JP2016119912A - リコンビナーゼポリメラーゼ増幅混合物のモニタリング - Google Patents
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Abstract
【解決手段】プロセスは、リコンビナーゼ、一本鎖結合タンパク質および1または複数種のオリゴヌクレオチドを包含する混合物を提供するステップと、反応混合物における粒子を検出するステップとを包含する。別の一態様において、本開示は、(a)リコンビナーゼポリメラーゼ増幅反応混合物を提供するステップと、(b)反応混合物における核酸増幅産物の産生を可能にする条件下で反応混合物を維持するステップと、(c)反応混合物における核酸増幅産物と関連する粒子を検出するステップとを包含するプロセスを特色とする。
【選択図】なし
Description
特定の等温増幅方法は、僅か数分間以内で微量レベルから非常に高い検出可能レベルへと、特異的な仕方で鋳型(標的)核酸を増幅することができる。このような等温方法、例えば、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(Recombinase Polymerase Amplification)(RPA)は、核酸ベースの診断の適用を、ポイントオブケア検査ならびに実地および消費者試験等、新興分野へと広げることができる。この技術の等温的性質および広範な温度範囲により、使用者は、複雑な、電力を必要とする(power-demanding)器具の使用を回避
することができる。
本開示は、少なくとも一部には、RPA混合物内における粒子の観察に基づく。一部の実施形態において、これらの粒子は、RPA反応の核酸(例えば、オリゴヌクレオチド)および/またはタンパク質成分を包含し得る。この発見は、RPAに関する新たなモニタリングおよび検出方法を提供する。
えば、ポリエチレングリコール(例えば、PEG1450、PEG3000、PEG8000、PEG10000、PEG14000、PEG15000、PEG20000、PEG250000、PEG30000、PEG35000、PEG40000、15,000〜20,000ダルトンの間の分子量のPEG化合物またはこれらの組合せ)、ポリビニルアルコール、デキストランおよびフィコールのうちの1または複数種を包含する。一部の実施形態において、クラウディング剤は、反応混合物の重量または容量で1〜12%の間の濃度、例えば、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%、7.0%、7.5%、8.0%、8.5%、9.0%、9.5%、10.0%、10.5%、11.0%、11.5%および12.0%から選択されるいずれか2つの濃度値の間の濃度で反応混合物中に存在する。
還元剤、クレアチンキナーゼ、ヌクレアーゼ(例えば、エキソヌクレアーゼIIIまたはエンドヌクレアーゼIV)、逆転写酵素、核酸プローブ、核酸プライマーおよび鋳型核酸(いずれかの組合せの)のうちの1または複数種(例えば、2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、8種以上または全種)を包含する。
れらの修飾バージョン)と共有結合していない、核酸ポリマー内のサブユニットポジションを意味する。一部の実施形態において、糖または修飾糖部分の1’炭素は、水素(例えば、テトラヒドロフラン)と共有結合している。一部の実施形態において、糖または修飾糖部分の1’炭素は、環状塩基構造に存在しない別の炭素と共有結合している。一部の実施形態において、糖または修飾糖部分の1’炭素は、非環状リンカー構造と共有結合している。一部の実施形態において、脱塩基部位模倣体は、脱塩基部位との構造的類似性(即ち、糖に付着した巨大な(bulky)塩基の化学基(base group)の欠如)により、脱塩基部位模倣体をプロセシングおよび修飾する酵素により認識される。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
(a)リコンビナーゼ、一本鎖DNA結合タンパク質および1または複数種のオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、
(b)該混合物における粒子を検出するステップと、
を含むプロセス。
(項目2)
前記混合物が、クラウディング剤を含む、項目1に記載のプロセス。
(項目3)
前記クラウディング剤が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、デキストランおよび/またはフィコールを含む、項目2に記載のプロセス。
(項目4)
前記クラウディング剤が、ポリエチレングリコールを含む、項目2に記載のプロセス。
項目5)
前記ポリエチレングリコールが、PEG1450、PEG3000、PEG8000、PEG10000、PEG14000、PEG15000、PEG20000、PEG250000、PEG30000、PEG35000、PEG40000、15,000〜20,000ダルトンの間の分子量のPEG化合物およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目3または4に記載のプロセス。
(項目6)
前記クラウディング剤が、前記混合物の重量または容量で1〜12%の間の濃度で前記混合物中に存在する、項目2〜5のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目7)
前記リコンビナーゼが、RecAまたはUvsXタンパク質を含む、項目1〜6のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目8)
前記一本鎖DNA結合タンパク質が、原核生物SSBタンパク質またはgp32タンパク質を含む、項目1〜7のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目9)
前記1または複数種のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも1種が、検出可能な標識を含む、項目1〜8のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目10)
前記粒子が、前記リコンビナーゼ、前記一本鎖結合タンパク質および前記1または複数種のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも1種のうちの1または複数種を含む、項目1〜9のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目11)
前記混合物が、DNAポリメラーゼ、リコンビナーゼローディングタンパク質、dNTPまたはdNTPとddNTPとの混合物、還元剤、クレアチンキナーゼ、ヌクレアーゼ、核酸プローブ、逆転写酵素および鋳型核酸のうちの1または複数種をさらに含む、項目1〜10のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目12)
前記粒子が、約1〜10μmのサイズである、項目1〜11のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目13)
前記混合物における粒子を検出するステップが、顕微鏡の使用を含む、項目1〜12のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目14)
前記混合物における粒子を検出するステップが、マイクロ流体デバイスの使用を含む、項目1〜12のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目15)
前記混合物における粒子を検出するステップが、フローサイトメトリーの使用を含む、項目1〜12のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目16)
前記粒子が、約0.5〜20μmのサイズである、項目1〜10または12〜15のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目17)
前記粒子が、前記粒子からの蛍光を用いて検出される、項目1〜16のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目18)
前記粒子が、前記粒子からの蛍光を用いずに検出される、項目1〜16のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目19)
前記粒子が、第一のサブセットの粒子および第二のサブセットの粒子を含み、該第一のサブセットの粒子が、該第一のサブセットの粒子からの蛍光を用いて検出され、該第二のサブセットの粒子が、該第二のサブセットの粒子からの蛍光を用いずに検出される、項目1〜16のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目20)
(a)リコンビナーゼポリメラーゼ増幅反応混合物を提供するステップと、
(b)該反応混合物を、該反応混合物における核酸増幅産物の産生を可能にする条件下で維持するステップと、
(c)該反応混合物における該核酸増幅産物に関連する粒子を検出するステップと、
を含むプロセス。
(項目21)
前記検出するステップが、前記維持するステップを始めてから10分間以内に行われる、項目20に記載のプロセス。
(項目22)
前記反応混合物がクラウディング剤を含む、項目20または21に記載のプロセス。
(項目23)
前記検出するステップが、核酸増幅産物に関連する粒子の数または比率を決定するステップを含む、項目20〜22のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目24)
前記検出するステップが、2種以上の別個の核酸増幅産物に関連する単一粒子を検出するステップを含む、項目20〜23のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目25)
前記粒子が、約0.5〜20μmのサイズである、項目20〜24のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目26)
前記粒子が、前記粒子からの蛍光を用いて検出される、項目20〜25のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目27)
前記粒子が、前記粒子からの蛍光を用いずに検出される、項目20〜25のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目28)
前記粒子が、第一のサブセットの粒子および第二のサブセットの粒子を含み、該第一のサブセットの粒子が、該第一のサブセットの粒子からの蛍光を用いて検出され、該第二のサブセットの粒子が、該第二のサブセットの粒子からの蛍光を用いずに検出される、項目20〜25のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目29)
(a)第一のリコンビナーゼ、第一の一本鎖結合タンパク質および第一のオリゴヌクレオチドを含む第一の集団の粒子と、
(b)第二のリコンビナーゼ、第二の一本鎖結合タンパク質および第二のオリゴヌクレオチドを含む第二の集団の粒子と、
を含む組成物であって、該第一のオリゴヌクレオチドと該第二のオリゴヌクレオチドとが異なる組成物。
(項目30)
前記第一のオリゴヌクレオチドおよび前記第二のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一方が、検出可能な標識を含む、項目29に記載の組成物。
(項目31)
前記第一のオリゴヌクレオチドおよび前記第二のオリゴヌクレオチドが、異なる検出可能な標識を含む、項目29に記載の組成物。
(項目32)
前記粒子が、約0.5〜20μmのサイズである、項目29〜31のいずれか一項に記載の組成物。
(項目33)
前記粒子が、前記粒子からの蛍光を用いて検出され得る、項目29〜32のいずれか一項に記載の組成物。
(項目34)
前記粒子が、前記粒子からの蛍光を用いずに検出され得る、項目29〜32のいずれか一項に記載の組成物。
(項目35)
前記粒子が、第一のサブセットの粒子および第二のサブセットの粒子を含み、該第一のサブセットの粒子が、該第一のサブセットの粒子からの蛍光を用いて検出され得、該第二のサブセットの粒子が、該第二のサブセットの粒子からの蛍光を用いずに検出され得る、項目29〜32のいずれか一項に記載の組成物。
顕微鏡観察において、RPA混合物内に粒子の外観を呈する構造体が観察された。RPA核酸増幅反応の進行において、粒子は、活性増幅の座位と関連する。
RPAは、核酸を増幅(例えば、等温増幅)するための方法である。一般に、RPAの第一のステップにおいて、リコンビナーゼが、第一および第二の核酸プライマーと接触されて、第一および第二のヌクレオプロテインプライマーを形成する。一般に、第二のステップにおいて、第一および第二のヌクレオプロテインプライマーが、二本鎖鋳型核酸と接触されて、第一の核酸プライマーおよび第二の核酸プライマーの3’端が所定のDNA分子において互いに向かい合うよう方向づけられるように、鋳型核酸の第一の鎖の第一の部分に第一の二本鎖構造と、鋳型核酸の第二の鎖の第二の部分に第二の二本鎖構造とを形成する。一般に、第三のステップにおいて、第一および第二のヌクレオプロテインプライマーの3’端が、DNAポリメラーゼにより伸長されて、第一および第二の二本鎖核酸ならびに第一および第二の置き換えられた核酸鎖を生成する。一般に、第二および第三のステップは、所望の程度の増幅が達成されるまで反復することができる。
Acad. Sci. U.S.A.、103巻:10328〜10333頁、2006年を参照)。
I、Staphylococcus aureus Pol I、E.coli DNAポリメラーゼI、E.coli DNAポリメラーゼII、E.coli DNAポリメラーゼIII、E.coli DNAポリメラーゼIV、E.coli DNAポリメラーゼVおよびこれらの変異体もしくは断片またはこれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態において、DNAポリメラーゼは、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。一部の実施形態において、DNAポリメラーゼは、鎖置き換え特性、例えば、クラスIの原核生物ポリメラーゼの大型断片またはpol Vを有する。
より行うことができる。ブロックプライマーは、ポリメラーゼによる延長を行うことができないプライマーである。ブロックプライマーを用いる場合、非ブロック化剤を用いてプライマーを非ブロック化させて、延長させることができる。非ブロック化剤は、プライマーからブロッキング基を開裂させることのできるエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼとなり得る。例示的な非ブロック化剤として、E.coliエキソヌクレアーゼIIIおよびE.coliエンドヌクレアーゼIVが挙げられる。
ルオレセイン、フィコビリンタンパク質、テトラエチルローダミンおよびベータ−ガラクトシダーゼが挙げられる。結合ペアは、ビオチン/アビジン、ビオチン/ストレプトアビジン(strepavidin)、抗原/抗体、リガンド/受容体およびアナログならびに結合ペア
の変異体を包含し得る。
粒子の検出およびモニタリングは、いずれかの適切な方法を用いて行うことができる。例示的な方法として、顕微鏡、光散乱、フローサイトメトリーおよびマイクロ流体方法が挙げられる。
またはシステムその他を用いて検出することができる。例えば、米国特許出願公開第2009/0326903号および第2009/0297733号明細書を参照されたい。
結合タンパク質、ATP、dNTPおよびプライマーまたはプローブを包含することができる。一部の実施形態において、リコンビナーゼ、ポリメラーゼ、一本鎖結合タンパク質、ATP、dNTPおよびプライマーまたはプローブを含有するデバイスであって、リコンビナーゼ、ポリメラーゼ、プライマーもしくはプローブの1種またはリコンビナーゼが、表面に共有結合的に付着または非共有結合的に結合した(例えば、親和性タグの使用により)デバイスを提供することができる。一部の実施形態において、粒子は、マルチウェルプレートにおける複数の単一ウェルに配置することができる。
本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドは、増幅プライマーおよび/または検出プローブとして作用することができる。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、例えば、増幅方法(例えば、本明細書に記載されている)において用いるための2種以上(例えば、2、3、4種以上)のオリゴヌクレオチドのセットとして提供される。
1990年)Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87巻:2264〜68頁のアルゴリズ
ムであり、これは、Karlin and Altschul(1993年)Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90巻:5873〜77頁として修正されている。このようなアルゴリズムは、Altschulら(1990年);J. Mol. Biol.、215巻:403〜410頁のNBLAST
プログラムに取り込まれる。比較目的のギャップ付(gapped)アライメントを得るため、Altschulら(1997年)Nucleic Acids Res.、25巻:3389〜3402頁に記載されている通りにGapped BLASTを利用することができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合、NBLASTプログラムのデフォルトパラメータを用いることができる。オンラインでncbi.nlm.nih.gov.を参照されたい
。
チドに付着することができる。他の付着も可能であり、広く公知である。
せることができない。オリゴヌクレオチドをブロッキングする方法は周知のものであり、少なくとも、ブロックされた3’ヌクレオチドの包含を包含する。ブロックされた3’ヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ伸長を妨げるブロッキング基を含有することができる。一般に、ブロッキング基は、3’糖残基の3’または2’部位に付着するが、他の付着位置も可能である。最も一般的な3’ブロッキング方法の一つは、オリゴヌクレオチドの3’端にジデオキシ糖を置くことである。ブロッキング基は、例えば、検出可能な標識となり得る。
本明細書に開示されている方法および組成物は、例えば、標的核酸のコピー数の検出および標的核酸内に存在する配列の増幅のモニターに用いることができる。本方法の一部の実施形態において、標的核酸は、低コピー数の、相対的に粗製試料において検出することができる。一部の実施形態において、検出される核酸は、細菌核酸、例えば、Chlamydia trachomatis、Neisseria gonorrhea、A群Streptococcus、B群Streptococcus、Clostridium difficile、Escherichia coli、Mycobacterium tuberculosis、Helicobacter pylori、Gardnerella vaginalis、Mycoplasma hominis、Mobiluncus spp.、Prevotella spp.およびPorphyromonas sppまたは本明細書に記載されているまたは本技術分野で公知の別の細菌から選択される細菌由来の核酸である。一部の実施形態において、検出される核酸は、哺乳動物核酸であり、例えば、核酸は、腫瘍細胞に関連する。一部の実施形態において、検出される核酸は、ウイルス核酸、例えば、HIV、インフルエンザウイルスもしくはデングウイルスまたは別のウイルス由来の核酸である。一部の実施形態において、検出される核酸は、真菌核酸、例えば、Candida albicansまたは別の真菌由来の核酸である。一部の実施形態において、検出される核酸は、原生動物核酸、例えば、Trichomonasまたは別の原生動物由来の核酸である。本明細書に開示されている方法および組成物は、検出される核酸、例えば、細菌核酸、哺乳動物核酸、ウイルス核酸、真菌核酸または原生動物核酸(例えば、本明細書に開示されている)に関連する障害または状態の診断において用いることができる。例えば、本明細書に提示されている方法および組成物は、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症または寄生虫感染症の診断に用いることができる。一部の実施形態において、検出される核酸は、インフルエンザAもしくはその変種、インフルエンザBもしくはその変種、メチシリン抵抗性Staphlococcus aureus(MRSA)、C.difficile、M.tuberculosis、Chlamydia種(例えば、Chlamydia trachomatis)、N.gonorrhoeae、Treponema pallidum、ヒトパピローマウイルス(HPV)(例えば、HPV変種16型および18型)、肝炎ウイルス(例えば、A、BおよびC型肝炎)または循環癌細胞由来の核酸である。一部の実施形態において、本明細書に提示されている方法および組成物は、MRSA感染症、C.difficile感染症、結核、クラミジア感染症、淋病、梅毒、HPV感染症、肝炎ウイルス感染症またはHPV感染症の診断に用いることができる。本明細書に開示されている方法および組成物は、核酸の定量化において用いることができる。核酸増幅/検出反応の「デジタル化」は、鋳型分子の正確な計数を可能にする近年のアプローチである(例えば、Vogelstein、1999年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、96巻:9236頁を参照)。通常、これらの方法において、要求される微小区画(micro-compartment)(通常、ナノリットル範囲の)への反応混合物の空間的隔離は、例えば、これを圧力下で適切なマイクロ流体カセットへと圧迫することにより、あるいは適切なエマルジョンにおいてこれを分散させることにより、増幅反応物を物理的に分割することにより達成される。理論に縛られることは望まないが、本明細書に開示されている粒子が増幅の活性中心である場合、粒子の存在は、定量化に用いることのできる反応混合物の固有の区画化を構成する。例えば、「活性」RPA粒子(例えば、蛍光シグナルの生成に関連する粒子)の数を計数することにより、反応混合物中に存在する鋳型核酸分子の数を測定または推定することができる。
する情報を届けない。2種のマーカーが、ゲノムDNAの単一小片において連結していることの立証は、抗生物質抵抗性を特定の病原体に関連づける。2種のマーカーの共局在化は、このシナリオにおける生命診断情報を届けることができる。
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅混合物における粒子
本実施例は、RPA混合物内におけるオリゴヌクレオチドを含有する粒子の観察について記載する。80μlの9.38mM Tris酢酸、pH8.3、3.13mM DTT、2.5%PEG、3.75%トレハロース、31.3mMクレアチンリン酸、1.56mM ATP、750μM dNTPミックス(それぞれ188μMのdATP、dTTP、dCTPおよびdGTP)、388nM Spy1258F2(CACAGACACTCGACAAG TCCTCAATCAAACCTTG;配列番号1)、363nM Spy1258R2(CAGAAATCCT TGATGAGTTGCGGAAATTTGAGGT;配列番号2)および75nM Spy1258exoP1(CCTTGTCCTACCTTATAGAACATAGAGAATQTHFAACCGCACTCGCTAC;F=FAM−dT、H=THF(脱塩基部位模倣体)、Q=BHQ−1−dT、3’=ブロックc3spacer;配列番号3)において、2.96μgクレアチンキナーゼ、13.1μg Rb69 gp32、18.1μg T6 H66S UvsX、5.15μg Rb69 UvsY、5.38μgエキソヌクレアーゼIIIおよび5.0μg DNAポリメラーゼ(S.aureusポリメラーゼIの大型断片)を含有する混合物を調製して、0.2mLチューブ内で混合物をフリーズドライすることにより、FAM標識したオリゴヌクレオチドを包含するRPA反応成分のフリーズドライ混合物を得た。乾燥させた試薬を、46.5μLの再水和バッファー(48mM Tris酢酸、133.8mM KOAc、2%PEG)+3.5μLの水に再懸濁し、ボルテックスした。このような混合物は、核酸鋳型またはマグネシウムを含有しなかった。混合物から10マイクロリットルを顕微鏡スライドに移し、40×拡大率の微分干渉コントラスト法(DIC)および蛍光顕微鏡を用いて画像化した(図1A〜1C)。DIC(図1A)または蛍光(図1B)を用い、この2画像を重ね合わせて(図1C)、サイズ約1〜10ミクロンの粒子を観察した。およそ100〜500粒子/nLを観察した(40×拡大率の視野は、1.55nLの混合物に相当)。
クラウディング剤は粒子形成を刺激する
粒子形成におけるクラウディング剤の効果を決定するため、50mM Tris酢酸、pH8.3、100mM KOAc、5mM DTT、1.2mM dNTPミックス(それぞれ300μMのdATP、dTTP、dCTPおよびdGTP)、50mMクレアチンリン酸、2.5mM ATP、6%トレハロース、14mM MgAc、30nM HIV p2LFtexas(Texas red標識オリゴAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCA5AATTTTCGGGTTT;3’dAブロック、5’Texas Red、5=dSpacer;配列番号4)、420nM Spy1258F2(CACAGACACTCGACAAGTCCTCAATCAAACCTTG;配列番号5)および390nM Spy1258R2(CAGAAATCCTTGATGAGTTGCGGAAATTTGAGGT;配列番号6)において、2.96μgクレアチンキナーゼ、13.1μg Rb69 gp32、18.8μg T6 H66S UvsX、2.5μg Rb69 UvsY、5.38μgエキソヌクレアーゼIIIおよび5.0μg DNAポリメラーゼを含有する新鮮なRPA混合物を調製した。各混合物に、0%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、5.5%または8%のPEGが包含された。混合物をピペットにより混合し、それぞれから10μLを顕微鏡スライドに移した。40×拡大率の微分干渉コントラスト法(DIC)および蛍光顕微鏡を用いて画像化を行った。観察された粒子の数は、最大5.5%までのPEG濃度増加と共に増加した(図3A〜3G)。8%PEGにおいて、より少ない粒子が観察された(図3H)。
粒子形成に対する混合物成分の寄与
粒子形成に対するRPA混合物成分の寄与を決定するため、各反応液において個々の成分を除外した以外は、5.5%PEGを用いた実施例2と同様に混合物を調製した。DICおよび蛍光顕微鏡を用いて、上述の通りに混合物を画像化した。全成分が存在する場合、上述の通りに混合物において粒子が形成された(図4A〜4B)。UvsXの非存在下で形成された粒子は、UvsXの存在下で形成された粒子とはサイズが異なるように見え、DICにより容易には観察できなかった(図4C〜4D)。gp32の非存在下で形成された粒子は、gp32の存在下で形成された粒子とは形状およびサイズが異なるように見えた(図4E〜4F)。他のRPA成分(UvsY、DNAポリメラーゼ、クレアチンキナーゼまたはエキソヌクレアーゼIII)の非存在下で形成された構造は、完全RPA反応液において形成された粒子と同様のものに見えた(図5A〜5H)。UvsYの非存在は、粒子数の僅かな減少および粒子サイズの増加をもたらすように見えた(図5A〜5B)。
粒子の別個の集団は、混合しても別々のままとなる
各混合物が異なるオリゴヌクレオチドおよび18.8μgのUvsXを包含した以外は、実施例1に記載されている通りに2種のフリーズドライ混合物を調製した。試薬ミックス1は、296nM SpaF3(配列番号7)、298nM SpaR10+1(配列番号8)および149nM SpaProbe1(CATCAGCTTTTGGAGCTTGAGAGTCAT9 A8G6TTTTGAGCTTCAC;3’ビオチン、6=BHQ−2dT、8=dSpacer、9=TMRdT;配列番号9)を含有した。試薬ミックス2は、299nM MecF9−8+2(CCCTCAAACAGGTGAA TTATTAGCACTTGT;配列番号10)、300nM MecR1a(CTTGTTGAGCAGAGG TTCTTTTTTATCTTC;配列番号11)および150nM MecProbe1(ATGACGTCTAT CCATTTATGTATGGCAFGHGQAACGAAGAATATA;3’ビオチンTEG、Q=BHQ−1dT、H=THF(脱塩基部位模倣体)、F=FAM−dT;配列番号12)を含有した。等容量の2種の試薬混合物を組み合わせ、80μLを0.2mLチューブに分注し、フリーズドライした。乾燥した混合物を、46.5μlの再水和バッファー(実施例1を参照)、1μLの水および2.5μLの280mM MgAcに再懸濁した。混合物をボルテックスし、DICおよび蛍光を用いた画像化のために10μLを顕微鏡スライドに移した。観察された粒子は、赤色(TMR)および緑色(FAM)蛍光の両方を含有し、両方の標識オリゴヌクレオチドが粒子に存在することを表示した(図7A〜7F)。
RPA反応は、粒子への局在化が観察される
実施例1と同様にFAM標識オリゴヌクレオチドプローブを包含するRPA反応成分のフリーズドライ混合物を46.5μlの再水和バッファーにより再構成し、1μLの50,000コピー/μL S.pyogenesゲノムDNAおよび2.5μLの280mM MgAcの添加により増幅反応を始めた。ピペッティングにより反応液を混合し、開始後約2分、40秒目、続いて8、12、14、15、16、18、20および22分目に始めるDICおよび蛍光による画像化のために顕微鏡スライドに移した(図10)。少なくとも最初は個々の粒子に局在化した、蛍光の増加(増幅を表示)が観察された。
UvsX変種の効果
異なるUvsX変種の効果を調査するため、50mM Tris酢酸、pH8.3、100mM KOAc、5mM DTT、1.2mM dNTPミックス(それぞれ300μMのdATP、dTTP、dCTPおよびdGTP)、50mMクレアチンリン酸、2.5mM ATP、6%トレハロース、14mM MgAc、5.5%PEG、120nM M2intFAM(配列番号19)、それぞれ420nMのSpaF3およびSpaR10+1(50μl最終容量)において2.96μgクレアチンキナーゼ、13.1μg Rb69 gp32、8.26μgエキソヌクレアーゼIII、5.0μgポリメラーゼを含有する混合物を室温にてセットアップした。18.8μg T6H66S UvsXまたは17.6μg T6 UvsXのいずれかを含有する、5.15μg Rb69 UvsYありまたはなしの4種の異なる混合物を調製した。10マイクロリットルの各混合物を顕微鏡スライドに移し、セットアップ約5〜20分後に20×拡大率で画像化し(図12A〜12D)、セットアップ約50〜60分後に40×拡大率でも画像化した(図13A〜13D)。一般に、T6H66S UvsX混合物において、T6 UvsXよりも多い粒子が観察された。その上、T6H66S UvsX粒子は多くの場合、彗星様形状等、T6 UvsXによる粒子とは形状が異なり、一方のT6 UvsX粒子はより球状であった。UvsYを欠くT6H66S UvsX混合物は、より拡散した粒子および拡散した「ハロー」または中央にシグナルを欠く「ドーナツ型」形状を有していた。T6 UvsXにより、逆の効果がしばしば観察された。UvsYなしでは、粒子は明るい小球であったが、UvsYありでは、粒子はより暗く、よりスメア(smeary)で小さかった。
核酸の定量化
本明細書に開示されている方法は、核酸の定量化に用いることができる。一実験において、鋳型核酸の希釈は、実施例5に開示されているRPA反応混合物と組み合わせる。核酸増幅の部位に関連する、指定の容量の反応液における粒子の数は、各希釈において決定される。範囲内において、核酸増幅の部位に関連する粒子の数は、反応液における鋳型核酸の濃度と共に変動する。例えば、核酸増幅に関連する粒子の数は、鋳型核酸の濃度に比例し得る、あるいは核酸増幅に関連する粒子の数は、同一容量における鋳型核酸分子の数と等しくなり得る。活性粒子数と鋳型核酸濃度との間の相関に関するこの情報を用いて、実験試料における鋳型核酸の濃度を決定することができる。
本発明の多くの実施形態を説明してきた。しかし一方で、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく様々な修正を為し得ることが理解されよう。したがって、他の実施形態も次の特許請求の範囲内に収まる。
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- 明細書に記載された発明。
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