DE112008001157T5

DE112008001157T5 - Wärmebeständige bioaktive Zusammensetzung

Info

Publication number: DE112008001157T5
Application number: DE112008001157T
Authority: DE
Inventors: Ping North Oaks Wang; Songtao St. Paul Wu; Hongfei Ann Arbor Jia; Masahiko Okazaki Ishii; Xiaodong St. Paul Tong; Minjuan Ann Arbor Zhang
Original assignee: Toyota Motor Corp; Toyota Motor Engineering and Manufacturing North America Inc; University of Minnesota; Toyota Engineering and Manufacturing North America Inc
Current assignee: Toyota Motor Corp; University of Minnesota
Priority date: 2007-05-11
Filing date: 2008-05-12
Publication date: 2010-03-25
Anticipated expiration: 2028-05-13
Also published as: US20080293117A1; DE112008001157B4; WO2008141263A1; US8361768B2; JP2010526540A; JP5592254B2; US20120252090A1; US8222015B2

Abstract

Bioaktive Zusammensetzung, umfassend:
eine poröse Hydrogelmatrix;
wenigstens ein in der porösen Hydrogelmatrix immobilisiertes Protein, wobei das Protein eine Halbwertszeit aufweist, die wenigstens 1000-mal länger als die Halbwertszeit eines frei verdaubaren entsprechenden Proteins ist.

Description

Querverweis zu zugehörigen Anmeldungen
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der US-Patentanmeldung Seriennummer 12/118,171, eingereicht am 9. Mai 2008, deren Inhalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren derselben zum Stabilisieren von bioaktiven Materialien, und insbesondere Wärmebehandlungen zum Stabilisieren von Hydrogel-immobilisierten bioaktiven Materialien.
Hintergrund der Erfindung
Bioaktive Makromoleküle, wie Proteine, Nukleinsäuren und funktionelle Enzyme wurden in verschiedenen Aspekten biomedizinischer und industrieller Anwendungen weit verbreitet eingesetzt. Zum Beispiel wurden Nukleinsäuren als genetische Matrizen für Polymerase-Kettenreaktionen verwendet, während Proteine in Reinigungsmittelmischungen zum Steigern der digestiven Reinigungseffizienz des Reinigungsmittels verwendet wurden.
In der Reinigungsmittelindustrie können Proteine als Reinigungsmittelzusätze verwendet werden, um Flecken mit einem biologischen Bestandteil zu reinigen. Biologische Flecken können in Fahrzeuganwendungen vorliegen, sowohl auf inneren als auch auf äußeren Oberflächen des Fahrzeugs. Beispiele für Fahrzeugoberflächen schließen Beschichtungen, Farben und Sitzstoffe ein, die verschmutzt sein können, wenn die Oberflächen anhaltend Vogeldreck, Insektenablagerungen, Harzen von Nadelbäumen, Mikroben, Gummis etc. ausgesetzt sind. Gewisse Flecken, wie Flecken, die von Insekten stammen, sind mit gewöhnlicher bürstenfreier Autowäsche schwer zu entfernen. Innere Oberflächen und Beschichtungen können ebenso leicht mit Öl, Protein, Zucker und anderen Inhaltsstoffen von Lebensmitteln und Getränken befleckt werden. Biologische Flecken wie Vogeldreck, Pflanzenharze und Insektenkörper-Ablagerungen können, wenn sie angesammelt werden, die Lackoberfläche von Fahrzeugen beschädigen. Zusätzlich können Beschädigungen wie Sprünge oder Hufwölbungen, die mit einem anhaltenden Aussetzen gegenüber Flecken verbunden sind, durch Wärmebehandlung nicht wiederherstellbar sein. Es besteht daher Bedarf im Stand der Technik für das zeitige Entfernen solcher Flecken.
Als Antwort darauf wurde eine selbstreinigende Technologie entwickelt, um Ansammlungen von Flecken auf Oberflächen zu verringern und die bürstenlose Autowäsche zu einer vernünftigen Alternative zu machen. Dennoch ist die herkömmliche Selbstreinigungstechnologie, die entweder als hydrophobe oder hydrophile Beschichtung bekannt ist, nur zum Entfernen von anorganischem Schmutz wirksam, jedoch nicht für den von biologischen Flecken, welche aus verschiedenen Typen von organischen Polymeren bestehen und häufig imstande sind, beträchtlich in die untere Oberfläche der Beschichtungen zu diffundieren.
Proteine, wie Verdauungsproteine oder Enzyme, sind bekannt dafür, dass sie organische Moleküle katalysieren und abbauen. Verdauungsproteine können sowohl aktiv als auch stabil in organischen Medien sein, was es ermöglicht, verschiedene Substrate zu verwenden. Wenn das Substrat in Wasser unlöslich oder nur schwer löslich ist, kann die maximale Aktivität der Verdauungsproteine in der wässrigen Lösung nicht erreicht werden. Die Untersuchungen der Aktivität eines Verdauungsproteins in nicht wässrigen Medien im Stand der Technik ist vorwiegend durch den Bedarf motiviert, die Anwendbarkeit von Verdauungsproteinen für die Katalyse von Reaktionen auszudehnen, deren Recktanten und/oder Produkte nicht wasserlöslich sind.
Obwohl Proteine, wie Verdauungsproteine oder Enzyme imstande sind, Moleküle eines organischen Flecks abzubauen, sind sie im Allgemeinen bei erhöhten Temperaturen und unter trockenen oder nicht wässrigen Bedingungen nicht wärmebe ständig. Es besteht daher Bedarf im Stand der Technik für eine wärmestabile bioaktive Zusammensetzung, die bei erhöhter Temperatur und trockenen Bedingungen verwendet werden kann. Es besteht ebenso Bedarf im Stand der Technik für eine wärmestabile bioaktive Zusammensetzung und ein Verfahren zum Herstellen der bioaktiven Zusammensetzung, die bei verschiedenen Umweltbelastungen, einschließlich erhöhter Temperatur und Azidität stabil ist.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem ersten Aspekt wird eine bioaktive Zusammensetzung offenbart, die eine poröse Hydrogelmatrix einschließt. Wenigstens ein Protein ist in der porösen Hydrogelmatrix immobilisiert. Das Protein weist eine Halbwertszeit auf, die wenigstens 1000-mal länger als die Halbwertszeit eines frei verdaubaren entsprechenden Proteins ist.
In einem weiteren Aspekt wird eine bioaktive Zusammensetzung offenbart, die eine ein Volumen V1 definierende Pore einer Hydrogenmatrix einschließt. Wenigstens ein Protein mit einem Gesamtvolumen V2, das durch die gemeinsame dreidimensionale Größe des Proteins definiert wird, ist in der Pore immobilisiert. Das Verhältnis von (V1 – V2)/V1 beträgt weniger als 20 Prozent.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zum Stabilisieren einer bioaktiven Zusammensetzung offenbart, das die folgenden Schritte einschließt: Bilden von Poren einer Hydrogelmatrix um Proteinmoleküle; und Verringern des Wassergehalts in den Poren der Hydrogelmatrix, während die Proteinmoleküle biologisch aktiv bleiben.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 ist eine grafische Darstellung der Hydrogelstruktur, bei der Verdauungsproteine in der Wasserstoffstruktur eingeschlossen sind;
2 ist eine grafische Darstellung der Bildung der Hydrogelstruktur mit einem in der Hydrogelstruktur eingeschlossenen Verdauungsprotein für ein Acrylamidmonomer, eine N,N'-Methylenbisacrylamid-Vernetzungsverbindung und den Polymerisationsinitiator Ammoniumpersulfat und Tetramethylendiamin;
3 ist ein Diagramm der Veränderung der Hydrogelporosität nach Wärmebehandlung;
4 ist eine Figur, die den Grad der Volumenänderung eines in dem Hydrogel eingeschlossenen Glucoseoxidase-Materials nach Wärmevorbehandlung und Wiederbefeuchten in Wasser detailliert zeigt;
5A und 5B sind Raster-Elektronenmikroskop (SEM)-Bilder, die die Porosität der in einem Hydrogel eingeschlossenen Glucoseoxidase vor bzw. nach Wärmevorbehandlung detailliert zeigen;
6 ist eine Figur der relativen Aktivität als Funktion der Zeit bei 80° Celsius für wärmevorbehandelte, in dem Hydrogel eingeschlossene Glucoseoxidase-Moleküle, nicht wärmevorbehandelte, in dem Hydrogel eingeschlossene entsprechende Moleküle und freie ungebundene native entsprechende Moleküle;
7 ist eine Figur der relativen Aktivität als Funktion der Zeit bei 110° Celsius für wärmevorbehandelte, in dem Hydrogel eingeschlossene Glucoseoxidase-Moleküle, nicht wärmevorbehandelte, in dem Hydrogel eingeschlossene entsprechende Moleküle und freie ungebundene native entsprechende Moleküle;
8 ist eine Figur, die die relative Aktivität als Funktion der Zeit für wärmevorbehandelte, in dem Hydrogel eingeschlossene α-Chymotrypsinmoleküle, nicht wärmevorbehandelte in dem Hydrogel eingeschlossene entsprechende Moleküle und freie ungebundene native entsprechende Moleküle detailliert zeigt;
9 ist eine Figur der relativen Aktivität als Funktion der Zeit bei 110° Celsius für wärmevorbehandelte, in dem Hydrogel eingeschlossene α-Chymotrypsinmoleküle, nicht wärmevorbehandelte, in dem Hydrogel eingeschlossene entsprechende Moleküle und freie ungebundene native entsprechende Moleküle;
10 ist eine grafische Darstellung der relativen Aktivität als Funktion der Zeit in einer kombinierten Untersuchung unter extremen Bedingungen für die wärmevorbehandelte, in dem Hydrogel eingeschlossene Glucoseoxidase, ein nicht wärmevorbehandeltes, in dem Hydrogel eingeschlossenes entsprechendes Molekül und ein freies ungebundenes natives entsprechendes Molekül;
11 ist eine grafische Darstellung der Absorption als Funktion der Zeit bei 500 nm mit oder ohne die Anwesenheit der in dem Hydrogel eingeschlossenen Glucoseoxidase-Scheibe für eine Reaktionsmischung für die Aktivitätsuntersuchung.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Bioaktive Makromoleküle können große Moleküle bezeichnen, die biologische Funktionalität in der lebenden Zelle aufweisen. Bioaktive Makromoleküle können Nukleinsäuren, Verdauungsproteine und funktionelle Enzyme einschließen. Andere Bestandteile, wie unten beschrieben, können ebenso eingeschlossen sein.
Proteine können als bioaktive Katalysatoren wirken, die selektiv biochemische Reaktionen katalysieren können. Verschiedene Proteine können zum Reagieren mit biologischen Komponenten verwendet werden. Die Proteine können den Abbau von Biopolymeren beschleunigen oder Fette und Öle hydrolysieren. Verschiedene biologische Komponenten können mit der bioaktiven Zusammensetzung umgesetzt werden. Zum Beispiel können Flecken eine biologische Komponente sein und können kaputte Körper von Käfern, Überreste von Tieren, Lebensmittel, Milch und andere Getränke, kosmetische und Körperpflegeprodukte, ebenso wie andere Flecken auf biologischer Basis einschließen. Zusätzlich können andere biologische Komponenten als Flecken ebenso mit der bioaktiven Zusammensetzung umgesetzt werden. Verschiedene biologische Komponenten können Proteine, Polysaccharide, Fette oder Öle einschließen.
Wie oben angegeben, können verschiedene Proteine verwendet werden, um mit verschiedenen biologischen Komponenten zu reagieren. Zum Beispiel können Verdauungsproteine, wie Proteasen, die Proteinmoleküle hydrolysieren, Lipasen, die Fette und Lipide hydrolysieren, Cellulasen, die Cellulose hydrolysieren, Amylasen, die Kohlehydrate hydrolysieren, genauso wie andere Verdauungsproteine, wie Peroxidasen, Chymotrypsin, Subtilisin, Superoxiddismutase, Asparaginase und Cholesteroloxidase ein Bestandteil der bioaktiven Zusammensetzung sein.
Verschiedene analytische Untersuchungen und diagnostische Techniken können zum Quantifizieren der Aktivitäten der bioaktiven Beschichtungen verwendet werden. Die Menge eines Verdauungsproteins in einer Zusammensetzung kann basierend auf kalorimetrischen Untersuchungen und Massengleichgewichts-Berechnungen bestimmt werden. Verschiedene Verteilungen eines Verdauungsproteins in einer Zusammensetzung oder Beschichtung können unter Verwenden von Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden. Die Wärmestabilität eines Verdauungsproteins in einer bioaktiven Beschichtung kann durch Altern der Beschichtungen in einem Luft-Wärmeofen beurteilt werden, während die Aktivitätsänderung beobachtet wird.
Die bioaktive Zusammensetzung auf Proteinbasis sollte in trockenen oder halbtrockenen Umgebungen Funktionalität bewahren. Im Allgemeinen können Systeme auf Proteinbasis Wasser oder andere wässrige Elemente einschließen, um zu ermöglichen, dass die Reaktion des Proteins und einer biologischen Komponente stattfindet. Zusätzlich sollte die bioaktive Zusammensetzung auf Proteinbasis gemäß einem weiteren Aspekt stabil sein und ihre Bioaktivität unter verschiedenen extremen Bedingungen bewahren. Extreme Bedingungen können erhöhte Temperaturen, saure Bedingungen, mechanische Scherung, Aussetzen gegenüber ultravioletter Strahlung, sowie andere Umweltbedingungen einschließen. Die bioaktive Zusammensetzung auf Proteinbasis sollte nicht denaturieren und unter solchen Bedingungen bioaktiv bleiben.
In einem Aspekt kann die bioaktive Zusammensetzung Proteine einschließen, die in einem festen porösen Material dispergiert sind, einschließlich eines Hydrogels, das durch die Polymerisation zwischen Monomeren und Vernetzern gebildet wird. Verschiedene Monomere können verwendet werden und schließen Kohlenwasserstoffe, wie Alken- und Arenmaterialien ein. Verschiedene Monomere schließen Polyethylen, Ethan, Acrylmonomere wie Acrylsäure, Methylacrylat und Acrylamid ein, ebenso wie andere Monomere, wie Vinylalkohol und Vinylpyrrolidon. Verschiedene Vernetzer können ebenso verwendet werden und schließen N,N'-Methylenbisacrylamid, Polyazoniumverbindungen und Glutardialdehyd ein. Verschiedene Polymerisationsinitiatoren können verwendet werden und schließen Ammoniumpersulfat und Tetramethylenethylendiamin (TEMED) ein. Während der Polymerisationsreaktion können die Monomere und Vernetzer eine Matrixporen einschließende Hydrogelmatrix bilden.
In einem Aspekt können die Proteine in die Hydrogelmatrixporen eingekuppelt oder darin positioniert werden. Die Hydrogelmatrixporen können verschiedene Größen aufweisen, die ein oder zehn Proteine, und stärker bevorzugt ein oder zwei Proteine aufnehmen können. Die Konzentration an in der Hydrogelmatrix vorliegenden bioaktiven Makromolekülen kann für verschiedene Anwendungen variiert werden. In einem Aspekt können bioaktive Makromoleküle, wie Proteine, in einem Gehalt von 0,05 bis 7,0 Trockengewichtsprozent, und bevorzugt 0,07 bis 6,0 Trockengewichtsprozent, und stärker bevorzugt 0,1 bis 5,0 Trockengewichtsprozent vorliegen. Die Poren der Hydrogelmatrix weisen eine solche Größe auf, dass sie die Diffusion von biologischen Komponenten in die Hydrogelmatrix ermöglichen, so dass die Proteine auf sie wirken können. Auf diese Weise bleiben die Proteine in den Poren der Hydrogelmatrix positioniert und bleiben, zum Reagieren mit verschiedenen biologischen Komponenten biologisch aktiv. Die Hydrogelmatrix beugt dem Denaturieren der Proteine vor und erhöht die Halbwertszeit der Proteine wenigstens um ein 1000faches im Vergleich zur Halbwertszeit der freien Verdauungsproteine.
Bezugnehmend auf 1 wird dort eine schematische Darstellung einer Protein-Hydrogelstruktur gezeigt, die Poren einschließt, die wenigstens ein in der Pore positioniertes Protein aufweisen. In einem Beispiel und wie in 2 gezeigt, bildet die Polymerisationsreaktion zwischen Acrylamid und N,N'-Methylenbisacrylamid die Hydrogelmatrix, so dass Proteine in einer Pore der Hydrogelstruktur aufgenommen und geschützt werden.
Verschiedene Additive können in der Protein-Hydrogelstruktur eingeschlossen sein, einschließlich Tenside, verschiedene Vernetzerverbindungen, zusätzliche biologische Zusammensetzungen und verschiedene andere biologisch aktive Substanzen, therapeutische Substanzen und andere Additive. Zusätzlich kann das Hydrogel auf einer Oberfläche gebildet werden, die durch Zentrifugalkraft mit einer Lösung beschichtet ist, die ein Hydrogel bildendes Monomer, ein Protein und ein Vernetzungsmittel, einschließlich einer Polyazoniumverbindung und Glutardialdehyd enthält. Verschiedene Polyazoniumverbindungen können verwendet werden und können monomere oder polymere organische Verbindungen einschließen, die wenigstens zwei Seitenketten aufweisen und/oder eine terminale Diazoniumsalzgruppe. Die verschiedenen Polyazoniumverbindungen schließen Benzidin-Tetrazoniumsalz, wie Benzidin-Tetrazoniumchlorid-Zinkchlorid-Doppelsalz, ein Diethylbenzidin-Tetrazoniumsalz, wie Diethylbenzidin-Tetrazoniumchlorid-Zinkchlorid-Doppelsalz oder Diethylbenzidin-Tetrazoniumsulfat, ein Dichlorbenzidin-Tetrazoniumsalz, wie Dichlorbenzidin-Tetrazoniumchlorid-Zinkchlorid-Doppelsalz, ein n-Tolidin-Tetrazoniumsalz, wie o-Tolidin-Tetrazoniumchlorid-Zinkchlorid-Doppelsalz oder o-Tolidin-Tetrazoniumsulfat, ein o-Dianisidin-Tetrazoniumsalz, wie o-Dianisidin-Tetrazoniumchlorid-Zinkchlorid-Doppelsalz ein.
Verschiedene Tenside können oberflächenaktive Substanzen einschließen, die die Oberflächenspannung einer Flüssigkeit verringern. Verschiedene Tenside können zum Steuern der Hydrogeleigenschaften und der Morphologie, ebenso so wie zum Erhöhen der Proteinaktivität verwendet werden. Die verschiedenen Tenside schließen Laurylsulfat und Octylsulfat als anionische Tenside ein; Cetylpiridiniumchlorid und Dodecyltrimethylammoniumbromid als kationische Tenside; und Pluronic F-68 und Tween 20 als nichtionische Tenside ein.
In einem Aspekt kann das Tensid zwischen 0,5 bis 5,0 Gewichtsprozent der wässrigen Komponente der Hydrogel bildenden Lösung zugegeben werden. Wenn die Polymerkomponente der Hydrogellösung Polyurethan ist, können Urethan-Präpolymere mit Wasser zusammen mit einem oder mehreren Typen von Proteinen, Tensiden und Puffersalzen gemischt werden.
In einem Aspekt kann die bioaktive Zusammensetzung bioaktive Makromoleküle, wie Proteine, einschließen, die als gefriergetrocknetes Pulver oder wässrige Lösung zugegeben werden. In einem Aspekt kann die bioaktive Zusammensetzung wenigstens eines, eine Oxidoreductase, eine Transferase, eine Hydrolase, eine Lyase, eine Isomerase, eine Ligase, eine Protease, eine Amylase, eine Cellulase, eine Lipase, eine Peroxidase, eine Tyrosinase, eine Glycosidase, eine Nuklease, eine Aldolase, eine Phosphatase, eine Sulfatase oder eine Dehydrogenase einschließen.
Die bioaktive Zusammensetzung kann optional wenigstens eine biochemisch aktive Substanz einschließen, welche beispielhaft einen Antikörper, eine Nukleinsäure, eine Fettsäure, ein Hormon, ein Vitamin, ein Mineral, ein Strukturprotein, ein Enzym wie Glucoseoxidase und Alkoholase, eine therapeutische Substanz, wie einen Histaminblocker und ein anti-thrombogenes Material, wie Heparin, einschließt.
Zusätzliche therapeutische Mittel schließen beispielhaft cardiovaskuläre Arzneimittel ein, wie cardioaktive und vasoaktive Arzneimittel, Blutdruck steigernde Mittel, Blutdruck senkende Mittel, Antiarrhythmica, Betablocker, Herzglykoside, synthetische herzstärkende Mittel, Calcium-Antagonisten, den Kreislauf beeinflussende Arzneimittel, Blutdiuretika, Neuropharmazeutika, wie neuropharmazeutische Mittel, Analeptika, Analgesica, Antipyretika, Anästhetika, Appetitzügler, antiepileptische Arzneimittel, Sedativa, Lokalanästhetika, Parkinson-Behandlung, Antipsychotika, Neuroleptika, Skelettmuskel-Relaxantien, Spasmolytika; Magen-Darm-Arzneimittel, wie Anti-Ulcus-Arzneimittel, Antiemetika, Abführmittel, gastropyretische Mittel, Motilin; Atemwegs-Arzneimittel, wie Hustenheilmittel, Antiasthmatika, Antiallergika; anti-infektiöse Arzneimittel, wie Antibiotika, synthetische chemotherapeutische Mittel, Antimykotika, Antihelmintika, HIV-Therapeutika; endokrine Arzneimittel, wie Steroide, Peptidhormone, chemische Kontrazeptiva, Schilddrüsen-Therapeutika, orale antidiabeti sche Arzneimittel; und verschiedene Arzneimittel, wie Gichtheilmittel, Immuntherapie, Krebs-Chemotherapie, ophtalmologische Mittel.
In einem Aspekt kann das das Protein enthaltende Hydrogel einer Wärmebehandlung unterzogen werden, um eine Hydrogel-Proteinstruktur zu bilden, die eine erhöhte Stabilität für die Protein-Makromoleküle bereitstellt. Wie oben ausgeführt, resultiert die Denaturierung von bioaktiven Makromolekülen, wie Proteinen und Nukleinsäuren, in einer Veränderung ihrer Struktur. Verschiedene externe Belastungen, einschließlich sauren, basischen, anorganischen Salzen oder organische Lösungsmittel und Wärme können die Denaturierung von Proteinen verursachen. Die Denaturierung von Proteinen kann in verschiedenen Problemen resultieren, einschließlich Verlust der Löslichkeit der gemeinsamen Aggregation, Bildung von Kondensation, ebenso wie Störung der tertiären strukturellen Integrität und der Verlust von Funktionalität der biologischen Komponenten.
Die oben definierte Hydrogel-Protein-Zusammensetzung schließt ein bioaktives Makromolekül, wie ein Verdauungsprotein oder eine Nukleinsäure ein, das in einer Pore positioniert ist, welche durch die Monomervernetzung und Polymerisation definiert wird. Das bioaktive Molekül wird dabei, wie oben definiert, in der Pore immobilisiert. Dennoch kann ein Teil der Hydrogel-Zusammensetzung Wasser sein. Innerhalb des Hydrogels fließt Wasser frei in und um die Poren, die durch das Polymer-Kettengitter definiert sind, so dass die Immobilisierung des biologischen Makromoleküls von dessen Molekulargewicht bezogen auf die Porengröße, dem Wassergehalt und der Mobilität der Wasserkomponente innerhalb des Hydrogels abhängt. In einem Aspekt kann, wenn der Wassergehalt oder die Wassermobilität ansteigt, das biologische Makromolekül imstande sein, sich mit dem Wasser zu einer benachbarten Pore innerhalb der Beschränkung des Hydrogelmatrix-Polymers zu bewegen. Eine solche Bewegung kann in der Bildung von Makromolekülaggregaten resultieren, was eine ungleiche Verteilung der biologischen Makromoleküle hervorruft. Zusätzlich kann ein Protein die tertiäre Struktur verlieren und denaturiert werden, wenn das Protein frei und ungebunden ist, im Gegensatz dazu, wenn es teilweise eingeschränkt oder gebunden ist. Daher kann die Stabilität der biologischen Makromoleküle durch die Steuerung der Porosität des resul tierenden Hydrogels durch die Beeinflussung des Wassergehalts des Hydrogels, wie Entfernen von freiem in dem Hydrogel befindlichen Wasser, verbessert werden.
Zusätzlich können verschiedene andere Verfahren zum Regulieren der Porosität oder zur Verfestigung des polymeren Materials eingesetzt werden, einschließlich der Auswahl der chemischen Zusammensetzung, des Molekulargewichts und der Verfügbarkeit verschiedener Gruppen zum Vernetzen, ebenso wie des Vernetzungsgrads der verschiedenen Polymere. Zusätzlich können verschiedene andere Faktoren, wie die Ionenstärke, Osmolarität und der pH der Polymerlösungen, ebenso wie die Zugabe von verschiedenen viskositätsverändernden Mitteln, wie Sorbitol, Glyzerin oder Saccharose, ebenso wie andere Materialien, wie Lipide oder hochgeladene Polymere, die Oberflächenbindung von Makromolekülen, die in den Hydrogelporen eingeschlossen sind, verändern. In einem Aspekt kann ein Wärme-Vorbehandlungsverfahren verwendet werden, so dass die Funktionalität und die Vitalität des immobilisierten biologischen Makromoleküls beibehalten wird, während die Stabilität des biologischen Makromoleküls verbessert wird.
In einem Aspekt kann eine Wärme-Vorbehandlung ein wärmeunterstütztes Verfahren einschließen, um Wasser aus dem Hydrogel zu entfernen. Verschiedene Faktoren, einschließlich des Temperaturgrades, der Zeitdauer der Wärmebehandlung, des anfänglichen Wassergehalts des Hydrogels, ebenso wie das Molekulargewicht des bestimmten bioaktiven Makromoleküls, werden einen Einfluss auf die Stabilität der Hydrogelmatrix haben. Bezugnehmend auf 3 wird eine Hydrogelprobe in Form einer Scheibe gezeigt, die in den Poren eingeschlossene Makromoleküle eines biologischen Mittels aufweist, die aber einen Bewegungsspielraum innerhalb der Poren haben. Wenn Wasser aus der Hydrogelmatrix entfernt wird, werden die Poren in den Abmessungen kleiner, so dass sich die biologischen Makromoleküle in einer kompakteren Anordnung mit wenig oder keinem Bewegungsspielraum befinden. So wird die strukturelle Denaturierung oder funktionelle Inaktivierung der biologischen Makromoleküle verringert.
Bezugnehmend auf die 5A und B werden REM-Aufnahmen eines Hydrogels vor einer wärmeunterstützten Wasserentfernung, wie in 5A gezeigt, und nach einer Wärmevorbehandlung, wie in 5B dargestellt, gezeigt. Wie aus den Figuren ersichtlich, weist das unbehandelte Hydrogel Porengrößen von ungefähr 100 bis 150 Nanometer auf, während die wärmevorbehandelte Hydrogelmatrix kondensiert ist, so dass die Porengrößen weniger als ungefähr 30 Nanometer betragen.
In einem Aspekt wird ein anfängliches Hydrogel so bereitgestellt, dass es von 55 bis 95 Gewichtsprozent Wasser und 0,01 bis 5,0 Trockengewichtsprozent bioaktive Makromoleküle aufweist. Eine Wärmevorbehandlung kann mit dem Hydrogelmaterial abhängig von dem anfänglichen Wassergehalt und dem bestimmten Typ des bioaktiven Makromoleküls durchgeführt werden. Zum Beispiel kann eine Hydrogelprobe mit Glucoseoxidase bei Temperaturen von 20 bis 110 Grad Celsius für Zeitspannen von 24 Stunden bis 7 Tage vorbehandelt werden. Eine Hydrogelprobe mit α-Chymotrypsin kann bei Temperaturen von 20 bis 55 Grad Celsius für Zeitspannen von 24 Stunden bis 7 Tage vorbehandelt werden. Wenn Wasser aus der Hydrogelmatrix entfernt wurde, werden die Porengrößen verringert und die eingeschlossenen bioaktiven Makromoleküle werden stärker stabilisiert.
In einem Aspekt kann die Wärmevorbehandlung in Form des Prozentsatzes der Gewichtsveränderung vor und nach der Wärmevorbehandlung definiert werden. Das Hydrogel weist ein Anfangsgewicht W1 auf und nach der Wärmevorbehandlung ein resultierendes Gewicht W2. Die Länge des Wärmeschritts ist so ausgerichtet, dass der Prozentsatz der Gewichtsveränderung, wie er durch (W1 – W2)/W1 formuliert wird, ein Wert ist, der größer als 20 Prozent ist, bevorzugt größer als 30 Prozent, und stärker bevorzugt größer als 50 Prozent.
Zusätzlich kann die Hydrogel-Zusammensetzung vor und nach der Wärmebehandlung durch das Volumen der Matrixpore V1 vor der Wärmebehandlung definiert werden, und einem oder mehreren bioaktiven Makromolekülen, die in der Pore aufgenommen sind, und die ein Gesamtvolumen V2 aufweisen, das durch die dreidimensionale Größe der bioaktiven Makromoleküle definiert wird. Die Differenz zwi schen dem Volumen V1 und dem Volumen V2 kann durch Wassermoleküle erschlossen werden. Da Wassermoleküle während der Wärmevorbehandlung entfernt werden, ändert sich das Verhältnis von (V1 – V2)/V1. In einem Aspekt beträgt das Verhältnis von (V1 – V2)/V1 weniger als 30 Prozent, bevorzugt weniger als 20 Prozent, und stärker bevorzugt weniger als 10 Prozent.
In einem weiteren Aspekt kann die Hydrogel-Zusammensetzung eine Hydrogelmatrix einschließen, die einen Wassergehalt und eine Vielzahl von bioaktiven Makromolekülen aufweist, die innerhalb der Poren der Hydrogelmatrix angeordnet sind. Der Wassergehalt kann weniger als 10 Prozent der Hydrogelmatrix betragen, bevorzugt weniger als 5 Gewichtsprozent der Hydrogelmatrix.
In einem weiteren Aspekt kann eine Wärmevorbehandlung mit einem Hydrogel verwendet werden, das vorher wärmevorbehandelt wurde, das dann aber einer Nassanwendung in wässrigen Lösungen ausgesetzt war. Die Wiederaufbereitungs-Wärmevorbehandlung kann in Form einer ersten Hydrogelprobe definiert werden, die ein anfängliches Nettogewicht W1, ein anfängliches Trockengewicht W2 nach Wärmevorbehandlung, wie oben beschrieben, und ein Nettogewicht W3 nach der wässrigen Anwendung, und ein wieder aufbereitetes Trockengewicht W4 nach einer weiteren Anwendung der Wärmevorbehandlung aufweist. Das Verhältnis der Gewichtsveränderung von (W1 – W4)/W1 kann wenigstens 70 Prozent des Verhältnisses der Gewichtsveränderung von (W1 – W2)/W1 betragen, so dass das Hydrogel wieder aufgearbeitet werden kann.
Die Zusammensetzung einer Hydrogelmatrix und eines biologischen Makromoleküls kann ebenso in Form der Halbwertszeit des Makromoleküls in Bezug auf entweder native entsprechende Moleküle, die nicht in der Hydrogelmatrix vorliegen, oder in Form eines Makromoleküls in dem Hydrogel, das nicht wärmebehandelt wurde, beschrieben werden. Die Halbwertszeit eines biologischen Makromoleküls kann durch Anwenden der Kinetik der Wärmeinaktivierung berechnet werden und wird als die Zeit definiert, in der die biologische Aktivität der Makromoleküle auf die Hälfte ihres anfänglichen Werts abfällt. Berechnungen in Verbindung mit der Halbwertszeit eines Makromoleküls werden in Beispiel 4 gegeben. Wie es ausführlicher im Abschnitt der Beispiele erörtert wird, zeigt die Halbwertszeit verschiedener biologischer Makromoleküle, wenn diese externen Belastungen wie erhöhten Temperaturen ausgesetzt sind, eine verbesserte Halbwertszeit im Vergleich zu nicht geschützten Makromolekülen, die schnell denaturiert werden, wenn sie erhöhten Temperaturen, wie 80° Celsius, ausgesetzt sind. Zusätzlich und wie es im Abschnitt der Beispiele beschrieben ist, kann die Wärmevorbehandlung in Verbindung mit der Immobilisierung eines biologischen Makromoleküls mit dem Hydrogel, in einem Anstieg der Halbwertszeit der Makromoleküle im Vergleich zu nicht geschützten biologischen Makromolekülen resultieren.
Beispiele
Beispiel 1 – Einschließen von Glucoseoxidase (GOx) in ein Polyacrylamid-Hydrogel
Ein beispielhaftes Protein, Glucoseoxidase (GOx, 5 mg) wird in 2 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 gelöst und dann mit 1,2 ml deionisiertem Wasser, 100 μl Ammoniumpersulfat (10% w/v in DI-Wasser) und 6,8 ml 30%iger Acrylamid/bis-Lösung (bezogen von Bio-Rad Laboratories) gemischt. Die Hydrogel-Polymerisation wird mit der Zugabe von 4 μl NNN'N'-Tetramethylenetylendiamin (TEMED) bei Raumtemperatur initiiert. Die Hydrogellösung wird vorsichtig unter Verwenden einer Pipette in ein Glasgehäuse (8,3 × 7 × 0,075 cm³) gegeben und für wenigstens vier Stunden aufbewahrt, um zu ermöglichen, dass die Polymerisation beendet wird. Das Protein enthaltende Hydrogel wird zu kleinen Scheiben mit einem Durchmesser von 16,2 mm ausgestanzt, welche gewaschen und für den weiteren Gebrauch getrocknet werden.
Beispiel 2 – Aktivitätsuntersuchungen für native und in einem Hydrogel eingeschlossene Glucoseoxidase (GOx)
Die Aktivitäten von nativer oder in einem Hydrogel eingeschlossener GOx werden unter Verwendung einer doppelt gekoppelten Reaktion bei Raumtemperatur gemessen:
GOx katalysiert die Oxidation von β-D-Glucose, was Gluconolacton und H₂O₂ erzeugt. H₂O₂ reagiert weiter mit o-Dianisidin (reduzierte Form) und setzt ein Produkt (oxidiertes o-Dianisidin) frei, welches auf einem Spektrometer bei einer Wellenlänge von 500 nm beobachtet wird. Reduziertes o-Dianisidin wird in der Anwesenheit von Peroxidase zu dem entsprechenden oxidierten Gegenmolekül umgewandelt, was eine Farbe erzeugt, die bei 500 nm durch ein Cary 50 Spektrometer gemessen wird.
Zum Messen nativer GOx enthält die Reaktionsmischung (1,1 ml) 0,1 mol Glucose, 7 μg Meerrettich-Peroxidase, 0,17 mM o-Dianisidin und 35 μl Enzym (0,4–0,8 Einheiten/ml) in 50 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,1. Andererseits wird, um die Aktivität der in dem Hydrogel eingeschlossenen Glucoseoxidase zu messen, die getrocknete Hydrogelscheibe in deionisiertem Wasser für wenigstens zwei Stunden eingetaucht, um einen vollkommen gequollenen Zustand vor dem Aktivitätstest zu erreichen. Zu jeder Hydrogelscheibe werden 20,7 ml 0,1 M Glucoselösung gegeben, die 0,14 mg Meerrettich-Peroxidase und 1,1 mg o-Dianisidin enthält. Die Reaktion mit der in dem Hydrogel eingeschlossenen GOx wird in 20-ml Glasfläschchen durchgeführt. Aliquots von jeweils 1 ml werden periodisch entnommen und unmittelbar nach Messen der Produktkonzentration unter Verwenden von UV-Absorption bei 500 nm wieder zugeführt.
Vergleiche werden basierend auf einem Restaktivitäts-Messwert durchgeführt, welcher durch die Formel A_n/A_m berechnet wird, wobei Am für die Aktivität zu einem ersten Zeitpunkt steht, A_n für die Aktivität zu einem zweiten oder späteren Zeitpunkt.
Beispiel 3 – Erhöhte Wärmestabilität, die mit in einem Polyacrylamid-Hydrogel eingeschlossener Glucoseoxidase (GOx) beobachtet wird.
Eine verbesserte Wärmestabilität wird im Fall eingeschlossener GOx im Vergleich zu freier GOx beobachtet. Die Analyse der Wärmestabilität wird in einem temperaturgesteuerten Ofen durchgeführt. Die Hydrogel-Protein-Scheiben werden bei 80° Celsius für unterschiedliche Zeiten inkubiert und deren Restaktivitäten werden dem im Beispiel 5 beschriebenen Protokoll folgend gemessen. Die Stabilität des nativen trockenen Proteins wird als Kontrolle ebenso untersucht.
Beispiel 4 – Berechnung der Halbwertszeit von sowohl freien ungebundenen Makromolekülen als auch solchen, die mittels einer Hydrogelmatrix eingeschlossen sind.
Die Halbwertszeit t_1/2 wird aus den experimentellen Daten durch Anlegen der Kinetiken der Wärmeinaktivierung berechnet und wird als die Zeit definiert, in welcher die Aktivität eines bioaktiven Makromoleküls auf die Hälfte ihres anfänglichen Wertes abfällt.
Verschiedene Formeln und Simulationsmethoden werden auf die freien ungebundenen Makromoleküle und auf solche Makromoleküle angewendet, die vorher in einem Hydrogel eingeschlossen wurden. Es wird angenommen, dass die Wärmeinaktivierung von nativen Enzymen dem klassischen Deaktivierungsmechanismus erster Ordnung folgt:
wobei E der aktive Enzymstatus ist, E_d das gesamte inaktivierte Enzym wiedergibt und k_d die Konstante des Inaktivierungsgrads erster Ordnung ist. Der Ausdruck für die enzymatische Aktivität wird analytisch hergeleitet und wird für die kinetischen Parameter gelöst. Daher wird der zeitabhängige Aktivitätsverlust wie unten ausgedrückt:
wobei A_t die Restaktivität zur Zeit = t ist, und A₀ die Anfangsaktivität zur Zeit = 0. Die Resultierenden A_t und A₀ sind messbare Komponenten in den Experimenten. Hierbei wurde die Methode der kleinsten Quadrate verwendet, um den simulierten Wert von k_d zu erhalten. Daher wird die Halbwertszeit t_1/2 für natives Enzym aus der folgenden Gleichung definiert und berechnet:
Das im Hydrogel eingeschlossene Enzym würde einem Deaktivierungsmechanismus nicht erster Ordnung folgen, dessen Faktoren in der Bedeutung des im Hydrogel mitwirkenden Einschlusses einbezogen wird. In der Annahme der Existenz eines zwischenenzymatischen Zustands sind E₁ mit reduzierter Aktivität, α₁ und einer deaktivierten Form des Enzyms (E₂) mit einer reduzierten Aktivität, α₂. k₁ und k₂ wären Geschwindigkeitskonstanten verschiedener Schritte:
Daher wird die obige Formel umgewandelt zu
Nach Einsetzen der experimentellen Werte für A und A₀ in die obige Gleichung wird die Computer-Software-Programm Matlab zum Lösen der Matrix der nicht linearen Gleichung zum Erhalt der entsprechenden Parameterwerte α₁, α₂, k₁ und k₂ verwendet. So wird die Halbwertszeit, wenn A/A₀ gleich 0,5 ist, simuliert und erhalten.
Bezüglich 6 wird dort eine grafische Darstellung eines in einem Hydrogel eingeschlossenen GOx-Proteins gezeigt. Die in dem Hydrogel eingeschlossene GOx zeigte unter Verwenden von Fluoreszenz-Mikroskopie keine Aggregation, was eine verbesserte Dispersion anzeigte. Wie in der Figur gezeigt, ist die Wärmestabilität der in dem Hydrogel eingeschlossenen GOx überraschend hoch. In dem Test wird eine weniger als ungefähr 20%ige Verringerung der Aktivität nach 3000 Stunden Alterung bei 80° Celsius beobachtet. Basierend auf der Extrapolation der Untersuchungsergebnisse wird geschätzt, dass die Halbwertszeit ungefähr 500 Tage beträgt. Die Halbwertszeit ist ein signifikanter Anstieg im Vergleich zu der Halbwertszeit von weniger als einer Stunde für das freie Verdauungsprotein. Der Anstieg beträgt ungefähr das 12000fache des freien Verdauungsproteins.
Beispiel 5 – Einschluss von α-Chymotrypsin (α-CT) in ein Polyacrylamid-Hydrogel
Der Einschluss von α-CT in ein Polyacrylamid-Hydrogel wird nach dem folgenden Verfahren durchgeführt: 0,5–10 mg α-CT wird zu 0,42 ml 0,01 molarem Natriumacetatpuffer, pH 7,5, gegeben; die Puffermischung wird dann mit 9,33 ml 30%iger Acrylamid/bis-Lösung und 0,25 ml DI-H₂O gemischt, um 10 ml einer Lösung mit einer Gesamt-Monomerkonzentration T = 28% und Vernetzerkonzentration C = 5% herzustellen. Die Polymerisation wird in einem Glasgehäuse (8,3 × 7 × 0,075 cm³) durch Zugabe von 100 μl frisch hergestelltem Ammoniumpersulfat (10% w/v in deionisiertem Wasser) und 4 μl TEMED bei Raumtemperatur initiiert. Wenigstens 4 Stunden werden für das vollständige Gelieren zum Einschließen des Enzyms in das Hydrogel benötigt. Die resultierenden Hydrogelplatten aus den Glasgehäusen werden zu kleinen Scheiben mit einem Durchmesser von 16 mm für weitere Untersuchungen ausgestanzt.
Beispiel 6 – Aktivitätsuntersuchungen für natives und in einem Hydrogel eingeschlossenes α-Chymotrypsin (α-CT)
Für das native Enzym werden 50 μl Enzymlösung (1 mg/ml) mit 2,44 ml Natriumacetatpuffer und 13 μl 160 mM SAAPPN (N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-Nitroanilid)-Stammlbsung in einer Cuvette gemischt. Die Reaktionsaktivitäten werden durch Beobachten der Absorption bei 410 nm bestimmt.
Für das in dem Hydrogel eingeschlossene α-CT wird die getrocknete Gelscheibe in deionisiertem Wasser für wenigstens 2 Stunden zum Erreichen des vollkommen gequollenen Zustands vor dem Aktivitätstest eingetaucht. Jedes Reaktionsglasfläschchen von 20 Milliliter enthält 4,975 ml 10 mM Natriumacetatpuffer, pH 7,5, mit 5 mM Calciumacetat und 25 μl von 160 mM SAAPPN-Stammlösung. Die Reaktion wird durch die Zugabe von in Hydrogel eingeschlossenem Enzym unter Rühren bei 200 Upm initiiert. Aliquots von jeweils 1 ml werden periodisch entnommen und sofort nach Messen der Produktkonzentration unter Verwenden von UV-Absorption bei 410 nm zurückgeführt.
Beispiel 7 – Veranschaulichung des Nicht-Austretens hinsichtlich der in einem Hydrogel eingeschlossenen Verdauungsproteine
Während der in den Beispielen 4 und 6 beschriebenen Aktivitätsuntersuchungen wird die untergetauchte Hydrogelscheibe aus der Reaktionsmischung für einige Minuten entnommen und wird dann im entsprechenden Reaktionsglasgefäß wieder eingetaucht. Dieser Schritt kann einige Male während der Dauer der Aktivitätsuntersuchung wiederholt werden. Die Absorption der Reaktionsmischung unmittelbar nach jeder Entnahme der Hydrogelscheibe wird durch UV-Vis bei 500 nm für die in dem Hydrogel eingeschlossene GOx und bei 410 nm für das in dem Hydrogel eingeschlossene α-CT gemessen. Wie aus 11 ersichtlich, wird kein signifikanter Anstieg in der Lichtabsorption nach jeder Entnahme beobachtet. Diese Beobachtung zeigt an, dass kein entsprechendes Protein aus den Scheiben in die Reaktionsmischungen während der Aktivitätsuntersuchungen austritt.
Beispiel 8 – Wärmevorbehandlung der in dem Hydrogel eingeschlossenen bioaktiven Makromoleküle
In einem Hydrogel eingeschlossene Glucoseoxidase (GOx) und α-Chymotrypsin wurden wie in den Beispielen 1 und 5 gezeigt hergestellt. Für Untersuchungsvergleiche wurden die resultierenden Hydrogelscheiben den im Folgenden dargestellten Behandlungen unterzogen.
Inkubation in einem Ofen unter spezifischen Temperaturen – Für in dem Hydrogel eingeschlossene Glucoseoxidase liegt eine wirksame Vorbehandlungstemperatur beispielhaft in dem Bereich von 20 Gad Celsius bis 80 Grad Celsius. Eine frische Hydrogelscheibe wurde in eine Petrischale gelegt und in dem Ofen bei 80 Grad Celsius für 24 Stunden inkubiert. Dann wurde die resultierende trockene Hydrogelscheibe für weitere Untersuchungen entnommen. Wie in 4 gezeigt, wurde die Acrylamid-Hydrogelmatrix, die 84 Gewichtsprozent Wasser und 0,2 Trockengewichtsprozent der eingeschlossenen Glucoseoxidase enthält, einer erfinderischen Wärmevorbehandlung in einem Ofen bei 80 Grad Celsius für die in dem Graphen angegebene Zeitdauer unterzogen. Der Grad der Volumenschrumpfung wird als Prozentsatz der Gewichtsveränderungen aufgrund von Wasserentzug definiert. Die Rate der Volumenschwellung wird als Prozentsatz der Gewichtsveränderungen nach einer wieder befeuchteten Hydrogelmatrix definiert, die vorher wärmebehandelt wurde. Jeder Datenpunkt gibt einen Durchschnitt von vier Wiederholungen wieder. Wie in 4 gezeigt, tritt der Wasserentzug in den ersten 30 Minuten schnell auf und lässt nachfolgend signifikant nach. Diese Beobachtung stimmt mit dem Verständnis überein, dass eine große Menge Wasser in der Hydrogelmatrix vorliegt, das schnell nach Zufuhr von Wärme verdampft. Eine ausgedehnte Wärmebehandlung nach den ersten 30 Minuten entfernt restliche Wassermoleküle, die zwischen den Hydrogelpolymeren eingebettet blieben.
Für das in dem Hydrogel eingeschlossene α-Chymotrypsin lag die wirksame Ofentemperatur in einem Bereich von 20 Grad Celsius bis 55 Grad Celsius. Eine frische Hydrogelscheibe wurde in dem Ofen bei 55 Grad Celsius für 24 Stunden inkubiert, und die resultierende trockene Hydrogelscheibe wurde für weitere Untersuchungen entnommen.
6 ist eine grafische Darstellung der relativen Aktivität von wärmevorbehandelter in dem Hydrogel eingeschlossener Glucoseoxidase in einem Ofen bei 80 Grad Celsius für eine verlängerte Zeitdauer. Die geschätzte Halbwertszeit der wärmevorbehandelten Glucoseoxidase-Moleküle ist größer als 500 Tage im Vergleich zu Minuten für die freien ungebundenen nativen entsprechenden Moleküle.
8 ist eine grafische Darstellung der relativen Aktivität von wärmevorbehandeltem in dem Hydrogel eingeschlossenen α-Chymotrypsin in einem Ofen bei 80 Grad Celsius für eine verlängerte Zeitdauer. Die geschätzte Halbwertszeit der wärmevorbehandelten α-Chymotrypsinmoleküle beträgt ungefähr 700 Tage verglichen mit 125 Stunden der freien ungebundenen nativen entsprechenden Moleküle.
9 ist eine grafische Darstellung der relativen Aktivität von wärmevorbehandeltem in dem Hydrogel eingeschlossenen α-Chymotrypsin in einem Ofen bei 110 Grad Celsius für eine verlängerte Zeitdauer. Die geschätzte Halbwertszeit der wärmevorbehandelten α-Chymotrypsinmoleküle beträgt ungefähr 1 Jahr im Vergleich zu ungefähr einem Tag für die freien ungebundenen nativen entsprechenden Moleküle.
Beispiel 9 – Stabilität von wärmevorbehandelter in dem Hydrogel eingeschlossener Glucoseoxidase (GOx) unter einer kombinierten extremen Bedingung
Bioaktive Makromoleküle, wie GOx, enthaltende Hydrogelscheiben wurden wie oben in Beispiel 1 gezeigt hergestellt und wie in Beispiel 3 gezeigt wärmebehandelt. Die Stabilität wurde unter einer kombinierten extremen Bedingung untersucht, die eine Kombination hoher Temperatur und eines polaren Lösungsmittels einschließt. Beispielhaft werden die vorbehandelten Hydrogelscheiben in 10 ml purem Ethanol inkubiert. Nach Einweichen in Ethanol für bis zu einer Stunde werden diese Scheiben dann in einen Ofen bei einer Temperatur vom 75 Grad Celsius gelegt. Die Scheiben wurden periodisch zur Aktivitätsbestimmung aus der Ofenkammer entnommen.
Wie in 10 gezeigt, rief die kombinierte extreme Bedingung von trockener Hitze von 75 Grad Celsius und der Anwesenheit von Ethanol keinen signifikanten Effekt auf die wärmevorbehandelte GOx über die untersuchte Zeitdauer von 1200 Stunden im Vergleich zu dem nativen entsprechenden GOx-Molekül hervor, welches sofort innerhalb weniger Minuten denaturiert und inaktiviert wird. Die Daten der wärmevorbehandelten GOx in der Figur sind extrapoliert, um eine Halbwertszeit von ungefähr 4.500 Stunden unter den kombinierten extremen Bedingungen anzugeben.
Beispiel 10 – Stabilität von vorbehandelter in einem Hydrogel eingeschlossener GOx unter UV-Licht
Scheiben von in einem Hydrogel eingeschlossener GOx wurden gemäß Beispiel 1 hergestellt und gemäß Beispiel 3 wärmevorbehandelt. Nach der Vorbehandlung wurde die Stabilität der in dem Hydrogel eingeschlossenen GOx unter UV-Licht untersucht. Beispielhaft wurden die vorbehandelten Hydrogelscheiben mit einer 365 nm Langwellenlampe (8 Watt, UVL-18, UVP, Upland, California, USA) für 12 Stunden bestrahlt. Dann wurden die Hydrogelscheiben zum Bestimmen der Restaktivität nach der UV-Bestrahlung für die Aktivitätsuntersuchung entnommen. Für die wärmevorbehandelte in dem Hydrogel eingeschlossene GOx wurde vor und nach der UV-Bestrahlung kein nennenswerter Aktivitätsverlust gefunden.
Zusammenfassung
Wärmebeständige bioaktive Zusammensetzung
Die bioaktive Zusammensetzung schließt eine Hydrogelmatrix ein. Wenigstens ein Protein ist in der Hydrogelmatrix immobilisiert. Das Verdauungsprotein weist eine Halbwertszeit auf, die wenigstens 1000-mal länger als die Halbwertszeit eines frei verdaubaren entsprechenden Proteins ist.

Claims

Bioaktive Zusammensetzung, umfassend: eine poröse Hydrogelmatrix; wenigstens ein in der porösen Hydrogelmatrix immobilisiertes Protein, wobei das Protein eine Halbwertszeit aufweist, die wenigstens 1000-mal länger als die Halbwertszeit eines frei verdaubaren entsprechenden Proteins ist.
Bioaktive Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Protein nach Aussetzen gegenüber einer Temperatur von bis zu 110°C biologisch aktiv bleibt.
Bioaktive Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Protease, Amylase, Cellulase, Lipase, Peroxidase, Tyrosinase, Glycosidase, Nuclease, Aldolase, Phosphatase, Sulfatase, Dehydrogenase und Lysozym und deren Kombinationen.
Bioaktive Zusammensetzung nach Anspruch 1, ferner eine biochemisch aktive Substanz einschließend, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Antikörper, Nukleinsäure, Fettsäure, Hormon, Vitamin, Mineral, Strukturprotein, Enzymen und therapeutische Substanzen einschließlich Histaminblockern und Heparin.
Bioaktive Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei eine Pore der Hydrogelmatrix ein Volumen V1 definiert; und das wenigstens eine Protein ein Gesamtvolumen V2 aufweist, das durch die gemeinsame dreidimensionale Größe des Proteins definiert wird, wobei das Verhältnis von (V1 – V2)/V1 weniger als 20 Prozent beträgt.
Bioaktive Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das wenigstens eine Protein eine Halbwertszeit von größer 300 Tagen aufweist, wenn es trockener Wärme bei einer Temperatur von ungefähr 110°C ausgesetzt wird.
Bioaktive Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Hydrogelmatrix einen Wassergehalt von weniger als 10 Gewichtsprozent der Hydrogelmatrix einschließt und wobei das Verdauungsprotein mit zwischen ungefähr 0,2 bis 5,0 Trockengewichtsprozent der Hydrogelmatrix vorliegt.
Verfahren zum stabilisieren einer bioaktiven Zusammensetzung umfassend: Bilden von Poren einer Hydrogelmatrix um Proteinmoleküle; und Verringern des Wassergehalts in den Poren der Hydrogelmatrix während die Proteinmoleküle biologisch aktiv bleiben.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Hydrogelmatrix einen anfänglichen Wassergehalt W1 aufweist, und das den Schritt einschließt, dass die Hydrogelmatrix einer Wärmevorbehandlung zum Bilden einer modifizierten Hydrogelmatrix mit einem modifizierten Wassergehalt W2 unterzogen wird, wobei (W1 – W2)/W1 größer als 30 Prozent ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei (W1 – W2)/W1 größer als 50 Prozent ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Wärmevorbehandlung Erwärmen der Hydrogelmatrix auf eine Temperatur von 20 bis 110°C für eine Zeitdauer von 24 Stunden bis 7 Tage umfasst.
Bioaktive Zusammensetzung umfassend: eine ein Volumen V1 definierende Pore eines Hydrogels; wenigstens ein der der Pore der Hydrogelmatrix immobilisiertes Protein, wobei das Protein ein Gesamtvolumen V2 aufweist, das durch die gemeinsame dreidimensionale Größe des Proteins definiert wird, wobei das Verhältnis von (V1 – V2)/V1 weniger als 20 Prozent beträgt.