentes grandes e irregulares (Fig. 6A-6C).
Este exemplo demonstra que a exclusão de UvsX ou gp32 tem o maior efeito sobre a morfologia das partículas, seguida por intermédio de um efeito de exclusão de UvsY, com nenhum efeito significativo sobre a exclusão observada de ADN-polimerase, creatinoquinase, ou exonuclease III. Exclusão de dois ou mais componentes tiveram um efeito aumentado.
Exemplo 4. Populações separadas de Partículas que Permanecem Distintas Quando Misturadas
Duas misturas liofilizadas foram preparadas como descrito no Exemplo 1, exceto que cada mistura incluía diferentes oligonucleotídeos e 18,8 ug de UvsX. Reagente Mix 1 continha SpaF3 296 nM (SEQ ID NO: 7), SpaR10+1 298 nM (SEQ ID NO: 8) e SpaProbel 149 nM (CATCAGCTTTTGGAGCTTGAG AGTCAT9 A8G6TTTTGAGCTTCAC, 3' biotina, 6 = BHQ-2 dT, 8 = dSpacer, 9 = TMR dT; SEQ ID NO: 9) . Mistura reagente 2 continha MecF9-8+2 299 nM (CCCTCAAACAGGTGAA TTATTAGCACTTGT; SEQ ID NO: 10), MecRla 300 nM (CTTGTTGAGCAGAGGTTCTTTTTTATCTTC; SEQ ID NO: 11) e MecProbel 150 nM (ATGACGTCTATCCATTTATGTATGGCAFGHGQAACGAAGAATATA, 3' biotinTEG, Q = BHQ-ldT, H = THF (sítio mimético abásico), F = FAM-dT; SEQ ID NO: 12). Volumes iguais das duas misturas de reagentes foram combinados, e 80 μL foi distribuído em tubos de 0,2 ml e liofilizados. As misturas secas foram ressuspensas em 46,5 μL de tampão de reidratação (ver Exemplo I), 1 μL de água, e 2,5 μL de MgAc 2 80 mM. A mistura foi agitada em vórtice e 10 μL foram transferidos para uma lâmina de microscópio para obter imagem utilizando DIC e fluorescência. As partículas observadas contendo fluorescência tanto vermelha (TMR) como verde (FAM), indicaram que ambos os oligonucleotídeos marcados estão presentes nas partículas (Fig. 7A-7F).
Em outra experiência, duas misturas liofilizadas separadas foram preparadas como descrito acima, incluindo somente a sonda TMR marcada com Spa RPA (Reagente Mix 1, acima), e o outro, incluindo apenas a sonda RPA FAM marcada com MECA (Mistura Reagente 2, acima). Após a reconstituição, as duas misturas reconstituídos foram combinadas e fotografadas usando DIC e fluorescência. Partículas distintas que continham predominantemente um fluoróforo ou o outro foram observadas na mistura (Figuras 8A-8F). Isto indica que as partículas incluindo cada sonda podem permanecer distintas umas das outras após a mistura.
Para determinar a estabilidade das populações mistas de partículas ao longo do tempo, duas reações liofilizadas livres de iniciador foram reconstituídos em tampão de re-hidratação com MgAc e oligonucleotídeos como abaixo. Uma mistura incluiu HIV p2LFtexas 30 nM (marcador vermelho Texas), Spyl258F2 420 nM (SEQ ID NO: 1, não marcada), e Spyl258R2 390 nm (SEQ ID NO: 2, não marcada) . A outra mistura incluiu M2intFAM 50 nM oligo (SEQ ID NO: 19, FAM marcada), Spyl258F2 420 nM (SEQ ID NO: 1, não marcada), e Spyl258R2 390 nM (SEQ ID NO: 2, não marcada) . Cinco microlitros de cada mistura foram pipetados sobre uma lâmina de microscópio e misturados, e a combinação foi fotografada a 2, 7 e 13 minutos (Figura 9) . Imagens da mistura após o período de 12 minutos são apresentadas na FIG. 9. Após 13 minutos, partículas incluindo predominantemente fluorescência Texas Red ou FAM foram observáveis.
Este exemplo demonstra que as partículas permanecem relativamente estáveis em solução e podem ser marcadas de forma independente. Esta observação pode ser útil no controle de duas ou mais reações RPA simultaneamente, ocorrendo em diferentes subconjuntos de partículas.
Exemplo 5. Reações RPA são Observadas Localizadas para Partículas
Misturas congeladas secas de componentes de reação RPA, incluindo uma sonda de oligonucleotídeo marcada com FAM, tal como no Exemplo 1, foram reconstituídas com 46,5 μL de tampão de reidratação e uma reação de amplificação foi iniciada por adição de 1 μL de 50.000 cópias/uL de ADN genômico de S. pyogenes e 2,5 μL de MgAc 280 mM. A reação foi misturada por pipetagem e transferida para uma lâmina de microscópio para obter a imagem por DIG e fluorescência a partir de cerca de 2 minutos, a 40 segundos após o inicio e, em seguida, aos 8, 12, 14, 15, 16, 18, 20, e 22 minutos (Fig. 10.). Observou-se um aumento na fluorescência (indicando amplificação), a qual foi, pelo menos, inicialmente localizada em partículas individuais.
Numa outra experiência, misturas liofilizadas livres de iniciador dos componentes de reação (preparado por mistura de um volume de 50 μg de 2,96 μg de creatinoquinase, 9,88 μg de Rb69 gp32, 18,8 μg T6 H66S UvsX, 5,38 μg UvsY, 5,38 μg de Exomiclease III e 5,34 μg de ADN Polimerase em Tris Acetato25 mM, pH 8,3, DTT 5 mM, PEG 2,28%, Tris Acetato25 mM, pH 8,3, DTT 5 mM, PEG 2,28%, trealose 5,7%, f osf ocreatina 50 mM, ATP 2,5 mM, dNTPmix 1.200 μΜ (300 μΜ cada um de dATP, dTTP, dCTP e DGTP e secagem por congelamento em tubos de 0,2 mL) foram reconstituídos com 29,5 μL de tampão de reidratação livre de iniciador (Tris acetato 41,7 mM, Acetato de potássiol67,5 mM, PEG 5,4%, pH 8,3), 3,5 μL de Spa F36 μΜ (SEQ ID NO: 7), 3,5 μL de SpaR10 + 1 6 μΜ (SEQ ID NO: 8), 1 μL de Sonda Spa 1 TMR-rotulada 6 μΜ (SEQ ID NO: 9), 1 μL M2intFAM oligo 0,6 μΜ (SEQ ID NO: 19, utilizado como um marcador fluorescente de partículas que não estão envolvidas na reação RPA), e 8 μL de água. A reação foi iniciada pela adição de 1 μL de 50.000 cópias/μL de ADN genômico molde de Estreptococos purificado Grupo A e 2,5 μL de MgAc 280 mM e misturando com uma pipeta. Dez microlitros da mistura foram transferidos para uma lâmina de microscópio, e a obtenção de imagem foi iniciada aproximadamente 3 minutos após o início da reação. Um curso de tempo da mistura reacional aos 3, 8, 15, 18, 22, e 26 minutos (Fig. 11) mostraram um aumento na fluorescência vermelha (indicando amplificação), a qual foi, pelo menos inicialmente localizada em partículas individuais.
Este exemplo demonstra que os produtos de amplificação de ácidos nucleicos podem ser observadso co-localizados com partículas.
Exemplo 6. Efeitos das Variantes de UvsX
Para investigar os efeitos de diferentes variantes de UvsX, as misturas foram criadas à temperatura ambiente contendo 2,96 mg creatinoquinase, 13,1 mg de Rh69 gp32, 8,26 μg de Exonuclease III, 5,0 mg de Polimerase em Tris acetato 50 mM, pH 8,3, KOAc 100 mM, DTT 5 mM, dNTP mix 1,2 mM (300 μΜ, cada um de dATP, dTTP, dCTP e dGTP), fosfocreatina 50 mM, ATP 2,5 mM, trealose 6%, MgAc 14 mM, PEG 5,5%, M2intFAM 120 nM (SEQ ID NO: 19), cada SpaF3 e SpaRlO+1 420 nm (50 μL volume final). Quatro diferentes misturas foram preparadas, contendo ou 18,8 mg de T6H66S UvsX ou 17,6 mg de T6 UvsX, e com ou sem 5,15 μg de Rb69 UvsY. Dez microlitros de cada mistura foram transferidos para uma lâmina de microscópio e fotografadas a 20x em ampliação cerca de 5-20 minutos após a configuração (Figuras 12A-12D) e também com uma ampliação de 40x cerca de 50-60 minutos após instalação (Fig. 13A-13D). Em geral, mais partículas foram observadas na mistura T6H66S UvsX do que com T6 UvsX. Além disso, as partículas T6H66S UvsX eram muitas vezes diferentes na forma daquelas com T6 UvsX, incluindo mais formas como cometa, enquanto que as partículas T6 UvsX eram mais esféricas. As misturas T6H66S UvsX faltando UvsY teve tem mais partículas difusas e difusos "halos" ou "Donuts" que não tinham sinal no meio. Com T6 UvsX o efeito oposto foi frequentemente observado. Sem UvsY, as partículas eram pequenas esferas brilhantes, mas com UvsY eram menos brilhantes e mais gordurosas e pequenas.
O efeito da UvsY na cinética da reação RPA usando T6H66S UvsX e T6 UvsX foi investigada. As reações foram preparadas como acima, com T6H66S UvsX ou T6 UvsX, e com ou sem Rb69 UvsY. Três experimentos separados foram realizados utilizando diferentes conjuntos de iniciadores e moldes. Na primeira experiência, os iniciadores foram FluAPAFNA507 420 nM (AACCTOGGACCTTTGATCTTGGGOGGCTATATG; SEQ ID NO: 13) e FluAPARNAl06 (ATGTGTTAGGAAGGAGTTGAACCAAGAAGCATT; SEQ ID NO: 14), com sonda FluAPAexoP2.2 120 nM (GATCTTGGGGGGCTATATGAA GCAATYGAGGAGFHCQTGATTAATGAT; F = FAM-dT, H = THF (sítio mimético abásico), Q = BHQ-l-dT, 3' = bloqueador c3spacer; SEQ ID NO: 15) . Quinhetos ou 50 cópias de molde de ARN de influenza A foram usados em cada reação. Reações RPA foram montadas contendo 2,96 μg de Creatinoquinase, 13,1 μg de Rb69 gp32, 18,8 μg de T6H66S UvsX ou 17,6 μg de T6 UvsX, 8,26 μg de Exonuclease III, 5,0 μg de Polymerase, 1,79 μg de Transcriptase Reversa, 5,15 μg de UvsY (quando presente) em Tris Acetato 50 mM, pH 8,3, KOAc 100 mM, DTT 5 mM, 0,2 unidades/uL de Ribolock™ Inibidor RNAse (Fermentas), 1,2 mM de dTP mix (300 μM cada um de dATP, dTTP, dCTP and dGTP) , fosfocreatina 50 mM, ATP 2,5 mM, trealose 6%, PEG 5,5%. Os compoentes acima foram montados em um volume de 46,5 μL em um tubo de 0,2 mL, e reações foram iniciadas por adição de 2,5 μL of MgOAc 2,80 mM e 1 μL de 500 ou 50 cópias/pL de molde de RNA de influenza A. Reações foram agitadas em vortex, centrifugadas rapidamente e transferidas para um instrumento Twista (ESE) e a fluorescência monitorada a cada 20 segundos por 20 minutos a 40°C com um passo de mistura (do tipo vortex e rápida centrifugação) a 5 minutos. Inclusão de UvsY com T6H66S UvsX leva a uma demora na amplificação relativa a reação sem UvsY, e o contrário foi visto para T6 UvsX (Fig. 14A-14B). Quando apenas 50 cópias do molde estavam presentes, as reações sem UvsY geraram menos sinal geral (Fig. 14A-14B). Um efeito similar em reações cinéticas foi observado em um segundo experimento utilizando SpaF3 e SpaRlO 420 nM como iniciadores, com SpaProbel.2 120 nM e 1000 cópias do ADN molde genômico de estreptococos purificado do grupo A (FIG. 15).
No segundo experimento, os iniciadores utilizados foram FluBNSF1007 (CATCGGATCCTCAACTCACTCTTCGAGCGT; SEQ ID NO: 16) e FluBNSR705 420 nm (GACCAAATTGGGATAAGACTCCCACCGCAGTTTC; SEQ ID NO: 17), com 120 nM de sonda FluBNSexoPl (CATCGGATCCTCAAYTCACTCTTCGAGCGFHTQAA TGAAGGACATTC; F = FAM-dT, H = THF (sitio mimético abásico) , Q = BHQ-l-dT, 3' = bloco c3spacer; SEQ ID NO: 18). Quinhentas cópias de ADN molde amplificado por PCR da influenza B foram utilizadas em cada reação. Nestas reações, nenhuma amplificação foi observada com T6H66S UvsX sem UvsY (FIG. 16A-16B). O efeito oposto foi observado com T6 UvsX (Figuras 16A-16B).
Este exemplo demonstra que as diferentes variantes de UvsX podem ter diferentes requisitos para UvsY no que diz respeito à morfologia das partículas e da cinética de reação de amplificação. Adicionalmente, a morfologia da partícula parece estar correlacionada com a cinética e/ou o progresso da reação de amplificação.
Exemplo 7. Quantificação dos ácidos nucleicos
Os métodos aqui descritos podem ser utilizados para a quantificação dos ácidos nucleicos. Numa das experiências, as diluições de um ácido nucleico molde é combinada com uma mistura de reação RPA como descrito no Exemplo 5. O número de partículas em um volume especificado da reação que estão associados a sítios de amplificação de ácido nucleico é determinado em cada diluição. Dentro de um intervalo, o número de partículas associadas com sítios de amplificação do ácido nucleico varia de acordo com a concentração de ácido nucleico molde na reação. Por exemplo, o número de partículas associadas à amplificação do ácido nucleico pode ser proporcional à concentração de ácido nucleico molde, ou o número de partículas associadas à amplificação do ácido nucleico pode ser equivalente ao número de moléculas de ácido nucleico molde, no mesmo volume. Utilizando essa informação sobre a correlação entre o número de partículas ativas e concentração de ácido nucleico molde, a concentração de ácido nucleico molde em uma amostra experimental pode ser determinada.
OUTRAS FORMAS DE REALIZAÇÃO
Um número de formas de realização da invenção foi descrito. No entanto, será entendido que várias modificações podem ser feitas sem se afastarem do espírito e âmbito da invenção. Assim, outras formas de realização estão dentro do âmbito das seguintes reivindicações.

Claims (13)

  1. Processo de monitoramento de misturas de amplificação de recombinase polimerase caracterizado pelo fato de que compreende:
    • (a) proporcionar uma mistura de reação de amplificação com recombinase polimerase compreendendo um agente de aglomeração;
    • (b) manter a mistura de reação sob condições que permitam a produção de produtos de amplificação de ácidos nucleicos na mistura de reação, as condições são tais que estruturas microscópicas com o aparecimento de partículas são formadas na mistura de reação, associadas a loci de amplificação ativa;
    • (c) detectar partículas associadas com os produtos de amplificação de ácidos nucleicos na mistura de reação, por observação de partículas e determinação de um número ou proporção de partículas co-localizadas com os produtos de ácidos nucleicos na mistura de reação.
  2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mistura de reação compreende uma recombinase, uma proteína de ligação de fita simples, e um ou mais oligonucleotídeos.
  3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o agente de aglomeração está presente na mistura em uma concentração entre 1 e 12% por peso ou por volume da mistura.
  4. Processo, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o agente de aglomeração é
    • i) polietilenoglicol, ou
    • ii) compreende polietilenoglicol opcionalmente PEG 1450, PEG3000, PEG8000, PEG10000, PEG14000, PEG15000, PEG20000, PEG250000, PEG30000, PEG35000, PEG40000, composto PEG com peso molecular entre 15.000 e 20.000 daltons, e suas combinações.
  5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que
    • (i) a recombinase inclui um RecA ou Uvsx recombinase;
    • (ii) a proteína de ligação de DNA de fita simples inclui uma proteína SSB procariótica ou uma proteína gp32;
    • (iii) a proteína de ligação de fita simples é E. coli SSB ou proteína de ligação de DNA de fita única derivada de fagos Myoviridae, como T4, T2, T6, Rb69, Aehl, KVP40, Acinetobacter fago 133, Aeromonas fago 65, cianofago P-SSM2, cianofago PSSM4, cianofago S-PM2, Rb14, Rb32, Aeromonas fago 25, fago de Vibrio nt-1, phi-1, Rb16, Rb43, fago 31, fago 44RR2.8t, Rb49, fago Rb3 e fago LZ2;
    • (iv) pelo menos um dos um ou mais oligonucleotídeos inclui um marcador detectável; e / ou
    • (v) a mistura de reação inclui um ou mais dentre: uma polimerase de DNA, uma proteína de carregamento de recombinase, ATP, dNTPs ou uma mistura de dNTPs e ddNTPs, um agente redutor, creatina quinase, uma nuclease, um iniciador de ácido nucleico, um ácido nucleico sonda, transcriptase reversa e um ácido nucleico modelo (em qualquer combinação).
  6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que:
    • (i) a detecção é realizada dentro de 10 minutos após o início da manutenção;
    • (ii) a detecção compreende a detecção de partículas únicas associadas a dois ou mais produtos de amplificação de ácido nucleico distintos;
    • (iii) as partículas são detectadas usando fluorescência das partículas ou sem o uso de fluorescência das partículas;
    • (iv) a detecção de partículas na mistura inclui o uso de uma ou mais das microscopias, um dispositivo microfluídico, citometria de fluxo e uma câmera; e / ou
    • (v) as partículas compreendem um primeiro subconjunto de partículas e um segundo subconjunto de partículas, o primeiro subconjunto de partículas é detectado usando fluorescência do primeiro subconjunto de partículas e o segundo subconjunto de partículas são detectados sem o uso de fluorescência do segundo subconjunto de partículas.
  7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que:
    • (i) as partículas têm entre 0,5-20 pm de tamanho; e/ou
    • (ii) as partículas incluem um ou mais (por exemplo, dois ou mais, ou todos) de uma recombinase, uma proteína de ligação em cadeia simples e pelo menos um dos um ou mais ácidos nucleicos (em qualquer combinação).
  8. Processo, caracterizado pelo fato de que compreende:
    • (a) fornecer uma mistura compreendendo uma recombinase, uma proteína de ligação ao DNA de fita simples, um agente de aglomeração e um ou mais oligonucleotídeos conforme definido na reivindicação 1; e
    • (b) detectar estruturas microscópicas com o aparecimento de partículas formadas na mistura, observando partículas e determinando um número ou proporção de partículas co-localizadas com produtos de amplificação de ácidos nucleicos.
  9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que:
    • (i) o agente de aglomeração compreende polietileno glicol (por exemplo, selecionado do grupo que consiste em PEG1450, PEG3000, PEG8000, PEG10000, PEG14000, PEG15000, PEG20000, PEG250000, PEG30000, PEG35000, PEG40000, composto de PEG com peso molecular entre 15.000 e 20.000 daltons, e combinações dos mesmos), álcool polivinílico, dextrano e / ou ficol; e / ou
    • (ii) o agente de aglomeração está presente na mistura em uma concentração entre 1 a 12% em peso ou em volume da mistura.
  10. Processo, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que:
    • (i) a recombinase compreende uma proteína RecA ou UvsX;
    • (ii) a proteína de ligação ao DNA de fita simples compreende uma proteína SSB procariótica ou uma proteína gp32; e / ou
    • (iii) pelo menos um dos um ou mais oligonucleotídeos compreende um marcador detectável.
  11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que as partículas:
    • (i) compreendem uma ou mais recombinases, a proteína de ligação de fita simples e pelo menos um dos um ou mais oligonucleotídeos; e / ou
    • (ii) têm entre 0,5-20 pm ou 1-10 pm de tamanho.
  12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que a mistura compreende ainda um ou mais dentre: uma polimerase de DNA, uma proteína de carregamento de recombinase, dNTPs ou uma mistura de dNTPs e ddNTPs, um agente redutor, creatina quinase, uma nuclease, uma sonda de ácido nucleico, uma transcriptase reversa e um ácido nucleico padrão.
  13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizado pelo fato de que:
    (i) a detecção de partículas na mistura compreende o uso de microscopia, um dispositivo microfluídico ou citometria de fluxo; e / ou
    ii) as partículas:
    • (a) são detectados usando fluorescência das partículas; ou
    • (b) são detectados sem o uso de fluorescência das partículas; ou
    • (c) compreendem um primeiro subconjunto de partículas e um segundo subconjunto de partículas, o primeiro subconjunto de partículas é detectado usando fluorescência do primeiro subconjunto de partículas e o segundo subconjunto de partículas é detectado sem o uso de fluorescência do segundo subconjunto de partículas.
BR112013025758-0A 2011-04-07 2012-04-06 Monitoramento de misturas de amplificação de recombinase polimerase BR112013025758B1 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161472919P 2011-04-07 2011-04-07
US61/472,919 2011-04-07
PCT/US2012/032508 WO2012138989A1 (en) 2011-04-07 2012-04-06 Monitoring recombinase polymerase amplification mixtures

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BR112013025758A2 BR112013025758A2 (pt) 2016-08-16
BR112013025758B1 true BR112013025758B1 (pt) 2021-04-06

Family

ID=46966393

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112013025758-0A BR112013025758B1 (pt) 2011-04-07 2012-04-06 Monitoramento de misturas de amplificação de recombinase polimerase

Country Status (10)

Country Link
US (3) US8809021B2 (pt)
EP (3) EP3202918B1 (pt)
JP (2) JP5961247B2 (pt)
CN (2) CN103476940B (pt)
AU (1) AU2012239989B2 (pt)
BR (1) BR112013025758B1 (pt)
CA (1) CA2831140C (pt)
ES (1) ES2905686T3 (pt)
WO (1) WO2012138989A1 (pt)
ZA (1) ZA201307184B (pt)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8030000B2 (en) 2002-02-21 2011-10-04 Alere San Diego, Inc. Recombinase polymerase amplification
US7399590B2 (en) 2002-02-21 2008-07-15 Asm Scientific, Inc. Recombinase polymerase amplification
US8071308B2 (en) 2006-05-04 2011-12-06 Alere San Diego, Inc. Recombinase polymerase amplification
US9309557B2 (en) 2010-12-17 2016-04-12 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
US9309566B2 (en) 2010-12-17 2016-04-12 Life Technologies Corporation Methods, compositions, systems, apparatuses and kits for nucleic acid amplification
US9334531B2 (en) 2010-12-17 2016-05-10 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
US9399217B2 (en) 2010-10-04 2016-07-26 Genapsys, Inc. Chamber free nanoreactor system
KR101963462B1 (ko) 2010-10-04 2019-03-28 제납시스 인크. 재사용 가능한 자동화 평행 생물 반응 시스템 및 방법
US9184099B2 (en) 2010-10-04 2015-11-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biosensor devices, systems and methods therefor
JP5907990B2 (ja) 2010-12-17 2016-05-11 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 核酸増幅のための方法、組成物、システム、装置およびキット
US8585973B2 (en) 2011-05-27 2013-11-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Nano-sensor array
US9926596B2 (en) 2011-05-27 2018-03-27 Genapsys, Inc. Systems and methods for genetic and biological analysis
CN106591103B (zh) 2011-12-01 2021-06-04 吉纳普赛斯股份有限公司 用于高效电子测序与检测的系统和方法
WO2014152625A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Genapsys, Inc. Systems and methods for biological analysis
EP3022319B1 (en) * 2013-07-15 2023-05-17 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequence by pto cleavage and extension-dependent immobilized oligonucleotide hybridization
WO2015075198A1 (en) * 2013-11-22 2015-05-28 Orion Diagnostica Oy Detection of nucleic acids by strand invasion based amplification
US10125393B2 (en) 2013-12-11 2018-11-13 Genapsys, Inc. Systems and methods for biological analysis and computation
US9822401B2 (en) 2014-04-18 2017-11-21 Genapsys, Inc. Methods and systems for nucleic acid amplification
CA2957359A1 (en) * 2014-08-22 2016-02-25 Cepheid Methods of detecting influenza
KR20170065028A (ko) * 2014-09-29 2017-06-12 일루미나 케임브리지 리미티드 재조합효소 돌연변이체
CN104830820A (zh) * 2015-05-07 2015-08-12 浙江泰晶生物科技有限公司 用于常温等温快速检测核糖核酸的蛋白酶及检测方法
JP6698708B2 (ja) 2015-06-09 2020-05-27 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 分子タグ付けのための方法、システム、組成物、キット、装置、及びコンピュータ可読媒体
US20180291413A1 (en) 2015-10-06 2018-10-11 Thermo Fisher Scientific Geneart Gmbh Devices and methods for producing nucleic acids and proteins
GB201519565D0 (en) 2015-11-05 2015-12-23 Alere San Diego Inc Sample preparation device
US11118206B2 (en) 2016-01-13 2021-09-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Multiple stage isothermal enzymatic amplification
EP3419989A4 (en) 2016-02-26 2019-11-06 Alere San Diego, Inc. OXIDIZED REDUCED OLIGONUCLEOTIDE PROBES AND USE THEREOF
BR112018067739A2 (pt) * 2016-03-04 2019-01-08 Alere San Diego Inc amplificação da polimerase recombinase nested automatizada
CN108779445A (zh) * 2016-03-28 2018-11-09 亿明达股份有限公司 重组酶突变
US9617587B1 (en) 2016-04-04 2017-04-11 Nat Diagnostics, Inc. Isothermal amplification components and processes
US11299777B2 (en) 2016-04-04 2022-04-12 Nat Diagnostics, Inc. Isothermal amplification components and processes
CN116397014A (zh) 2016-07-20 2023-07-07 测序健康公司 用于核酸测序的系统和方法
JP6701450B2 (ja) * 2017-07-05 2020-05-27 オリシロジェノミクス株式会社 Ｄｎａの産生方法及びｄｎａ断片連結用キット
EP3684951A4 (en) 2017-09-21 2021-06-16 Genapsys, Inc. NUCLEIC ACID SEQUENCING SYSTEMS AND METHODS
CN108195801B (zh) * 2017-11-17 2020-11-24 北京林业大学 单分子水平观测气孔保卫细胞膜蛋白分布和动态的方法
CN107893103A (zh) * 2017-11-29 2018-04-10 默禾医疗科技（上海）有限公司 重组酶聚合酶扩增中重组酶和蛋白浓度比及活性定量法
AU2019287163A1 (en) 2018-06-12 2020-12-03 Keygene N.V. Nucleic acid amplification method
GB201905303D0 (en) 2019-04-15 2019-05-29 Thermo Fisher Scient Geneart Gmbh Multiplex assembly of nucleic acid molecules
CN111154739B (zh) * 2020-02-06 2021-03-02 广州普世利华科技有限公司 一种新型重组酶依赖型扩增方法及试剂盒
US20210381067A1 (en) * 2020-06-08 2021-12-09 Ampliwise Inc. Nucleic acid amplification and detection with attenuaiting probe
BR112023022562A2 (pt) 2021-04-29 2024-01-02 Abbott Lab Sistemas e métodos para agrupar amostras para análise de alto rendimento
CN114085891A (zh) * 2021-11-23 2022-02-25 广州达安基因股份有限公司 基于重组酶聚合酶扩增技术的逆转录扩增系统和方法

Family Cites Families (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US5858652A (en) 1988-08-30 1999-01-12 Abbott Laboratories Detection and amplification of target nucleic acid sequences
GB8903627D0 (en) 1989-02-17 1989-04-05 Unilever Plc Assays
KR950013953B1 (ko) 1990-01-26 1995-11-18 애보트 래보라토리즈 리가제 연쇄 반응에 적용가능한 표적 핵산의 증폭 방법
US5326692B1 (en) 1992-05-13 1996-04-30 Molecular Probes Inc Fluorescent microparticles with controllable enhanced stokes shift
US5223414A (en) 1990-05-07 1993-06-29 Sri International Process for nucleic acid hybridization and amplification
US5273881A (en) 1990-05-07 1993-12-28 Daikin Industries, Ltd. Diagnostic applications of double D-loop formation
US5670316A (en) 1990-05-07 1997-09-23 Daikin Industries, Ltd. Diagnostic applications of double D-loop formation
DK0540693T3 (da) 1990-07-24 1999-09-13 Hoffmann La Roche Reduktion af ikke-specifik amplifikation under in vitro-nukleinsyreamplifikation under anvendelse af modificerede nukleinsy
CA2077135A1 (en) 1991-08-30 1993-03-01 Joh-E Ikeda A method of dna amplification
CA2122203C (en) 1993-05-11 2001-12-18 Melinda S. Fraiser Decontamination of nucleic acid amplification reactions
FR2708288B1 (fr) 1993-07-26 1995-09-01 Bio Merieux Procédé d'amplification d'acides nucléiques par transcription utilisant le déplacement, réactifs et nécessaire pour la mise en Óoeuvre de ce procédé.
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5705366A (en) 1994-09-15 1998-01-06 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Coamplification of target nucleic acids using volume exclusion agent in reaction composition, test kit and test device useful therefor
US5656430A (en) 1995-06-07 1997-08-12 Trevigen, Inc. Oscillating signal amplifier for nucleic acid detection
US5853990A (en) 1996-07-26 1998-12-29 Edward E. Winger Real time homogeneous nucleotide assay
AU712873B2 (en) 1996-08-29 1999-11-18 Tapestry Pharmaceuticals, Inc. Methods for targeting, enriching, detecting and/or isolating target nucleic acidsequence using reca-like recombinase
JP3065035B2 (ja) * 1998-10-01 2000-07-12 ダイキン工業株式会社 高性能なＲｅｃＡ様組換え酵素／１本鎖核酸プローブ複合体の調製方法及びその利用
US6087112A (en) 1998-12-30 2000-07-11 Oligos Etc. Inc. Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions
AU2410500A (en) 1999-01-11 2000-08-01 President And Fellows Of Harvard College Isothermal amplification of dna
US6699693B1 (en) 1999-02-04 2004-03-02 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Process for DNA replication
US6387621B1 (en) 1999-04-27 2002-05-14 University Of Utah Research Foundation Automated analysis of real-time nucleic acid amplification
NO314091B1 (no) 2000-01-12 2003-01-27 Biotec Pharmacon Asa Varmelabil uracil-DNA-glykosylase, DNA-sekvens som koder for enzymet, mikroorganisme som inneholder DNA-sekvensen, samt anvendelse av enzymet
AU2001243670A1 (en) 2000-03-20 2001-10-03 Maxygen, Inc. Method for generating recombinant dna molecules in complex mixtures
US20020061530A1 (en) 2000-07-31 2002-05-23 Belotserkovskii Boris P. Enhanced targeting of DNA sequences by recombinase protein and single-stranded homologous DNA probes using DNA analog activation
US6379899B1 (en) 2001-03-13 2002-04-30 Discoverx Isothermal exponential RNA amplification in complex mixtures
CA2444649C (en) 2001-04-20 2012-10-02 The Penn State Research Foundation Methods for nucleic acid manipulation
US7056671B2 (en) 2001-08-20 2006-06-06 Takara Bio Inc. Isothermal chimeric primer nucleic acid amplification methods using blocking oglionucleotide
WO2003027640A2 (en) 2001-09-28 2003-04-03 University Of Delaware Polymorphism detection and separation
US7244562B2 (en) 2001-11-01 2007-07-17 Gene Check, Inc. RecA assisted detection of mutations, single nucleotide polymorphisms and specific sequences
US8030000B2 (en) * 2002-02-21 2011-10-04 Alere San Diego, Inc. Recombinase polymerase amplification
US7399590B2 (en) 2002-02-21 2008-07-15 Asm Scientific, Inc. Recombinase polymerase amplification
ATE400663T1 (de) 2002-02-21 2008-07-15 Asm Scient Inc Rekombinase-polymerase-amplifikation
US20040137456A1 (en) 2002-04-04 2004-07-15 Hiroki Yokota Method for identifying and characterizing individual dna molecules
US20030228611A1 (en) 2002-05-01 2003-12-11 President And Fellows Of Harvard College Nucleic acid memory device
EP1525055A1 (en) 2002-07-12 2005-04-27 British Biocell International Limited Lateral flow assay device and method
CA2494993A1 (en) 2002-08-21 2004-03-04 Epoch Biosciences, Inc. Abasic site endonuclease assay
JP4632788B2 (ja) 2002-09-20 2011-02-16 ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイティッド 核酸のヘリカーゼ依存性増幅
US20040224336A1 (en) 2003-03-11 2004-11-11 Gene Check, Inc. RecA-assisted specific oligonucleotide extension method for detecting mutations, SNPs and specific sequences
WO2004104213A2 (en) 2003-05-15 2004-12-02 The Rockefeller University Nucleic acids and polypeptides of c1 bacteriophage and uses thereof
JP2005110621A (ja) 2003-10-10 2005-04-28 Aisin Seiki Co Ltd 核酸増幅方法及び核酸増幅用試薬キット
US20050191682A1 (en) 2004-02-17 2005-09-01 Affymetrix, Inc. Methods for fragmenting DNA
CN1942761A (zh) 2004-04-21 2007-04-04 东丽株式会社 芯片实验室用基板
DE102005052752A1 (de) 2005-11-04 2007-05-10 Clondiag Chip Technologies Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von molekularen Wechselwirkungen
EP1759012B1 (en) 2004-06-01 2013-05-22 Alere San Diego, Inc. Recombinase polymerase amplification
US7745125B2 (en) 2004-06-28 2010-06-29 Roche Molecular Systems, Inc. 2′-terminator related pyrophosphorolysis activated polymerization
WO2006057918A2 (en) 2004-11-23 2006-06-01 Morisawa, Shinkatsu Detection of nucleic acid variation by cleavage-amplification method
EP1929049B1 (en) * 2005-07-25 2013-04-10 Alere San Diego, Inc. Methods for multiplexing recombinase polymerase amplification
US8071308B2 (en) * 2006-05-04 2011-12-06 Alere San Diego, Inc. Recombinase polymerase amplification
EP2089159B1 (en) 2007-05-03 2013-01-23 Clondiag GmbH Assays
US8560130B2 (en) 2007-12-04 2013-10-15 Lester F. Ludwig Software controlled lab-on-a-chip emulation
US20090215050A1 (en) * 2008-02-22 2009-08-27 Robert Delmar Jenison Systems and methods for point-of-care amplification and detection of polynucleotides
CN102026725B (zh) 2008-03-14 2014-10-29 科隆迪亚戈有限公司 一种用于检测样品中分析物的装置及其方法
WO2010141940A1 (en) * 2009-06-05 2010-12-09 Alere San Diego, Inc. Recombinase polymerase amplification reagents and kits

Also Published As

Publication number Publication date
ES2905686T3 (es) 2022-04-11
AU2012239989B2 (en) 2016-03-10
EP2694666A4 (en) 2014-12-24
ZA201307184B (en) 2014-12-23
US9719132B2 (en) 2017-08-01
US20160068898A1 (en) 2016-03-10
US20120258456A1 (en) 2012-10-11
JP2016119912A (ja) 2016-07-07
EP3978620A1 (en) 2022-04-06
AU2012239989A1 (en) 2013-10-17
JP2014516512A (ja) 2014-07-17
CN103476940A (zh) 2013-12-25
US9157127B2 (en) 2015-10-13
WO2012138989A1 (en) 2012-10-11
CA2831140A1 (en) 2012-10-11
CA2831140C (en) 2017-11-07
BR112013025758A2 (pt) 2016-08-16
EP3202918A1 (en) 2017-08-09
US20150024397A1 (en) 2015-01-22
JP6209638B2 (ja) 2017-10-04
EP2694666A1 (en) 2014-02-12
CN103476940B (zh) 2016-07-13
EP2694666B1 (en) 2018-05-23
CN105907846A (zh) 2016-08-31
NZ615861A (en) 2015-12-24
JP5961247B2 (ja) 2016-08-02
EP3202918B1 (en) 2021-10-20
US8809021B2 (en) 2014-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9719132B2 (en) Monitoring recombinase polymerase amplification mixtures
CN109477095A (zh) 用于单分子检测的阵列及其应用
US20090221095A1 (en) Colorimetric Screening of DNA Binding/Intercalating Agents with Gold Nanoparticle Probes
CN107735497A (zh) 用于单分子检测的测定及其应用
BR112017000167B1 (pt) Dispositivo de microfluidos, método de carregamento de dispositivo de microfluidos, método para testes de sensibilidade aos antibióticos, método para genotipagem de células in situ e método para a caracterização do fenótipo de células
CN110964796A (zh) 大规模平行单细胞分析
EP3049067A2 (en) Encapsulated sensors and sensing systems for bioassays and diagnostics and methods for making and using them
Lee et al. Single-molecule views of MutS on mismatched DNA
KR102129506B1 (ko) 핵산 에세이에서의 향상된 용융 식별 및 복합화를 위한 프로브
US11807899B2 (en) Biochemical reaction methods and reagents comprising intrinsically disordered regions
Ma et al. Developing novel methods to image and visualize 3D genomes
WO2011050938A1 (de) Konjugate von nukleotiden und methoden zu deren anwendung
Tanner et al. Visualizing DNA replication at the single-molecule level
Liu Freezing DNA for Controlling Bio/nano Interfaces and Catalysis
WO2022051296A1 (en) Methods and systems for reducing particle aggregation
US20200061617A1 (en) Devices and methods for nucleic acid identification
NZ615861B2 (en) Monitoring recombinase polymerase amplification mixtures
WO2021242804A1 (en) Apparatus and method for fast digital detection
TW202233848A (zh) 利用寡核苷酸偵測混合物中之物質
Tanner et al. Techniques for Single-Molecule Observation of Prokaryotic DNA Replication
AU2014326783A1 (en) Encapsulated sensors and sensing systems for bioassays and diagnostics and methods for making and using them

Legal Events

Date Code Title Description
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B06T Formal requirements before examination [chapter 6.20 patent gazette]
B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B25A Requested transfer of rights approved

Owner name: ABBOTT DIAGNOSTICS SCARBOROUGH, INC. (US)

B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 06/04/2012, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.