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Die Erfindung betrifft eine Messanordnung zum Nachweis enzymatischer Reaktionen in der Medizin, insbes. der medizinischen Diagnostik und Therapiekontrolle, in der Lebensmittelbranche, insbes. der Lebensmittelkontrolle und in der biochemischen Analytik generell. Mit der Vorrichtung wird die Anwesenheit oder Abwesenheit von Enzymen in der zu analysierenden Probe angezeigt.
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Hintergrund und Kontext der Erfindung
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Definition und Einteilung der Enzyme
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Enzyme sind biochemische Katalysatoren. Sie beschleunigen Schritte zur stofflichen Umwandlung von Substraten in Produkte, die in Abwesenheit der jeweiligen Enzyme nur extrem langsam, nicht selektiv genug oder sonst nur unter unphysiologischen Bedingungen vonstatten gehen würden [Einführung s. Schellenberger 1989].
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Unter Substrat wird im Zusammenhang mit Enzymen ganz allgemein eine Substanz vor Eintritt in die Reaktion verstanden, unter Produkt die in Folge der Reaktion daraus entstehende Substanz. Eine enzymatische Reaktion kann sowohl mehrere Substrate einbeziehen, als auch mehrere Produkte liefern. Das Produkt der einen Reaktion ist in aller Regel das Substrat für eine andere. Auf diese Art und Weise hat die Evolution Enzymkaskaden geschaffen und im Zusammenwirken der Organismen die zyklische Wiederverwertung fast aller natürlichen organischen Verbindungen sichergestellt [ausführlich z. B. in Stryer et al., 2002].
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Bei ihrer Klassifikation hat man sich international auf streng chemisch definierte Kriterien geeinigt [Braunstein et al., 1972]. Die Hauptenzymklassen entsprechend der verbindlichen IUPAC-Nomenklatur sind: Oxidoreduktasen (EC1.x.x.x), Transferasen (EC2.x.x.x), Hydrolasen (EC3.x.x.x), Lyasen (EC4.x.x.x), Isomerasen (EC5.x.x.x) und Ligasen (EC6.x.x.x). Jede dieser Klassen enthält Vertreter mit hoher Relevanz für die medizinische Diagnostik, die Biotechnologie, die Lebensmitteltechnologie und für den universalistischen Anspruch der biochemisch-enzymologischen Analytik generell.
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Über ihre Katalysewirkung [Stürmer, Breuer, 2006] sind ganze Gruppen von Enzymen an den Lebensprozessen beteiligt. Ihr Zusammenwirken stellt die Stoffwandlung, den Energiehaushalt und die Informationsverarbeitung sicher. Die Einzelreaktionen und die daran beteiligten Stoffe sind sehr vielgestaltig.
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Beispiele für Enzyme mit medizinischer Relevanz
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Exemplarisch sei hier für alle sechs Hauptklassen je ein Vertreter mit medizinischer Relevanz benannt. Die medizinisch-diagnostische Relevanz kann ebenso in der genetischen Kausalität zwischen Enzymdefekt und Erkrankung liegen [
McKusick, 1998], wie auch nicht-genetisch bedingt sein, z. B. im Falle von Indikatorenzymen, die einen exogen verursachten körperlichen oder seelischen Zustand mit oder ohne gesundheitliche, soziale und rechtliche Folgen (Infektion, Vergiftung, Verbrennung, Stress, Doping, Suchtgeschehen) anzeigen [
Burtis, 2006]:
| EC 1.14.18.1 | Die humane Tyrosinase ist eine Oxidase und kausal für okulokutanösen Albinismus. |
| EC 2.1.2.1 | Die humane Serin-Hydroxymethyltransferase ist eine Transferase und wandelt Glycin in Serin um. |
| EC 3.4.23.15 | Das humane Renin ist eine proteinspaltende Hydrolase. Es ist essentiell für die Blutdruckregulation. |
| EC 4.2.1.1 | Die humane Karbonische Anhydrase ist eine Lyase und verantwortlich für die Regulation der Schweißmenge und der Menge der mit dem Schweiß abgesonderten Elektrolyte. |
| EC 5.3.2.1 | Der Makrophagen-Migrationshemmfaktor ist eine Isomerase. Sie überführt das Phenylpyruvat aus der Keto- in die Enolform und wirkt als proinflammatorisches Zytokin. |
| EC 6.3.2.- | Die E3 Ubiquitin-Protein ligase RNF4 ist eine Ligase. Sie bewirkt eine kovalente Markierung von Proteinen, die in den Katabolismus gehen sollen, mit Ubiquitin. |
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Ein konkretes Beispiel sind die Matrix Metalloproteinasen im Urin. Diese treten in erhöhter Konzentration auf, wenn eine pathologische Indikation vorliegt. Dies kann eine kanzerogene Erkrankung oder aber auch eine entzündliche Reaktion sein [Übersichtsartikel Rodrigues, 2010].
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Blasen- und Harnwegsentzündungen sind ein weit verbreitetes Gesundheitsproblem, das Frauen häufiger betrifft als Männer. Ob der Entzündung eine bakterielle Infektion zugrunde liegt, lässt sich am MMP2/9- und Nitritgehalt des Urins feststellen [Hatipoglu, 2011]. Die Therapie erfolgt in der Regel mit Antibiotika. Bei hämorrhagischen Entzündungen hingegen besteht die Gewebeschädigung trotz sterilen Urins fort.
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Im Urin von Patienten mit einem Blasenkarzinom lassen sich die Metalloproteinasen MMP2 und MMP9 nachweisen [Di Carlo, 2006]. Eine sehr empfindliche Nachweismethode ist die Zymografie [Lantz, 1994].
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Analog ließen sich auch aus dem Bereich der Lebensmitteltechnologie entsprechende Vertreter beispielhaft aufführen. Der Hauptunterschied zum oben genannten medizinisch-diagnostischen Bereich besteht darin, dass die in der Ernährungswirtschaft eingesetzten Enzyme und Substrate nicht humaner, sondern pflanzlicher, tierischer und mikrobieller Herkunft sind [vgl. Ulber, 2004, Renneberg, 2005 und 2010]
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Stand der Technik
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Nachweis von Enzymen
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Für den Nachweis von Enzymen stehen prinzipiell mehrere Vorgehensweisen offen: Entweder man identifiziert und quantifiziert ein Enzym anhand seiner eigenen molekularen Charakteristika oder anhand seiner speziellen katalytischen Wirkung. Vorliegende Erfindung betrifft ausschließlich den letzteren Fall – den Nachweis von Enzymen anhand ihrer speziellen katalytischen Wirkung, ohne an eine spezielle Stoffklasse oder an einen besonderen Katalysechemismus gebunden zu sein.
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Bisher: Pro Enzym ein Test
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Die außerordentliche Vielfalt von biologischen Stoffen und die unterschiedlichen Reaktionsmechanismen, die den einzelnen Enzymklassen zu Grunde liegen, haben es in der Geschichte der Enzymologie erforderlich gemacht, fast für jedes der genannten Enzyme seinen eigenen Nachweis zu entwickeln. Aus diesem Grund sind zahllose individuelle Nachweisverfahren parallel entwickelt worden, mit deren Hilfe man zwar die Aktivität des jeweils interessierenden Enzyms durch Vergleich mit einem definierten Standard qualitativ feststellen und/oder quantifizieren kann, die aber – untereinander verglichen – nicht immer übereinstimmende Aussagen liefern.
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Einteilung der Nachweisverfahren
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In der enzymatischen Analytik wird häufig eine Einteilung der Nachweisverfahren in homogene und heterogene Assays vorgenommen.
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Unter homogenen Assays versteht man solche, bei denen alle maßgeblichen Komponenten, das heißt die Substrate und der enzymhaltige Analyt, in gelöster Form miteinander in Kontakt gebracht werden. Enzym- und Substratmoleküle finden sich nach Durchmischung auf dem Wege der Diffusion. Nicht zwingend muss das Produkt der Reaktion ebenfalls löslich sein; es kann sich an der Begrenzung des Reaktionsvolumens niederschlagen. Nicht zwingend muss es sich bei der Lösung um eine wässrige Phase handeln. Es gibt Enzyme, die ihre Wirkung in organischen Lösungsmitteln oder in ionischen Flüssigkeiten (Flüssigsalzen) entfalten. Die Mehrzahl der Enzyme entfaltet ihr Wirkoptimum jedoch in wässrigen Puffern, wie das vom Grundsatz auch in der Zelle (Zytoplasma) und in Körperflüssigkeiten (Blut, Lymphe, Drüsensekrete, extrazelluläre Gewebsflüssigkeit, Exkremente) der Fall ist, unbeschadet der komplexen stofflichen Zusammensetzungen der aufgezählten Umgebungen.
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Heterogene Assays gründen sich im Unterschied dazu auf die Besonderheit, dass das Enzym oder eine andere Reaktionskomponente ortsfest an eine feste Phase gebunden vorliegt, beispielsweise immobilisiert an der Wand des Gefäßes, in der die Reaktion ablaufen soll, auf einem Teststreifen oder ganz allgemein an Trenn- und Trägermaterialien wie Kügelchen, Fasern, Hohlfasern, Chipmaterialien usw. In derartigen Systemen lässt sich über die Geometrie und die Besatzdichte der reaktionsbereiten Oberflächen gezielt Einfluss auf die Kinetik der enzymatischen Reaktion nehmen. Die Reaktionen laufen auch hier diffusionslimitiert ab, wobei die beweglichen Reaktanten zur Festphase hinfinden müssen. Weitere Eigenheiten/Vorteile heterogener Assays bestehen in der Miniaturisierbarkeit des Nachweisbestecks, Nachweissystem und in der Möglichkeit, die Trägerphase gleich als mikroelektronischen Sensor für die Reaktionsprodukte zu nutzen. Heterogene Assays ahmen in gewissem Sinne die Gegebenheiten in lebenden Systemen nach, wo zahlreiche Enzyme und/oder Substrate an Membranen, inneren Zellstrukturen, Organellen und Kompartimenten gebunden, also im oben angegebenen Sinne immobil und in verschiedene Volumenausschnitte separiert vorliegen.
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Die Einteilung von Nachweisverfahren in homologe und heterologe Assays ist nicht nur für enzymatische Reaktionen sinnvoll. Auch andere Prinzipien der selektiven biologischen Erkennung, allen voran aus der Immunologie entlehnte Antigen-Antikörper-Reaktionen werden vorteilhaft für hochsensitive und molekülspezifische Diagnostik und Analytik genutzt. Beim ELISA und anderen gängigen Techniken werden enzymatische und immunologische Nachweisreaktionen in ein und demselben Assay kombiniert.
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Kompartimente in lebenden Systemen
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Es fand bereits Erwähnung, dass kaum ein Enzym in lebenden Systemen gleichverteilt vorliegt. Der Bestimmungsort eines Enzyms kann extra-, inter- oder intrazellulär sein, sowie an eine bestimmte Zellorganelle, Membran, einen Enzymkomplex o. ä. gebunden. Bei Pathologien können diese eindeutigen raumlichen Zuordnungen zu Organ-, Gewebs- und Zellkompartimenten und der normale Aktivitätskorridor erheblich gestört sein. Mit zunehmendem Erkenntnisfortschritt haben sich mehr und mehr eindeutige Korrelationen zwischen Erkrankungen und Anomalien der Enzymaktivität herausgestellt. Solche Korrelationen können, müssen aber nicht eine Ursache-Wirkungs-Beziehung widerspiegeln, sondern sie können auch Begleiterscheinungen sein. Ein solcher Fall ist beispielsweise gegeben, wenn durch das entzündungsbedingte Aufbrechen von Zellen Enzyme in den Außenraum gelangen, wo sie in der Norm nicht hingehören. Daher ist ihr Nachweis in Körperflüssigkeiten oder Gewebsaufschlüssen diagnostisch sinnvoll.
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Kopplung der Enzymreaktion an Indikatorsysteme
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Nachweisverfahren basierend auf enzymatischen Reaktionen machen sich Veränderungen auf stofflicher bzw. chemischer Natur zu Nutze, in Verbindung mit möglichen optischen Veränderungen, wie etwa einen Farbumschlag. Im Regelfalle muss der Diagnostiker/Analytiker apparative Messverfahren anwenden, um die Wirkung des betreffenden Enzyms verfolgen zu können, da ein direkter Nachweis aufgrund optisch bzw. chemisch fehlender Reaktionen nicht möglich ist. Aufgrund dessen werden gekoppelte enzymatische Reaktionen verwandt. Das heißt, dass das Produkt aus einer enzymatischen Reaktion nur als Zwischensubstrat dient und weiter zu einem nachweisbaren Endprodukt umgesetzt wird.
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Ist das Produkt P1 selbst schwer nachweisbar; wird es It. diesem Schema in einer Enzymkaskade zu leicht nachweisbarem, z. B. sichtbarem P2 weiter umgesetzt und in günstigen Fällen dabei noch verstärkt.
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Auf diese Art und Weise kann sowohl das Enzym, als auch das Substrat nachgewiesen werden. Über die Spezifitäten können dann entweder das Enzym oder aber das Substrat katalytisch näher definiert werden.
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Bei der vorliegenden Erfindung sollen mehrere Klassen von Enzyme und deren jeweilige Substrate bestimmt werden. Zu diesem Zweck wurde entgegen dem gegenwärtigen Stand der Technik ein Nachweisdesign entwickelt, was durch Spaltung eines Substrates eine Änderung einer festen Phase, bzw. einer Trennschicht und ihrer Konsistenz mit sich bringt.
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Die Änderung der festen Substratphase durch ein Enzym oder Enzymgruppe löst eine Nachweisreaktion aus, entweder durch den völligen Wegfall der festen Phase bzw. Schicht oder durch Erzeugung einer Permeabilität für eingeschlossene Moleküle und Partikel oder durch das bewirken einer Reaktion, die dann den Nachweis herbeiführt.
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Beispiel: Die feste Substratphase bildet in der vorliegenden Erfindung eine hohlförmige Kugel, die einen Indikatorstoff beinhaltet. Dieser wird frei, wenn die Substratphase teilweise bzw. vollständig durch die Enzymgruppe abgebaut oder gespalten wird.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Die Erfindung verfolgt das Ziel, Enzymwirkungen einfach, sicher und schnell nachzuweisen. Ihr lag die Aufgabe zugrunde, einen für viele unterschiedliche Enzyme universell anwendbaren Nachweis zu schaffen, der auf der spezifischen Einwirkung des jeweiligen Enzyms auf dessen Substrat in immobilisierter Form aufsetzt und dadurch eingeschlossene Indikatoren zur Anzeige der Reaktion veranlasst, z. B. durch einen Farbstoffaustritt aus einer Hohlkugel oder einer Membranblase.
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Die Aufgabe wurde erfindungsgemäß durch die Konstruktion einer Vorrichtung gelöst, in der zwei getrennte Volumenanteile (Kammern) enthalten sind. Die räumliche Trennung der Volumenanteile wird erfindungsgemäß durch eine Trennschicht realisiert. Die Trennschicht besteht aus einem Trägermaterial mit eingearbeiteten Enzymsubstraten.
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Neben der Vorrichtung gehören die einmalige oder die mehrmalige, zeitlich gestaffelte Erhebung von Daten zum Gegenstand der Erfindung, wobei sich der Aussagewert der erhobenen Daten aus dem Vergleich mit wohl charakterisierten Standards und Kontrollen ergibt.
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Gegenstand der Erfindung sind auch die Anwendungen zum nicht-invasiven Nachweis von körpereigenen Enzymen für diagnostische Zwecken.
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Wesen der Erfindung
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Die Erfindung besteht aus einem System zum Nachweis von Enzymen, die mindestens 2 durch eine Trennschicht abgegrenzte Volumenanteile enthalten. Diese so entstandenen Raumabtrennungen dienen zur Aufnahme mindestens eines flüssigen Analyten und/oder zur Aufnahme eines oder mehrere Indikatoren, z. B. eines Farbstoffes. Die Trennschicht besteht aus einem Trägermaterial mit eingearbeiteten Enzymsubstraten, welche selbst direkt oder indirekt als Nachweisbasis dienen, sie enthält ggf. weitere Substanzen.
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Es zeigte sich überraschend, dass auch die Konsistenz des Substrats für den Enzymnachweis ausgenutzt werden kann, z. B. verliert das Substrat Gelatine die feste Konsistenz. Bei den herkömmlichen Varianten des Nachweisdesigns kommt es lediglich auf die Verfügbarkeit des Primärsubstrats an, nicht auf dessen Konsistenz. Im Unterschied zu dieser bekannten Vorgehensweise geht bei dem erfindungsgemäßen Verfahren der Verbrauch von Substrat mit der Änderung der Konsistenz einer Phase einher. Das erwies sich als Schlüsseleigenschaft der erfindungsgemäßen Trennschicht. Die Änderung der Konsistenz einer Phase, die eine Barriere zwischen Volumenanteilen bildet, kann beispielsweise in deren völligem Wegfall bestehen. Es reicht aber, wenn in der Barriere eine Permeabilität für Indikatorstoffe erzeugt wurde. Nach Überwindung der Barriere tritt der Indikator aus oder reagiert mit einer anderen Substanz. In der Freisetzung des Indikatorstoffes bzw. seiner Farbreaktion besteht dann die Anzeige der erfolgten enzymatischen Wirkung. Der Indikator kann Färbung, Ausfall oder Phasenentmischung bewirken.
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Die Trennschichten sind so beschaffen, dass sie den Indikator, der flüssig oder korpuskulär vorliegen kann, diffusionsdicht abdeckt oder umschließt. Der Volumenanteil, der den Indikator enthält und von der diffusionsdichten Trennschicht umschlossen wird, muss nicht zwingend eine zusammenhängende Kammer sein, sondern kann sich aus einer Anzahl getrennter Gebilde, beispielsweise aus umhüllten Tröpfchen oder auf einem Träger aufgebrachte und beschichtete Indikatortröpfchen zusammensetzen. Die Gestaltung und Form des Indikators bzw. seiner Kammer ist geeignet, die Kontaktfläche zwischen Analyten und Trennschicht optimal für den beabsichtigten Nachweis einzustellen.
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Behältnisse, die bei in-vitro Anwendungen den Analyten aufnehmen, können gleichzeitig zur Aufnahme der umhüllten Indikatorphase vorgesehen sein.
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Weiterhin kann das Trägermaterial, welches die Trennschicht bildet, selbst als Enzymsubstrat dienen.
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Bevorzugt wird das Trägermaterial als wabenartiges Gerüst aus enzymatisch inerten Polymeren ausgebildet. Wabenartige Gerüste haben den Vorteil, dass sie einen Größenausschluss für den selektiven Durchtritt von Indikatormolekülen vorsehen.
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Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass Trägermaterial und Enzymsubstrat in alternierenden Lagen angeordnet sind. Das Trägermaterial ist in diesem Falle hinsichtlich seiner Formstabilität auf das Enzymsubstrat angewiesen. Bei enzymatischer Wandlung des Enzymsubstrats verliert das Trägermaterial seine mechanische Stabilität und Formbeständigkeit. Durch das kombinieren unterschiedlicher Schichten, Substrate und Indikatoren können komplexe Nachweissysteme für mehrere Systeme aufgebaut werden.
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Als weitere Substanzen in der Trennschicht können quellfähige Füllstoffe, Elektrolyte, schwingungssensitive, vernetzende oder komplexbildende Agenzien enthalten sein. Quellfähige Füllstoffe unterstützen das Nachweissystem durch den Aufbau osmotischer Drücke. Zusammen mit Elektrolyten bewirken sie die Rehydrierung (Solvatisierung) der eingangs trockenen Trennschicht. Schwingungssensitive und komplexbildende Agenzien sind geeignet, die enzymatische Reaktion an der Trennschicht zu beschleunigen bzw. mit notwendigen Ionen/Kofaktoren zu versorgen.
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Eine besondere Rolle im Aufbau der Trennschicht nehmen vernetzende Agenzien ein. Im einfachsten Falle verleihen sie der Trennschicht eine gewünschte mechanische Stabilität. Sie können aber auch zur selektiven Diskriminierung von einzelnen Enzymspezies in einem Enzymgemisch herangezogen werden, indem sie sterische Hindernisse für deren Enzymwirkung setzen. Vernetzung kann durch rein chemisch, etwa durch bifunktionelle Moleküle, herbeigeführt werden. Ein wichtiger Sonderfall ist die Vernetzung der substrathaltigen Trennschicht mit Hilfsenzymen, etwa mit Transglutaminasen, die man wahlweise an der Trägersubstanz oder am Enzymsubstrat selber ansetzen lassen kann.
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Der Massenanteil des Enzymsubstrats an der Trennschicht kann unterschiedlich sein. Das Enzymsubstrat ist erfindungsgemäß ein Substrat für ein nachzuweisendes Enzyms oder eine Gruppe nachzuweisender Enzyme aus den Klassen proteolytischer, esterolytischer oder glykolytischer Hydrolasen, beispielsweise
- – Gelatine für den Nachweis von Gelatinasen, vorzugsweise für die humanen Matrix-Metalloproteinasen MMP2 und MMP9, aber auch für mikrobielle Metalloproteinasen;
- – ein fakultativ gelatinehaltiges Gemisch denaturierter Proteine für den Nachweis von Endoproteasen ohne ausgeprägte Spaltpräferenz wie Proteinase K oder Thermitase;
- – eine Kombination aus nativen und denaturierten Nukleinsäuren sowie Nukleinsäure-Analoga für den Nachweis von Phosphodiesterasen, insbesondere Nukleasen;
- – organische Polymere, die zahlreiche Monoester-Phosphatgruppen tragen, für den Nachweis von Phosphatasen;
- – gelbildende Saccharidderivate für den Nachweis von Glykosidasen. Zu den Spezialsubstraten für Glykosidasen gehören auch Glyko-Konjugate von Fettsäure-Abkömmlingen.
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Als Indikatoren für die Realisierung der Erfindung dienen wahlweise folgende Gruppen mit offensichtlicher Staffelung nach Größe und Wasserlöslichkeit:
- – Atome oder Ionen mit einem Radius zwischen 70 und 200 pm. Jod- und Silberionen sind Vertreter dieser Gruppe.
- – Farbstoffe und andere Verbindungen einschließlich organischer fluorogener, chromogener und komplexbildender Substanzen;
- – lipophile, vorzugsweise emulsions- und suspensionsbildende Verbindungen wie veresterte Fettsäuren;
- – Proteine mit fluoreszierenden Gruppen, Eigenfluoreszenz (GFP oder YFP) oder mit der Fähigkeit zu sekundären Nachweisreaktionen, beispielsweise Antikörper
- – biologische Makromoleküle, die zu Partnersystemen gehören, beispielsweise Stärke/Jod oder DNA/Interkalationsfarbstoffe;
- – Zellen mit Eigenfärbung oder rekombinant exprimierten Indikatorproteinen sowie Zellen, die auf Tetrazoliumfärbung ansprechen.
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Natürlich können mehrere Enzymaktivitäten aus verschiedenen Klassen detektiert werden, indem pro Einzelaktivität je ein Trennschicht-Enzymsubstrat und ein distinkter Indikator in der Vorrichtung simultan, jedoch ohne Effektüberschneidungen oder -überdeckungen Verwendung finden.
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Der nichtinvasive Nachweis von MMP2 und MMP9 in Urinproben dient der Erkennung von malignen Gewebeveränderungen im Urogenitalsystem. Hierbei wird unvernetzte Gelatine als Trennschicht eingesetzt und die voranschreitende Ausbreitung des Indikators in der eingebrachten kleinen Menge Urin gemessen.
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Der Nachweis von MMP2 und MMP9 in Urinproben kann auch zur Erkennung von entzündlichen Prozessen im Urogenitalsystem dienen.
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Die Erfindung lässt sich auch mit einer oder mehreren Trennschicht/Indikatoren-Kombinationen realisieren. Damit können technologiebedingt zugesetzte hydrolytische Enzyme in Roh- oder Zwischenprodukten der verarbeitenden Industrie nachgewiesen werden.
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Eine weitere Zielstellung und Anwendung ist der nichtinvasive Nachweis von hydrolytischen Enzymen im Urin von Sportlern, die in manipulatorischer Absicht dem Urin extern zugesetzt wurden, um beispielsweise ein Doping mit Erythropoetin oder anderen Wirkstoffen nachträglich zu maskieren. Hier wird eine Trennschicht eingesetzt, die gegenüber der mutmaßlich in manipulatorischer Absicht zugesetzten Enzyms sensitiv ist wie beispielsweise vernetzte Gelatine gegenüber Proteasen ohne Spaltpräferenz.
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Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele erläutert werden.
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Ausführungsbeispiele
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Ausführungsbeispiel 1
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Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum nichtinvasiven Nachweis der Metalloproteinasen MMP2 und MMP9 bei verschiedenen diagnostischen Fragestellungen in der Urologie. (1)
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Vorrichtung bestehend aus einem verschraubbaren Gefäß für 2 ml Analyten, bestückt mit 0,5 cm3 eines lipophilen, wasserunlöslichen, in wässriger Lösung jedoch emulgationsfähigen Indikators auf der Basis pflanzlicher Triglyzeride in Tropfenform, umhüllt von einer diffusionsdicht ausgehärteten eiweißhaltigen Trennschicht bestehend zu 85% aus Gelatine Typ A mit 15% Restfeuchte (in der 1 bezeichnet als GK). Diagnostisches Prinzip: Urine von Patienten mit manifestem Blasenkarzinom oder Blasenentzündungen enthalten erhöhte Mengen an MMP2 und/oder MMP9, verglichen mit dem Urin von Gesunden. Wird die Vorrichtung mit Urinen befüllt und inkubiert, zeigt sich eine signifikante Eintrübung dann und nur dann, wenn entweder malignes Geschehen oder eine Entzündung vorlag, während die Urine gesunder Kontrollpersonen nicht zu Eintrübungen führen. Unabhängiges methodisches Validierungsverfahren: Zymografie [nach Lantz 1994]
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Ausführungsbeispiel 2
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Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum forensischen Nachweis von proteolytischen Enzymen ohne ausgeprägte Spaltpräferenz, die in manipulatorischer Absicht einem Analyten exogen zugesetzt worden sind. Typische Fragestellung: Enthält der zu Dopingkontrollen abgegebene Urin von Sportlern proteinabbauende Enzyme, die zur Kaschierung des Einsatzes naturidentischer Wirkstoffe auf Proteinbasis zur unerlaubten Leistungssteigerung (Doping) zugesetzt worden sind? Vorrichtung bestehend aus einem verschraubbaren Gefäß für 2 ml Analyten, bestückt mit (2) 0,3 cm3 einer in wässriger Lösung aufschwimmenden emulgationsfähigen Indikatorphase auf Pflanzenölbasis als kleine Kügelchen – hier: ohne Eigenfärbung –, umhüllt von einer teilweise vernetzten eiweißhaltigen Trennschicht bestehend zu 90% aus denaturierten Kollagenen (Gelatine) unter Zusatz von der 1% Glutaraldehyd mit maximal 10% Restfeuchte.
Nachweisprinzip: Mit Proteasen ohne ausgeprägte Spaltpräferenz – hier: Proteinase K – versetzte Urinproben (oder andere Analyten) werden in die erfindungsgemäße Vorrichtung gefüllt. Nach ca. 2½ Stunden Inkubation bei Raumtemperatur verlieren die Indikatorkügelchen ihre Schwimmfähigkeit und der Analyt trübt sich sichtbar ein.
Kontrollen: Puffer und Urine ohne externe Zusätze
Unabhängiges methodisches Validierungsverfahren: Zymografie [nach Lantz 1994]
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Die Nachweisgrenze liegt im Bereich weniger Nanogramm exogen zugesetzter Protease.
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Beschreibung der Figuren
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1: Nachweis der gelatinespaltenden Metalloproteinasen MMP2 und MMP9 in Urinen von Patienten mit Blasenkarzinom, Blasenentzündung bzw. ohne pathologischen Befund.
Oben: bei Verwendung der Vorrichtung (Spezifikationen siehe Text) und Turbiditätsmessung;
Unten: Ergebnis der zymografischen Kontrolle derselben Urinproben
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2: Nachweis von exogen zugesetzter Protease ohne ausgeprägte Spaltpräferenz in Urin.
Oben: Visueller Eindruck bei Verwendung der Vorrichtung (Spezifikationen siehe Text);
Unten: Ergebnis der zymografischen Kontrolle derselben Urinproben
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Referenzen
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- – Lantz MS, Ciborowski P (1994). "Zymographic techniques for detection and characterization of microbial proteases", Methods Enzymol. 235: 563–594
- – Alfred Schellenberger (Hrsg.): Enzymkatalyse. Einführung in die Chemie, Biochemie und Technologie der Enzyme. Gustav Fischer Verlag, Jena 1989. ISBN 3-540-18942-4
- – A. E. Braunstein, J. S. Fruton, O. Hoffmann-Ostenhof, B. L. Horecker, W. B. Jakoby, P. Karlson, B. Keil, E. C. Slater, E. C. Webb (convener) and W. J. Whelan, Recommendations of the International Union of Pure and Applied Chemistry and the International Union of Biochemistry, Elsevier Publishing Company, Amsterdam 1972
– Jeremy M Berg, John L Tymoczko und Lubert Stryer, Biochemistry, Author Information Jeremy M Berg, 1 John L Tymoczko, 2 and Lubert Stryer 3. Jeremy M Berg, 1 John L Tymoczko, 2 und Lubert Stryer 3.
1 Johns Hopkins University School of Medicine 1 Johns Hopkins University School of Medicine
2 Carleton College 2 Carleton College
3 Stanford University 3 Stanford University
- – New York: WH Freeman; WH Freeman, 5th edition, New York 2002, ISBN-10: 0-7167-3051-0 ISBN-10: 0-7167-3051-0
- – Rainer Stürmer, Michael Breuer: Enzyme als Katalysatoren. Chemie und Biologie Hand in Hand. In: Chemie in unserer Zeit, 2006, 40, 104–111
- – McKusick, V. A., Mendelian Inheritance in Man. A Catalog of Human Genes and Genetic Disorders, Baltimore: Johns Hopkins University Press, 1998 (12th edition)
- – Burtis, Carl A.; Ashwood, Edward R.; Bruns, David E. (2006). Tietz textbook of clinical chemistry (4th ed.). Saunders. pp. 2448
- – D. Rodríguez, C. J. Morrison, C. M. Overall: Matrix metalloproteinases: what do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics. In: Biochimica et biophysica acta Band 1803, Nummer 1, Januar 2010, S. 39–54 (Review)
- – Di Carlo A, Terracciano D, Mariano A, Macchia V, Urinary gelatinase activities (matrix metalloproteinases 2 and 9) in human bladder tumors, Oncol Rep. 2006 May; 15(5): 1321–6
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- – R. Ulber, K. Soyez: 5000 Jahre Biotechnologie: Vom Wein zum Penicillin, in: Chemie in unserer Zeit 2004, 38, 172–180
- – Reinhard Renneberg, Darja Süßbier: Biotechnologie für Einsteiger. Spektrum Akademischer Verlag, 1. Auflage 2005. ISBN 3-8274-1538-1, 3. Auflage 2010
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Schellenberger 1989 [0002]
- Stryer et al., 2002 [0003]
- Braunstein et al., 1972 [0004]
- Stürmer, Breuer, 2006 [0005]
- McKusick, 1998 [0006]
- Burtis, 2006 [0006]
- Übersichtsartikel Rodrigues, 2010 [0007]
- Hatipoglu, 2011 [0008]
- Di Carlo, 2006 [0009]
- Lantz, 1994 [0009]
- Ulber, 2004 [0010]
- Renneberg, 2005 und 2010 [0010]
- Lantz 1994 [0046]
- Lantz 1994 [0047]
