JP5592254B2 - 耐熱性生物活性組成物 - Google Patents
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Description
本願は、2008年5月9日に出願した米国特許出願第12/118,171号における優先権を主張する。その内容は参考により本明細書中に組み込まれている。
本発明は、生物活性材料を安定化するための組成物及びその方法、特にヒドロゲルに固定化された生物活性材料を安定化するための熱処理に関する。
生物活性高分子、例えばタンパク質、核酸及び機能酵素は、生物医学的及び工業的な適用の様々な観点において広く利用されている。例えば、核酸はポリメラーゼ連鎖反応のための遺伝子の鋳型として利用されており、一方タンパク質は、洗剤の分解洗浄能力を亢進するために洗剤混合物において使用されている。
生物活性高分子は、生体細胞内で生物学的な機能性を有する高分子を意味してよい。生物活性高分子は、核酸、消化タンパク質、及び機能酵素を含んでよい。以下に記載されるそのほかの成分も含んでよい。
代表的なタンパク質である、グルコースオキシダーゼ(GOx、5mg)を2mlの0.1M、pH7.0のリン酸ナトリウム緩衝液に溶かし、その後1.2mlの脱イオン水、100μlの過硫酸アンモニウム(DI水中10%w/v)及び6.8mlの30%アクリルアミド/ビス溶液(Bio-Rad Laboratoriesから購入)と混合する。ヒドロゲル重合は、4μlのNNN’N’−テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)を室温で添加することにより開始する。ピペットを用いてヒドロゲル溶液を注意深くガラスエンクロージャー(8.3×7×0.075cm3)に添加し、そして少なくとも4時間保持し、重合を完了させる。タンパク質含有ヒドロゲルを、16.2mmの直径を有する小ディスクに押し出し、これをさらに使用するためにリンスし、そして乾燥させる。
遊離GOxと比較して、捕捉されたGOxの場合には増大した熱安定性が観察される。熱安定性の分析は温度調節オーブン中で行う。ヒドロゲル−タンパク質ディスクを80℃で様々な時間インキュベートし、そしてこれらの残留活性を例5に記載されるプロトコルに従い測定する。天然の乾燥タンパク質の安定性もまた対照として試験する。
ポリアクリルアミドヒドロゲル中のα−CTの捕捉は、以下の手順により行われる:0.5〜10mgのα−CTを0.42mlの0.01MのpH7.5の酢酸ナトリウム緩衝液に添加し、その後該緩衝液混合物を9.33mlの30%アクリルアミド/ビス溶液及び0.25mlのDI H2Oと混合し、全モノマー濃度がT=28%及び架橋剤濃度がC=5%である10mlの溶液を作成する。重合は、100μlの新しく調製した過硫酸アンモニウム(脱イオン水中10%w/v)及び4μlのTEMEDを室温で添加することにより、ガラスエンクロージャー(8.3×7×0.075cm3)中で開始する。ヒドロゲル中に酵素を捕捉するための完全なゲル化に少なくとも4時間は必要とする。ガラスエンクロージャーから生じたヒドロゲルプレートを、さらなる試験のために16mmの直径を伴う小ディスクに押し出した。
天然酵素のために、50μlの酵素溶液(1mg/ml)を2.44mlの酢酸ナトリウム緩衝液及び13μlの160mM SAAPPN(N−スクシニル−Ala−Ala−Pro−Phe−p−ニトロアニリド)原液をキュベット中で混合する。反応活性は、410nmの吸光度をモニタリングすることにより測定する。
例4及び6に記載される活性試験において、冠水したヒドロゲルディスクを数分間反応混合物から取り出し、その後各々の反応バイアル中に再び浸す。この工程は、活性アッセイを行う間、何回か繰り返すことができる。ヒドロゲルディスクの取り出し(withdrawal)直後の反応混合物の吸光度は、ヒドロゲル捕捉GOxについて500nmにおけるUV−Vにより測定され、そしてヒドロゲル捕捉α−CTについて410nmにおけるUV−Vにより測定される。図11からわかるように、それぞれの取り出し後において吸光度の有意な増加は何ら観察されなかった。この観察は、活性アッセイにおいてディスクから反応溶液への明らかなタンパク質の漏出が存在しないことを示す。
例1及び5に示されるとおり、ヒドロゲル捕捉グルコースオキシダーゼ(GOx)及びα−キモトリプシンを調製した。治験比較目的のために、生じたヒドロゲルディスクを以下に示す処理にかけた。
例1に示されるとおり、生物活性高分子、例えばGOxを含有するヒドロゲルディスクを調製し、そして例3に示されるとおり熱処理した。高温度及び極性溶媒の組み合わせを含む厳しい条件下において安定性を調査した。具体的には、前処理したヒドロゲルディスクを10mlの純粋なエタノール中でインキュベートする。エタノール中に最大1時間浸漬させ、その後これらのディスクを75℃の温度のオーブンに置いた。ディスクは、活性測定のためにオーブン内から定期的に移動させた。
例1に示されるとおり、生物活性高分子、例えばGOxを含有するヒドロゲルディスクを調製し、そして例3に示されるとおり熱処理した。前処理後、ヒドロゲル捕捉GOxの安定性をUV光下において調査した。具体的には、前処理したヒドロゲルディスクを、365nmの長波長ランプ(8 watts, UVL-18, UVP, Upland, California, USA)で12時間照射した。UV照射後、残留活性を測定するための活性アッセイのために、該ヒドロゲルディスクを移した。熱前処理ヒドロゲル捕捉GOxについて、UV照射の前後に明らかな活性の喪失は見られなかった。
Claims (9)
- 生物活性組成物であって:
多孔性ヒドロゲルマトリックス;
該多孔性ヒドロゲルマトリックス中に固定された少なくとも1つの消化タンパク質の有効量、
を含んで成り、該ヒドロゲルマトリックスの細孔が体積V1を定義し、そして少なくとも1つの消化タンパク質が該消化タンパク質の集合的な3次元サイズにより定義される全体積V2を有し、ここで(V1−V2)/V1の割合が20%以下であり、該消化タンパク質が、対応する遊離の消化タンパク質の半減期よりも少なくとも1000倍長い半減期を有し、該ヒドロゲルマトリックスが、該ヒドロゲルマトリックスの10重量%以下の水分含有量を含み、そして該消化タンパク質が、該ヒドロゲルマトリックスの0.2〜5.0乾燥重量%であることを特徴とする、生物活性組成物。 - 前記消化タンパク質が、最大110℃の温度に対する暴露後に生物学的活性を維持する、請求項1に記載の生物活性組成物。
- 前記消化タンパク質が、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、チロシナーゼ、グリコシダーゼ、ヌクレアーゼ、アルドラーゼ、ホスファターゼ、スファターゼ、デヒドロゲナーゼ、及びリゾチーム、ならびにこれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項1に記載の生物活性組成物。
- 抗体、核酸、脂肪酸、ホルモン、ビタミン、ミネラル、構造タンパク質、酵素、ならびに治療剤から成る群から選択される生物活性剤をさらに含む、請求項1に記載の生物活性組成物。
- 前記治療剤が、ヒスタミン遮断薬又はヘパリンである、請求項4に記載の生物活性組成物。
- 前記少なくとも1つの消化タンパク質が、110℃の温度における乾燥加熱に暴露した場合に300日以上の半減期を有する、請求項1に記載の生物活性組成物。
- 生物活性組成物を安定化するための方法であって:
消化タンパク質分子の周りにヒドロゲルマトリックスの細孔を形成する工程;及び
該ヒドロゲルマトリックスの細孔内の水分含有量を低下させ、その一方で消化タンパク質分子の生物活性を保持する工程、
を含んでなり、該ヒドロゲルマトリックスが、初期水分含有量W1を有し、そして該ヒドロゲルマトリックスを熱前処理にかけ、改変した水分含有量W2を有する改変したヒドロゲルマトリックスを形成する工程を含み、ここで(W1−W2)/W1が30%以上であり、該消化タンパク質が、対応する遊離の消化タンパク質の半減期よりも少なくとも1000倍長い半減期を有することを特徴とする、方法。 - 前記(W1−W2)/W1が50%以上である、請求項7に記載の方法。
- 前記熱前処理が、ヒドロゲルマトリックスを20〜110℃の温度で24時間〜7日間加熱する工程を含んでなる、請求項7に記載の方法。
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