LT6165B - Didelio tikslumo restrikcijos endonukleazės - Google Patents

Abstract

Pateikiami mutantinių fermentų su susilpnintu žvaigždiniu aktyvumu gavimo genų inžineriniai metodai ir kompozicijos, kur mutantiniai fermentai apibrėžtame buferyje turi didesnį tikslumo indeksą (FI), negu nemutuotų fermentų FI tokiame pačiame buferyje.

Description

Teoriniai pagrindai

Restrikcijos endonukleazės yra fermentai, kurie skaldo dvigrandę DNR, atpažindami specifines sekas (Roberts, R.J. Proc Natl Acad Sci USA 102: 5905-5908 (2005); Roberts, etai. NucIeicAcids Res31:1805-1812 (2003); Roberts, etai. Nucleic Acids Res 33: D230-232 (2005); Alves, et ai. Restriction Endonucleases, Protein Engineering of Restriction Enzymes, ed. Pingoud, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, New York, 393-407 (2004)). Jos yra plačiai paplitę tarp prokariotinių organizmų (Raleigh, et ai., Bacterial Genomes Physical Structure and Analysis, Ch.8, eds. De Bruijin, et ai., Chapman & Hali, New York, 78-92 (1998)), kuriuose jie sudaro dalį restrikcijos-modifikacijos sistemos, kuri pagrinde susideda iš endonukleazės ir metiltransferazės. Gimininga metiltransferazė metilina tokią pačią specifinę seką, kurią atpažįsta suporuota endonukleazė taip, kad šeimininko DNR būtų tinkamai apsaugota. Tačiau, jeigu yra svetimos DNR invazija, ypatingai bakteriofago DNR, svetima DNR gali būti suardyta prieš tai, kol ji bus pilnai metilinta. Restrikcijos-modifikacijos sistemos pagrindinė biologinė funkcija yra apsaugoti šeimininką nuo bakteriofagų infekcijos (Arber Science 205 : 361-365 (1979)). Yra taip pat galimos ir kitos funkcijos, tokios kaip dalyvavimas rekombinacijoje ir transpozicijoje (Carlson, et ai. Mol Microbiol, 27 : 671-676 (1998); Heitman, Genet Eng (N Y) 15 : 57-108 (1993); McKane, et ai . Genetics 139: 35-43 (1995)).

Žinomas maždaug 3000 restrikcijos endonukleazių specifiškumas daugiau negu 250 skirtingoms taikinio sekoms. Atradus pirmosios restrikcijos endonukleazės sekai specifinę prigimtį (Danna, etai., Proc Natl Acad Sci U S A68 : 2913-2917 (1971); Kelly, et ai ., J Mol Biol 51 : 393-409 (1970)), netrukus mokslininkai atrado, kad tam tikros restrikcijos endonukleazės skaldo sekas, kurios yra panašios, bet neidentiškos jų apibrėžtoms atpažinimo sekoms, esant neoptimalioms sąlygoms (Polisky, et ai ., Proc Natl Acad Sci U S A, 72 : 3310-3314 (1975); Nasri, et ai. , Nucleic Acids Res 14: 811-821 (1986)). Šis susilpnintas specifiškumas yra pavadintas restrikcijos endonukleazių žvaigždiniu aktyvumu.

Žvaigždinis aktyvumas yra molekulinės biologijos reakcijų problema. Žvaigždinis aktyvumas klonavimo vektoriuose arba kitoje DNR įveda nepageidaujamus kirpimus. Tokiuose atvejuose kaip teismo ekspertizė, kur tam tikras DNR substratas turi būti perkirptas restrikcijos endonukleaze, sukuriant unikalų individo DNR profilį („pirštų atspaudą“), žvaigždinis aktyvumas pakeičia skėlimo pobūdį, taip komplikuodamas analizę. Žvaigždinio aktyvumo išvengimas taip pat yra lemiamas tokiame pritaikyme, kaip grandinės nustūmimo amplifikacija (VValker, et ai.,

Proc Natl Acad Sci U S A, 89 : 392-396 (1992)) ir nuosekli genų raiškos analizė (Velculescu, et ai., Science 270 :484-487 (1995)).

IŠRADIMO SANTRAUKA

Išradimo įgyvendinime yra pateikiamas restrikcijos endonukleazių ir jų variantų tikslumo indekso (Fl) identifikavimo būdas, kuris apima reakcijos buferio ir DNR substrato, turinčio restrikcijos endonukleazės prisirišimo ir skėlimo vietą, parinkimą; sudarymą sąlygų vienodai praskiestai restrikcijos endonukleazei arba jos variantams perskelti DNR substratą; ir Fl nustatymą kiekvienai restrikcijos endonukleazei ir vienam arba daugiau jos variantų.

Jgyvendinimo būdas dar apima restrikcijos endonukleazių ir jų variantų Fl palyginimą, kad gautų pagerinimo faktorių, pvz., didesnį negu 2 kiekvienam variantui.

Išradimo įgyvendinime yra parinktas buferis, kuriame yra kalio acetatas, Tris acetatas ir magnio acetatas; arba magnio chloridas.

Papildomi įgyvendinimai apima:

(a) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 1, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš S36, K77, P154, E163, Y165 ir K185.

(b) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 2, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš K198 ir Q148.

(c) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 3, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš S15, H20, E34, M58, Q95, R106, K108, T181, R187 ir R199.

(d) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 4, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš D16, D148 ir E132.

(e) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 5, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš K75, N146 ir D256.

(f) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 6, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš E198 ir D200.

(g) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 7, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš K229, E025, R034 ir Q261.

(h) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 8, kurioje mutacijos padėtis yra K225.

(i) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 9, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš H137, D177, K363, K408, R411, Q215, Q226 ir Q230.

(j) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 10, kurioje mutacijos padėtis yra F376.

(k) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 11, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš R78, T140, E152, R199 ir F217.

(l) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 12, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš G26, P105, T195, Q210, Y147, Y193, K114, T197, S245, D252 irY027.

(m) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 13, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš H10, N208, K48, K74, R75, Y56, K58 ir M 117.

(n) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 14, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš K014, Q069, E099, R105, R117, G135 ir Y035.

(o) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 15, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš N106, Q169, E314 ir R126.

(p) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 16, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš T20, P52, Y67, K68, R75, E86, Q90, S91, Q93, H121 irG172.

(q) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 17 kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš E059, P065, S108, N172, K174, Q179, G182 irY055.

(r) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 18, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš N212 ir L213.

(s) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 19, turinčią mutaciją N65 padėtyje.

(t) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 20, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš E007, D011, E049, R073, R114, G137, S210 ir R213.

(u) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 21, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš P079, E086, H096 ir E218.

(v) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 22, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš E32, S081, G132, F60 ir S61.

(w) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 23, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš G013, G016, K018, P052, R053, K070, E071, D072, G073, S84, E086, R090, K094, R095, P099, P103, K113, N135, S151, P157, G173, T204, S206, K207, E233, N235, E237, S238, D241, K295, S301 ir S302.

(x) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 24, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš S64, S80, S162, T77/T96 ir N 178.

(y) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 25, kurioje R232 padėtis yra mutuota.

(z) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 26, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš S50, Y81, N93 ir W207.

(aa) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 27, turintį G26 mutaciją.

(bb) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 28, turintį E122/R132 mutaciją.

(cc) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 29, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš N016, S33, P36, H76, P87, N89, R90, T138, K141, K143, Q221, Q224, N253, Q292, R296, T152, G326 irT324.

(dd) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 30, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš K024, P214, E146, N251 ir Y095.

(ee) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 31, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš G075, Q099, G155, P022 ir R90.

(ff) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 32, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš S097 ir E125.

(gg) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 33, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš K021,1031 ir T120.

(hh) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 34, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš K7, T10, N1I, N14, Q232 ir T199.

(ii) Kompoziciją, apimančią: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 35, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš P92, P144, G197 ir M 198.

Bet kuri aukščiau esanti kompozicija dar gali būti charakterizuojama tuo, kad mutuotas fermentas iš anksto numatytame buferyje turi didesnį Fl, negu fermentas neturintis mutacijų iš anksto numatytame buferyje.

TRUMPAS FIGŪRŲ APRAŠYMAS

Figūrose 1A ir 1B parodytas Pvul-HF ir Pvul-VVT aktyvumo palyginimas.

Figūroje 1A žvaigždutės (*) ženklas žymi takelį kairėje (takelis 2), kur žvaiždinis aktyvumas daugiau neaptinkamas. Ženklas (#) žymi takelį dešinėje (takelis 8), kur įvyksta dalinis suskaldymas. Pradinė Pvul-VVT koncentracija buvo paskaičiuota 77 vienetai.

Figūroje 1B pilnas suskaldymas buvo stebimas iki 15 takelio, po kurio buvo stebimas žvaigždinis aktyvumas. Praskiedimo riba, įgalinanti pilną suskaldymą, buvo praplėsta nuo 6 praskiedimų iki 15 praskiedimų serijoje. Pradinė Pvul-HF koncentracija buvo paskaičiuota mažiausiai 9600 vienetų.

Figūrose 2A ir 2B parodytas HindiIl-HF ir HindiIl-WT aktyvumo palyginimas.

Figūroje 2A žvaigždutės (*) ženklas žymi takelį kairėje (takelis 9), kur žvaiždinis aktyvumas daugiau neaptinkamas. Ženklas (#) žymi takelį dešinėje (takelis 15), kur įvyksta dalinis suskaldymas. Pradinė HindiIl-WT koncentracija buvo paskaičiuota 9600 vienetų.

Figūroje 2B pilnas suskaldymas buvo stebimas iki 13 takelio, po kurio buvo stebimas žvaigždinis aktyvumas. Praskiedimo riba, įgalinanti pilną suskaldymą, buvo praplėsta nuo 6 praskiedimų iki 13 praskiedimų serijoje. Pradinė Hindlll-HF koncentracija buvo paskaičiuota mažiausiai 2400 vienetų.

Figūrose 3A ir 3B parodytas Dralll-HF ir Dralll-VVT aktyvumo palyginimas.

Figūroje 3A žvaigždutės (*) ženklas žymi takelį kairėje (takelis 12), kur žvaiždinis aktyvumas daugiau neaptinkamas. Ženklas (#) žymi takelį dešinėje (takelis

12), kur įvyksta dalinis suskaldymas. Nei žvaigždinio aktyvumo nei dalinio DNR suskaldymo nestebima. Pradinė Dralll-VVT koncentracija buvo paskaičiuota 1200 vienetų.

Figūroje 3B pilnas suskaldymas buvo stebimas iki 12 takelio, po kurio buvo stebimas žvaigždinis aktyvumas. Praskiedimo riba, įgalinanti pilną suskaldymą, buvo praplėsta nuo 6 praskiedimų iki 13 praskiedimų serijoje. Pradinė Dralll-HF koncentracija buvo paskaičiuota mažiausiai 1200 vienetų.

Figūrose 4A ir 4B parodytas Kpnl-HF ir Kpnl-WT aktyvumo palyginimas.

Figūroje 4A * ženklas žymi takelį kairėje (takelis 9), kur žvaiždinis aktyvumas daugiau neaptinkamas. Ženklas # žymi takelį dešinėje (takelis 13), kur įvyksta dalinis suskaldymas. Figūroje 1A pradinė Kpnl-WT koncentracija buvo paskaičiuota 2000 vienetų.

Figūroje 4B pilnas suskaldymas buvo nustatytas visą laiką be žvaigždinio aktyvumo arba dalinio skaldymo. Pradinė Kpnl-HF koncentracija buvo paskaičiuota didesnė negu 12000 vienetų.

Figūrose 5A ir 5B parodytas Styl-HF ir Styl-VVT aktyvumo palyginimas.

Figūroje 5A * ženklas žymi žvaigždinio aktyvumo pradžią kairėje (takelis 6), ženklas # žymi dalinio aktyvumo pradžią dešinėje (takelis 12). Pradinis Styl-VVT kiekis buvo paskaičiuotas 1000 vienetų.

Figūroje 5B žvaiždinis aktyvumas buvo nustatytas pirmuose 2 takeliuose ir dalinis skaldymas nuo 14 arba 15 takelio. Pradinis Styl-HF kiekis buvo paskaičiuotas 4000 vienetų.

Figūroje 6 parodytas Bgll-HF ir Bgll-VVT palyginimas ant pXba. Bgll-HF turi FI mažiausiai 8000, tuo tarpu Bgll-VVT turi FI 32, jeigu pagerinimo faktorius yra mažiausiai 250. Dešinėje schemoje pateiktas teorinis skaldymo modelis.

Figūroje 7 parodytas BsrDI-HF ir BsrDI-VVT palyginimas ant pBR322. BsrDIHFturi FI mažiausiai 1000 buferyje NEB4, tuo tarpu BsrDI-VVT turi ¹/z FI, pateikiant pagerinimo faktorių mažiausiai 2000. Dešinėje schemoje pateiktas teorinis skaldymo modelis.

Figūroje 8 parodytas Bcll-HF ir Bcll-VVT palyginimas buferyje NEB4 ant lambda (dam-). Bcll-HF turi FI mažiausiai 2000, tuo tarpu Bcll-VVT turi FI 32, pateikiant pagerinimo faktorių mažiausiai 64. Dešinėje schemoje pateiktas teorinis skaldymo modelis.

Figūroje 9 parodytas Bglll-HF ir Bglll-WT palyginimas ant pXba. Bglll-HF turi Fl mažiausiai 32000, tuo tarpu Bglll-WT turi Fl 16, pateikiant pagerinimo faktorių mažiausiai 2000. Dešinėje schemoje pateiktas teorinis skaldymo modelis.

Figūroje 10 parodytas BstEII-HF ir BstEII-WT palyginimas ant lambda DNR. BstEII-HF turi Fl mažiausiai 2000, tuo tarpu BstEII-WT turi Fl 4, pateikiant pagerinimo faktorių mažiausiai 500. Dešinėje schemoje pateiktas teorinis skaldymo modelis.

Figūroje 11 parodytas Sfil-HF ir Sfil-WT palyginimas ant pBC4. Sfil-HF turi Fl mažiausiai 8000 NEB4 buferyje, tuo tarpu Sfil-VVT turi Fl 64, pateikiant pagerinimo faktorių mažiausiai 120. Dešinėje schemoje pateiktas teorinis skaldymo modelis.

Figūroje 12 parodytas Smal-HF ir Smal-WT palyginimas ant pXba. Smal-HF turi Fl mažiausiai 256000, tuo tarpu Smal-WT turi Fl 64, pateikiant pagerinimo faktorių mažiausiai 4000. Dešinėje schemoje pateiktas teorinis skaldymo modelis.

Figūroje 13 parodytas BsmBI-HF ir BsmBI-VVT palyginimas ant lambda DNR. BsmBI-HF turi Fl 250 NEB4 buferyje, tuo tarpu BsmBI-WT turi Fl 4, pateikiant pagerinimo faktorių mažiausiai 64. Dešinėje schemoje pateiktas teorinis skaldymo modelis.

Figūroje 14 parodytas BstNI-HF ir BstNI-VVT palyginimas ant pBR322. BstNIHF turi Fl 500 NEB4 buferyje, tuo tarpu BstNI-VVT turi Fl 4, pateikiant pagerinimo faktorių mažiausiai 120. Dešinėje schemoje pateiktas teorinis skaldymo modelis.

Figūroje 15 parodytas Mlul-HF ir Mlul-VVT palyginimas ant lambda DNR. BstNI-HF turi Fl mažiausiai 32000 NEB4 buferyje, tuo tarpu Mlul-VVT turi Fl 32, pateikiant pagerinimo faktorių mažiausiai 120. Dešinėje schemoje pateiktas teorinis skaldymo modelis.

Figūroje 16 parodytas Nspl-HF ir Nspl-VVT palyginimas ant pUC19. Nspl-HF turi Fl mažiausiai 500 NEB4 buferyje, tuo tarpu Nspl-VVT Fl turi 32, pateikiant pagerinimo faktorių mažiausiai 16. Dešinėje schemoje pateiktas teorinis skaldymo modelis.

Figūroje 17 parodytas BsrFI-HF ir BsrFI-VVT palyginimas ant pBR322. BsrFIHF turi Fl mažiausiai 500 NEB4 buferyje, tuo tarpu BsrFI-VVT turi Fl 16, pateikiant pagerinimo faktorių mažiausiai 32. Dešinėje schemoje pateiktas teorinis skaldymo modelis.

DETALUS ĮGYVENDINIMU APRAŠYMAS

Restrikcijos endonukleazių mutantų su pagerintu specifiškumu vienai sekai sukūrimas nėra paprastas. Susiduriama su daugybe problemų, kaip sekančios: mutuotas fermentas turi sumažėjusį aktyvumą arba jo visai neturi, neturi sumažinto žvaigždinio aktyvumo arba faktiškai turi padidėjusį žvaigždinį aktyvumą. Be to, mutuotas fermentas negali būti klonuotas ir tokiu būdu negali būti analizuojamas.

Nesėkmė siekiant pagaminti mutantą gali įvykti dėl daugybės galimų priežasčių, įskaitant bet kurią iš sekančių. Tai gali įvykti dėl nesėkmingos atvirkštinės PGR. Gali būti, kad mutacija, sukelianti naują specifinį aktyvumą yra toksiška ląstelei šeimininkei, netgi jeigu ji vykdo giminingos metilazės raišką, esant sąlygoms, kurios įprastai yra saugios nemutuotos restrikcijos endonukleazės raiškai. Šiomis aplinkybėmis negali būti gaunamas gyvybingas mutantinis klonas. Be to mutantas gali turėti pirmenybę tam tikram buferiui, kad jeigu tiriama kitame buferyje, aktyvumas nenustatomas. Kitas sunkumas, su kuriuo susiduriama, yra tas, kad net jeigu paprastai tiriamas kiekvienos mutacijos neapdorotas lizatas ir lizate aktyvumas neaptikamas, laikant, kad bandymas neigiamas. Kai kuriais atvejais fermentas turi būti išgrynintas, kad būtų aptiktas aktyvumas.

Stebina tai, kad kai kuriuose pavyzdžiuose, prolino pakeitimas alaninu duoda variantus su norimu Fl truputį didesniu negu 250 ir duodančiu mažiausiai dvigubą pagerinimo faktorių. Tai pailiustruota Pvul, BamHI, Nrul ir Spel variantuose.

Kiti sunkumai didelio tikslumo mutantų gavime susiję su DNR, koduojančios kai kurias restrikcijos endonukleazes, dydžiu. Tokią DNR gali būti sunku amplifikuoti PGR metodu dėl didelio matricos dydžio. Be to, PGR produktai kai kuriomis aplinkybėmis lengvai nesitransfomuoja į naują šeimininką. Netgi jeigu transformacija į ląstelę šeimininkę bus sėkminga, transformuotos ląstelės ne visada duos kolonijas ir tuo būdu mutaciją bus nelengva aptikti. Kai kuriais atvejais, netgi jeigu po transformacijos kolonijos aptinkamos, jos negali būti kultivuojamos jokiomis sąlygomis.

Priežastys, mažinančios mutantų specifinį aktyvumą gali būti sekančios: mutacija sąveikauja su baltymo susilankstymu, kuris žymiai mažina raiškos lygį arba mutacija veikia specifinį fermento aktyvumą.

Pavyzdžiui, tai buvo nustatyta Styl mutantams: N34A, F35A, D58A, F65A,

K66A, K67A, F100A, N148A, E213A, F250A, T251A, D258A, D262A, N283A, R293A,

F294A, R295A, R296A, D298A, D299A, M304A, M310A, D318A, S337A, S346A ir

F371A.

Fermentinio aktyvumo praradimas gali įvykti dėl bet kurios sekančios priežasties, apimančios: mutacija pašalina liekanas, kurios yra svarbios katalizei; mutacijos pasėkoje pakeistos liekanos, kurios yra svarbios susilankstymui, taigi, klaidingai sulankstytas mutuotas baltymas yra neaktyvus.

Pavyzdžiui, tai buvo nustatyta Styl mutantams: M33A, D37A, F41A, D55A, D71A, N77A, R79A, E80A, F81A, T82A, E83A, F97A, F101A, E136A, VV137A, M138A, M 140A, K144A, Q145A, R151A, R255A, R259A, S261A, T264A, F278A, R281A, T284A, M297A, H305A, N306A, D314A, D338A ir E382A.

Didelio tikslumo mutantų sukūrimas reikalauja kruopštaus darbo. Yra atrenkama ir testuojama daugybė mutantų ir santykinai tik mažas skaičius rodo didelį tikslumą. Buvo neįmanoma numatyti ekstrapoliacijos metodu, kurie mutantai galimai rodys pagerintas savybes.

Bandymų, atliktų siekiant identifikuoti didelio tikslumo restrikcijos endonukleazių variantus, pavyzdžiai parodyti 1-17 figūrose. Figūrose parodyti ir laukinio tipo ir didelio tikslumo variantų rezultatai viename buferyje. Visose figūrose parodyti perskeltos DNR kiekiai ir tipai, po dviejų skiedimų serijos gelyje iš kairės į dešinę, fermento koncentracijai mažėjant trikampio kryptimi. Lentelėje 1 pavaizduoti 33 fermentų rezultatai. Pavyzdžiuose panaudoti restrikcijos endonukleazės reakcijos buferiai (1-4 buferiai) yra apibrėžti pvz. NEB kataloge (2009/10). Kiti buferiai gali būti parinkti pagal naudotojo teikiamą pirmenybę.

Bandymuose gautas FI yra didžiausios restrikcijos fermento koncentracijos, nerodančios akivaizdaus žvaigždinio aktyvumo, santykis kaip nustatyta esant juostoms, susijusioms su žvaigždiniu aktyvumu, su restrikcijos fermentų koncentracija, kuri pilnai suskaldo 1 pg standartinio DNR substrato 50-yje pi reakcijos per 1 valandą nustatytoje temperatūroje, standartiniuose NEB buferiuose. 6-17 figūrose yra uždėtas rėmelis, rodantis žvaigždinio aktyvumo juostas. Išradimo įgyvendinimuose FI yra pavyzdžiui geriau bent 250, pavyzdžiui didesnis negu 500, pavyzdžiui didesnis negu 1000, pavyzdžiui didesnis negu 5000.

Tikslumo pagerinimo reikšmė yra skaičiuojama kaip varianto Fl santykis padalintas iš nemutuoto fermento Fl. Išradimo įgyvendinime, pagerinimo reikšmė yra pavyzdžiui geriau bent 2, pavyzdžiui geriau bent 4, pavyzdžiui geriau bent 8, pavyzdžiui geriau bent 16.

Jgyvendinime Fl nurodomas didžiausio restrikcijos fermento kiekio, nerodančio akivaizdaus žvaigždinio aktyvumo, santykį su kiekiu, kuris pilnai suskaldo 1 pg standartinio DNR substrato 50-yje pi reakcijos per 1 valandą būdingoje temperatūroje, standartiniuose NEB buferiuose.

lentelė: HF fermentų savybių santrauka

Ferme ntas	Subst FIT FI2‘ FI3‘ FI4‘ Pvz. Si ratas N
Pvul-HF	pXba	£2000(1/8)	£16000(1)	£4000(¼)	> 16000(1)	1	1
Hindlll-HF	λ	£260000(½)	£260000(½)	£250(1/2000)	£520000(1)	2	2
Dralll-HF	λ	£120(1/16)	£1000(½)	£32(1/64)	£2000(1)	3	3
Kpnl-HF	pXba	>1000000(1)	21000000(1)	>30000(1/500)	>1000000(1)	4	4
Styl-HF	λ	2:4000(½)	2000(1)	>16(1/250)	4000(½)	5	5
BsaJI-HF	pBR322	21000(¼)	>4000(1)	24000(1)	>4000(1)	6	6
BsaWI-HF	pXba	8(1/64)	120(1)	>120(1))	>4000(1)	7	7
Bgll-HF	λ	24000(½)	28000(1)	2500(1/16)	28000(1)	8	8
BsrDI-HF	pBR322	>120(1/8)	2500(1)	264(1/16)	>1000(1)	9	9
Nsil-HF	pXba	^250(1/32)	21000(1/8)	>500(1/16)	£8000(1)	10	10
Dpnll-HF	λ(-)	4000(¼)	2000(1/8)	64(1/128)	8000(1)	11	11
Bcll-KF	λ(-)	2250(1/32)	2500(¼)	>32(1/64)	22000(1)	12	12

Bglll-HF	pXba	28000(1/8)	>128000(1)	2000(½)	232000(%)	13	13
BstEII-HF	λ	>64(1/32)	21000(½)	232(1/64)	>2000(1)	14	14
Banll-HF	λ(-)	24000(1)	22000(½)	2500(1/8)	22000(½)	15	15
RspGI-HF	pBC4	21000(%)	24000(1)	>4000(1)	24000(1)	16	16
Spel-HF	T7	2:4000(½)	>250(1/8)	2120(½)	21000(1)	17	17
BsmAI-HF	FX174	>4000(1)	22000(½)	2500(1/8)	24000(1)	18	18

BstXI-HF	λ	2500(½)	21000(1)	>500(1/2)	21000(1)	19	19
Sfil-HF	pBC4	250(½)	21000(1/8)	232(1/250)	28000(1)	20	20
Pmel-HF	pXba	>2000(1/8)	2500(1/16)	232(1/250)	28000(1)	21	21
Smal-HF	pXba	>2000(1/500)	>32000(1/32)	232(1/32000)	2256000(1)	22	22
Aatll-HF	pXba	NC	NC	NC	21000(1)	23	23
Apol-HF	pXba	22000(½)	24000(1)	21000(%)	22000(½)	24	24
BsmBI-HF	λ	32(½)	120(½)	>120(%)	250(1)	25	25
Bmtl-HF	pXba	25600(%)	25600(%)	2000(1/500)	1000000(1)	26	26
BstNI-HF	pBR322	2120(½)	2500(1)	2120(%)	500(1)	27	27
Mlul-HF	λ	216000(½)	232000(1)	22000(1/16)	>32000(1)	28	28
Banl-HF	λ	21000(½)	>250(1/8)	>250(1/8)	22000(1)	29	29
Kasl-KF	pBR322	28000(½)	216000(1)	22000(1/8)	216000(1)	30	30
Nrul-HF	λ	>64(1/250)	>1000(1/16)	>100(1/16)	>16000(1)	31	31

Nspl-HF	pUC19	24000(1)	500(1)	2250(1/8)	500(1)	32	32
BsrFI-HF	pBR322	2500(1)	264(1/8)	>100	2500(1)	33	33

Skiedikliai (Dil) A, B ir C ir 1-4 buferiai yra apibrėžti 2009/10 NEB kataloge, 87 psl.

Visos šioje paraiškoje pacituotos nuorodos, kaip ir US laikinosiose paraiškose, paduotose 2010 m. vasario 5 d, Nr. 61/301666 ir 2010 m. rugsėjo 29 dieną, Nr. 61/387800, yra įtrauktos į šią paraišką su nuoroda j minėtas paraiškas.

PAVYZDŽIAI

Pavyzdys 1: Didelio tikslumo (HF) Pvul konstravimas

1. Pvul raiška

Pvul raiška buvo vykdoma E.coli, transformuotose pUC19-PvulR ir pACYC184-Pvul-M, kiekviena iš kurių turi Pvul endonukleazės ir metilazės genus. Ląstelės buvo auginamos prie 30 °C per naktį LB terpėje su Amp ir Cam.

2. Pvul-HF mutagenezė

Visos Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr liekanos buvo pakeistos j Ala padėtyse 7, 8,11, 12,16,17, 20, 21, 22, 23, 26, 28, 29, 30, 31, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 46, 48, 49, 53, 55, 57, 59, 61,63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 72, 73, 77, 78, 80, 81, 82, 87, 88, 90, 92, 93, 96, 97, 101, 102, 104, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 115, 116, 119, 120, 121, 122, 126, 127, 129, 131, 132, 135, 138, 139, 144, 146,

147, 148, 150, 151, 152, 154, 155, 157, 158, 160, 161, 162, 163, 167, 169, 170, 172,

173, 174, 178, 180, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 189, 192, 194, 195, 196, 201, 202,

203, 205, 206, 210, 211, 214, 215, 218, 219, 220, 221, 226, 230, 231, 232, 233, 235,

236,238, 239, 240, 241,246, 247,248, 249,251,253, 254; tuo tarpuTyr buvo pakeista j Phe padėtyse 18, 52, 56, 84, 91, 130, 143, 165, 204, 242.

Mutagenezė buvo atlikta inversnės PGR metodu su poriniais pradmenimis ir po to sekančiu skaldymu Dpnl. Produktas buvo transformuotas į E.coli ER2683 kamieną.

3. Pvul-HF atranka

Pvul-HF atranka buvo atlikta naudojant NEB3 ir NEB 4 (New England Biolabs,

Ine., Ipswich, MA (NEB) aktyvumo palyginimą, naudojant pXba DNR kaip substratą. Pvul-WT turėjo didesnį aktyvumą NEB3. Buvo atrinktas pvz. su didesniu NEB4 aktyvumu. Buvo rasti 6 mutantai turintys didesnį aktyvumą NEB4: S36A, K77A, P154A, E163A, Y165F ir K185A. P154A turėjo daug didesnį aktyvumą, negu WT NEB4. Paprastai, mutantas su didesniu aktyvumu NEB4 buferyje buvo mutantas su pagerintu žvaigždiniu aktyvumu. Pvul(P154A) buvo pavadintas Pvul-HF. Tai buvo pirmas kartas, kai buvo efektyvi mutacija proliną pakeitus į alaniną.

4. Pvul-HF gryninimas

Du litrai EK2683(pUC19-Pvul(P154A), pACYC184-PvulM)) ląstelių buvo auginama LB terpėje su 100 pg/ml Amp ir 33 pg/ml 30 °C per naktį. Ląstelės surenkamos ir veikiamos ultragarsu 20-yje ml Tris-HCI, kurio pH 7,5 ir 50 mM NaCI. Po 30 min centrifugavimo prie 15000 rpm, supernatantas švirkštu buvo įleistas į 5 ml HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine., Piscatavvay, NJ), iš anksto subalansuotą su tuo pačiu buferiu. Į kolonėlę įleidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-IM NaCI linijinis gradientas ir po to 10 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1M NaCI. Buvo tiriamas eliuuotų frakcijų aktyvumas. Didesnio aktyvumo frakcijos buvo toliau koncentruojamos Vivaspin® 15R (Vivascience, now Sartorius Vivascience GmbH, Goettingen, Germany) ir laikomos glicerine prie -20 °C.

5. Pvul-HF ir Pvul-WT palyginimas

Pvul-HF ir Pvul-VVT Fl buvo nustatyti atskirai ant pXba DNR keturiuose NEB buferiuose, su B skiedikliu. Palyginimas parodytas 1 figūroje, rezultatai pateikti lentelėje 2 (žemiau).

Lentelė 2: Pvul-HF ir Pvul-VVT palyginimas

Buferis	Pvul-HF	Pvul-VVT
Aktyvumas	Fl	Aktyvumas	Fl	Pagerinimo faktorius
NEB1	12,5%	>2000	6,3 %	32	>64
NEB2	100%	>16000	25%	32	£500
NEB3	25%	>4000	100%	32	>125
NEB4	100%	>16000	12,5%	32	>500

Pvul-HF geriausią aktyvumą rodė NEB2 ir NEB4 buferiuose, kur Fl buvo >16000; WT Pvul geriausias aktyvumas buvo NEB3 buferyje, kur Fl buvo 32. Taigi, bendras pagerinimo faktorius buvo >16000/32 = £500.

Pavyzdys 2: HF Hindlll konstravimas

Hindlll atpažįsta ir skaldo A/AGCTT, kaip aprašyta Tarptautinės publikacijos Nr. VV02009/009797 21-ame pavyzdyje. Hindlll(K198A) mutantas buvo atrinktas kaip Hindlll HF versija. Tolimesnis šio mutanto charakterizavimas atskleidžia, kad netgi jeigu Hindlll(K198A) elgesys vienos valandos skalėje yra puikus, tačiau jis nėra puikus skaldyme per naktį. Tuo tarpu didesnio skaičiaus mutantų paieška parodė, kad Hindlll(Q148A) taip pat yra dalinai geras. Sekantis žingsnis tolesnio pagerinimo kryptimi buvo alanino pakeitimas kita aminorūgšties liekana. Tarp kitų, Hindlll(Q148I) pasirodė puikiai ir vienos valandos skaldyme ir skaldyme per naktį ir jis pavadintas Hindlll-HF (Figūra 2).

Hindlll-HF raiška buvo vykdoma ER3081(puC19-Hindlll(Q148l)M). Auginimo ir gryninimo metodai buvo atliekami pagal VVO/2009/009797.

Sekančioje lentelėje (Lentelė 3) palyginama Hindlll-HF ir Hindlll-VVT Fl.

Lentelė 3: Hindlll-HF ir Hindlll-VVT palyginimas

Buferi s	Hindlll-HF	Hindlll-VVT
Aktyvu mas	Fl	Aktyvu mas	Fl	Pagerinimo faktorius
NEB2	100%	£ 16000	25%	32	£500
NEB3	25%	Ž 4000	100%	32	Ž125
NEB4	100%	£ 16000	12.5%	32	>500

Geriausias Hindlll-HF aktyvumas buvo NEB4 buferyje; Hindlll-HF Fl NEB4 buvo >520000; Hindlll-VVT geriausias aktyvumas buvo NEB2 buferyje. Hindlll-VVT Fl NEB2 buferyje buvo 250. Taigi bendras pagerinimo faktorius buvo £2000.

Pavyzdys 3: HF Dralll konstravimas

1. Dralll raiška

Dralll atpažįsta ir skaldo CACNNN/GTG. Dralll raiška buvo vykdoma E.coli ER3081 ląstelėse su plazmidėmis pAGR3-DralllR() ir pACYC-DralllM(). Ląstelės buvo auginamos prie 37 °C per naktį LB terpėje su Amp ir Cam.

2. Dralll mutagenezė

Dralll baltymo ilgis yra 227 aminorūgštys. Pradžioje buvo numatytas mutuoti j Ala (arba Phe) bendras 132 aminorūgščių saitas. Cys, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Gly ir Trp buvo mutuotos j Ala. Try buvo mutuota j Phe. Tai buvo: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 28, 29, 31,32, 34, 35, 37, 40,

42, 43, 44, 45, 47, 51, 54, 55, 57, 58, 59, 60, 64, 65, 66, 67, 68, 72, 73, 74, 76, 77, 82,

83, 84, 88, 89, 90, 91,93, 94, 95, 96, 99, 101, 102, 104, 106, 107, 108, 111, 112, 113,

114, 115, 117, 120, 121, 123, 124, 127, 128, 130, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142,

144, 145, 146, 147,150, 154, 155, 156, 157, 158, 160, 161, 165, 167, 169, 170, 171,

172, 173, 175, 176, 180, 181, 183, 184, 185, 187, 189, 190, 192, 193, 196, 198, 199,

200, 201, 202, 205, 207, 208, 209, 211, 212, 213, 214, 216, 217, 218, 219, 22 ir 223.

Atrinktų mutantų taškinė mutagenezė buvo atlikta atvirkštinės PGR metodu. PGR reakcija buvo vykdoma 100 pi reakcijos tūryje, esant 2 μΙ kiekvieno PGR pradmens, 1 μΙ pAGR3-DralllR, 400 μΙ dNTP, 4 vienetus Deep Vent™ DNA polimerazės (NEB), ir 10 ui 10Χ Thermopol buferio su papildomu vandens kiekiu.

PGR reakcijos sąlygos buvo 94 °C, 5 min, 25 ciklai prie 94 °C 30 s, 55 °C 60 s, 72 °C 4 min ir paskutinis prailginimo laikas prie 72 °C 7 min. PGR produktas buvo skaldomas 20 vienetų Dpnl 1 valandą. Suskaldytas produktas buvo transformuojamas į E. coli ER3081(pACYC-DralllM).

3. Dralll-HF atrinkimas

Kiekvienos mutacijos keturios kolonijos buvo užaugintos LB terpėje su Amp ir Cam 37 °C per naktį. Standartiniai ir žvaigždinio aktyvumo Dralll tyrimai buvo atlikti naudojant pXba kaip substratą NEB4 buferyje ir 10 % glicerolj.

Mutantai S15A, H20A, E34A, M58A, Q95A, R106A, K108A, T181A, R187A, R199A, N202D, T181G, T181N, T181Q, T181C, T181V, T181L, T181I, T181M, D55A, D55S, D55C, D55G, D55N, T12A, H20A, E34A, H45A, T57A, M58A, T60A, S66A,

R76A, F90A, M94A, T101A, C115A, F169A, N172A, R173A, H189A, N193A ir

O95A/K104A buvo atrinkti atrankos bandymuose. Po keleto palyginimo skirtingose sąlygose su skirtingais substratais ciklų, buvo surasta, kad Dralll(T181 A) yra pageidaujamas mutantas, išlaikantis aukštą skaldymo aktyvumą, bet turintis iš esmės sumažintą žvaigždinį aktyvumą. Dralll(T181 A) buvo pažymėtas Dralll-HF.

4. Dralll-HF ir Dralll-WT palyginimas

Dralll-WT ir Dralll-HF(T181 A) baltymai buvo išgryninti, panaudojant hepariną ir Source 15S kolonėlę. Detalaus palyginimo bandymo sąlygos buvo sekančios: NEB4 (arba NEB1, 2, 3), 37 °C, Ih; 2 yl išgryninto baltymo 20 μΙ reakcijos sistemos; lambda DNR kaip substratas. Palyginimas parodytas figūrose 3A ir 3B, ir rezultatai išdėstyti lentelėje 4.

Lentelė 4: Dralll-HF ir Dralll-WT palyginimas

Buferis	Dralll- HF(T181A)	Dralll-WT	Pagerinimo faktorius
Aktyvu mas	Fl	Aktyvu mas	Fl
Buferis 1	6,25 %	>120	16%	16	>8
Buferis 2	50%	>1000	100%	2	>500
Buferis 3	1,56%	>32	50%	2	>16
Buferis 4	100%	>64000	50%	0,5	>128000

Dralll-HF turi didžiausią aktyvumą NEB4, kuriame Fl buvo mažiausiai 64000; Dralll-WT turi didžiausią aktyvumą NEB2, kuriame Fl yra 2. Bendras Fl pagerinimo faktorius buvo mažiausiai 32000-kartinis.

Pavyzdys Nr.4: HF Kpnl konstravimas

Kpnl atpažįsta ir skelia GGTAC/C kaip aprašyta tarptautinės publikacijos Nr. VV02009/009797 pavyzdyje Nr. 26. Trigubas mutantas Kpnl(D16N/E132A/D148E) buvo atrinktas kaip Kpnl didelio tikslumo versija. Kadangi D148E ir E132A buvo įvestos vietos specifinės mutagenezės metodu, D16N buvo įvesta PGR metodu. Tolimesnis šio trigubo mutanto mutacijų charakterizavimas parodė, kad E132A pašalinimas toliau pagerina restrikcijos fermentą, ypatingai fermento specifinio aktyvumo aspektu. Trigubas mutantas Kpnl(D16N/E132A/D148E) turi 200000 vienetų/mg baltymo specifinį aktyvumą, tuo metu Kpnl(D16N/D148E) turi 1800000 vienetų/mg baltymo specifinį aktyvumą. Dvigubas mutantas yra 9 kartus aktyvesnis, negu ankstesnis trigubas mutantas, taigi dvigubas mutantas Kpnl(D16N/D148E) buvo pavadintas KpnlHF.

Kpnl-HF raiška buvo vykdoma ER2523(pAGR3-Kpnl(D16N/D148E), pSYX20KpnlM). Auginimo ir gryninimo metodai buvo atliekami pagal VVO/2009/009797.

Sekančioje lentelėje (Lentelė 5) palyginami Kpnl-HF ir Kpnl-WT Fl.

Lentelė 5: Kpnl-HF ir Kpnl-WT palyginimas

Buferis	Kpnl-HF	Kpnl-WT	Pagerinimo faktorius
Santykinis aktyvumą s	Fl	Santykini s aktyvumą s	Fl
NEB1	100%	21,000,000	100%	16	62,500
NEB2	100%	21,000,000	25%	16	62,500
NEB3	0.2%	230,000	6%	8	3,750
NEB4	100%	21,000,000	50%	4	250,000

Kpnl-WT turėjo geriausią aktyvumą NEB1, Kpnl-WT Fl NEB1 buvo 16; KpnlHF turėjo geriausią aktyvumą NEB1, NEB2 ir NEB4 buferiuose. Kpnl-HF Fl šiuose trijuose buferiuose buvo visų didžiausias £1000000. Bendras pagerinimo faktorius buvo £62500.

Pavyzdys Nr,5: HF Stvl konstravimas

1. Styl raiška

Styl atpažįsta ir skaldo C/CVVVVGG. Styl raiška buvo vykdoma E. coli (ER2833) su pACYC-StylM ir placzz-StylR plazmidėmis. Ląstelės buvo auginamos 37 °C per naktį LB terpėje su Amp ir Cam.

2. Styl mutagenezė

Atrinktų mutacijų taškinė mutagenezė buvo atlikta su atvirkštinės PGR metodu. Styl buvo atliktos 237 aminorūgščių mutacijos sekančiai: Cys, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Trp buvo mutuotos į Ala. Tyr buvo mutuotas į Phe. Tai buvo padėtyse: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 22, 23, 24, 25, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 43, 49, 51, 52, 53, 54, 57, 58, 59, 61,62, 64, 65, 66, 69,

70, 73, 75, 76, 78, 79, 80, 81, 82, 85, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103,

104,	105, 106,	109, 111,	112,	114, 116,	118,	119,	122, 123,	124,	125, 126, 128,	129,
130,	131, 135,	136, 137,	139,	140, 141,	142,	143,	144, 145,	146,	147, 150, 151,	152,
153,	155, 157,	158, 159,	163,	164, 165,	166,	167,	170, 172,	173,	175, 176, 177,	178,
181,	183, 187,	188, 192,	193,	194, 195,	196,	200,	203, 204,	205,	207, 209, 211,	212,
213,	214, 216,	218,219,	220,	221, 222,	227,	229,	230, 232,	234,	235, 236, 237,	238,
239,	241, 242,	245, 247,	248,	249, 250,	252,	253,	254, 256,	257,	258, 259, 260,	261,
263,	266, 267,	269, 272,	274,	277, 280,	282,	283,	, 284, 286,	288,	, 289,291, 292,	293,
294,	295, 296,	297, 298,	303,	304, 305,	307,	308,	309, 313,	317,	318, 319, 320,	323,
324,	326, 327,	329, 331,	335,	336, 337,	339,	340,	343, 345,	346,	347, 349, 350,	351,
353,	355, 356,	359, 360,	361,	363, 365,	366,	368,	369, 370,	372,	373, 376, 377,	379,

381 ir 382.

Pradmenų projektavimo (design) ir PGR metodai gali būti atliekami kaip aprašyta ir paskelbta PCT paraiškoje VV02009/0029376 (Pavyzdys Nr. 1). PGR produktas buvo skaldomas Dpnl ir transformuotas j kompetentines ląsteles ER2833(pACYC-StylM0.

3. Styl-HF atranka

Kiekvienos mutacijos keturios kolonijos buvo auginamos LB terpėje su Amp ir Cam 37 °C per naktį. Giminingo aktyvumo ir žvaigždinio aktyvumo bandymai buvo atliekami naudojant lambda DNR NEB4 ir Exol buferyje bei 20 % glicerolį atitinkamai.

K75, N146A ir D256A mutantai buvo atrinkti atrankos bandymo metu. Po keleto palyginimo ciklų skirtingose sąlygose ir substratuose, K75A buvo rastas kaip geriausias mutantas, išlaikantis didelį skaldymo aktyvumą, bet rodantis iš esmės žemą žvaigždinį aktyvumą. Styl(K75A) buvo pažymėtas kaip Styl-HF.

4. Styl-HF ir Styl-WT palyginimas

Styl-HF ir Styl-VVT palyginimas NEB4 buferyje parodytas 5A ir 5B figūrose ir rezultatai išdėstyti 6-oje lentelėje.

Lentelė 6: Styl-HF ir Styl-VVT palyginimas

Buferis	Hindlll-HF	Hindlll-VVT	Pagerini mo faktorius
Santykinis aktyvumas	Fl	Santykinis aktyvumas	Fl

NEB1	50%	>400 0	25%	32	>125
NEB2	100%	2000	100%	16	125
NEB3	0,4 %	>16	50%	32	>0,5
NEB4	50%	4000	25%	16	250

Styl-WT ir Styl-HF turėjo geriausią aktyvumą NEB2. Styl-VVT FI buvo 16 ir StylHF - buvo 2000. Bendras FI pagerinimo faktorius buvo 125.

Pavyzdys 6: H F BsaJI konstravimas

1. BsaJI raiška

BsaJI raiška buvo vykdoma E.coli, transformuotose pRRS-BsaJIR+M, kuri turi BsaJI endonukleazės ir metilazės geną toje pačioje plazmidėje. Ląstelės buvo auginamos prie 37 °C per naktį LB terpėje su Amp ir Cam.

2. BsaJI-HF mutageneze

Visos liekanos Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Phe, Trp buvo pakeistos į Ala padėtyse 9, 10, 14, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 27, 30, 32, 35, 39, 42, 43, 48, 50, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 60, 61,65, 66, 67, 68, 70, 71,72, 73, 78, 79, 81, 83, 84, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 104, 106, 110, 111, 113, 114, 117, 119, 120, 121, 123, 127, 129, 131, 132, 134, 136, 138, 140, 141, 142, 147, 152,

153, 157, 158, 159, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 175, 178, 181, 183, 184, 185,

186, 187, 188, 189, 194, 196, 197, 198, 199, 200, 202, 203, 204, 206, 211, 212, 213,

214, 215, 216, 218, 220, 222, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 233, 238, 239, 240,

241, 246, 247, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 257, 260, 262, 265, 267, 268, 269,

270, 271, 273, 274, 276, 277, 280, 281, 282, 283, 285, 287, 288, 290, 291, 293, 294,

295, 298 ir 299; tuo tarpu, Tyr yra pakeistas į Phe padėtyse 21, 59, 62, 77, 89, 105, 130, 191, 208, 272, 286 ir 296.

Mutageneze buvo atlikta atvirkštinės PGR su poriniais pradmenimis metodu ir po to sekančiu skaldymu Dpnl. Apdorotas produktas buvo transformuotas j E.coli ER3081 kamieną.

3. BsaJI-HF atrinkimas

BsaJI-HF atrinkimas buvo atliekamas naudojant BEB3 ir NEB4 palyginimą ir naudojant pBR322 DNR kaip substratą. E198A ir D200A turi didžiausią aktyvumą.

D200A turėjo NEB4 buferyje žymiai mažesnį žvaigždinį aktyvumą, negu WT.

BsaJI(D200A) yra pavadintas BsaJI-HF.

4. BsaJI-HF gryninimas

Du litrai ląstelių ER3081 (pRRS-BsaJIR(D200A)+M) buvo auginama LB terpėje su 100 pg/ml Amp, 33 pg/ml Cam ir 0,5 mM IPTG prie 37 °C per naktį. Ląstelės buvo surinktos ir veikiamos ultragarsu 50-yje ml 10mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI. Po 30 minučių centrifugavimo prie 15000 rpm, supernatantas švirkštu buvo leidžiamas į 5 ml HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine., Piscataway, NJ), iš anksto subalansuotą su tuo pačiu buferiu. Į kolonėlę įleidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-1M NaCI linijinis gradientas ir po to 10 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5,1M NaCI. Po to testuotas eliuuotų frakcijų aktyvumas. Frakcijos, turinčios didžiausią aktyvumą buvo toliau koncentruotos Amicon® Ultra 30KDa (Millipore, U.S. A; dabar Merck, Germany). J koncentruotą BsaJI-HF buvo pridėtas toks pat tūris glicerolio ir laikoma -20 °C.

5. BsaJI-HF ir BsaJI-WT palyginimas

BsaJI-HF ir BsaJI-WT Fl buvo nustatyti ant pBR322 DNR atskirai keturiuose NEB buferiuose su A skiedikliu. Rezultatai išdėstyti lentelėje 7.

Lentelė 7: BsaJI-HF ir BsaJI-VVT palyginimas

Buferis	BsaJI-HF	BsaJI-VVT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	Fl	Aktyvumas	Fl
NEB1	25%	£1000	100%	64	£15
NEB2	100%	£4000	100%	64	£60
NEB3	100%	£4000	25%	16	£250
NEB4	100%	£4000	100%	64	£60

BsaJI-HF geriausiai veikė NEB2, 3 ir 4, kuriuose Fl buvo £4000; BsaJI-VVT geriausiai veikė NEB1, 2 ir 4, kuriuose Fl buvo 64. Taigi NEB4 pagerinimo faktorius buvo £4000/64 £64.

Pavyzdys 7: H F BsaVVl konstravimas

1. BsaVVl raiška

BsaVVl raiška buvo vykdoma E.coli, transformuotose pLacZZI-BsaVVIR ir pACYC-MspIM, kurių kiekviena turi BsaVVI endonukleazės ir metilazės geną. Ląstelės buvo auginamos 30 °C per naktj LB terpėje su Amp ir Cam ir indukuotos 30 °C su 0,5 mM IPTG 18 valandų.

2. BsaWI-HF mutagenezė

Visos liekanos Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr buvo pakeistos į Ala padėtyse 9, 10, 13, 16, 17, 18, 20, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 34, 35, 36, 39, 42, 43, 45, 46, 48, 51, 54, 58, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 69, 70, 71,74, 75, 78,

80, 81, 82, 84, 85, I	B6, 88, 89,	92, 93, 96, 99, 100, 101,	102,	104, 105,	107,	109,	113,
114,	115, 117, 121,	, 112, 123,	124,	127, 128, 129, 130,	131,	133, 136,	137,	138,	140,
141,	142, 145, 149,	, 151, 152,	153,	154, 155, 156, 160,	163,	164, 165,	166,	167,	169,
170,	171, 173, 174,	, 175, 176,	177,	178, 179, 181, 184,	189,	195, 196,	197,	200,	202,
203,	209, 210, 211,	, 212, 213,	214,	216,218,219, 221,	222,	228, 229,	230,	231,	233,

234, 237, 239, 241,243, 247, 248, 250, 251,254, 255, 258, 259, 260, 261,264, ir 266; o Tyr yra pakeista j Phe padėtysell, 57, 106, 147, 157, 215, 224, 236 ir 265.

Mutagenezė buvo atlikta atvirkštinės PGR metodu su poriniais pradmenimis ir po to sekančiu skaldymu Dpnl. Apdorotas produktas buvo transformuotas j E.coli ER3081 kamieną.

3. BsaWI-HF atranka

BsaVVI-HF atranka buvo atlikta, panaudojant aktyvumo palyginimą NEB3 ir NEB4 buferiuose, naudojant lambda DNR kaip substratą. Sekantys mutantai rodė pakeitimus: K229A, E025A, R034A ir Q261A. BsaWI-WT gali pilnai suskaldyti abiejuose buferiuose, jeigu auginama mažoje kultūroje; buvo pastebėta, kad Q261A davė tik stabilų dalinį vaizdą. Tai galėjo būti tik dėl to, kad mutantas blogai augo mažoje kultūroje. Jeigu auginama didelėje kultūroje ir išgryninama, dalinis vaizdas buvo pašalintas ir substratas suskaldytas pilnai ir rezultatas buvo patvirtintas didelio tikslumo mutantu, jeigu buvo testuojama ant pXba substrato.

4. BsaWI-HF gryninimas

Du litrai ER3081 (pLacZZI-BwaWI(Q261A), pACYC-MspIM)) buvo auginamos 30 °C per naktį LB terpėje su 100 pg/ml Amp ir 33 pg/ml. Po 8 vai. kultūra buvo indukuota 0,5 mM IPTG. Ląstelės buvo surinktos ir veikiamos ultragarsu 20 ml TrisHCI, pH 7,5, 50 mM NaCI. Po centrifugavimo prie 15000 rpm 30 min supernatantas buvo įleistas į 5 ml HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine.,

Piscatavvay, NJ), iš anksto subalansuotą su tuo pačiu buferiu. į kolonėlę įleidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-1M NaCl linijinis gradientas ir po to 10 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5,1M NaCl. Po to testuotas eliuuotų frakcijų aktyvumas. Frakcijos, turinčios didžiausią aktyvumą buvo toliau koncentruotos Vivaspin® 15R (Vivascience, dabar Sartorius Vivascience GmbH, Goettingen, Germany). Į koncentruotą BsaVVI-HF buvo pridedamas lygus tūris glicerolio ir laikomas -20 °C.

5. BsaVVI-HF ir BsaWI-WT palyginimas

BsaWI-HF ir BsaWI-WT Fl buvo nustatyti atskirai keturiuose NEB buferiuose ant pXba DNR, su A skiedikliu. Rezultatai išdėstyti 8 lentelėje (žemiau).

Lentelė 8: BsaVVI-HF ir BsaWI-WT palyginimas

Buferi s	BsaVVI-HF	BsaWI-WT	Pagerini mo faktorius
Santykinis aktyvumas	Fl	Santykinis aktyvumas	Fl
NEB1	1,6%	8	12,5%	4	2
NEB2	100%	120	50%	8	£15
NEB3	3,1 %	£250	3,1 %	64	£4
NEB4	100%	£4000	100%	16	£250

BsaVVI-HF didžiausią aktyvumą rodė NEB2 ir NEB4 buferiuose, kur geriausias Fl yra £4000; BsaVVI-VVT didžiausią aktyvumą rodė NEB4, kur Fl yra 16. Bendras pagerinimo faktorius yra £4000/16=~250.

Pavyzdys 8: Didelio tikslumo Bgll konstravimas

1. Bgll raiška

Bgll raiška buvo vykdoma E.coli, transformuotose pUC19-BgllR ir pSYX20Bgll-M, kiekviena turi Bgll endonukleazės ir metilazės geną. Ląstelės buvo auginamos prie 37 °C per naktį LB terpėje su Amp ir Kan.

2. Bgll-HF m u ta genezė

Visos liekanos Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr buvo pakeistos į Ala padėtyse 7, 8,12,14, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 31, 34, 36, 39, 40, 43, 44,45, 46 47, 48, 50, 52, 54, 5, 57, 60, 61, 65, 67, 68, 70, 71, 72,

73, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 84, 86, 87, 88, 91, 92, 94, 95, 96, 99, 100, 101, 102, 103,

105, 107, 108, 110, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 122, 123, 124, 125, 128, 130,

131, 132, 134, 135, 136, 152, 158, 159, 160, 161, 163, 164, 165, 166, 167, 170, 172,

173, 174, 176, 177, 178, 179, 180 181, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 193, 194,

196, 197, 202, 203, 204, 205, 208, 211, 215, 216, 221, 222, 224, 225, 226, 227, 228,

229, 230, 231, 234, 236, 239, 241, 242, 243, 245, 249, 250, 251, 255, 256, 259, 263,

264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 275, 276, 277, 279, 281283, 286, 287, 289, 290, ir 291 ; o Tyr yra pakeistas j Phe padėtyse 19, 13, 33, 53, 66, 119, 127, 153, 199,218, 233, 252 ir 258.

Mutagenezės metodai buvo atvirkštinė PGR su poriniais pradmenimis ir po to sekančiu skaldymu Dpnl. Apdorotas produktas buvo transformuotas j E.coli ER2566 kamieną.

2. Bgll-HF atrinkimas

Bgll-HF atranka buvo vykdoma naudojant aktyvumo palyginimą NEB4 buferyje, naudojant lambda DNR kaip substratą. Bgll-WT turi žemą aktyvumą NEB4, nei vienas mutantas su panašiu ar didesniu aktyvumu kaip WT NEB4 buferyje nebuvo atrinktas, tuomet jie buvo tikrinami prieš su gliceroliu, dėl žvaigždinio aktyvumo lygio palyginimo. Tik vienas mutantas K225A rodė panašų aktyvumą kaip WT NEB4 buferyje, o taip pat mažėjantį žvaigždinį aktyvumą, kai tiriama glicerolyje. Bgll(K225A) yra pavadintas Bgll-HF.

3. Bgll-HF gryninimas

Du litrai ląstelių EK2566(pUC19-Bgll(K225A), pSYX20-BgllM) buvo auginama LB terpėje su 100 pg/ml Amp ir 33 pg/ml Kan at 37 °C per naktį. Ląstelės buvo surenkamos ir veikiamos ultragarsu 20 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI. Po centrifugavimo prie 15,000 rpm 30 minučių supernatantas buvo įleistas į 5ml HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine., Piscatavvay, N J) iš anksto subalansuotą su tuo pačiu buferiu. į kolonėlę įleidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM TrisHCI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-IM NaCI linijinis gradientas ir po to 10 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1M NaCI. Buvo tiriamas eliuuotų frakcijų aktyvumas. Didesnio aktyvumo frakcijos dar buvo koncentruotos Vivaspin® 15R (Vivascience, dabar SartoriusVivascience GmbH, Goettingen, Germany). Į koncentruotą Bgll-HF buvo pridedamas lygus tūris glicerolio ir saugomas prie -20 °C.

4. Bgll-HF ir Bgl-WT palyginimas

Bgll-HF ir Bgl-VVT Fl buvo nustatyti atskirai ant lanbda DNR keturiuose NEB buferiuose su B skiedikliu. Palyginimas parodytas figūroje 6 ir rezultatai išdėstyti lentelėje 9 (žemiau).

Lentelė 9: Bgll-HF ir Bgll-WT palyginimas

Buferis	Bgll-HF	Bgll-VVT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	Fl	Aktyvumas	Fl
NEB1	50%	>4000	25,0 %	64	>62
NEB2	100%	>8000	100%	64	>125
NEB3	6,3 %	>500	100%	250	>2
NEB4	100%	>8000	50%	32	>250

Bgll HF didžiausią aktyvumą rodė NEB2 ir NEB4 buferiuose, kuriuose Fl buvo £8000; Bgll-VVT aktyviausias buvo NEB3, kur Fl buvo 250. Bendras pagerinimo faktorius buvo >8000/250=£32.

Pavyzdys 9: HF BsrDI konstravimas

I.BsrDI raiška

BsrDI fermentas turi du subvienetus: BsrDIA ir BsrDIB.

Norint gautu gryną BsrDIA subvienetą, buvo naudojama IMPACT (InteinMediated purification with an Affinity Chitin-Binding Tag) sistema (NEB katalogas: E6901) vienos pakopos BsrDIA gryninimui. Trumpai sakant, BsrDIA genas buvo subklonuotas j pTXB1 vektorių, kuris po to buvo transformuotas j kompetentinj kamieną, turintį T7 polimerazę, kontroliuojamą lac operono (NEB Nr.ER2566). Po atrankos ir sekvenavimo buvo atrinktas tinkamas kamienas. Ląstelės buvo auginamos LB terpėje su ampicilinu (100 pg/ml) prie 37 °C iki Οϋβοο pasiekia 0,5. Tuomet buvo pridedama ΙΡΤΘ iki galutinės koncentracijos 0,4 mM dėl BsrDIA indukcijos 3 valandas. Ląstelių kultūra buvo išsodinta, resuspenduota lediniame kolonėlės buferyje (20 mM Tris-HCI, pH 8,5, 500 mM HCI) ir lizuota, veikiant ultragarsu. Gautas ląstelių lizatas buvo centrifuguojamas, norint pašalinti ląstelių nuolaužas. Po to, supernatantas buvo užneštas ant nulygsvarintos chitino kolonėlės. Po praplovimo su užnešimo buferiu, kolonėlė buvo inkubuota su skaldymo buferiu (20 mM Tris-HCI, pH 8,5, 500 mM NaCI ir 50 mMDTT) prie 4 °C per naktį. Galiausiai, Btsl.A baltymas buvo eliuuotas dialize prieš saugojimo buferį (10 mM Tris-HCI, pH 7,4, 0,1 mm EDTA, 1 mM DTT, 50 mM

KCI ir 50 % glicerolio).

BsrDIB subvieneto raiška buvo vykdoma E.coli, transformuotose pUC19BsrDIRB ir pl_G-BsrBIM1M2, kiekviena iš kurių turi BsrDI endonukleazės ir metilazės geną. Ląstelės buvo auginamos 37 °C per naktį LB terpėje su Amp ir Kam.

2. BsrDI-HF mutagenezė

Visos BsrDIB liekanos, įskaitant Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr buvo pakeistos į Ala padėtyse 7, 11, 12, 14, 15, 17, 21, 22, 25, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 37, 40, 45, 46, 47, 51, 52, 56, 58, 62, 64, 65, 67, 68, 71,72, 74, 75, 81, 83, 90, 91, 92, 93, 99, 100, 101, 106, 108, 109, 112, 113, 115, 116, 120, 122, 123, 124, 132, 133, 136, 137, 138, 139, 142, 143, 144, 145, 146, 150, 155, 157, 158, 161,

162, 164, 168, 170, 171, 173, 174, 176, 177, 179, 180, 182, 185, 189, 190, 193, 197,

200, 202, 203, 206, 210, 213, 215, 217, 218, 221, 224, 225, 226, 228, 229, 230, 232,

237, 238, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 249, 253, 258, 259, 261, 264, 265, 268, 271,

272, 273, 274, 276, 278, 279, 281, 285, 287, 288, 292, 294, 295, 299, 300, 301, 306,

307, 308, 312, 314, 315, 317, 318, 320, 321, 324, 325, 326, 327, 328, 331, 332, 335,

337, 341, 343, 345, 347, 352, 353, 354, 355, 356, 360, 361, 362, 363, 364, 370, 373,

374, 376, 380, 381, 385, 387, 389, 392, 393, 395, 396, 397, 405, 406, 408, 411, 415,

418, 420, 422, 425, 426, 430, 431,432, 434, 437, 445, 446, 449, 450, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 463, 465, 466, 467, 469, 470, 475, 481 ; o Tyr yra pakeistas į Phe padėtyse 9, 38, 63, 87, 118, 129, 169, 178, 198, 216, 251, 286, 291, 303, 357, 358, 367, 371,402,442,443,448.

Mutagenezės metodai buvo inversinė PGR su poriniais pradmenimis ir po to sekančiu skaldymu Dpnl. Apdorotas produktas buvo transformuotas į E.coli ER2566 kamieną.

3. BsrDI-HF atranka

BsrDI-HF atranka buvo vykdoma naudojant žvaigždinio aktyvumo tarp BsrDIB WT sumaišyto su BsrDIA ir mutantinio BsrDIB sumaišyto su BsrDIA NEB4 buferyje ant pBR322 DNR, kaip substrato. Buvo rasti aštuoni mutantai, turintys mažesnį žvaigždinį aktyvumą NEB4: H137A, D177A, K363A, K408A, R411A, Q215A, Q226A, Q230A.

Tolimesniam žvaigždinio aktyvumo sumažinimui, kombinuojant mutacijas, buvo padaryti dvigubi mutantai: K363A/Q230A, K363A/K408A, Q230A/K408A. Tuomet

BsrDI su mutacijomis O230A/K363A ant BsrDIB yra pavadintas kaip BsrDI-HF.

4. BsrDI-HF gryninimas

Du litrai EF?2566(pUC19-BsrDI(Q230A/K363A), pLG-BsrDIM1M2)) buvo auginamos 37 °C per naktį LB terpėje su 100 pg/ml Amp ir 33 pg/ml Kam. Ląstelės buvo surinktos ir veikiamos ultragarsu 20 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI. Po centrifugavimo prie 15000 rpm 30 min supernatantas buvo įleistas į 5 ml HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine., Piscataway, NJ), iš anksto subalansuotą su tuo pačiu buferiu. Į kolonėlę įleidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM TrisHCI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM-1M NaCI linijinis gradientas ir 10 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5,1M NaCI. Po to testuotas eliuuotų frakcijų aktyvumas. Frakcijos, turinčios didžiausią aktyvumą buvo toliau koncentruotos Vivaspin® 15R (Vivascience, dabar Sartorius Vivascience GmbH, Goettingen, Germany). Į koncentruotą BsrDI-HF buvo pridedamas lygus tūris glicerolio ir laikomas -20 °C.

5. BsrDI-HF ir BsrDI-WT palyginimas

BsrDI-HF ir BsrDI-WT Fl buvo nustatyti atskirai ant pBR322 DNR keturiuose NEB buferiuose su A skiedikliu. Rezultatai parodyti figūroje 7 ir rezultatai išdėstyti lentelėje 10 (žemiau).

Lentelė 10: BsrDI-HF ir BsrDI-WT palyginimas

Buferis	BsrDI-HF	BsrDI-WT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	Fl	Aktyvumas	Fl
NEB1	12,5%	>120	6%	1	>120
NEB2	100%	>500	100%	4	>120
NEB3	6%	>64	12,5%	4	>16
NEB4	100%	>1000	25%	1/2	>2000

BsrDI-HF didžiausią aktyvumą rodė NEB4 buferyje, kur Fl buvo £1000; BsrDIWT aktyviausias buvo NEB2 ir NEB3, kur Fl buvo 64. Bendras pagerinimo faktorius buvo >1000/0,5=>2000.

Pavyzdys 10: HF Nsil konstravimas

1. Nsil raiška

Nsil raiška buvo vykdoma E.coli, transformuotose placzz1-NsilR ir pACYXNsilR M, kiekviena turi NsilR endonukleazės ir metilazės geną. Ląstelės buvo auginamos prie 37 °C per naktį LB terpėje su Amp ir Cam.

2. Nsil-HF mutagenezė

Visos liekanos Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Phe, Trp, buvo pakeistos į Ala padėtyse 8, 9, 10, 11, 12, 13, 18, 21, 22, 23, 24, 26, 27, 32, 34, 35, 42, 44, 45, 46, 47, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 57, 58, 60, 61,69, 70, 73, 74, 79, 80,

84, 85, 87, 90,	91, 92, 93, 95,	96, 97, 98, 99,	100,	102, 103,	105,	106,	108,	109, 110,
113, 114, 115,	117,	118,	119,	120,	121, 122,	123,	124, 126,	134,	135,	137,	138, 139,
140, 142, 144,	145,	146,	149,	151,	153, 154,	155,	156, 159,	160,	161,	162,	163, 166,
167, 170, 173,	174,	175,	178,	179,	180, 181,	182,	183, 184,	186,	188,	189,	190, 191,
192, 195, 197,	198,	199,	200,	201,	202, 203,	206,	207, 209,	210,	211,	213,	215, 216,
217, 219, 221,	222,	225,	230,	231,	232, 234,	235,	236, 237,	239,	242,	243,	244, 245,
246, 249, 250,	251,	256,	257,	259,	260, 261,	263,	264, 268,	269,	271,	272,	273, 276,
277, 278, 279,	281,	282,	283,	285,	287, 288,	290,	292, 294,	295,	297,	298,	299, 302,
303, 306, 307,	308,	309,	310,	312,	315, 316,	319,	320, 323,	325,	327,	329,	333, 334,
336, 337, 338,	340,	341,	344,	347,	349, 350,	352,	353, 354,	355,	358,	359,	360, 362,
363, 365, 366,	367,	371,	372,	373,	375, 376 ii	377;	oTyr yra	pake	istas	j Phe	padėtyse

of 30, 40, 62, 65, 71, 76, 83, 86, 141, 226, 233, 255, 289, 311, 326, 335, 351, 357, 378.

Mutagenezė buvo atlikta atv irkštinės PGR metodu su poriniais pradmenimis ir po to sekančiu skaldymu Dpnl. Apdorotas produktas buvo po to transformuotas j E. coli ER3081 kamieną.

3. Nsil-HF atranka

Nsil-HF atranka buvo atlikta, panaudojant aktyvumo palyginimą NEB3 ir NEB4 buferiuose, naudojant pXba DNR kaip substratą. Nsil-VVT turėjo didžiausią aktyvumą NEB3, buvo atrinktas vienas su didžiausiu aktyvumu NEB4. Rasti 148 mutantai, turintys didžiausią aktyvumą NEB4. F376A turėjo daug didesnį aktyvumą NEB4, negu WT. Paprastai mutantas su didžiausiu aktyvumu NEB4 yra mutantas su pagerintu žvaigždiniu aktyvumu. Nsil(F376A) yra pavadintas kaip Nsil-HF.

4. Nsil-HF gryninimas

Du litrai ER3081 (placzzl- Nsil(F376A), pACYC-NsilM)) buvo auginamos 37 °C per naktį LB terpėje su 100 pg/ml Amp ir 33 pg/ml Cam ir 0,5 mM IPTG. Ląstelės buvo surinktos ir veikiamos ultragarsu 50 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI. Po centrifugavimo prie 15000 rpm 30 min. Supernatantas švirkštu buvo įleistas j 5 ml HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine., Piscatavvay, NJ), iš anksto subalansuotą su tuo pačiu buferiu, j kolonėlę įleidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-1M NaCI linijinis gradientas ir po to sekanti 10 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1M NaCI pakopa. Po to testuotas eliuuotų frakcijų aktyvumas. Frakcijos, turinčios didžiausią aktyvumą buvo toliau koncentruotos Amicon Ultra 30 KDa (Millipore, U.S.A.; dabar Merck, Germany). J koncentruotą Nsil-HF buvo pridedamas lygus tūris glicerolio ir laikoma -20 °C.

5. Nsil-HF ir Nsil-WT palyginimas

Nsil-HF ir Nsil-WT FI buvo nustatyti atskirai ant pXba DNR keturiuose NEB buferiuose su A skiedikliu. Rezultatai išdėstyti lentelėje 11 (žemiau).

Lentelė 11: Nsil-HF ir Nsil-VVT palyginimas

Buferis	Nsil-HF	Nsil-VVT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	FI	Aktyvumas	FI
NEB1	3%	>250	6,3 %	32	>8
NEB2	12,5%	>1000	25%	32	>30
NEB3	6%	>500	100%	32	>15
NEB4	100%	>8000	12,5%	32	>250

Nsil-HF didžiausią aktyvumą rodė NEB4 buferyje, kur FI buvo >8000; Nsil-VVT aktyviausias buvo NEB3, kur FI buvo 32. taip pagerinimo faktorius NEB4 buvo >8000/32=>250.

Pavyzdys 11: Dpnll konstravimas

1. Dpnll raiška

Dpnll raiška buvo vykdoma E. co//3081, transformuotose pBAD241-Dpnll RM. Ląstelės buvo auginamos 30 °C temperatūroje LB terpėje su AMP per naktį.

2. Dpnll mutageneze

Atrinktų mutacijų taškinė mutagenezė buvo atlikta atvirkštinės PGR metodu.

Dpnll buvo padarytos sekančios 189 aminorūgščių mutacijos: Cys, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Trp buvo mutuotos j Ala. Try buvo mutuotas j Phe. Tai buvo: 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 46, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 59, 61,62, 63, 64, 66, 69, 76, 77, 78, 80, 81, 82, 86, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 116, 117, 118, 120, 121, 122, 125, 126,

129, 130, 132, 135, 138, 139, 140, 141, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 152,

153, 156, 157, 158, 160, 161, 162, 164, 168, 169, 171, 172, 173, 175, 176, 177, 178,

180, 181, 183, 184, 186, 188, 189, 191, 192, 193, 195, 196, 198, 199, 200, 201, 202,

205, 206, 207, 208, 211, 214, 216, 217, 218, 219, 221, 223, 224, 226, 227, 228, 229,

230, 231, 232, 233, 234, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 244, 246, 247, 248, 249, 251,

252, 254, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 264, 265, 266, 267, 268, 272, 274, 275,

277,278, 280, 281 ir 282.

Pradmenų projektavimo ir PGR metodas is similarto that described previously. PGR produktas buvo suskaldytas su Dpnl ir transformuotas j kompetentines E. coli 3081 ląsteles.

3. Dpnll-HF atranka

Kiekvienos mutacijos keturios kolonijos buvo užaugintos 37 °C LB terpėje su Amp per naktį. Buvo atliktas standartinis Dpnll atrankos testas, naudojant danr lambda substratą NEB4 buferyje ir 5 % glicerolyje.

Iš atrankos testo buvo atrinkti R78A, T140A, E152A, R199A ir F217A mutantai. Po keleto patikrinimo ciklų skirtingose sąlygose ir buferiuose, kaip kandidatas buvo pasirinktas R199A, išlaikantis aukštą kanoninį fermento aktyvumą, bet rodantis iš esmės sumažintą žvaigždinį aktyvumą. R199A buvo pažymėtas kaip Dpnll-HF.

4. Dpnll-HF gryninimas

Du litrai E. coli (pBAD241.Dpnll.RM(R199A)) buvo auginamos 30 °C per naktį LB terpėje su 100 pg/ml Amp. Ląstelės buvo surinktos ir veikiamos ultragarsu 20 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI. Po 30 min. centrifugavimo prie 15000 rpm supernatantas švirkštu buvo įleistas į 5 ml HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine., Piscataway, NJ), kuri iš anksto buvo subalansuota tuo pačiu buferiu. J kolonėlę buvo leidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-1M NaCI linijinis gradientas ir po to ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1M NaCI. Buvo tiriamas eliuuotų frakcijų aktyvumas.

Frakcijos, turinčios didžiausią aktyvumą buvo toliau koncentruojamos. J koncentruotą

Dpnll-HF buvo pridėtas toks pat tūris glicerolio ir laikoma prie -20 °C.

5. Dpnll-HF ir Dpnll-WT palyginimas

Dpnll-HF buvo 2 kartus paeiliui praskiestas B buferiu ir tiriamas keturiuose NEB buferiuose. Rezultatai yra išdėstyti lentelėje 12.

Lentelė 12: Dpnll-HF ir Dpnll-WT palyginimas

Buferis	Dpnll-HF	Dpnll-VVT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	Fl	Aktyvumas	Fl
NEB1	50%	4000	25%	1	4000
NEB2	25%	2000	25%	1	2000
NEB3	0,8 %	64	100%	32	2
NEB4	100%	8000	25%	1	8000

Dpnll-HF didžiausią aktyvumą rodė NEB4 buferyje, kur geriausias Fl buvo =8000; Dpnll-WT aktyviausias buvo NEB3, kur Fl buvo 32. Bendras pagerinimo faktorius Fl buvo 8000/32=250.

Pavyzdys 12: Didelio tikslumo Bell konstravimas

1. Bell raiška

Bell raiška buvo vykdoma E. coli, transformuotose pRRS-BcIIR ir pACYC184BcllM, kiekviena iš kurių turi endonukleazės ir metilazės geną. Ląstelės buvo užaugintos per naktj 37 °C LB terpėje su Amp.

2. Bcll-HF atranka

Bcll-HF atranka buvo pasiekta panaudojant aktyvumo palyginimą glicerolyje ir NEB4, naudojant danr lambda kaip substratą. Jei tik įtariamas žemesnis žvaigždinis aktyvumas, mutantai taip pat palyginami su normaliu aktyvumu vandenyje irNEB4 ant to paties substrato. Buvo atrinkti mutantai su panašiu į WT NEB4 buferyje ir taip pat potencialiai turintys žemesnį žvaigždinį aktyvumą. Yra surasti 6 mutantai, turintys tokias charakteristikas: G26A, P105A, T195A, Q210A, Y147F ir Y193F. Kai kurie mutantai (Κ114A, T197A, S245A, D252A ir Y027F) rodė žemesnį aktyvumą vandenyje, bet sumažintą žvaigždinį aktyvumą taip pat; jie paprastai turėjo aukštesnį aktyvumą giminingą aktyvumą negu WT, esant aukštesnei glicerolio koncentracijai. Vienas mutantas rodė aukštesnį aktyvumą negu WT ir taip pat žemesnį žvaigždinį aktyvumą:

Y192F. Bcll(Y192F) yra pavadintas kaip Bcll-HF.

4. Bcll-HF gryninimas

Du litrai ląstelių EK2984(pRRS-Bcll(Y192F), pACYC184-BcllM)) buvo auginamos LB terpėje su 100 pg/ml Amp prie 37 °C per naktį. Ląstelės buvo surinktos ir veikiamos ultragarsu 20 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI. Po centrifugavimo prie 15000 rpm 30 minučių, supernatantas buvo švirkštu įleistas j 5ml HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine., Piscatavvay, NJ), kuri iš anksto buvo subalansuota tuo pačiu buferiu. Į kolonėlę buvo leidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM TrisHCI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-IM NaCI linijinis gradientas ir po to 10 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5,1M NaCI. Po to buvo tiriamas eliuuotų frakcijų aktyvumas, frakcijos su aukštesniu aktyvumu buvo toliau koncentruojamos Vivaspin® 15R (Vivascience, dabar Sartorius Vivascience GmbH, Goettingen, Germany), j koncentruotą Bcll-HF buvo pridedamas lygus tūris glicerolio ir laikomas 20 °C.

5. Bcll-HF ir Bcll-WT palyginimas

Bcll-HF ir Bcll-WT Fl buvo nustatomi atskirai ant danr lambda DNR keturiuose NEB buferiuose su A skiedikliu. Palyginimas yra parodytas figūroje 8 ir rezultatai išdėstyti lentelėje 13 (žemiau).

Lentelė 13: Bcll-HF ir Bcll-WT palyginimas

Buferis	Bcll-HF	Bcll-WT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	Fl	Aktyvumas	Fl
NEB1	12,5%	>250	50%	120	>2
NEB2	100%	>500	100%	32	>16
NEB3	25%	>32	50%	64	>1/2
NEB4	100%	>2000	100%	32	>60

Bell HF didžiausią aktyvumą rodė NEB2 ir NEB4 buferiuose, kuriuose Fl buvo >2000; Bcll-WT aktyviausias buvo NEB2 ir NEB4, kur Fl buvo 32. Bendras pagerinimo faktorius yra >2000/32=>64.

Pavyzdys 13: HF Bglll konstravimas

1. Bglll raiška

Bglll raiška buvo vykdoma E.coli, transformuotose pLacZZ-BgilIR ir pACYC33

BglIlM, kurių kiekviena turi Bglll endonukleazės ir metilazės geną. Ląstelės buvo auginamos prie 37 °C per naktį LB terpėje su Amp ir Cam.

2. Bglll-HF mutagenezė

Visos liekanos Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr buvo pakeistos j Ala padėtyse 2, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 16, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 29, 30, 33, 35, 37, 38, 39, 41,42, 45, 48, 49, 53, 54, 55, 58, 59, 60, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 74, 75, 76, 77, 78, 81, 82, 84, 85, 87, 88, 89, 90, 93, 95, 96, 97, 98, 101, 104, 105, 106, 108, 109, 110, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 120, 121, 122, 124, 125, 131, 132,

134, 135, 136, 139, 140, 141, 142, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 157, 159, 161,

162, 166, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 179, 182, 183, 184, 187, 188, 189, 191, 192,

193, 195, 196, 197, 198, 199, 201, 203, 206, 207, 208, 209, 211, 212, 213, 214, 215,

216, 217, 219, 222; o Tyr yra pakeistas j Phe padėtyse 8, 56, 99, 144, 145, 158, 185 ir 190.

Mutagenezė buvo atlikta inversnės PGR metodu su poriniais pradmenimis ir po to sekančiu skaldymu Dpnl. Apdorotas produktas buvo po to transformuotas į E. co//ER3081 kamieną.

3. Bglll-HF atranka

Bglll-HF atranka buvo pasiekta panaudojant aktyvumo palyginimą NEB3 ir NEB4 buferyje, naudojant pXba DNR kaip substratą. Bglll-WT turėjo didesnį aktyvumą NEB3 buferyje, taigi buvo atrinkti mutantai su didesniu aktyvumu NEB4 buferyje. Visi mutantai su didesniu aktyvumu buvo po to palyginti su WT aktyvumu glicerolyje, ieškant žvaigždinio aktyvumo. Normaliai mutantai su didesniu aktyvumu NEB4 buferyje turi pagerintą žvaigždinį aktyvumą. Mutantai, kurie buvo teikiantys vilčių (H10A, N208A, K48A, K74A, R75A, Y56F, K58A, M117A) buvo galiausiai tiriami su Exol buferiu vandenyje, kurie galėjo pakelti žvaigždinį aktyvumą. Mažoje kultūroje šis mutantas gali pasirodyti turintis stabilų dalinį aktyvumą, kurį mes galime nustatyti, yra kitas indikatorius, kad tikslumas pasikeitė. Bglll(N208A) pavadintas kaip Bglll-HF.

4. Bglll-HF gryninimas

Du litrai ląstelių ER308f(pLacZZ-Bglll(N208A), pACYC184-BglllM)) buvo auginamos LB terpėje su 100 pg/ml Amp ir 33 pg/ml prie 37 °C per naktį. Ląstelės buvo surinktos ir veikiamos ultragarsu 20 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI. Po centrifugavimo prie 15000 rpm 30 minučių, supernatantas buvo užneštas ant 5ml

HiTrap™ Heparin HP kolonėlės (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine., Piscataway, NJ) iš anksto subalansuotos su tuo pačiu buferiu švirkšto injekcija, kolonėlė buvo po to užnešama ant sistemos pagal sekančią procedūrą: 48 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-IM NaCI linijinis gradientas ir 10 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1M NaCI. Po to buvo tiriamas eliuuotų frakcijų aktyvumas. Frakcijos su didesniu aktyvumu buvo toliau koncentruojamos Vivaspin® 15R (Vivascience, dabar Sartorius Vivascience GmbH, Goettingen, Germany). Į koncentruotą Bglll-HF buvo pridedamas lygus tūris glicerolio ir laikomas -20 °C.

4. Bglll-HF ir Bglll-WT palyginimas

Bglll-HF ir Bglll-WT Fl buvo nustatomi atskirai ant pXba DNR keturiuose NEB buferiuose su B skiedikliu. Palyginimas yra parodytas figūroje 9 ir rezultatai išdėstyti lentelėje 14 (žemiau).

Lentelė 14: Bglll-HF ir Bglll-WT palyginimas

Buferis	Bcll-HF	Bcll-WT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	Fl	Aktyvumas	Fl
NEB1	12,5%	£8000	25%	250	£32
NEB2	100%	£12800	100%	64	£2000
NEB3	50%	£2000	100%	120	£16
NEB4	25%	£32000	6,3 %	16	£2000

Bglll-HF didžiausią aktyvumą rodė NEB2, kuriame Fl buvo £128000; Bglll-WT aktyviausias buvo NEB3, kur Fl buvo 120. Bendras pagerinimo faktorius yra £128000/12O=£1000.

Pavyzdys 14: HF BstEII konstravimas

1. BstEII raiška

BstEII raiška buvo vykdoma E. coli 3081, transformuotose pUC19-BstEIIR ir pACYC-BstEIIM, kiekviena iš kurių turi BstEII endonukleazės ir metilazės geną. Ląstelės buvo auginamos 37 °C temperatūroje LB terpėje per naktį su Amp ir Cam.

2. BstEII-HF mutagenezė

Visos liekanos Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr buvo pakeistos į Ala padėtyse 7, 9, 10, 14, 17, 20, 21, 22, 25, 26, 29, 30, 32, 36, 37, 40, 41, 44, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 57, 58, 60, 61,62, 63, 64, 65, 67, 68, 69, 72, 75, 76, 79,

80, 81, 82, 83, 85, 88, 89, 90, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 111,

112, 113, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 130, 132, 133, 134, 135, 136, 137,

138, 140, 142, 143, 147, 150, 151, 152, 154, 155, 157, 160, 161, 162, 163, 165, 166,

167, 171, 172, 175, 176, 178, 179, 180, 182, 184, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195,

199, 202, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219,

220, 221, 222, 224, 225, 227, 228, 232, 233, 234, 236, 238, 243, 244, 245, 246, 247,

251, 252, 255, 256, 258, 261, 262, 264, 265, 266, 272, 274, 277, 278, 279, 281; o Tyr yra pakeistas j Phe padėtyse 8, 15, 24, 27, 35, 43, 77, 129, 131, 139, 156, 188, 203, 229, 257 ir 263.

Mutagenezė buvo atlikta atvirkštinės PGR metodu su poriniais pradmenimis ir po to sekančiu skaldymu Dpnl. Apdorotas produktas buvo po to transformuotas į Ė. coli ER2683 kamieną.

3. BstEII-HF atranka

BstEII-HF atranka buvo pasiekta panaudojant aktyvumo palyginimą NEB3 ir NEB4 buferyje, naudojant lambda DNR kaip substratą. BstEII-WT turėjo didesnį aktyvumą NEB3 buferyje, taigi buvo atrinkti mutantai su didesniu aktyvumu NEB4 buferyje. Buvo rasti septyni mutantai, turintys pagerintą aktyvumą NEB4 buferyje: K014A, Q069A, E099A, R105A, R117A, G135A ir Y035F. R105A turėjo didžiausią aktyvumo skirtumą, palyginus su WT NEB4 buferyje ir vandenyje ir taip pat rodė sumažintą žvaigždinį aktyvumą, kai buvo tiriamas kartu glicerolyje su Exol buferiu, sąlyga, kuri rodė žvaigždinį aktyvumą WT. BstEII(R105A) yra pavadintas BstEII-HF.

4. BstEII-HF gryninimas

Du litrai ląstelių ER2683(pUC19-BstEII(R105), pACYC-BstEIIM)) buvo auginamos LB terpėje su 100 pg/ml Amp ir 33 pg/ml prie 30 °C per naktį. Ląstelės buvo surinktos ir veikiamos ultragarsu 20 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCl. Po centrifugavimo prie 15000 rpm 30 minučių, supernatantas švirkštu buvo įleistas į 5ml HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine., Piscatavvay, NJ) iš anksto subalansuotą su tuo pačiu buferiu. Į kolonėlę įleidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-IM NaCl linijinis gradientas ir po to10 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1M NaCl. Po to buvo tiriamas eliuuotų frakcijų aktyvumas, frakcijos su aukštesniu aktyvumu buvo toliau koncentruojamos Vivaspin® 15R (Vivascience, dabar Sartorius Vivascience GmbH,

Goettingen, Germany). Į koncentruotą BstEII-HF buvo pridedamas lygus tūris glicerolio ir laikomas -20 °C.

5. BstEII-HF ir BstEII-WT palyginimas

BstEII-HF ir BstEII-WT Fl buvo nustatyti atskirai ant lambda DNR keturiuose NEB buferiuose su A skiedikliu. Palyginimas parodytas figūroje 10 ir rezultatai išdėstyti lentelėje 15 (žemiau).

Lentelė 15: BstEII-HF ir BstEII-WT palyginimas

Buferis	BstEII-HF	BstEII-WT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	Fl	Aktyvumas	Fl
NEB1	3%	£64	50%	16	£4
NEB2	50%	£1000	100%	4	£250
NEB3	1,6%	£32	50%	16	£2
NEB4	100%	£2000	100%	4	£500

BstEII-HF didžiausią aktyvumą rodė NEB4 buferyje, kur Fl buvo £2000; BstEIIWT aktyviausias buvo NEB2 ir NEB4, kur Fl buvo 4. Bendras pagerinimo faktorius yra £2000/4=£500.

Pavyzdys 15: HF Banll konstravimas

1. Banll raiška

Banll raiška buvo vykdoma E. coli 3081, transformuotose pUC19-BanllR ir pACYC-BanlIM, kiekviena iš kurių turi Banll endonukleazės ir metilazės geną. Ląstelės buvo auginamos 37 °C temperatūroje LB terpėje per naktį su Amp ir Cam.

2. Banll mutagenezė

Visos liekanos, išskyrus Tyr (ir tas, kurios jau buvo Ala) buvo pakeistos į Ala padėtyse 7, 8, 9, 10, 12, 16, 17, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 24, 31, 32, 35, 38, 39, 43, 44, 45, 47, 49, 54, 59, 61,63, 64, 66, 67, 71,72, 73, 74, 75, 77, 78, 81, 83, 84, 87, 88, 92, 94, 95, 96, 97, 99, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 113, 115, 117, 118, 120, 121, 122, 123, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 135, 139, 142, 143, 145, 146, 147, 148, 149, 152, 153, 155,156, 163, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 173, 175, 176, 178, 179, 180, 181, 183, 184, 186, 190, 191, 194, 195, 196, 198, 199, 200, 207, 208,

211, 213, 214, 215, 216, 219, 220, 221, 222, 224, 226, 229, 230, 231, 232, 234, 235,

236, 237, 239, 240, 242, 245, 246, 247, 248, 252, 254, 256, 257, 258, 259, 261, 262,

263, 264, 266, 267, 270, 271, 272, 274, 276, 278, 279, 281 284, 285, 286, 287, 289,

291, 292, 293, 294, 295, 296, 300, 302, 303, 305, 309, 311, 312, 314, 317, 318, 319,

322, 326, 327, 328, 330, 331, 334, 338, 339, 341, 342, 344, 346, 347, 348, 349, 351,

352, 355, 356 ir 358; Tyr buvo pakeistas į Phe padėtyse 27, 50, 80, 160, 182, 197,

244, 251, 260, 307 ir 313.

Mutagenezė buvo atlikta atvirkštinės PGR metodu su poriniais pradmenimis ir po to sekančiu skaldymu Dpnl. Apdorotas produktas buvo po to transformuotas į E. coli ER2566 kamieną.

3. Banll-HF atranka

Banll-HF atranka buvo pasiekta panaudojant aktyvumo palyginimą NEB4 su vandeniu su žvaigždiniu aktyvumu, Exol buferyje ir glicerolyje, naudojant lambda DNR kaip substratą. Mutantai, kurie rodė panašų arba pagerintą aktyvumą, lyginant su WT vandenyje ir NEB4, jeigu taip pat rodė pagerintą žvaigždinį aktyvumą, buvo atrinkti tolimesniam tyrimui. Šie mutantai sudarė N106A, Q169A ir E314A. R126A buvo atrinktas, kadangi rodė pastovų dalinį vaizdą, kuris, kaip mes parodėme, taip pat buvo didelio tikslumo indikatorius. Po išgryninimo R126A rodė geriausią žvaigždinio aktyvumo sumažėjimą. Banll(R126A) yra pavadintas Banll-HF.

2. Banll gryninimas

Du litrai ląstelių ER2566(pUC19-Banll(R126A),pACYC-BanllM)) buvo auginamos LB terpėje su 100 pg/ml Amp ir 33 pg/ml prie 30 °C per naktį. Ląstelės buvo surinktos ir veikiamos ultragarsu 20 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI. Po centrifugavimo prie 15000 rpm 30 minučių, supernatantas švirkštu buvo įleistas j 5ml HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine., Piscataway, NJ) iš anksto subalansuotą su tuo pačiu buferiu. Į kolonėlę įleidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-IM NaCI linijinis gradientas ir po to 10 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1M NaCI. Buvo tiriamas eliuuotų frakcijų aktyvumas, frakcijos su aukštesniu aktyvumu buvo toliau koncentruojamos Vivaspin® 15R (Vivascience, dabar Sartorius Vivascience GmbH, Goettingen, Germany). J koncentruotą Banll-HF buvo pridedamas lygus tūris glicerolio ir laikoma -20 °C.

5. Banll-HF ir Banll-WT palyginimas

Banll-HF ir Banll-WT Fl buvo nustatyti atskirai ant darrr lambda DNR keturiuose NEB buferiuose su A skiedikliu. Rezultatai išdėstyti lentelėje 16 (žemiau).

Lentelė 16: Banll-HF ir Banll-WT palyginimas

Buferis	Banll-HF	Banll-WT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	Fl	Aktyvumas	Fl
NEB1	100%	£4000	100%	64	£64
NEB2	50%	£2000	100%	64	£32
NEB3	12,5%	£500	12,5%	16	£32
NEB4	50%	£2000	100%	16	£125

Banll-HF didžiausią aktyvumą rodė NEB1 buferyje, kur Fl buvo £4000; BanllWT aktyviausias buvo NEB1, NEB2 ir NEB4, kur Fl buvo 64. Taigi, bendras pagerinimo faktorius yra £4000/64=£64.

Pavyzdys 16: HF PspGI konstravimas

1. PspGI raiška

PspGI raiška buvo vykdoma E.coli, transformuotose pRRS-PspGIRM, kurios turi PspGI endonukleazės ir metilazės geną. Ląstelės buvo auginamos prie 30 °C per naktį LB terpėje su Amp.

2. PspGI-HF mutagenezė

PspGI baltymo ilgis yra 272 aminorūgštys. Visos PspGI baltymo 166 a.r. vietos buvo numatytos mutuoti į Ala (arba Phe). Cys, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Trp buvo mutuotos į Ala. Try buvo mutuota į Phe. Tai buvo: 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18,19, 20, 21, 22, 25, 26, 29, 30, 32, 34, 35, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 51, 52, 53, 54, 57, 60, 61,62, 65, 68, 69, 71, 72, 73, 75, 76, 80, 82, 84, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 99, 100, 101, 102, 105, 109, 110, 113, 134, 135, 136, 137, 138, 142, 143, 145, 149, 150, 151, 152, 153, 158, 160, 161, 162, 164 ir 165. Mutagenezė buvo atlikta atvirkštinės PGR metodu su poriniais pradmenimis ir po to sekančiu skaldymu Dpnl. Apdorotas produktas buvo tuomet transformuotas į E. coli ER2984 kamieną.

3. PspGI-HF atranka

PspGI-HF atranka buvo atlikta naudojant mutantų ir WT aktyvumo palyginimą NEB4 buferyje ir naudojant pBC4 DNR kaip substratą. PspGI atrankos bandymai buvo atliekami naudojant pBC4 DNR kaip substratą NEB4 buferyje (2h skaldymas prie 69 °C). Rasta 11 mutantantų, turinčių didesnį aktyvumą, negu WT NEB4 buferyje: T20A,

P52A, Y67F, K68A, R75A, E86A, Q90A, S91A, Q93A, H121A ir G172A. PspGI (R75A) turėjo daug didesnį aktyvumą, negu WT NEB4 buferyje. Paprastai, mutantas su didžiausiu aktyvumu NEB4 turi pagerintą žvaigždinį aktyvumą. Po keleto ciklų palyginimų skirtingomis sąlygomis ir esant skirtingiems substratams, rasta, kad PspGI yra pageidaujamas mutantas, išlaikantis aukštą skėlimo aktyvumą, bet rodantis iš esmės sumažintą žvaigždinį aktyvumą. PspGI (R75A) yra pavadintas PspGI-HF.

4. PspGI-HF gryninimas

Du litrai ląstelių E.coli 2984(pRRS-PspGIRM(R75A)) buvo auginamos LB terpėje su 100 pg/ml Amp prie 30 °C per naktį. Ląstelės buvo surinktos ir veikiamos ultragarsu 20 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI. Po centrifugavimo prie 15000 rpm 30 minučių, supernatantas švirkštu buvo įleistas j 5ml HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine., Piscatavvay, N J) iš anksto subalansuotą su tuo pačiu buferiu. Į kolonėlę įleidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-IM NaCI linijinis gradientas ir po to10 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1M NaCI. Buvo tiriamas eliuuotų frakcijų aktyvumas, frakcijos su aukštesniu aktyvumu buvo toliau koncentruojamos Vivaspin® 15R (Vivascience, dabar Sartorius Vivascience GmbH, Goettingen, Germany), j koncentruotą PspGI-HF buvo pridedamas lygus tūris glicerolio ir laikoma -20 °C.

5. PspGI-HF ir PspGI-WT palyginimas

PspGI-HF ir PspGI-VVT Fl buvo nustatyti atskirai ant pBC4 DNR keturiuose NEB buferiuose su A skiedikliu. Rezultatai išdėstyti lentelėje 17 (žemiau).

Lentelė 17: PspGI-HF ir PspGI-VVT palyginimas

Buferis	PspGI-HF	PspGI-VVT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	Fl	Aktyvumas	Fl
NEB1	25%	>1000	12,5%	1	>1000
NEB2	100%	>4000	100%	4	>1000
NEB3	100%	>4000	100%	8	>500
NEB4	100%	>4000	100%	1	>4000

PspGI-HF didžiausią aktyvumą rodė NEB2, NEB3 ir NEB4 buferiuose, kur pageidaujamas Fl buvo £4000; PspGI-VVT aktyviausias buvo NEB2, NEB3 ir NEB4. Kur geriausias PspGI-VVT Fl NEB 3 buferyje buvo 8. Bendras pagerinimo faktorius Fl yra £4000/8=£500.

Pavyzdys 17: H F Spel konstravimas

1. Spel raiška

Spel raiška buvo vykdoma E. coli, transformuotose pRRS-Spel ir pASYX20SpelM9, kiekviena turi Spel endonukleazės ir metilazės geną. Ląstelės buvo auginamos prie 30 °C per naktį LB terpėje su Amp ir Kan.

2. Spel-HF mutagenezė

Visos liekanos Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr buvo pakeistos į Ala padėtyse 7, 9, 10, 17, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 40,43, 45,46,49, 50, 51,52, 53, 54, 57, 58, 59, 61,65, 66, 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 80, 81, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 92, 96, 97, 101, 102, 103, 105, 107, 108, 109, 110,

112, 113, 115, 116, 118, 121, 122, 125, 126, 128, 130, 131, 137, 138, 139, 140, 142,

146, 149, 151, 152, 154, 157, 158, 159, 160, 161, 163, 166, 167, 169, 170, 172, 174,

175, 179, 180 ir 182; Tyr buvo pakeistas į Phe padėtyse 13, 19, 28, 55, 104, 120, 129 ir 164.

Mutagenezė buvo atlikta atvirkštinės PGR metodu su poriniais pradmenimis ir po to sekančiu skaldymu Dpnl. Apdorotas produktas buvo po to transformuotas į E. coli ER1038 kamieną.

3. Spel-HF atranka

Spel-HF atranka buvo pasiekta panaudojant kiekvieno mutanto aktyvumo palyginimą NEB4 buferyje su vandeniu ir pXBA DNR, kuri pirma buvo suskaldyta su Sacl-HF kaip substratu, glicerolio reakcija su Exol ir normalia pXba. Sacl-HF suskaldyta pXba pripažinta kaip didesnio grynumo, kai tiriamas mutantų aktyvumas, palyginus su WT. Glicerolio reakcija buvo naudojama žvaigždinio aktyvumo rezultatų palyginimui. Kai kurie mutantai rodė aukštą giminingą aktyvumą ir tuo pat metu žvaigždinio aktyvumo sumažėjimą: E059A, P065A, S108A, N 172A, K174A, Q179A, G182A ir Y055F. Po išgrynintų pavyzdžių palyginimo, Spel(P065A) buvo pavadintas kaip Spel-HF.

3. Spel-HF gryninimas

Du litrai ląstelių ER 3081(pRRS-SpelM7(P065A), pSYX20-SpelM9)) buvo auginamos LB terpėje su 100 pg/ml Amp ir 33 pg/ml prie 30 °C per naktį. Ląstelės buvo surinktos ir veikiamos ultragarsu 20 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI. Po centrifugavimo prie 15000 rpm 30 minučių, supernatantas švirkštu buvo įleistas į 5ml HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine., Piscatavvay, NJ) iš anksto subalansuotą su tuo pačiu buferiu. J kolonėlę įleidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-IM NaCI linijinis gradientas ir po to10 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1M NaCI. Buvo tiriamas eliuuotų frakcijų aktyvumas. Frakcijos su didesniu aktyvumu buvo toliau koncentruojamos Vivaspin® 15R (Vivascience, dabar Sartorius Vivascience GmbH, Goettingen, Germany). Į koncentruotą Spel-HF buvo pridedamas lygus tūris glicerolio ir laikoma -20 °C.

5. Spel-HF ir Spel-VVT palyginimas

Spel-HF ir Spel-VVT FI buvo nustatyti atskirai ant pXba keturiuose NEB buferiuose su C skiedikliu ir rezultatai parodyti lentelėje 18 (žemiau).

Lentelė 18: Spel-HF ir Spel-VVT palyginimas

Buferis	Spel-HF	Spel-VVT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	FI	Aktyvumas	FI
NEB1	50%	>4000	100%	100	>1000
NEB2	12,5%	>2000	100%	500	>2
NEB3	12,5%	>2000	12,5%	2000	>1/8
NEB4	100%	>8000	50%	500	>2

Spel-HF didžiausią aktyvumą rodė NEB4 buferyje, kur FI buvo £8000; SpelVVT aktyviausias buvo NEB1, kur FI buvo 1000. Taigi, bendras pagerinimo faktorius yra >8.

Pavyzdys 18: HF BsmAI konstravimas

1. BsmAI raiška

BsmAI raiška buvo vykdoma E. coli, transformuotose pBAD241-BsmAIR ir pACYC184-BsmAIM, kiekviena iš kurių turi BsmAI endonukleazės ir metilazės geną. Ląstelės buvo užaugintos per naktį 37 °C LB terpėje su Amp ir Cam ir po to indukuotos arabinoze 4 valandas.

2. BsmAI-HF mutagenezė

Dėl homologijos tarp Bsal, BsmBI ir BsmAI, buvo pasirinktos aminorūgštys BsmAI 210-227 srityje nuosekliam mutavimui j Ala, kadangi Bsal ir BsmBI didelio tikslumo mutantai buvo rasti panašioje į šią srityje.

Mutagenezė buvo atlikta atvirkštinės PGR metodu su poriniais pradmenimis ir po to sekančiu skaldymu Dpnl. Apdorotas produktas buvo po to transformuotas į E.

coli ER3081 kamieną.

3. BsmAI-HF atranka

BsmAI-HF atranka buvo pasiekta naudojant BsmAI mutanto ir BsmAI WT žvaigždinio aktyvumo palyginimą NEB4 ant FX174 DNR kaip substrato. Du mutantai turėjo mažesnį žvaigždinį aktyvumą, negu BsmAI WT: N212A ir L213A. BsmAI(N212A) mutantas pavadintas kaip BsmAI-HF.

4. BsmAI-HF gryninimas

Du litrai ląstelių EK2566(pBAD241-BsmAI(N212A), pACYC184-BsmAIM)) buvo auginamos LB terpėje su 100 pg/ml Amp ir 33 pg/ml Cam prie 37 °C per naktį. Po to ląstelės buvo indukuotos 4 vai. arabinoze, kurios galutinė koncentracija 0,2 %. Ląstelės buvo surinktos ir veikiamos ultragarsu 20 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI. Po centrifugavimo prie 15000 rpm 30 minučių, supernatantas švirkštu buvo įleistas į 5ml HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine., Piscatavvay, NJ) iš anksto subalansuotą su tuo pačiu buferiu. Į kolonėlę įleidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-IM NaCI linijinis gradientas ir po tol 0 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5,1M NaCI. Buvo tiriamas eliuuotų frakcijų aktyvumas. Frakcijos su didesniu aktyvumu buvo toliau koncentruojamos Vivaspin® 15R (Vivascience, dabar Sartorius Vivascience GmbH, Goettingen, Germany). Į koncentruotą BsmAI-HF buvo pridedamas lygus tūris glicerolio ir laikoma -20 °C.

5. BsmAI-HF ir BsmAI-VVT palyginimas

BsmAI-HF ir BsmAI-WT Fl buvo nustatyti atskirai ant FX174 DNR keturiuose NEB buferiuose su B skiedikliu. Rezultatai išdėstyti lentelėje 19 (žemiau).

Lentelė 19: BsmAI-HF ir BsmAI-VVT palyginimas

Buferis	BsmAI-HF	BsmAI-VVT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	Fl	Aktyvumas	Fl
NEB1	100%	>4000	50%	120	£32
NEB2	50%	£2000	50%	500	£4
NEB3	12,5%	£500	50%	500	1
NEB4	100%	£4000	100%	250	£8

BsmAI-HF didžiausią aktyvumą rodė NEB1 ir NEB4 buferiuosee, kur Fl buvo £4000; BsmAI-WT aktyviausias buvo NEB4, kur Fl buvo 250. Taigi, bendras pagerinimo faktorius yra £4OOO/25O=£16.

Pavyzdys 19: HF BstXI konstravimas

BstXI atpažįsta ir skaldo ties CCANNNNN/NTGG kaip aprašyta tarptautinės paraiškos publikacijoje Nr. WO 2009/009797. BstXI (N65A) mutantas buvo atrinktas kaip BstXI didelio tikslumo versija. Sekanti geresnio su mažesniu žvaigždiniu aktyvumu BstXI paieškos pakopa buvo N65 mutavimas j kitas aminorūgščių liekanas. Iš visų buvo rasta, kad BstXI(N65T) turi mažą žvaigždinį aktyvumą ir jis buvo pavadintas BstXI-HF.

BstXI-HF raiška buvo vykdoma ER2833 (pBAD241-BstXI(N65T), pACYCBstXIM. Auginimo ir gryninimo metodai buvo atliekami pagal VVO/2009/009797.

Sekančioje lentelėje (Lentelė 20) palyginti BstXI-HF ir BstXI-WT Fl.

Lentelė 20: BstXI-HF ir BstXI-WT palyginimas

Buferis	BstXI-HF	BstXI-WT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	Fl	Aktyvumas	Fl
NEB1	50%	£500	6%	4	£125
NEB2	100%	£1000	100%	32	£32
NEB3	100%	£1000	100%	2	£500
NEB4	100%	£1000	100%	32	£32

BstXI-HF geriausią aktyvumą rodė NEB2, NEB3 ir NEB4 buferiuose, geriausias BstXI-HF Fl buvo £1000; WT BstXI turėjo geriausią aktyvumą NEB2, NEB3 ir NEB4 buferiuose. WT BstXI Fl NEB2 buferyje ir NEB4 buferyje buvo 32. Taigi, bendras pagerinimo faktorius buvo £32.

Pavyzdys 20: HF Sfil konstravimas

1. Sfil raiška

Sfil raiška buvo vykdoma E. coli, transformuotose pRRS-SfilR ir pSX33-SfilM, kiekviena turi Sfil endonukleazės ir metilazės geną. Ląstelės buvo auginamos prie 30 °C per naktį LB terpėje su Amp ir Kan.

2. Sfil-HF mutagenezė

Visos liekanos Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr buvo pakeistos j Ala padėtyse 7, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 26, 29, 30, 32, 33,

34, 36, 37, 40, 41,42, 45, 46, 47, 48, 49, 55, 56, 58, 59, 63, 66, 67, 69, 71, 72, 73, 76,

79, 81, 82, 84, 87, 88, 89, 90, 91, 94, 95, 100, 102, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110,

111, 113, 114, 115, 116, 118, 120, 122, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 133, 135,

137, 140, 141, 145, 146, 148, 149, 150, 153, 156, 157, 158, 162, 166, 167, 169, 170,

172, 173, 174, 176, 177, 179, 180, 185, 187, 188, 190, 192, 193, 194, 196, 197, 198,

199, 200, 201, 202, 205, 207, 208, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 218, 220, 224, 225,

227, 228, 231, 233, 235, 236, 238, 240, 242, 243, 244, 246, 247, 248, 249, 251,252,

254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263; Tyr yra pakeistas į Phe padėtyse 31, 60, 68,

80, 164, 165, 175, 182, 195, 222, 239, ir 245.

Mutagenezė buvo atlikta atvirkštinės PGR metodu su poriniais pradmenimis ir po to sekančiu skaldymu Dpni. Apdorotas produktas buvo po to transformuotas j E. coli ER2169 kamieną.

3. Sfil-HF atranka

Sfil-HF atranka buvo pasiekta panaudojant aktyvumo palyginimą tarp mutantų ir WT vandenyje su NEB Exol buferiu ir BSA, panaudojant kaip substratą pXba DNR, iš anksto suskaldytą EcoRI-HF. Buvo atrinkti mutantai su panašiu arba didesniu aktyvumu negu laukinis tipas, taip pat rodantys žvaigždinio aktyvumo pasikeitimą tam tikrame buferyje, lyginant su WT. Rasta keletas mutantų, turinčių didesnį aktyvumą NEB4: E007A, DOHA, E049A, R073A, R0114A, G137A, S210A ir R213A. Po gryninimo P114A pasirodė turįs didžiausią žvaigždinio aktyvumo sumažėjimą. Sfil(R114A) yra pavadintas Sfil-HF.

Taip pat įsidėmėtini buvo mutantai, kurių žvaigždinis aktyvumas padidėjo: N071A, D079A, H 162A, R225A, K227A, Y068F ir Y182F. Y068F anksčiau buvo pastebėti, kad turi skirtingą skėlimą, negu WT.

4. Sfil-HF gryninimas

Du litrai ląstelių ER2169(pRRS-Sfil(R114A), pSX33-SfilM)) buvo auginamos LB terpėje su 100 pg/ml Amp ir 33 pg/ml Kan prie 30 °C per naktį. Ląstelės buvo surinktos ir veikiamos ultragarsu 20 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI. Po centrifugavimo prie 15000 rpm 30 minučių, supernatantas švirkštu buvo įleistas j 5ml HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine., Piscatavvay, NJ) iš anksto subalansuotą su tuo pačiu buferiu. Į kolonėlę įleidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-IM NaCI linijinis gradientas ir po to10 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1M NaCI. Buvo tiriamas eliuuotų frakcijų aktyvumas. Frakcijos su aukštesniu aktyvumu buvo toliau koncentruojamos Vivaspin® 15R (Vivascience, dabar Sartorius Vivascience GmbH,

Goettingen, Germany). J koncentruotą Sfil-HF buvo pridedamas lygus tūris glicerolio ir laikoma -20 °C.

5. Sfil-HF ir Sfil-WT palyginimas

Sfil-HF ir Sfil-WT Fl buvo nustatyti atskirai ant pBC4 DNR keturiuose NEB buferiuose su C skiedikliu. Palyginimas parodytas 11 figūroje ir rezultatai išdėstyti lentelėje 21 (žemiau).

Lentelė 21: Sfil-HF ir Sfil-VVT palyginimas

Buferis	Sfil-HF	Sfil-VVT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	Fl	Aktyvumas	Fl
NEB1	50%	>250	12,5%	64	>4
NEB2	12,5%	>4000	100%	250	>4
NEB3	0,4 %	>32	100%	2000	>1/64
NEB4	100%	>8000	25%	64	>125

Sfil-HF didžiausią aktyvumą rodė NEB4 buferyjee, kur Fl buvo £8000; Sfil-VVT aktyviausias buvo NEB3, kuriame Fl buvo 2000. Bendras pagerinimo faktorius Fl yra >8000/2000=>4.

Pavyzdys 21: HF Pmel konstravimas

1. Pmel raiška

Pmel raiška buvo vykdoma E. coli 3081, transformuotose pRRS-PmelR ir pACYC- EsaS91M, kiekviena iš kurių turi Pmel endonukleazės ir metilazės geną. Ląstelės buvo auginamos 37 °C temperatūroje LB terpėje per naktį su Amp ir Cam.

2. Pmel-HF mutagenezė

Visos liekanos Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr buvo pakeistos į Ala padėtyse 7, 8,10,13, 14,17, 20,21,22, 25, 28,29, 30, 32, 33, 35, 37, 39, 41,42, 43, 46, 47, 49, 50, 51, 54, 55, 60, 62, 63, 64, 66, 67, 68, 69, 71, 72, 73, 77, 79, 80, 81, 82, 83, 86, 87, 91, 94, 95, 96, 97, 98, 100, 104, 106, 107, 108, 109, 110, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 121, 123, 124, 127, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 137, 138, 145, 147, 148, 149, 151, 152, 153, 154, 155, 157, 160, 162, 165, 166, 167,

169, 170, 171, 172, 177, 180, 181, 182, 183, 185, 186, 188, 190, 191, 192, 193, 194,

199, 200, 201, 202, 204, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 215, 218, 219, 221, 222, 223,

225; Tyr yra pakeistas j Phe padėtyse 111, 129, 146 ir 161.

Mutagenezė buvo atlikta atvirkštinės PGR metodu su poriniais pradmenimis ir po to sekančiu skaldymu Dpnl. Apdorotas produktas buvo po to transformuotas j E. coli ER2426 kamieną.

3. Pmel-HF atranka

Pmel-HF atranka buvo pasiekta panaudojant aktyvumo palyginimą tarp mutantų ir WT vandeniniame NEB4, naudojant lambda DNR kaip substratą, su tais pat mutantais glicerolyje su NEB Thermopol buferiu ir pXba kaip substratu. Pmel mutantų ir WT tyrimas vandenyje ant lambda DNR leido palyginti gretimus aktyvumus ir buvo atrinkti mutantai su panašiu arba didesniu aktyvumu negu WT NEB4 buferyje. Tačiau mutantai su priimtinu aktyvumu paskui buvo atmesti, jeigu jie nerodė žvaigždinio aktyvumo pasikeitimo, tiriant esant glicerolio sąlygoms su Thermopol buferiu ir pXba. Keletas mutantų parodė turintys žvaigždinio aktyvumo skirtumus: P079A, E086A, H096A ir E218A. Pmel(E086A) yra pavadintas kaip Pmel-HF.

4. Pmel-HF gryninimas

Du litrai ląstelių EK2426(pRRS-Pmel(P154A), pACYC184-EsaS9IM)) buvo auginama LB terpėje su 100 pg/ml Amp ir 33 pg/ml Cam prie 37 °C per naktį. Ląstelės buvo surinktos ir veikiamos ultragarsu 20 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI. Po centrifugavimo prie 15000 rpm 30 minučių, supernatantas švirkštu buvo įleistas į 5ml HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine., Piscatavvay, NJ) iš anksto subalansuotą su tuo pačiu buferiu. Į kolonėlę įleidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-IM NaCI linijinis gradientas ir po to10 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1M NaCI. Buvo tiriamas eliuuotų frakcijų aktyvumas. Frakcijos su aukštesniu aktyvumu buvo toliau koncentruojamos Vivaspin® 15R (Vivascience, dabar Sartorius Vivascience GmbH, Goettingen, Germany). J koncentruotą Sfil-HF buvo pridedamas lygus tūris glicerolio ir laikoma -20 °C.

5. Pmel-HF ir Pmel-WT palyginimas

Pmel-HF ir Pmel-VVT Fl buvo nustatyti atskirai ant pXba DNR keturiuose NEB buferiuose su A skiedikliu. Palyginimas parodytas Rezultatai išdėstyti lentelėje 22 (žemiau).

Lentelė 22: Pmel-HF ir Pmel-VVT palyginimas

Buferis	Pmel-HF	Pmel-VVT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	FI	Aktyvumas	FI
NEB1	12,5%	>2000	100%	250	>64
NEB2	6,3 %	>500	100%	250	>500
NEB3	0,4 %	>32	50%	120	>125
NEB4	100%	>8000	25%	64	>500

Pmel-HF didžiausią aktyvumą rodė NEB4 buferyje, kur FI buvo £8000; PmelVVT aktyviausias buvo NEB1 ir NEB2, kur FI buvo 250. Bendras pagerinimo faktorius FI yra >8000/250=>16.

Pavyzdys 21: HF Smal konstravimas

1. Smal raiška

Smal raiška buvo vykdoma E.coli, transformuotose pRRS-SmalR ir pSYX20SmalM, kiekviena iš kurių turi Smal endonukleazės ir metilazės geną. Ląstelės buvo auginamos 37 °C temperatūroje LB terpėje per naktį su Amp ir Kan.

2. Smal-HF mutagenezė

Visos liekanos Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr buvo pakeistos į Ala; visi Tyr buvo pakeisti j Phe.

Mutagenezė buvo atlikta atvirkštinės PGR metodu su poriniais pradmenimis ir po to sekančiu skaldymu Dpnl. Apdorotas produktas buvo po to transformuotas j E. coli ER2428 kamieną.

3. Smal-HF atranka

Smal-HF atranka buvo pasiekta naudojant aktyvumų palyginimą vandeniniame NEB4, naudojant pXba DNR kaip substratą su žvaigždinį aktyvumą duodančiomis glicerolio sąlygomis NEb standartiniame Taq buferyje. Mutantai, kurie rodė žvaigždinio aktyvumo pasikeitimus nurodytame buferyje, buvo atrinkti, jeigu išlaikė panašų arba aukštą giminingą aktyvumą WT. Buvo rasta keletas mutantų: E32R, S081A, G132A ir dvigubas mutantas F60L/S61R. Smal(F60L/S61R) yra pavadintas kaip Smal-HF.

4. Smal-HF gryninimas

Du litrai ląstelių EK2428(pRRS-Smal(F60L/S61R), pSYX20-SmalM)) buvo auginama LB terpėje su 100 pg/ml Amp ird 33 pg/ml Kan prie 37 °C per naktį. Ląstelės buvo surinktos ir veikiamos ultragarsu 20 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI. Po centrifugavimo prie 15000 rpm 30 minučių, supernatantas švirkštu buvo įleistas į 5ml HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine., Piscatavvay, NJ) iš anksto subalansuotą su tuo pačiu buferiu. J kolonėlę įleidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-IM NaCI linijinis gradientas ir po to10 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1M NaCI. Buvo tiriamas eliuuotų frakcijų aktyvumas. Frakcijos su didesniu aktyvumu buvo toliau koncentruojamos Vivaspin® 15R (Vivascience, dabar Sartorius Vivascience GmbH, Goettingen, Germany). Į koncentruotą Smal-HF buvo pridedamas lygus tūris glicerolio ir laikoma -20 °C.

5. Smal-HF ir Smal-WT palyginimas

Smal-HF ir Smal-WT Fl buvo nustatyti atskirai ant pXba keturiuose NEB buferiuose su A skiedikliu. Palyginimas parodytas figūroje 12 ir rezultatai parodyti lentelėje 23 (žemiau).

Lentelė 23: Smal-HF ir Smal-WT palyginimas

Buferis	Smal-HF	Smal-WT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	Fl	Aktyvumas	Fl
NEB1	0,2 %	>2000	3%	>16	ND
NEB2	3,2 %	>32000	12,5%	>64	ND
NEB3	0,0032 %	>32	0,8 %	>8	ND
NEB4	100%	>256000	100%	64	>4000

N D: nenustatyta

Smal-HF didžiausią aktyvumą rodė NEB4 buferyje, kur Fl buvo £256000; Smal-WT aktyviausias buvo NEB2 ir NEB4, kur Fl buvo 64. Bendras pagerinimo faktorius yra 256000/64=>4000.

Pavyzdys 23: Didelio tikslumo Aatll konstravimas

1. Aatll raiška

Aatll raiška buvo vykdoma E.coli, transformuotose pRRS-AatlI ir pACYC184AatlIM, kiekviena iš kurių turi Aatll endonukleazės ir metilazės geną. Ląstelės buvo užaugintos per naktį 37 °C LB terpėje su Amp ir Cam.

2. Aatll-HF m u ta genezė

Visos liekanos Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr buvo pakeistos į Ala padėtyse 8, 9,11, 12,13,16,17,18, 20, 22, 26, 29, 32, 33, 35, 36, 37,

38, 40, 43, 45, 46, 49, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 60, 61,62, 64, 65, 69, 70, 71, 72, 73, 74,

75, 77, 79, 80, 83, 84, 86, 87, 90, 92, 93, 94, 95, 97, 99, 100, 103, 104, 106, 107, 111,

113,	114,	117,	121,	123, 124,	125,	126,	128, 129,	131,	132, 133, 135,	136, 140,	141,
143,	144,	145,	146,	148, 149,	150,	151,	153, 155,	156,	157, 160, 164,	165, 167,	169,
171,	172,	173,	174,	175, 176,	177,	179,	181, 182,	186,	189, 191, 192,	193, 194,	196,
198,	200,	201,	203,	204, 205,	206,	207,	208,210,	211,	213, 214, 216,	217, 219,	220,
221,	222,	226,	228,	230, 231,	233,	235,	236, 237,	238,	240, 241, 244,	247, 248,	249,
250,	251,	252,	253,	256, 262,	264,	265,	266, 268,	269,	272, 273, 275,	280, 281,	282,
283,	286,	298,	292,	293, 295,	296,	297,	298, 301,	302,	308, 309, 311,	312, 313,	314,
315,	317,	319,	321,	325, 327,	329,	330,	333, 334,	335,	336; Tyr buvo |	oakeistas į	Phe

padėtyse 82, 89, 98, 112, 232, 305 ir 306.

Mutagenezė buvo atlikta atvirkštinės PGR metodu su poriniais pradmenimis ir po to sekančiu skaldymu Dpnl. Apdorotas produktas buvo po to transformuotas į E. coli ER2426 kamieną.

3. Aatll-HF atranka

Aatll-HF atranka buvo pasiekta naudojant aktyvumų palyginimą vandeniniame NEB4 su NEB Exol buferyje glicerolyje, naudojant pXba DNR kaip substratą. Mutantai, kurie rodė žvaigždinio aktyvumo pasikeitimus, esant glicerolio sąlygoms, buvo atrinkti tolimesniam tyrimui iki tol, kol jie turėjo panašų arba aukštesnį aktyvumą negu WT esant normalioms sąlygoms vandenyje. Po pradinės atrankos buvo atrinkta keletas mutantų tolimesniam tyrimui: G013A, G016A, K018A, P052A, R053A, K070A, E071A, D072A, G073A, S84A, E086A, R090A, K094A, R095A, P099A, P103A, K113A, N 135A, S151A, P157A, G173A, T204A, S206A, K207A, E233A, N235A, E237A, S238A, D241A, K295A, S301A ir S302A. Aatll(N235A) yra pavadintas kaip Aatll-HF.

4. Aatll-HF gryninimas

Du litrai ląstelių EK2426(pRRS-Aatll(N235A), pACYC184-AatllM)) buvo auginamos LB terpėje su 100 pg/ml Amp ir 33 pg/ml Cam prie 37 °C per naktj. Ląstelės buvo surinktos ir veikiamos ultragarsu 20 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI. Po centrifugavimo prie 15000 rpm 30 minučių, supernatantas švirkštu buvo įleistas j 5ml

HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine., Piscatavvay, NJ) iš anksto subalansuotą su tuo pačiu buferiu. J kolonėlę įleidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-IM NaCI linijinis gradientas ir po to10 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1M NaCI. Buvo tiriamas eliuuotų frakcijų aktyvumas, frakcijos su aukštesniu aktyvumu buvo toliau koncentruojamos Vivaspin® 15R (Vivascience, dabar Sartorius Vivascience GmbH, Goettingen, Germany). į koncentruotą Aatll-HF buvo pridedamas lygus tūris glicerolio ir laikoma -20 °C.

3. Aatll-HF ir Aatll-WT palyginimas

Aatll-HF ir Aatll-WT Fl buvo nustatyti atskirai ant pBR322 DNR keturiuose NEB buferiuose su A skiedikliu. Palyginimas parodytas Rezultatai išdėstyti lentelėje 24 (žemiau).

Lentelė 24: Aatll-HF ir Aatll-WT palyginimas

Buferis	Aatll-HF	Aatll-VVT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	Fl	Aktyvumas	Fl
NEB1	NC	NC	3%	32	ND
NEB2	NC	NC	100%	1/4	ND
NEB3	NC	NC	NC	NC	ND
NEB4	100%	£1000	50%	16	£64

NC: nežbaigta; ND: neišmatuojama

Aatll-HF didžiausią aktyvumą rodė NEB4 buferyje, kur Fl buvo £1000; AatllWT aktyviausias buvo NEB2, kur Fl buvo 1/4. Bendras pagerinimo faktorius Fl yra £1000/1 /4=£4000.

Pavyzdys 24: HF Apol konstravimas

1. Apol raiška

Apol raiška buvo vykdoma E. coli 3081, transformuotose pRRS-ApolR ir pACYC184-ApolM, kiekviena iš kurių turi Apol endonukleazės ir metilazės geną. Ląstelės buvo auginamos 37 °C temperatūroje LB terpėje per naktį su Amp ir Cam.

2. Apol-HF mutagenezė

Visos liekanos Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gin ir Arg, buvo pakeistos į Ala padėtyse 8, 9,10,11,13,14,17,18,19,20,21,22,23, 24,26,28, 29,

33, 35, 36, 37, 39, 41,43, 47, 48, 49, 50, 51,56, 57, 60, 62, 63, 64, 66, 67, 69, 71,72,

73, 75, 76, 77, 80, 81,82, 83, 84, 87, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 102, 103, 105, 106, 107,

108, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 124, 125, 128, 129, 131, 132,

133, 136, 137, 143, 144, 145, 148, 153, 155, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 166, 167,

169, 170, 175, 176, 178, 179, 181, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 192, 193, 194, 195,

199, 201, 202, 204, 206, 207, 209, 210, 214, 216, 217, 218, 221,226, 227, 229 ir 230.

Mutagenezė buvo atlikta atvirkštinės PGR metodu su poriniais pradmenimis ir po to sekančiu skaldymu Dpnl. Apdorotas produktas buvo po to transformuotas į E. coli ER2426 kamieną.

3. Apol-HF atranka

Apol-HF atranka buvo pasiekta naudojant aktyvumų palyginimą NEB3 ir NEB4 buferiuose, naudojant lambda DNR kaip substratą. Buvo atrinkti mutantai su didesniu aktyvumu negu WT NEB4 buferyje, kadangi padidintas aktyvumas NEB4 buferyje yra padidinto tikslumo indikatorius. Buvo rasti sekantys mutantai, turintys didesnį aktyvumą NEB4: S64A, S80A, S162A, T77A/T96A ir N178A. Apol(T77A/T96A) yra pavadintas kaip Apol-HF.

4. Apol-HF gryninimas

Du litrai ląstelių EK2426(pRRS-Apol(T77A/T96A), pACYC184-ApolM)) buvo auginamos LB terpėje su 100 pg/ml Amp ir 33 pg/ml Cam prie 37 °C per naktį. Ląstelės buvo surinktos ir veikiamos ultragarsu 20 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI. Po centrifugavimo prie 15000 rpm 30 minučių, supernatantas švirkštu buvo įleistas į 5ml HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine., Piscatavvay, NJ) iš anksto subalansuotą su tuo pačiu buferiu. Į kolonėlę įleidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-IM NaCI linijinis gradientas ir po to10 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1M NaCI. Buvo tiriamas eliuuotų frakcijų aktyvumas, frakcijos su aukštesniu aktyvumu buvo toliau koncentruojamos Vivaspin® 15R (Vivascience, dabar Sartorius Vivascience GmbH, Goettingen, Germany). Į koncentruotą Apol-HF buvo pridedamas lygus tūris glicerolio ir laikoma -20 °C.

5. Apol-HF ir Apol-WT palyginimas

Apol-HF ir Apol-WT Fl buvo nustatyti atskirai ant pXba DNR keturiuose NEB buferiuose su A skiedikliu. Palyginimas parodytas Rezultatai išdėstyti lentelėje 24 (žemiau).

Lentelė 24: Apol-HF ir Apol-WT palyginimas

Buferis	Apol-HF	Apol-WT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	Fl	Aktyvumas	Fl
NEB1	50%	£2000	25%	120	£16
NEB2	100%	£4000	100%	32	£125
NEB3	25%	£1000	100%	64	£16
NEB4	50%	£2000	50%	32	£64

Apol-HF didžiausią aktyvumą rodė NEB2 buferyje, kur Fl buvo £4000; ApolWT aktyviausias buvo NEB2 ir NEB3, kur Fl buvo 64. Bendras pagerinimo faktorius Fl yra £4000/64=£64.

Pavyzdys 25: HF BsmBI konstravimas

BsmBI atpažįsta ir skaldo CGTCTCN1/N5 kaip aprašyta Tarptautinės publikacijos Nr. VV02009/009797 23 pavyzdyje. BsmBI(R232A) mutantas buvo atrinktas kaip BsmBI didelio tikslumo versija. Tolimesnis šio mutanto characterizavimas atskleidė, kad nors BsmBI(R232A) elgesys vienos valandos skalėje yra labai geras, tačiau jis nepasirodo puikiu skaldyme per naktį. Atliekant paiešką tarp didesnio sakaičiaus mutantų, BsmBI(W238A) buvo surastas, kad yra puikus ir vienos valandos reakcijoje ir reakcijoje per naktį ir pavadintas BsmBI-HF (Figūra 13).

BsmBI-HF raiška buvo vykdoma ER3081 (pBAD241BsmBIR(W238A)/pACYC-BsmAIM). Auginimo ir gryninimo metodai buvo atlikti pagal VVO/2009/009797.

Sekančioje lentelėje (lentelė 26) palyginami BsmBI-HF ir BsmBI-WT Fl.

Lentelė 26: BsmBI-HF ir BsmBI-VVT palyginimas

Buferis	BsmBI-HF	BsmBI-VVT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	Fl	Aktyvumas	Fl
NEB1	50%	32	12,5%	1	32
NEB2	50%	120	50%	8	25
NEB3	12,5%	250	100%	120	2
NEB4	100%	250	25%	4	64

BsmBI-HF didžiausią aktyvumą rodė NEB4 buferyje, kur BsmBI-HF Fl NEB4 buvo 250; BsmBI-VVT aktyviausias buvo NEB3. Fl BsmBI-VVT NEB2 buvo 120. Bendras pagerinimo faktorius yra 2.

Pavyzdys 26: Didelio tikslumo Bmtl konstravimas

1. Bmtl raiška

Bmtl raiška buvo vykdoma E.coli, transformuotose pACYC-BmtIM ir placzzlBmtlR. pACYC yra mažakopijinė suderinama plazmidė. Ląstelės buvo auginamos prie 37 °C per naktį LB terpėje su Amp ir Cam.

2. Bmtl mutagenezė

Atrinktų mutantų taškinė mutagenezė buvo atlikta atvirkštinės PGR metodu. Buvo padarytos 150 sekančių Bmtl aminorūgščių mutacijų. Cys, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Trp buvo mutuotos į Ala. Try buvo mutuota į Phe. Tai buvo: 5, 9, 11, 12, 16, 19, 20, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 39, 45, 46, 49, 50, 51, 53, 56, 58, 59, 60, 63, 65, 69, 71,72, 73, 74, 75, 76, 78, 79, 80, 81, 83, 85,

86, 88, 89, 90, 92, 9	3,94	,95,	97,9	8, 99	, 101, 104,	105, 106,	108, 110,	111, 112,	113
116,	118, 119, 120,	121,	122,	124,	128,	129, 131,	132, 133,	134, 136,	138, 139,	140
141,	142, 144, 145,	146,	147,	148,	150,	151, 152,	154, 156,	157, 161,	162, 163,	165
166,	167, 168, 169,	171,	172,	173,	175,	178, 179,	180, 181,	185, 186,	189, 190,	191
193,	194, 195, 196,	199,	200,	201,	202,	203, 204,	205, 206,	207, 208,	210, 211,	213
214,	216, 217, 218,	219,	220,	221,	222,	226, 228,	229, 230,	231, 234,	236, 237,	238

239 ir 241. Mutagenezė buvo atlikta atvirkštinės PGR metodu su poriniais pradmenimis ir po to sekančiu skaldymu Dpnl. Apdorotas produktas buvo po to transformuotas į E. co//'ER3081 kamieną.

3. Bmtl-HF atranka

Kiekvienos mutacijos keturios kolonijos buvo užaugintos LB terpėje su Amp ir Cam 37 °C per naktį. Standartiniai Bmtl giminingi ir žvaigždinio aktyvumo bandymai buvo atlikti naudojant pBC4 Exol buferyje ir 10 % DMSO.

Mutantai S50A, Y81F, N93A ir VV207A buvo atrinkti patikrinimo bandymuose. Po keleto palyginimo skirtingose sąlygose raundų buvo rasta, kad S50A yra privilegijuotas mutantas, išlaikantis aukštą kanoninį fermento aktyvumą, bet disponuojantis iš esmės sumažintu žvaigždiniu aktyvumu. Bmtl(S50A) buvo pažymėtas kaip Bmtl-HF.

4. Bmtl-HF gryninimas

Du litrai E. coli ląstelių 3081 (placzzl-BmtlR(S50A), pACYC-BmtIM) buvo užaugintos LB terpėje su 100 pg/ml Amp and 30 pg/ml Cam prie 37 °C per naktį. Ląstelės buvo surinktos ir veikiamos ultragarsu 20 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI. Po centrifugavimo prie 15000 rpm 30 minučių, supernatantas švirkštu buvo įleistas į 5ml HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine., Piscatavvay, NJ) iš anksto subalansuotą su tuo pačiu buferiu. Į kolonėlę įleidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-IM NaCI linijinis gradientas irpotolO ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5,1M NaCI. Buvo tiriamas eliuuotų frakcijų aktyvumas, frakcijos su aukštesniu aktyvumu buvo toliau koncentruojamos Vivaspin® 15R (Vivascience, dabar Sartorius Vivascience GmbH, Goettingen, Germany). Į koncentruotą Bmtl-HF buvo pridedamas lygus tūris glicerolio ir laikoma -20 °C.

5. Bmtl-HF ir Bmtl-WT palyginimas

Bmtl-HF buvo du kartus paeiliui praskiestas A skiedikliu ir juo veikiama pXba. Rezultatas yra parodytas lentelėje 27.

Lentelė 27: Bmtl-HF ir Bmtl-WT palyginimas

Buferis	Bmtl-HF	Bmtl-VVT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	Fl	Aktyvumas	Fl
NEB1	25%	>256000	50%	32	>8000
NEB2	25%	>256000	100%	16	>16000
NEB3	0,2 %	>2000	6,3 %	32	>64
NEB4	100%	>1000000	100%	16	>62500

Bmtl-HF didžiausią aktyvumą rodė NEB4 buferyje, kur Fl buvo £1000000; Bmtl-WT aktyviausias buvo NEB2 ir NEB4, kur Fl buvo 16. Bendras pagerinimo faktorius Fl buvo £1000000/164=£62500.

Pavyzdys 27: HF BstNI konstravimas

1. BstNI raiška

BstNI raiška buvo vykdoma E.coli, transformuotose pBAD241-BstNIR and pACYC184-BstNIM, kiekviena iš kurių turi BstNI endonukleazės ir metilazės geną. Ląstelės buvo auginamos 37 °C temperatūroje LB terpėje per naktį su Amp ir Cam, praskiestos iki 1/10 LB terpe ir tuomet indukuotos arabinoze 4 valandas.

2. BstNI-HF mutagenezė ir atranka

Serijos BstNI mutacijų sukūrimo eksperimento metu buvo surastas

BstNI(G26N), turintis mažesnį žvaigždinį aktyvumą negu WT BstNI. Ieškant geresnių

BstNI mutantų su netgi mažesniu žvaigždiniu aktyvumu, G26 buvo mutuotas į visas kitas aminorūgštis. Tarp visų šių mutantų BstNI(G26T) turėjo mažiausią žvaigždinį aktyvumą ir yra pavadintas kaip BstNI-HF.

3. BstNI-HF gryninimas

Du litrai ląstelių EK2833(pBAD241-BstNI(G26T), pACYC184-BstNIM) buvo auginamos LB terpėje su 100 pg/ml Amp ir 33 pg/ml Cam prie 37 °C per naktį. Po to ląstelės buvo praskiestos 1:10 LB terpe ir indukuotas arabinoze, kurios galutinė koncentracija 0,2 %, keturias valandas. Ląstelės buvo surinktos ir veikiamos ultragarsu 20 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCl. Po centrifugavimo prie 15000 rpm 30 minučių, supernatantas švirkštu buvo įleistas į 5ml HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine., Piscatavvay, NJ) iš anksto subalansuotą su tuo pačiu buferiu. Į kolonėlę įleidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCl, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-IM NaCl linijinis gradientas ir po to 10 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1M NaCl. Buvo tiriamas eliuuotų frakcijų aktyvumas, frakcijos su aukštesniu aktyvumu buvo toliau koncentruojamos Vivaspin® 15R (Vivascience, dabar Sartorius Vivascience GmbH, Goettingen, Germany). Į koncentruotą BstNI-HF buvo pridedamas lygus tūris glicerolio ir laikoma -20 °C.

3. BstNI-HF ir BstNI-WT palyginimas

BstNI-HF ir BstNI-VVT Fl buvo nustatyti atskirai ant pBR322 DNR keturiuose NEB buferiuose su A skiedikliu. Palyginimas parodytas figūroje 14, ir rezultatai išdėstyti lentelėje 28 (žemiau).

Lentelė 28: BstNI-HF ir BstNI-VVT palyginimas

Buferis	BstNI-HF	BstNI-VVT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	Fl	Aktyvumas	Fl
NEB1	50%	£120	50%	8	£16
NEB2	100%	£500	100%	64	8
NEB3	25%	£120	100%	250	£1/8
NEB4	100%	500	50%	4	£32

BstNI-HF didžiausią aktyvumą rodė NEB2 irNEB4 buferiuose, kur Fl buvo £500; BstNI-VVT aktyviausias buvo NEB2 ir NEB3, kur Fl buvo 250. Bendras pagerinimo faktorius Fl buvo £500/250=£2.

Pavyzdys 28: HF Mlul konstravimas

1. Mlul raiška

Mlul raiška buvo vykdoma E. coli, transformuotose pUC19-MlulR ir pACYCMIulM, kiekviena iš kurių turi Mlul endonukleazės ir metilazės geną. Ląstelės buvo auginamos 30 °C temperatūroje LB terpėje per naktį su Amp ir Cam.

2. Mlul mutagenezė

Visos liekanos Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr buvo pakeistos j Ala padėtyse 7, 8, 10,11,13,16, 21,23, 24, 26, 27, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 42, 44, 48, 50, 51, 54, 57, 59, 60, 61,67, 68, 71,72, 74, 75, 78, 79, 81, 83, 84, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 95, 97, 99, 101,102, 104, 106, 108, 111, 112, 114, 116, 117,

119,	120,	121, 123,	125,	128, 130,	131,	132,	134, 136,	137, 139, 140,	141, 142, 144,
145,	146,	148, 152,	154,	155, 156,	157,	159,	161, 163,	165, 166, 170,	172, 173, 174,
176,	177,	179, 180,	181,	182, 183,	184,	186,	189, 192,	195, 196, 197,	200, 206, 207,
208,	210,	211, 214,	216,	218, 219,	220,	221,	223, 227,	228, 230, 232,	233, 234, 236,
237,	238,	240, 243,	244,	247, 249,	255,	256,	257, 258,	261, 263, 264,	265, 266, 269;

Tyr buvo pakeistas j Phe padėtyse 14, 28, 47, 53, 77, 107,175, 198, 217, 239 ir 248.

Mutagenezė buvo atlikta atvirkštinės PGR metodu su poriniais pradmenimis ir po to sekančiu skaldymu Dpnl. Apdorotas produktas buvo po to transformuotas į E. coli ER1582 kamieną.

3. Mlul-HF atranka

Mlul-HF atranka buvo pasiekta panaudojant aktyvumo palyginimą NEB3 ir NEB4 buferiuose, naudojant lambda DNR kaip substratą. Buvo atrinkti mutantai su didesniu aktyvumu negu WT NEB4 buferyje, kadangi padidintas aktyvumas NEB4 yra padidinto tikslumo indikatorius. Buvo rastas vienintelis mutantas, atitinkantis mūsų kriterijus buvo E112A/R132A; Mlul(E112A/R132A) pavadintas Mlul-HF.

4. Mlul-HF gryninimas

Du litrai ląstelių EKi582(pUC19-Mlul(E112A/R132A), pACYC184- MIulM)) buvo auginamos LB terpėje su su 100 pg/ml Amp and 30 pg/ml Cam prie 30 °C per naktį. Ląstelės buvo surinktos ir veikiamos ultragarsu 20 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI. Po centrifugavimo prie 15000 rpm 30 minučių, supernatantas švirkštu buvo įleistas j 5ml HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine.,

Piscatavvay, NJ) iš anksto subalansuotą su tuo pačiu buferiu. Į kolonėlę įleidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-IM NaCI linijinis gradientas irpotolOml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5,1M NaCI. Buvo tiriamas eliuuotų frakcijų aktyvumas. Frakcijos su aukštesniu aktyvumu buvo toliau koncentruojamos Vivaspin® 15R (Vivascience, dabar Sartorius Vivascience GmbH, Goettingen, Germany). Į koncentruotą Mlul-HF buvo pridedamas lygus tūris glicerolio ir laikoma -20 °C.

5. Mlul-HF ir Mlul-WT palyginimas

Mlul-HF ir Mlul-WT Fl buvo nustatyti atskirai ant lambda DNR keturiuose NEB buferiuose su A skiedikliu. Palyginimas parodytas figūroje 15, ir rezultatai išdėstyti lentelėje 29 (žemiau).

Lentelė 29: Mlul-HF ir Mlul-WT palyginimas

Buferis	Mlul-HF	Mlul-WT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	Fl	Aktyvumas	Fl
NEB1	25%	>256000	50%	32	>8000
NEB2	25%	>256000	100%	16	>16000
NEB3	0,2 %	>2000	6,3 %	32	>64
NEB4	100%	>1000000	100%	16	>62500

Mlul-HF didžiausią aktyvumą rodė NEB2 ir NEB4 buferyje, kur Fl buvo >32000;

Mlul-WT aktyviausias buvo NEB3, kur Fl buvo 2000. Bendras pagerinimo faktorius Fl yra >32000/2000=>16.

Pavyzdys 29: HF Banį konstravimas

1. Banį raiška

Banį raiška buvo vykdoma E.coli, transformuotose pUC19-BanlR ir pACYC184-BanlM, kiekviena iš kurių turi Banį endonukleazės ir metilazės geną.. Ląstelės buvo auginamos prie 37 °C per naktį LB terpėje su Amp ir Cam.

2. Banl-HF mutagenezė

Visos liekanos Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr buvo pakeistos j Ala padėtyse 7, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 16, 19, 22, 23, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 40, 41,42, 43, 47, 50, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 61, 64, 66, 67, 69, 70, 71,75, 76, 81, 82, 84, 85, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 100, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 117, 121, 122, 123, 124, 126, 130, 131, 133, 135, 136, 138,

139,	140, 141,	143,	145, 146,	148,	150, 151, 152,	154,	156,	157,	160,	161, 169,	171,
174,	175, 176,	178,	179, 182,	183,	185, 187, 188,	191,	192,	193,	194,	195, 197,	198,
201,	202, 203,	208,	209, 211,	212,	213, 215,217,	218,	220,	221,	224,	225, 226,	229,
232,	233, 234,	236,	237, 238,	240,	242, 243, 244,	245,	246,	248,	249,	251, 252,	253,
254,	255, 256,	257,	259, 260,	262,	266, 267, 268,	269,	270,	271,	275,	277, 279,	281,
282,	283, 284,	285,	287, 288,	289,	291,292, 294,	296,	298,	301,	302,	303, 304,	305,
312,	313, 315,	316,	318, 319,	320,	321, 324, 325,	328,	329,	330,	331,	333, 337,	338,
339,	340, 342,	346;	Tyr buvo	pakei	istas į Phe padėtyse	104,	125,	127,	156, 159,	204,

239, 297, 306 ir 336.

Mutagenezė buvo atlikta atvirkštinės PGR metodu su poriniais pradmenimis ir po to sekančiu skaldymu Dpnl. Apdorotas produktas buvo po to transformuotas į E. coli ER2683 kamieną.

3. Banl-HF atranka

Banl-HF atranka buvo pasiekta panaudojant aktyvumo palyginimą vandenyje ir NEB4 prieš glicerolj ir NEB Exol buferį, naudojant lambda DNR kaip substratą. Buvo atrinkti mutantai su tokiu aktyvumu arba didesniu kaip WT NEB4 buferyje, jeigu jie taip pat rodė žvaigždinio aktyvumo pasikeitimą, jeigu buvo tiriama esant glicerolio sąlygoms. Kitas indikatorius, naudojamas šių mutantų atrinkimui, buvo faktas, kad žvaigždinio aktyvumo pašalinimas sukuria palaipsnišką gretimo skaldymo saitą. Buvo surasti skaitlingi mutantai, turintys žvaigždinio aktyvumo pakitimus ir gaunamą palaipsnišką saitą: N016A,S33A, P36A, H76A, P87A, N89A, R90A, T138A, K141A, K143A, Q221A, Q224A, N253A, Q292A, R296A, T152I, G326A irT324A. Banl(Q292A) yra pavadintas kaip Banl-HF.

4. Banl-HF gryninimas

Du litrai ląstelių E/?2683(pUC19-Banl(P154A), pACYC184-BanlM)) buvo auginamos LB terpėje su 100 pg/ml Amp ir 33 pg/ml Cam prie 37 °C per naktį. Ląstelės buvo surinktos ir veikiamos ultragarsu 20 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI. Po centrifugavimo prie 15000 rpm 30 minučių, supernatantas švirkštu buvo įleistas į 5ml HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine., Piscatavvay, NJ) iš anksto subalansuotą su tuo pačiu buferiu. J kolonėlę įleidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-IM NaCI linijinis gradientas ir po to10 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1M NaCI. Buvo tiriamas eliuuotų frakcijų aktyvumas, frakcijos su aukštesniu aktyvumu buvo toliau koncentruojamos Vivaspin® 15R (Vivascience, dabar Sartorius Vivascience GmbH,

Goettingen, Germany). J koncentruotą Banl-HF buvo pridedamas lygus tūris glicerolio ir laikoma -20 °C.

5. Banl-HF ir Banl-WT palyginimas

Banl-HF ir Banl-VVT FI buvo nustatyti atskirai ant lambda DNR keturiuose NEB buferiuose su A skiedikliu. Rezultatai išdėstyti lentelėje 30 (žemiau).

Lentelė 30: Banl-HF ir Banl-VVT palyginimas

Buferis	Banl-HF	Banl-VVT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	FI	Aktyvumas	FI
NEB1	50%	£1000	25%	4	£250
NEB2	12,5%	£250	25%	4	£63
NEB3	0,4 %	£8	6,3 %	2	£4
NEB4	100%	£2000	100%	16	£125

Banl-HF didžiausią aktyvumą rodė NEB4 buferyje, kur FI buvo £2000; BanlVVT taip pat aktyviausias buvo NEB4, kur FI buvo 16. Bendras pagerinimo faktorius yra £2000/16=£125.

Pavyzdys 30: HF Kasi konstravimas

1. Kasi raiška

Kasi raiška buvo vykdoma E.coli, transformuotose placZZ-KaslR ir pACYSfolM, kiekviena iš kurių turi Kasi endonukleazės ir metilazės geną.. Ląstelės buvo auginamos prie 30 °C per naktį LB terpėje su Amp ir Cam.

2. Kasl-HF mutagenezė

Visos liekanos Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr buvo pakeistos j Ala padėtyse 7, 8, 9, 11, 13, 14, 17, 18, 21, 24, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 34, 36, 37, 39, 42, 43, 44, 47, 48, 51, 52, 54, 55, 56, 58, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 69, 70, 73, 76, 77, 78, 79, 83, 85, 86, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 98, 100, 101, 102, 103, 104, 108, 110, 111, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 122, 123, 124, 125, 126, 128, 129, 134, 137,

138, 139, 140, 142, 143, 144, 145, 146, 149, 150, 152, 153, 154, 156, 158, 161, 162,

163, 164, 165, 167, 168, 173, 177, 178, 180, 181, 182\, 184, 185, 188, 189, 190, 191,

192, 195, 197, 198, 200, 202, 203, 204, 210, 211, 212, 214, 215, 216, 217, 218, 219,

220, 221, 222, 223, 225, 226, 228, 229, 231, 234, 237, 238, 241, 243, 244, 245, 246,

248, 251, 253, 255, 257, 258, 259, 260, 261, 263, 264, 265, 266, 269, 270, 271, 274,

275, 276, 277 ir 278; Tyr buvo pakeistas į Phe padėtyse 19, 41,74, 80, 95, 207 ir 256.

Mutagenezė buvo atlikta atvirkštinės PGR metodu su poriniais pradmenimis ir po to sekančiu skaldymu Dpnl. Apdorotas produktas buvo po to transformuotas į E. coli ER2683 kamieną.

3. Kasl-HF atranka

Kasl-HF atranka buvo pasiekta naudojant aktyvumo palyginimą NEB3 ir NEB4 buferiuose, kaip substratą naudojant pBR322 DNR. Buvo atrinkti mutantai su didesniu aktyvumu, negu WT NEB4, kadangi padidintas aktyvumas NEB4 yra pagerinto tikslumo indikatorius. Buvo surasti sekantys mutantai, turintys didesnį aktyvumą NEB4: K024A, P214A, E146A, N251A ir Y095F. Kasl(N251A) yra pavadintas kaip Kasl-HF.

4. Kasl-HF gryninimas

Du litrai ląstelių ER2683(pLacZZ-Kasl(M251A), pACYC-SfolM)) buvo auginama LB terpėje su 100 pg/ml Amp and 33 pg/ml Cam prie 30 °C per naktį. Ląstelės buvo surinktos ir veikiamos ultragarsu 20 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI. Po centrifugavimo prie 15000 rpm 30 minučių, supernatantas švirkštu buvo įleistas j 5ml HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine., Piscatavvay, NJ) iš anksto subalansuotą su tuo pačiu buferiu. J kolonėlę įleidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-IM NaCI linijinis gradientas ir po to10 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5,1M NaCI. Buvo tiriamas eliuuotų frakcijų aktyvumas, frakcijos su aukštesniu aktyvumu buvo toliau koncentruojamos Vivaspin® 15R (Vivascience, dabar Sartorius Vivascience GmbH, Goettingen, Germany). Į koncentruotą Kasl-HF buvo pridedamas lygus tūris glicerolio ir laikoma -20 °C.

5. Kasl-HF ir kasl-WT palyginimas

Kasl-HF ir Kasl-VVT FI buvo nustatyti atskirai ant pBR322 DNR keturiuose NEB buferiuose su B skiedikliu. Rezultatai išdėstyti lentelėje 31 (žemiau).

Lentelė 31: Kasl-HF ir Kasl-VVT palyginimas

Buferis	Kasl-HF	Kasl-VVT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	FI	Aktyvumas	FI
NEB1	50%	>8000	100%	1	>8000
NEB2	100%	£16000	100%	8	>2000

NEB3	12,5%	>2000	100%	8	>250
NEB4	100%	>16000	100%	4	>4000

Kasl-HF didžiausią aktyvumą rodė NEB2 ir NEB4 buferyje, kur Fl yra >16000; Kasl-WT taip pat aktyviausias buvo tuose pačiuose buferiuose, kur geriausiasb Fl yra 8. Bendras pagerinimo faktorius yra £16OOO/8=£2OOO.

Pavyzdys 31: HF Nrul konstravimas

1. Nrul raiška

Nrul raiška buvo vykdoma E.coli, transformuotose pUC19-NrulR ir pACYCSbo13IM, kiekviena iš kurių turi Nrul endonukleazės ir metilazės geną. Ląstelės buvo auginamos prie 37 °C per naktį LB terpėje su Amp ir Cam.

2. Nrul-HF mutagenezė

Visos liekanos Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr buvo pakeistos į Ala padėtyse 8, 10, 12, 13, 15, 16, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 26, 30, 34, 36, 38, 39, 44, 45, 46, 47, 49, 50, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 68, 70, 71, 72, 73, 75, 77, 79, 80, 82, 83, 84, 85, 87, 89, 90, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 99, 101, 103,

104, 106, 107, 112, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 124, 125, 127, 132, 134, 137, 138,

139, 141, 146, 147, 148, 149, 152, 154, 155, 157, 158, 159, 162, 163, 165, 166, 168,

169, 170, 171, 174, 175, 177, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 189, 190, 191, 193, 196,

197, 200, 201,202, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 211 ir 213; Tyr buvo pakeistas į Phe padėtyse 11, 31, 52, 69, 98, 64 ir 187.

Mutagenezė buvo atlikta atvirkštinės PGR metodu su poriniais pradmenimis ir po to sekančiu skaldymu Dpnl. Apdorotas produktas buvo po to transformuotas į E. coli ER2683 kamieną.

3. Nrul-HF atranka

Nrul-HF atranka buvo pasiekta naudojant aktyvumų palyginimą NEB3 ir NEB4 buferiuose, naudojant dam- lambda DNR kaip substratą. Mutantai su disesniu aktyvumu negu WT NEB4 buferyje buvo atrinkti, kadangi padidintas aktyvumas NEB4 yra padidinto tikslumo indikatorius. Buvo rasti sekantys mutantai, turintys didesnį aktyvumą NEB4: G075A, Q099A, G155A ir P022A/R90A. P154A Nrul(P022A/R90A) yra pavadintas kaip Nrul-HF.

4. Nrul-HF gryninimas

Du litrai ląstelių EK2683(pUC19-Nrul(P022AR90A), pACYC184-Sbol3IM) buvo auginamos LB terpėje su 100 pg/ml Amp ir 33 pg/ml Cam prie 37 °C per naktį. Ląstelės buvo surinktos ir veikiamos ultragarsu 20 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI. Po centrifugavimo prie 15000 rpm 30 minučių, supernatantas švirkštu buvo įleistas j 5ml HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine., Piscatavvay, NJ) iš anksto subalansuotą su tuo pačiu buferiu. J kolonėlę įleidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-IM NaCI linijinis gradientas ir po tol 0 ml 10 mM T ris-HCI, pH 7,5,1M NaCI. Buvo tiriamas eliuuotų frakcijų aktyvumas, frakcijos su aukštesniu aktyvumu buvo toliau koncentruojamos Vivaspin® 15R (Vivascience, dabar Sartorius Vivascience GmbH, Goettingen, Germany). Į koncentruotą Nrul-HF buvo pridedamas lygus tūris glicerolio ir laikoma -20 °C.

5. Nrul-HF ir Nrul-WT palyginimas

Nrul-HF ir Nrul-WT Fl buvo nustatyti atskirai ant dam- lambda DNR keturiuose NEB buferiuose su A skiedikliu. Rezultatai išdėstyti lentelėje 32 (žemiau).

Lentelė 32: Nrul-HF ir Nrul-VVT palyginimas

Buferis	Nrul-HF	Nrul-VVT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	Fl	Aktyvumas	Fl
NEB1	0,4 %	>64	12,5%	64	>1
NEB2	6,3 %	>1000	50%	250	>4
NEB3	6,3 %	>1000	100%	500	>2
NEB4	100%	>16000	12,5%	32	>32

Nrul-HF didžiausią aktyvumą rodė NEB4 buferyje, kur Fl buvo >16000; NrulVVT aktyviausias buvo NEB3, kur Fl buvo 500. Bendras pagerinimo faktorius yra >16000/500=>32.

Pavyzdys 32: HF Nspl konstravimas

1. Nspl raiška

Nspl raiška buvo vykdoma E. coli, transformuotose pUC19-NsplR ir pACYCFatlM, kiekviena iš kurių turi Nspl endonukleazės ir metilazės geną. Ląstelės buvo auginamos 37 °C temperatūroje LB terpėje per naktį su Amp ir Cam.

2. Nspl-HF mutagenezė

Visos liekanos Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr buvo pakeistos į Ala padėtyse 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 26, 29, 30, 31, 32, 34, 36, 37, 39, 40, 41,42, 44, 45, 46, 47, 50, 51, 52, 53, 55, 56, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 70, 71,72, 73, 74, 77, 78, 80, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 96, 97, 99, 100, 102, 104, 107, 108, 111, 114, 116, 117, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 132, 133, 134, 136, 138, 139, 141, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 150,

152, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172,

175, 176, 177, 178, 180, 181, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 191, 193, 195, 199, 200,

201, 202, 203, 205, 206, 208, 209, 210, 211,212, 213, 215, 216, 217, 220, 222, 225,

227, 230, 231, 234, 235, 236, ir 238; Tyr buvo pakeistas į Phe padėtyse 48, 75, 113, 115, 198 ir 224.

Mutagenezė buvo atlikta atvirkštinės PGR metodu su poriniais pradmenimis ir po to sekančiu skaldymu Dpnl. Apdorotas produktas buvo po to transformuotas į E. coli ER2566 kamieną.

3. Nspl-HF atranka

Nspl-HF atranka buvo pasiekta naudojant aktyvumo palyginimą NEB3 ir NEB4 buferiuose, kaip substratą naudojant pBR322 DNR. Buvo atrinkti mutantai su didesniu aktyvumu, negu WT NEB4, kadangi padidintas aktyvumas NEB4 yra pagerinto tikslumo indikatorius. Buvo surasti sekantys mutantai, turintys didesnį aktyvumą NEB4: S097A ir E125A. Nspl(S097A) yra pavadintas kaip Nspl-HF.

4. Nspl-HF gryninimas

Du litrai ląstelių EK2566(pUC19-Nspl(S097A), pACYC-FatIM)) buvo auginamos LB terpėje su 100 pg/ml Amp ir 33 pg/ml Cam prie 37 °C per naktį. Ląstelės buvo surinktos ir veikiamos ultragarsu 20 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI. Po centrifugavimo prie 15000 rpm 30 minučių, supernatantas švirkštu buvo įleistas į 5ml HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine., Piscatavvay, NJ) iš anksto subalansuotą su tuo pačiu buferiu. Į kolonėlę įleidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-IM NaCI linijinis gradientas ir po to10 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1M NaCI. Buvo tiriamas eliuuotų frakcijų aktyvumas. Frakcijos su aukštesniu aktyvumu buvo toliau koncentruojamos Vivaspin® 15R (Vivascience, dabar Sartorius Vivascience GmbH,

Goettingen, Germany). Į koncentruotą Nspl-HF buvo pridedamas lygus tūris glicerolio ir laikoma -20 °C.

5. Nspl-HF ir Nspl-VVT palyginimas

Nspl-HF ir Nspl-VVT Fl buvo nustatyti atskirai ant pUC19 DNR keturiuose NEB buferiuose su A skiedikliu ir su BSA. Palyginimas yra parodytas figūroje 16, ir rezultatai išdėstyti lentelėje 33 (žemiau).

Lentelė 33: Nspl-HF ir Nspl-VVT palyginimas

Buferis	Nspl-HF	Nspl-VVT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	Fl	Aktyvumas	Fl
NEB1	100%	£4000	100%	250	£16
NEB2	100%	£500	100%	16	£32
NEB3	12,5%	£250	25%	120	£50
NEB4	100%	500	50%	32	£16

Nspl-HF didžiausią aktyvumą rodė NEB1 ir NEB4 buferyje, kur geriausias Fl buvo £4000; Nspl-VVT aktyviausias buvo NEB1 ir NEB2 buferiuose, kur geriausiasb Fl buvo 250. Bendras pagerinimo faktorius yra £4OOO/25O=£16.

Pavyzdys 33: HF BsrFI konstravimas

1. BsrFI raiška

BsrFI raiška buvo vykdoma E.coli, transformuotose pBAD-BsrFIR ir pSYX33HpalIM, kiekviena iš kurių turi BsrFI endonukleazės ir metilazės geną.. Ląstelės buvo auginamos prie 37 °C per naktį LB terpėje su Amp ir Kan su arabinozės indukcija.

2. BsrFI-HF mutagenezė

Visos liekanos Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr buvo pakeistos į Ala padėtyse 7, 8, 9, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 25, 26, 28, 32, 35, 36, 37, 39, 40, 41,42, 44, 45, 46, 48, 49, 51, 52, 56, 59, 61,62, 64, 65, 66, 68, 72, 73, 74,75, 76, 77, 80, 86, 87, 89, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 103, 105, 106, 108, 109, 111, 113, 114, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 126, 128, 129, 130, 133, 134, 135, 136,

137, 139, 142, 143, 144, 145, 146, 151, 152, 153, 154, 157, 158, 159, 161, 162, 163,

165, 166, 168, 169, 170, 171, 173, 174, 177, 180, 181, 183, 184, 185, 187, 189, 190,

194, 196, 198, 199, 200, 202, 203, 204, 205, 206, 208, 211, 212, 213, 214, 217, 218,

222, 224, 226, 229, 230, 231, 233, 235, 238, 240, 241, 242, 243, 245, 246, 248, 249,

250, 253, 254, 257, 258, 259, 262, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 272, 273, 276, 278,

279, 281,282, 284 ir 285; Tyr yra pakeistas j Phe padėtyse 14, 34, 53, 90, 96, 99,125,

160, 227, 236, 237.

Mutagenezė buvo atlikta atvirkštinės PGR metodu su poriniais pradmenimis ir po to sekančiu skaldymu Dpnl. Apdorotas produktas buvo po to transformuotas į E. coli ER2566 kamieną.

3. BsrFI-HF atranka

BsrFI-HF atranka buvo pasiekta naudojant aktyvumų palyginimą NEB3 ir NEB4 buferiuose, naudojant pBR322 DNR kaip substratą. Mutantai su disesniu aktyvumu negu WT NEB4 buferyje buvo atrinkti, kadangi padidintas aktyvumas NEB4 yra padidinto tikslumo indikatorius. Buvo rasti sekantys mutantai, turintys didesnį aktyvumą NEB4: K021A/I031R ir T120A. BsrFI(KO21A/IO31R) yra pavadintas kaip BsrFI-HF.

4. BsrFI-HF gryninimas

Du litrai ląstelių EK2566(pBAD-BsrFI(K021A/l031R), pSYX33-HpallM) buvo auginamos LB terpėje su 100 pg/ml Amp ir 33 pg/ml Kan prie 37 °C per naktį su 0,2 % arabinozės indukcija po 8 valandų. Ląstelės buvo surinktos ir veikiamos ultragarsu 20 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI. Po 30 minučių centrifugavimo prie 15000 rpm, supernatantas švirkštu buvo įleistas j 5ml HiTrap™ Heparin HP kolonėlę (GE Healthcare, dabar Pfizer, Ine., Piscatavvay, N J) iš anksto subalansuotą su tuo pačiu buferiu. J kolonėlę įleidžiama tokia eiga: 48 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI, 100 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50mM-IM NaCI linijinis gradientas ir po to 10 ml 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1M NaCI. Buvo tiriamas eliuuotų frakcijų aktyvumas, frakcijos su aukštesniu aktyvumu buvo toliau koncentruojamos Vivaspin® 15R (Vivascience, dabar Sartorius Vivascience GmbH, Goettingen, Germany). Į koncentruotą BsrFI-HF buvo pridedamas lygus tūris glicerolio ir laikoma -20 °C.

5. BsrFI-HF ir BsrFI-VVT palyginimas

BsrFI-HF ir BsrFI-VVT FI buvo nustatyti atskirai ant pBR322 DNR keturiuose NEB buferiuose su A skiedikliu. Palyginimas parodytas figūroje 17 ir rezultatai išdėstyti lentelėje 35 (žemiau).

Lentelė 35: BsrFI-HF ir BsrFI-WT palyginimas

Buferis	BsrFI-HF	BsrFI-WT	Pagerinimo faktorius
Aktyvumas	Fl	Aktyvumas	Fl
NEB1	100%	>500	25%	16	>32
NEB2	12,5%	>64	100%	4	>500
NEB3	NC	NC	3,1 %	8	>-8
NEB4	100%	>500	50%	16	>32

BsrFI-HF didžiausią aktyvumą rodė NEB4 buferyje, kur Fl buvo >16000; BsrFIWT aktyviausias buvo NEB2, kur Fl buvo 4. Bendras pagerinimo faktorius yra >500/4=>120.

Pavyzdys 34: HF BspEI konstravimas

1. BspEI raiška (SEQ ID Nr. 34)

BspEI raiška buvo vykdoma E. coli, transformuotose pLazzI-BspEIR ir pACYC184-BspEIM, kiekviena iš kurių turi BspEI endonukleazės ir metilazės geną. Ląstelės buvo auginamos 37 °C temperatūroje LB terpėje per naktį su Amp ir Cam.

2. BspEI-HF mutagenezė

Visos liekanos Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr buvo pakeistos j Ala padėtyse 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 19, 20,21,22,23, 27, 30, 31,33,

34, 35, 36, 37, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 48, 49, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 60, 62, 63,

64, 66, 67, 68, 71, 72, 73, 74, 75, 78, 79, 81,82, 84, 85, 88, 89, 91, 92, 93, 94, 95, 96,

98, 101, 102, 103, 106, 107, 108, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 121, 122, 124, 126, 127, 128, 129, 132, 133, 135, 136, 137, 138, 140, 141, 148, 149, 151, 153, 155, 156,

157, 160, 162, 164, 166, 167, 168, 169, 172, 174, 175, 176, 177, 178, 182, 183, 184,

185, 186, 187, 189, 192, 193, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 203, 204, 208, 209,

212, 213, 214, 216, 217, 218, 219, 221, 222, 228, 229, 231, 232, 233, 234, 235, 236,

237, 238, 239, 240, 242, 244, 245, 246, 250, 251, 253, 254, 255, 256, 258, 260, 261,

263, 264, 266, 267, 269, 270, 271, 272, 273, 275, 276, 277, 281, 282, 283, 285, 286,

288, 289, 293, 294.

Mutagenezė buvo atlikta atvirkštinės PGR metodu su poriniais pradmenimis ir po to sekančiu skaldymu Dpnl. Apdorotas produktas buvo po to transformuotas j E. co//ER3081 kamieną.

3. BspEI-HF atranka

BspEI-HF atranka buvo pasiekta naudojant aktyvumų palyginimą NEB3 ir NEB4 buferiuose, naudojant nemetilintą (λ ) DNR kaip substratą. WT BspEI turėjo didesnį aktyvumą NEB3, buvo atrinkatas vienintelis su didesniu aktyvumu NEB4. Rasti 6 mutantai, turintys didesnį aktyvumą NEB4: K7A, T10A, N11A, N14A, Q232A and T199A. T199A turėjo didžiausią aktyvumą NEB4 buferyje, lyginant su WT. BspEI(T199A) yra pavadintas kaip BspEI-HF.

Pavyzdys 35: Didelio tikslumo BamHI konstravimas (papildomi mutantai)

BamHI (SEQ ID Nr. 35) atpažįsta ir skaldo G/GATCC kaip aprašyta Tarptautinės publikacijos Nr. WO 2009/009797 1-ame pavyzdyje. BamHI(E163A/E167T) mutantas buvo atrinktas kaip BamHI didelio tikslumo versija.

Buvo atlikta pilna BamHI mutacija. Be liekanų, apie kurias pranešta ankstesniuose patentuose ir paraiškose, likusios liekanos taip pat buvo mutuotos į Ala padėtyse 3, 7, 8, 15, 16, 21, 22, 23, 24, 27, 29, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 45, 47, 48, 49, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 63, 64, 67, 68, 73, 74, 79, 80, 82, 83, 85, 90, 91, 92, 93, 95, 99, 100, 102, 105, 108, 109, 110, 112, 115, 116, 117, 124, 125, 127, 128, 129, 130, 131, 134, 136, 138, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 147, 148, 151, 152, 156, 158, 159, 162, 164, 166, 168, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 185, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 194, 197, 198, 203, 206, 210 ir 212.

Tarp šių mutantų P92A, P144A, G197A ir M198A turėjo aukštesnį aktyvumą negu laukinio tipo BamHI. P92A gali būti alternatyvus didelio tikslumo BamHI.

SEQ ID Nr. 1 <120> Didelio tikslumo restrikcijos endonukleazės <130> NEB-331-PCT <150> 61/301,666 <151> 2010-02-05 <150> 61/387,800 <151> 2010-09-29 <160> 35 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 260 <212> PRT <213> Proteus vulgaris <400> 1

Met Lys Lys Asn Arg Tyr Glu Ser Ile Ile Glu Gly Ile Phe Leu Asp

10 15

Lys Tyr Vai Asp Gly Asn Asp Ile Vai Glu Phe Asn Arg Thr Asp Ile

25 30

Ile Ser Lys Ser Ala Glu Leu Asp Ile Asn Leu Pro Lys Asn Ile Gly

40 45

Asp Vai Ile Tyr Ser Phe Lys Tyr Arg Ala Ser Leu Pro Vai Ser Ile

55 60

Thr Gln Lys Ala Gln Asn Gly Lys Glu Trp Vai Ile Lys Asn Ile Gly 65 70 75 80

Arg Ser Leu Tyr Cys Phe Gln Gln Vai Asn Tyr Ser Arg Ile Leu Pro

Asp Met Met Leu Ser Thr Ile Lys Ile Pro Asp Ser Thr Pro Thr Ile 100 105 110

Vai Ala Glu His Ala Phe Asn Asp Glu Gln Ala Leu Leu Thr Arg Vai 115 120 125

Arg Tyr Asn Arg Leu Ile Asp Ile Phe Thr Gly Ala Vai Cys Tyr Ser

130 135 140

Leu Gln Asn His Leu Arg Thr Thr Vai Pro Ser Vai Gly Gln Ile Glu 145 150 155 160

Thr Asp Glu Ile Tyr Vai Gly Vai Asp Arg Leu Gly Arg Gln Phe Ile

165 170 175

Phe Pro Vai Gln Ala Lys Gly Gly Lys Asp Glu Leu Gly Ile Vai Gln

180 185 190

Ile Glu Gln Asp Phe Leu Leu Cys Arg His Lys Tyr Pro Asn Leu Ile

195 200 205

Cys Arg Pro Ile Ala Thr Gln Phe Ile Ser Asn Asp Lys Ile Ala Ile

210 215 220

Phe Glu Phe Vai Leu Glu Asn Asn Glu Vai Lys Lys Leu Gln Glu Lys 225 230 235 240

His Tyr Leu Leu Vai Gly Lys Gly Gln Ile Ser Vai Asp Glu Leu Ser

245 250 255

Asn Tyr Asn Phe

260

Claims (6)

1. Išradimo apibrėžtis

   1. Kompozicija, apimanti: fermentą, apimantį SEQ ID Nr. 1, kurioje viena arba daugiau aminorūgščių yra mutuotos, kur vienos arba daugiau mutacijų padėtis yra parinkta iš grupės, susidedančios iš S36, K77, P154, E163, Y165 ir K185.
2. 2. Fermentas pagal 1 punktą, kur aminorūgšties mutacija yra parinkta iš grupės, susidedančios iš S36A, K77A, P154A, E163A, Y165F ir K185A.
3. 3. Fermentas pagal 1 arba 2 punktą, kur mutacija yra P154A.
4. 4. Nukleorūgšties seka, koduojanti fermentą, turintį aminorūgščių seką pagal bet kurį 1-3 punktą.
5. 5. Vektorius, apimantis nukleorūgšties seką pagal 4 punktą.
6. 6. Ląstelė šeimininkė, apimanti nukleorūgšties seką pagal 4 punktą arba vektorių pagal 5 punktą.