DE10392821T5

DE10392821T5 - Synteseverfahrens für Alanylglutamin

Info

Publication number: DE10392821T5
Application number: DE10392821T
Authority: DE
Inventors: Yufen Zhao; Guo Tang; Ning Zhou; Liming Hu; Yong Chen
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2002-06-17
Filing date: 2003-05-30
Publication date: 2005-05-25
Anticipated expiration: 2023-05-31
Also published as: JP4942295B2; WO2003106481A8; US20050233977A1; AU2003242188A8; WO2003106481A1; CN1164611C; CN1392156A; US7163917B2; JP2005538963A; DE10392821B4; AU2003242188A1

Abstract

Syntheseverfahren für Alanylglutamin, umfassend die Stufen:
1) Bildung eines aktivierten Esters durch die Reaktion von 10 mmol N-terminal geschütztem Alanin, 10~30 mmol Triphenylphosphin und 10~30 mmol Hexachlorethan in einem organischen Lösungsmittel für 20 min.~3 Stunden und bei einer Reaktionstemperatur von –5~30°C;
2) Reagieren des aus Stufe 1 erhaltenen aktivierten Esters in einem flüssigen Gemisch, welches hergestellt wird, indem ein organisches Lösungsmittel und eine wässrige Lösung einer anorganischen Base gemischt werden, mit 10~30 mmol Glutamin, um das N-terminal geschützte Alanin zu erhalten, wobei das Volumenverhältnis des organischen Lösungsmittels und der wässrigen Lösung der anorganischen Base bei 0~4 liegt, die Reaktionstemperatur bei –5~30°C liegt und der pH auf 8,5~13 eingestellt wird;
3) Ansäuern des Reaktionsgemisches aus Stufe 2 mit einer anorganischen Säure auf einen pH-Wert von ≤ 3,0;
4) Erhalten des Alanylglutamins durch Entfernen der N-terminalen Schutzgruppe mit einem Schutzgruppen abspaltenden Reagenz.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Syntheseverfahren für ein Aminosäure enthaltenes Dipeptid, insbesondere ein Syntheseverfahren für ein Alanylglutamine.
Glutamin ist der Hauptbestandteil der Aminosäuren im menschlichen Körper, wobei der Gehalt an Glutamin im Muskelprotein und im Plasmaprotein bei etwa 75% bzw. 26% liegt.
Glutamin weist eine wichtige physiologische Wirkung auf. Glutamin ist ein notwendiges Vorläufermolekül für die Synthese von Nukleinsäuren von Organismen, ein Regulator der Synthese und des Abbaus von Protein, ein Träger des von dem peripheren Gewebe zu den internen Organen transportierten Aminostickstoffs, und ein wichtiger Träger der Stickstoffexkretion durch die Niere. Glutamin ist der wichtigste Energieträger von Epithelialzellen der intestinalen Mukosa, der renalen Tubuluszelle, des Makrophagen und des Fibroblasten. Es spielt eine wichtige Rolle unter verschiedenen Aspekten wie beispielsweise das Aufrechterhalten der Intestinalfunktion, das Vermitteln der Immunitätsfunktion, das Aufrechterhalten eines Alkaligleichgewichtes im Körper und das Erhöhen der Anpassungsfähigkeit des Organismus gegenüber der Erregbarkeit.
Im Notfall und bei hoher Katabolismus Aktivität, beispielsweise wie im Falle einer ernsthaften klinischen Infektion, einer multiplen Fraktur, einer großen Operation, großflächiger Verbrennungen und der Anaphase eines malignen Tumors etc., übersteigt der Bedarf an Glutamin die Synthesekapazität des Körpers für Glutamin in hohem Maße, und der Gehalt an Glutamin im Körper verringert sich, wodurch eine Abnahme der Nukleinsäure- und Proteinsynthese hervorgerufen wird. Wird die herkömmliche vollständige Phleboklysis Ernährungslösung (TPN) angepasst, kann dies das Schrumpfen der intestinalen Mukosa bewirken, wodurch die Durchlässigkeit der intestinalen Mukosa und der Durchlass von Bakterien erhöht wird, und dies wird sogar eine Blutvergiftung sowie multiples Organversagen (Multi-apparatus-Disfunktion) bewirken. Eine große Anzahl von Experimenten hat gezeigt, dass die Supplementierung der TPN mit GLN deutliche Wirkung bei der Verhinderung und der Heilung vieler Erkrankungen zeigt. Wird eine gewisse Menge an Glutamin zu der TPN hinzugefügt, um die Konzentration an Glutamin im Gewebe wie beispielsweise dem Blut und Muskel etc. zu erhöhen, zeigt dies eine wichtige Wirkung für das Beibehalten oder die Wiederherstellung der Funktion der intestinalen Mukosa. Wird das mit Glutamin supplementierte TPN ernsthaft infizierten Patienten transfundiert, zeigen sich evidente Wirkungen im Beibehalten eines positiven Stickstoffgleichgewichts und der Förderung der Expression der GLN-Synthetase in Zellen, wodurch die Abnahme der GLN-Konzentrationen und der Ribosomen innerhalb des Myocyten reduziert wird.
In den letzten Jahren erhielt die Verabreichung von Glutamin über die Ernährung außerhalb des Intestinums in der Öffentlichkeit allgemein Aufmerksamkeit wegen dessen wichtigen physiologischen und pharmakologischen Wirkungen. Wie oben erwähnt, ist die Konzentration an Glutamin im Blut und den Zellen unter dem Zustand der Irritation wie bei verschiedenen Wunden (einschließlich Unfallwunden, Operationswunden und Bestrahlungswunden) oder Infektionen etc. verringert, und kann durch Verabreichung von Aminosäuremedikamenten (GLN nicht eingeschlossen), die heute verfügbar sind, nicht erhöht werden. Bestimmte wichtige Funktionen von Zellen wie die Proteinsynthese, die Phagozytose und die Vermehrung von Lymphozyten etc. sind alle notwendigerweise von der Verfügbarkeit von genug GLN bedingt. Aufgrund seiner geringen Löslichkeit und Stabilität in Lösung bildet es die toxische Pyroglutamatsäure und Stickstoff, wenn es für die Sterilisation erhitzt wird, so dass Glutamat in einem kommerziell erhältlichen Aminosäuremedikament nicht enthalten ist. Zurzeit wird Glutamin hauptsächlich auf folgenden Wegen verabreicht: (1) Verwendung direkt nach Herstellung; Zufügen von GLN-Kristallen zu der Aminosäurelösung und nachfolgende Filtration und Sterilisation und Transfusion innerhalb von acht Stunden. Dieses Vorgehen muss unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden, die Arbeit ist kompliziert und schwierig, so dass der Anwendungsbereich limitiert ist. (2) Die Synthese von GLN-Derivaten, wie beispielsweise Acetylglutamin. Dieses kann einfach synthetisiert werden, ist gegenüber der Erhitzung stabil und im Körper kann daraus GLN gebildet werden. Allerdings ist dessen Verwertungsverhältnis gering und 40% der aufgenommenen Menge wird als Harnstoff ausgeschieden. (3) Verabreichung von GLN-Dipetiden.
Zurzeit sind die in experimentellen Untersuchungen verwendeten Dipeptide hauptsächlich zweierlei Art: Glycylglutamin (L-Glycyl-L-Glutamin, L-Gly-L-Gln) und Ananylglutamin (L-Alanyl-L-Glutamin, L-Ala-L-Gln). Die in Tieren und im menschlichen Körper vorgenommenen Experimente zeigen, dass diese beiden Arten von Dipeptiden im menschlichen Körper schnell in die sie zusammensetzenden Aminosäuren abgebaut werden, dass ihre Halbwertzeit gering ist, dass nur geringe Mengen der Dipeptide im Blut nachgewiesen werden können, und dass nur geringe Mengen der Dipeptide als Harnstoff ausgeschieden werden. Diese Fakten zeigen, dass GLN-Dipeptide effektiv verwertet werden können, und dass sie nicht im Blut akkumulieren, so dass die möglichen pharmakologischen und physiologischen Nebenwirkungen, die durch die Dipeptide hervorgerufen werden, vermieden werden können. Experimente beweisen, dass, wenn ein gesunder menschlicher Körper über einen langen Zeitraum intravenös L-Ala-L-Gln verabreicht bekommt, keine Nebenwirkungen und gefährliche Reaktionen auftreten, und dass die normalen Nierenfunktionen nicht beeinflusst werden. Die Löslichkeit des L-Ala-L-Gln, welches chemisch synthetisiert wird, ist nach Reinigung 20-mal höher als die des GLN-Monomers. Es ist stabil sowohl bei Lagerung und bei Erhitzung zur Sterilisation. Wenn es vom menschlichen Körper aufgenommen wird, zerfällt es in GLN und zeigt seine Wirkung, und macht daher die Anwendung von GLN in TPN einfacher und praktisch durchführbar.
Es gibt vier Syntheseverfahren für Ananylglutamin, die wie folgt dargestellt ausgestaltet sind:

1. Zunächst wird die terminale Aminogruppe in GLN (Glutamin) geschützt, wodurch beispielsweise ein carbobenzyloxylgeschütztes Glutamin (Cbz-Gln) gebildet wird. In einem zweiten Schritt wird die Acylaminogruppe im Cbz-Gln geschützt, wobei Cbz-Gln (OC₁₃H₉) gebildet wird. In einem dritten Schritt wird die Carbonylgruppe in Cbz-Gln (OC₁₃H₉) geschützt, und Cbz-Gln (OC₁₃H₉)OMe wird gebildet. Der vierte Schritt besteht in dem Überleiten von Wasserstoffgas, um GLN(OC₁₃H₉)OMe zu bilden. In einem fünften Schritt wird Cbz-Ala hinzugefügt. Im sechsten Schritt wird Cbz-Ala aktiviert. Der siebte Schritt besteht darin, Cbz-Ala mit Gln (OC₁₃H₉)OMe zu kombinieren, um ein Peptid zu bilden. Der achte Schritt umfasst die Entfernung des Methylesters durch Verseifung. Der neunte Schritt ist die Entfernung aller Schutzgruppen durch Ansäuerung um Alanylglutamin zu bilden. (Literatur: Yasutsugu Shimomishi, Untersuchungen zur Synthese von Peptiden die Glutamine am C-Terminus enthalten. Y. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1962, 35, 1966) Dieses Reaktionsverfahren umfasst zu viele Schritte, wobei die Kosten für die Reagenzien teuer sind, und es besitzt daher keinen praktischen Wert.
2. Die folgende Reaktion wird verwendet: Unter Einwirkung von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) wird das carbobenzyloxyschützende Alanin (Z-Ala) mit HOSu bei 20~25°C für fünf Stunden zur Reaktion gebracht, wonach das Dicyclohexylharnstoff abfiltriert wird, und die Synthese in einer wässrigen Lösung von Natriumbikarbonat mit nicht geschütztem Gln fortgeführt wird, und das Produkt wird durch Hydrogenierung in Methylalkohol reduziert, um die Schutzgruppe zu entfernen, wonach das Alanylglutamin erhalten wird. (Literatur: Katoh, T. Kurauchi, M. Eur, Pat. 311,057, 12. Apr. 1989) Die in dieser Methode verwendeten Reagenzien sind teuer, es ist schwierig, die Produkte des DCC nach der Reaktion zu entfernen, und das Produktionsverfahren wird dadurch komplizierter.
3. Die folgende Reaktion wird verwendet: Phosgen (COCl₂) wird mit Alanyn reagiert, um ein gemischtes Anhydrid zu bilden, wird dann mit Gln in Wasser zur Reaktion gebracht, wobei der pH-Wert der Lösung bei 10,2 gehalten wird, und zuletzt wird die Schutzgruppe in saurer Lösung entfernt und das Ananylglutamin wird erhalten. (Literatur: Frerst, P. Pfaendetr, P. Ger. Offen. DE 3206,784 . 01 Sep. 1983) Das Reaktionsverfahren dieser Methode ist weniger, allerdings ist Phosgen ein gefährliches Gas, die Reaktion kann nur schwerlich zur Vollständigkeit geführt werden, und ist für den menschlichen Körper gefährlicher.
4. Acylchlorid wird durch Aktivierung des chiralen Reagenz Chloropropionsäure mit SOCl₂ gebildet, und reagiert dann in einer wässrigen NaOH-Lösung mit Gln, wobei der pH-Wert der Lösung bei 10 gehalten wird. Das Produkt ist das Dichlorpropionylglutamin, welches mit flüssigem Stickstoff bei einem gewissen Druck reagiert, wodurch das Alanylglutamin erhalten wird. (Literatur: Takahiro Sano, Toru Sugaya, Process Research und Development of 1-Alanul-1-glutamine, [A] Component of Parenteral Nutrition, Organic Process Research and Development. 2000,4,147-152) Das Ausgangsmaterial dieser Reaktion ist ein chirales Reagenz, welches für das Syntheseverfahren von Acylchlorid sehr teuer ist, die Reaktionstemperatur ist erhöht, und es gibt zu viele Seitenreaktionen. Daher können die Produktionskosten zu teuer werden, wenn es für die Produktion verwendet wird.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Syntheseverfahren für ein Alanylglutamin zur Verfügung zu stellen, welches billigere Ausgangsmaterialien betrifft, eine einfach Synthesetechnik umfasst, geringe Produktionskosten, eine hohe Produktivität und vorteilhafte Umweltschutzeigenschaften aufweist.
Das Vorgehen bei dem Syntheseverfahren für Alanylglutamin ist wie folgend dargestellt:

1) 10 mmol N-terminal geschütztes Alanin (I), 10~30 mmol, vorzugsweise 15~20 mmol Triphenylphosphin und 10~30 mmol, vorzugsweise 15~20 mmol Hexachlorethan werden in organischen Lösungsmitteln (II) für 0,33 Stunden zur Reaktion gebracht, vorzugsweise für 1,5~2 Stunden, bei einer Reaktionstemperatur von –5~30°C, vorzugsweise bei 0~10°C, um einen aktivierten Ester zu bilden;
2) Das Reaktionsgemisch nach Stufe 1, welches den aktivierten Ester umfasst, wird mit 10~30 mmol Glutamin in einer gemischten Flüssigkeit, welche organische Lösungsmittel (III) und restliche Lösung einer anorganischen Basis (IV) enthält (wegen der Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels in Stufe 1), wobei das Volumenverhältnis von III zu IV bei etwa 0~4 liegt, falls das organische Lösungsmittel (II), welches in Stufe 1 verwendet wurde, mit dem organischen Lösungsmittel (III) übereinstimmt, muss in Stufe 2 kein organisches Lösungsmittel mehr verwendet werden, und in diesem Fall ist das Volumenverhältnis von III zu IV 0, vorzugsweise 0,5~2, und die Reaktionstemperatur ist –5~30°C, vorzugsweise 5~10°C, und der pH-Wert der Lösung wird auf 8,5~13 eingestellt, vorzugsweise 9,5~10,5. Das bevorzugteste Verfahren ist es, wenn Stufe 2 unter Rühren durchgeführt wird, wobei der aktivierte Ester, der aus Stufe 1 erhalten wurde, mit 10~30 mmol Glutamin in ein gerührtes Flüssigkeitsgemisch aus dem organischen Lösungsmittel (III) und der wässrigen Lösung einer anorganischen Base (IV) zur Reaktion gebracht wird. Während der Reaktion wird weiter gerührt und der pH-Wert von 9,5–10,5 muss beibehalten werden;
3) Ansäuern der Lösung auf einen pH-Wert < 3,0, vorzugsweise 2,0–3,0 mit anorganischer Säure (V); und dann
4) Entfernen der N-terminalen Schutzgruppe mit dem Schutzgruppen abspaltenden Reagenz (VI), wodurch Alanylglutamin in einer Ausbeute von 30%~65% erhalten wird,

(I) die N-terminal geschützte Aminosäure bevorzugt N-(O,=-Dimethyl)Phosphoalanin(DMP-L-Ala), N-(O,=-Diethyl)phosphoalanin(DEP-L-Ala), N-(O,O-Diiospropyl)Phosphoalanin(DIPP-L-Ala), N-(O,O-Di-N-Butyl)Phosphoalanin(DBP-Ala), Carbobenzoxy-Alanin(Z-L-Ala), (Para-Carbomethoxy)Carbobenzoxyaline(MZ-L-Ala), Tert-Butylcarbonylalanin(Boc-L-Ala)2-(Dibiphenyl)Isopropylcarbonylalanin (Bpoc-L-ala) etc. ist,
(II) das organische Lösungsmittel bevorzugt Dichloromethan, Toluen, Tetrahydrofuran, Acetonitril, 1,2-Dichlorethan etc ist,
(III) das organische Lösungsmittel bevorzugt Ethylalkohol, Ethylacetat, Petroliumether, Cyclohexan, Toluol, Dichloromethan etc ist,
(IV) die anorganische Basis bevorzugt Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumbikarbonat, Natriumkarbonat, Kaliumkarbonat etc ist,
(V) die anorganische Säure bevorzugt Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure etc ist, und
(VI) das als Schutzgruppen abspaltendes Gruppe verwendete Reagenz bevorzugt Trifluoressigsäure, Salzsäure/Eisessig, Bromwasserstoff/Eisessig, Methylsulfonsäure, die Reduktion durch Hydrogenierung, Salzsäure/1,4-Dioxan, Bromwasserstoff/1,4-Dioxan etc ist.

Im Vergleich mit den bisher verfügbaren Syntheseverfahren liegen die Hauptvorteile dieser Erfindung darin:

1) Die Ausgangsmaterialien sind billig.
2) Das Syntheseverfahren ist einfach, es ist keine Trennung der Zwischenprodukte nötig, wenn die Reaktion beendet ist, und es ist einfach, das Produkt zu separieren und zu reinigen.
3) Der aktivierte Ester bildet sich in einem sauren Medium, so dass die Razematbildung des Produktes mit der organischen Base vermieden wird.
4) Der Verfahrensschtritt in der wässrigen Phase in der zweiten Stufe der Reaktion wird so angepasst, dass die Bindung der Schutzgruppe an die bzw. das Abspalten der Schutzgruppe von der Aminosäure Glutamin ausgelassen wird, so dass die Syntheseroute vereinfacht und die Reaktionsdauer verkürzt wird.
5) Da in der zweiten Stufe in einer wässrigen Phase gearbeitet wird, kann eine anorganische Base die Stelle der organischen Base einnehmen, wodurch die Produktionskosten reduziert werden und positive Effekte hinsichtlich der Umweltverträglichkeit des Verfahrens erzielt werden.
6) Am Ende der Reaktion werden zwei Produkte erhalten, das eine ist Alanylglutamin und das andere ist das Nebenprodukt (Triphenylphosphin). Das Triphenylphosphin ist ein nicht-flüssiger Feststoff, der einfach abgetrennt werden kann, und der als Rohmaterial aufbewahrt werden kann.
7) Alle Lösungsmittel, die in dem gesamten Syntheseverfahren verwendet werden, können wieder gewonnen und einfach wieder verwendet werden.

In Kürze ist das Syntheseverfahren einfach, die Rohmaterialien sind billig und einfach zu erhalten, die Synthesetechnik ist rationell, sie ist vorteilhaft für den Umweltschutz und die Produktionskosten sind gering, wodurch das Verfahren einen exzellenten praktischen Wert besitzt.
Unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele wird die Erfindung weiter erläutert.
Beispiele
Beispiel 1
20 mmol Hexachlorethan werden in 10 mmol Dichlormethan gelöst und tropfenweise in ein Gemisch aus 10 mmol N-(O,O-Dimethyl)Phosphoalanin, 20 mmol Triphenylphosphin und 20 mmol Toluol eingebracht. Nach Reaktion bei 0°C über 3 Stunden wird das Reaktionsgemisch in ein gerührtes Gemisch aus 25 mmol Glutamin, 20 ml Wasser und 60 ml Pretoläther überführt, der pH-Wert wird auf 10 mit 20 mmol Kaliumhydroxid und nachfolgend Kaliumbicarbonat eingestellt, die Reaktionstemperatur wird bei 0°C gehalten, die verbleibende Reaktionsdauer nach Eintropfen beträgt 1,5 Stunden unter stetigem Rühren, der pH-Wert von 10 wird über die gesamte Reaktionsdauer beibehalten, und dann wird auf einen pH-Wert von 2,5 angesäuert mit konzentrierter Salzsäure. Die aufkonzentrierte wässrige Phase wird mit Methylsulfonsäure bei Raumtemperatur für 20 Stunden zur Reaktion gebracht. Zur Beendigung der Reaktion werden 50 ml Äther zugefügt, die Feststoffe lagern sich ab, und das Produkt L-Ala-L-Gln mit einer Ausbeute von 65% wird durch Rekristallisierung in Isopropanol/Wasser erhalten. [α]_D=10.55, C=2, m.p.=214–215.5.
Beispiel 2
20 mmol Hexachlorethan werden in 10 mmol Dichlormethan gelöst und tropfenweise in ein Gemisch aus 10 mmol N-(O,O-Dimethyl)Phosphoalanin, 20 mmol Triphenylphosphin und 20 ml Toluol eingebracht. Nach Reaktion bei 0°C über 3 Stunden wird das Reaktionsgemisch in ein gerührtes Gemisch aus 25 mmol Glutamin, 20 ml Wasser und 60 ml Pretoläther überführt, der pH-Wert wird auf 10 mit 20 mmol Kaliumhydroxid und nachfolgend Kaliumbicarbonat eingestellt, die Reaktionstemperatur wird bei 0°C gehalten, die verbleibende Reaktionsdauer nach Eintropfen beträgt 1,5 Stunden, und dann wird auf einen pH-Wert von 2,5 angesäuert mit konzentrierter Salzsäure. Die aufkonzentrierte wässrige Phase wird mit Methylsulfonsäure bei Raumtemperatur für 20 Stunden zur Reaktion gebracht. Zur Beendigung der Reaktion werden 50 ml Äther zugefügt, die Feststoffe lagern sich ab, und das Produkt L-Ala-L-Gln mit einer Ausbeute von 45% wird durch Rekristallisierung in Isopropanol/Wasser erhalten.
Beispiel 3
30 mmol Triphenylphosphin werden in 30 ml Tetrafuran gelöst und tropfenweise zu einem Gemisch aus 10 mmol N-(O,O-Dimethyl)Phosphoalanin, 30 mmol Hexaethan und 10 ml Tetrahydrofuran zugefügt. Nach einer Reaktion bei 10°C für 20 Minuten, wird es tropfenweise einem flüssigen Gemisch aus 30 mmol Glutamin, 20 ml Wasser und 20 ml Cyclohexan zugefügt. Während der Reaktion wird der pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 12 eingestellt, die Reaktionstemperatur beträgt 25°C und die Reaktionsdauer nach dem tropfenweisen Zufügen beträgt 30 Minuten. Dann wird der pH-Wert durch Ansäuern mit verdünnter Salpetersäure auf 1,5 eingestellt. Die konzentrierte wässrige Phase wird 20% Bromwasserstoff/Eisessig bei Raumtemperatur für 5 Stunden zur Reaktion gebracht. Am Ende der Reaktion werden 50 ml Äther tropfenweise zugefügt, die Feststoffe scheiden sich ab und das Produkt L-Ala-L-Gln wird mit einer Ausbeute von 50% durch Rekristallisieren der Feststoffe in Methanol-Wasser erhalten.
Beispiel 4
In einer Rundbodenflasche werden 10 mmol N-(O,O-Dimethyl)Phosphoalanin, 20 mmol Triphenylphosphin und 30 mmol Hexachlorethan gemischt, wonach 20 ml Toluol zugefügt werden. Nach Reaktion bei 5°C für 1 Stunde wird das Reaktionsgemisch in ein flüssiges Gemisch aus 10 mmol Glutamin, 20 ml Wasser und 5 ml Ethanol zugefügt. Während der Reaktion wird der pH-Wert auf 9,5 mit Natriumcarbonat eingestellt, die Reaktionstemperatur liegt bei 5°C und die Reaktionsdauer ist 10 Minuten. Dann wird der pH-Wert durch Ansäuern mit Phosphorsäure auf 1,0 eingestellt. Die konzentrierte wässrige Phase wird mit Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 15 Stunden zur Reaktion gebracht. Am Ende der Reaktion werden 50 ml Äther hinzugefügt, die Feststoffe scheiden sich ab und das Produkt L-Ala-L-Gln wird mit einer Ausbeute von 40% durch Rekristallisieren der Feststoffe in Methanol-Wasser erhalten.
Beispiel 5
20 mmol Triphenylphosphin werdein in 10 ml Methylhydrofuran gelöst und tropfenweise einem Gemisch aus 10 mmol N-(O,O-Dimethyl)Phosphoalanin, 30 mmol Hexachlorethan und 10 ml Tetrahydrofuran zugefügt. Nach Reaktion bei –5°C für 2 Stunden wird das erhaltene Gemisch einem flüssigen Gemisch enthaltend 10 mmol Glutamin, 20 ml Wasser und 20 ml Ethanol zugefügt. Während der Reaktion wird der pH-Wert mit 10 mmol Natriumhydroxid und nachfolgend Natriumbicarbonat auf 9,5 eingestellt, die Reaktionstemperatur beträgt –5°C, die Reaktionsdauer nach dem tropfenweisen Zufügen beträgt 2 Stunden. Dann wird mit konzentrierter Salzsäure angesäuert, um einen pH-Wert von 3,0 einzustellen. Die konzentrierte wässrige Phase reagiert mit gesättigtem Salzsäure/Eisessig bei Raumtemperatur für 5 Stunden. Am Ende der Reaktion werden 50 ml Äther zugefügt, die Feststoffe scheiden sich ab, und das Produkt L-Ala-L-Gln wird mit einer Ausbeute von 35% durch Rekristallisieren der Feststoffe mit Ethanol-Wasser erhalten.
Beispiel 6
30 mmol Hexaethan werden in 20 ml Dichlormethan gelöst und tropfenweise einem Gemisch bestehend aus 10 mmol N-(O,O-Diethyl) Phosphoalanin, 30 mmol Triphenylphosphin und 10 mmol Dichlormethan zugefügt. Nach einer Reaktion bei 0°C für 40 Minuten wird das erhaltene Gemisch tropfenweise einem flüssigen Gemisch enthaltend 30 mmol Glutamin, 20 ml Wasser und 10 ml Cyclohexan zugefügt. Während der Reaktion wird der pH-Wert mit Kaliumhydroxid auf 13 eingestellt, die Reaktionstemperatur beträgt 20°C und die Reaktionsdauer nach dem tropfenweisen Zufügen beträgt 30 Minuten. Dann wird mit verdünnter Salpetersäure angesäuert, um den pH-Wert auf 1,5 einzustellen. Die konzentrierte wässrige Phase wird mit Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 10 Stunden zur Reaktion gebracht. Am Ende der Reaktion werden 50 ml Äther zugefügt, die Feststoffe scheiden sich ab, und das Produkt Produkt L-Ala-L-Gln wird mit einer Ausbeute von 60% durch Rekristallisieren der Feststoffe mit 1,4-Dioxan-Wasser erhalten.
Beispiel 7
In einer Rundkolbenflasche werden 10 mmol N-(O,O-Diethyl)Phosphoalanin, 10 mmol Triphenylphosphin und 15 mmol Hexachlorethan gemischt, wonach 20 ml Acetonitril zugefügt werden. Nach Reaktion bei 15°C für 2,5 Stunden wird das erhalten Gemisch tropfenweise einem flüssigen Gemisch aus 30 mmol Glutamin, 20 ml Wasser und 30 ml Toluol zugefügt. Während der Reaktion wird der pH-Wert mit Natriumcarbonat auf 8,5 eingestellt, die Reaktionstemperatur beträgt 30°C und die Reaktionsdauer nach dem tropfenweisen Zufügen beträgt 1 Stunde. Dann wird mit verdünnter Schwefelsäure angesäuert, um den pH-Wert auf 2 einzustellen. Die konzentrierte wässrige Phase wird mit gesättigtem Bromwasserstoff/1,4-Dioxan bei Raumtemperatur für 5 Stunden zur Reaktion gebracht. Am Ende der Reaktion werden 50 ml Äther zugefügt, die Feststoffe scheiden sich ab und das Produkt L-Ala-L-Gln wird in einer Ausbeute von 40% durch Rekristallisieren der Feststoffe in Tetrahydrofuran-Wasser erhalten.
Beispiel 8
In einer Rundkolbenflasche werden 10 mmol N-(O,O-Diisopropyl)Phosphoalanin, Triphenylphosphin und Hexachlorethan gemischt, und dann werden 20 ml Tetrahydrofuran zugefügt. Nach Reaktion bei 30°C für 2 Stunden wird das Gemisch tropfenweise in ein flüssiges Gemisch enthaltend 15 mmol Glutamin, 20 ml Wasser und 10 ml Ethanol überführt. Während der Reaktion wird der pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 10,5 eingestellt, die Reaktionstemperatur ist –5°C, und die Reaktionsdauer nach dem tropfenweisen Zufügen beträgt 2 Stunden. Dann wird der pH-Wert mit konzentrierter Salzsäure auf 3,0 eingestellt. Die wässrige konzentrierte Phase wird mit gesättigter Salzsäure/Eisessig bei Raumtemperatur für 2 Stunden zur Reaktion gebracht. Am Ende der Reaktion werden 50 ml Äther hinzugefügt, die Feststoffe scheiden sich ab und das Produkt L-Ala-L-Gln wird in einer Ausbeute von 60% durch Rekristallisieren der Feststoffe in Ethanol-Wasser erhalten.
Beispiel 9
15 mmol Triphenylphosphin werden in 20 ml Dichlormethan gelöst und tropfenweise einem Gemisch aus 10 mmol N-(O,O-Diisopropyl)Phosphoalanin, 20 mmol Hexachlorethan und 10 mmol Dichlormethan zugefügt. Nach einer 3-stündigen Reaktion bei 10°C wird das Gemisch einem flüssigen Gemisch enthaltend 10 mmol Glutamin, 20 ml Wasser und 20 ml Ethylacetat zugefügt. Während der Reaktion wird der pH-Wert mit 10 mmol Natriumhydroxid und nachfolgend mit Natriumcarbonat auf 9 eingestellt. Die Reaktionstemperatur liegt bei 10°C, und die Reaktionsdauer nach dem tropfenweisen Zufügen liegt bei einer Stunde. Dann wird mit verdünnter Schwefelsäure angesäuert, um den pH-Wert auf 2,0 einzustellen. Die konzentrierte wässrige Phase reagiert mit 20% Bromwasserstoff/Eisessig bei Raumtemperatur für 5 Stunden. Am Ende der Reaktion werden 50 ml Äther zugefügt, die Feststoffe scheiden sich ab, und das Produkt L-Ala-L-Gln wird in einer Ausbeute von 45% durch Rekristallisieren der Feststoffe mit Methylalkohol-Wasser erhalten.
Beispiel 10
15 mmol Hexachlorethan werden in 10 ml 1,2-Dichlorethan gelöst und das erhaltene Gemisch wird einem Gemisch aus 10 mmol N-(O,O-Diisopropyl)Phosphoalanin, 15 mmol Triphenylphosphin und 10 ml 1,2-Dichlorethan zugefügt. Nach Reaktion bei 20°C für 1,5 Stunden wird es tropfenweise zu 20 ml Wasser enthaltend 20 mmol Glutamin zugefügt. Während des Reaktionsverlaufs wird der pH-Wert mit Kaliumhydroxid auf 13 eingestellt, die Reaktionstemperatur liegt bei 10°C und die Reaktionsdauer nach dem tropfenweisen Zufügen liegt bei 2 Stunden. Dann wird der pH-Wert durch Ansäuern mit verdünnter Salpetersäure auf 1,5 eingestellt. Die konzentrierte wässrige Phase wird mit Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 10 Stunden zur Reaktion gebracht. Am Ende der Reaktion werden 50 ml Äther zugefügt, die Feststoffe scheiden sich ab, und das Produkt L-Ala-L-Gln wird in einer Ausbeute von 52% durch Rekristallisieren der Feststoffe mit Isopropanol-Wasser erhalten.
Beispiel 11
In einer Rundkolbenflasche werden 10 mmol Tert-Butylcarbonylalanin (Boc-Ala), 15 mmol Triphenylphosphin und 20 mmol Hexachlorethan vereinigt, und dann in 20 ml 1,2-Dichlorethan überführt. Nach 20-minütiger Reaktion bei 10°C wird das Gemisch in ein flüssiges Gemisch, enthalten 30 mmol Glutamin, 20 ml Wasser und 20 ml Cyclohexan zugefügt. Während der Reaktion wird der pH-Wert mit Kaliumhydroxid auf 11 eingestellt und die Reaktionstemperatur liegt bei 20°C, die Reaktionsdauer nach dem tropfenweisen Zufügen liegt bei 30 Minuten. Dann wird der pH-Wert mit verdünnter Salpetersäure auf 1,5 eingestellt. Die konzentrierte wässrige Phase wird mit Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 15 Stunden zur Reaktion gebracht. Am Ende der Reaktion werden 50 ml Äther zugefügt, die Feststoffe scheiden sich ab, und das Produkt L-Ala-L-Gln wird in einer Ausbeute von 40% durch Rekristallisieren der Feststoffe mit Tetrahydrofuran-Wasser erhalten.
Beispiel 12
10 mmol Triphenylphosphin werden in 10 ml Toluol gelöst, und tropfenweise einem gemischten System aus 10 ml Tert-Butylcarbonylalanin (Boc-Ala), 10 mmol Hexachlorethan und 20 ml Toluol zugefügt. Nach 2-stündiger Reaktion bei 5°C wird das Gemisch tropfenweise in ein flüssiges Gemisch, enthaltend 15 mmol Glutamin, 20 ml Wasser und 60 ml Petrolether, zugefügt. Während der Reaktion wird der pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 12 eingestellt, die Reaktionstemperatur liegt bei 10°C und die Reaktionsdauer nach dem tropfenweisen Zufügen liegt bei 1,5 Stunden. Dann wird mit verdünnter Schwefelsäure der pH-Wert auf 1,5 eingestellt. Die wässrige Phase wird aufkonzentriert und mit Chlorwasserstoff/1,4-Dioxan bei Raumtemperatur für 5 Stunden zur Reaktion gebracht. Am Ende der Reaktion werden 50 ml Äther hinzugefügt, die Feststoffe scheiden sich ab, und das Produkt L-Ala-L-Gln wird durch Rekristallisieren der Feststoffe mit 1,4-Dioxan-Wasser in einer Ausbeute von 52% erhalten.
Beispiel 13
20 mmol Hexachlorethan werden in 10 ml Tetrahydrofuran gelöst, und das Gemisch wird tropfenweise in ein Gemisch bestehend aus 10 mmol Tert-Butylcarbonylalanin (Boc-Ala), 20 mmol Triphenylphosphin und 20 ml Tetrahydrofuran zugefügt. Nach 1,5-stündiger Reaktion bei 0°C wird das Gemisch tropfenweise in ein flüssiges Gemisch, enthaltend 20 mmol Glutamin, 20 ml Wasser und 15 ml Dichlormethan zugefügt. Während der Reaktion wird der pH-Wert mit 20 mmol Kaliumhydroxid und nachfolgend mit Natriumcarbonat auf 10 eingestellt, die Reaktionstemperatur liegt bei 8°C, die Reaktionsdauer nach dem tropfenweisen Zufügen liegt bei 2 Stunden. Dann wird mit konzentrierter Salzsäure angesäuert, um den pH-Wert auf 2,0 einzustellen. Die wässrige konzentrierte Phase wird bei Raumtemperatur für 20 Stunden mit Methylsulfonsäure zur Reaktion gebracht. Am Ende der Reaktion werden 50 ml Äther zugefügt, die Feststoffe scheiden sich ab, und das Produkt L-Ala-L-Gln wird durch Rekristallisieren der Feststoffe mit Methanol-Wasser in einer Ausbeute von 45% erhalten.
Beispiel 14
In einer Rundkolbenflasche werden jeweils 10 mmol Carbobenzoxy-Alanin (Z-Ala), triphenylphosphin und Hexachlorethan gemischt und dann 30 ml Toluen zugefügt. Nach Reaktion bei 0°C für 3 Stunden wird das erhaltene Gemisch in ein flüssiges Gemisch enthaltend 25 mmol Glutamin und 20 ml Wasser überführt. Während der Reaktion wird der pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 12 eingestellt, die Reaktionstemperatur liegt bei 15°C, die Reaktionsdauer nach dem tropfenweisen Zufügen liegt bei 1,5 Stunden. Dann wird der pH-Wert mit verdünnter wässriger Säure auf pH-Wert 2,5 eingestellt. Die konzentrierte wässrige Phase wird in Methanol mit Wasserstoffgas bei Raumtemperatur für 15 Stunden zur Reaktion gebracht. Das Produkt L-Ala-L-Gln wird in einer Ausbeute von 48% erhalten.
Beispiel 15
15 mmol Triphenylphosphin werden in 10 ml Tetrahydrofuran gelöst, das erhaltene Gemisch wird in ein Gemisch aus 10 mmol Carbobenzoxy-Alanin (Z-Ala), 20 mmol Hexachlorethan und 10 ml Tetrahydrofuran eingetropft. Nach Reaktion für 1,5 Stunden bei 0°C wird das erhaltene Gemisch in ein flüssiges Gemisch enthaltend 18 mmol Glutamin, 20 ml Wasser und 40 ml Dichlormethan zugefügt. Während der Reaktion wird der pH-Wert mit Kaliumhydroxid auf 13 eingestellt, die Reaktionstemperatur liegt bei 0°C und die Reaktionsdauer nach dem tropfenweisen Zufügen bei 2 Stunden. Dann wird mit verdünnter Schwefelsäure angesäuert, um den pH-Wert auf 2,0 einzustellen. Die konzentrierte wässrige Phase wird bei Raumtemperatur für 15 Stunden in Methanol mit Wasserstoff zur Reaktion gebracht. Das Produkt L-Ala-L-Gln wird in einer Ausbeute von 65% erhalten.
Beispiel 16
30 mmol Hexachlorethan werden in 10 ml Acetonitril gelöst, und das erhaltene Gemisch wird in ein Gemisch aus 10 mmol Carbobenzoxy-Alanin (Z-Ala), 20 ml Triphenylphosphin und 10 ml Acetonitril eingefügt. Nach einer Stunde Reaktion bei 5°C wird das erhaltene Gemisch in 20 ml Wasser enthaltend 10 mmol Glutamin eingetropft. Während der Reaktionsdauer wird der pH-Wert mit zunächst 20 mmol Natriumhydroxid und dann Kaliumcarbonat auf 10 eingestellt, die Reaktionstemperatur liegt bei 5°C und die Reaktionsdauer nach dem tropfenweisen Zufügen bei 2 Stunden. Dann wird mit konzentrierter Salzsäure angesäuert, um den pH-Wert auf 3,0 einzustellen. Die konzentrierte wässrige Phase wird bei Raumtemperatur für 40 Stunden mit Trifluoressigsäure zur Reaktion gebracht. Am Ende der Reaktion werden 50 ml Äther hinzugefügt, Feststoffe scheiden sich ab, und das Produkt L-Ala-L-Gln wird in einer Ausbeute von 45% durch Rekristallisieren der Feststoffe in 1,4-Dioxan-Wasser erhalten.
Zusammenfassung
Es wird ein Syntheseverfahren für Alanylglutamin offenbart, welches folgende Stufen umfasst: Das N-terminal geschützte Alanin wird mit Triphenylphosphin und Hexachlorethan in einem organischen Lösungsmittel zur Reaktion gebracht, um einen aktivierten Ester zu bilden, der aktivierte Ester reagiert in einem Lösungsgemisch, welches ein organisches Lösungsmittel und eine wässrige Lösung einer anorganischen Base enthält, zur Reaktion gebracht, und das resultierende Gemisch wird mit einer anorganischen Säure angesäuert und dann wird die N-terminale Schutzgruppe entfernt. In diesem Verfahren sind die verwendeten Rohmaterialien billig, die Synthesetechnik ist einfach, es sind keine Vorrichtung für die Trennung und Reinigung nötig, das Produkt kann einfach separiert und gereinigt werden, die Toxizitäten aller im Laufe der Produktion verwendeten Reagenzien sind minimal und das Verfahren ist vorteilhaft für den Umweltschutz.

Claims

Syntheseverfahren für Alanylglutamin, umfassend die Stufen: 1) Bildung eines aktivierten Esters durch die Reaktion von 10 mmol N-terminal geschütztem Alanin, 10~30 mmol Triphenylphosphin und 10~30 mmol Hexachlorethan in einem organischen Lösungsmittel für 20 min.~3 Stunden und bei einer Reaktionstemperatur von –5~30°C; 2) Reagieren des aus Stufe 1 erhaltenen aktivierten Esters in einem flüssigen Gemisch, welches hergestellt wird, indem ein organisches Lösungsmittel und eine wässrige Lösung einer anorganischen Base gemischt werden, mit 10~30 mmol Glutamin, um das N-terminal geschützte Alanin zu erhalten, wobei das Volumenverhältnis des organischen Lösungsmittels und der wässrigen Lösung der anorganischen Base bei 0~4 liegt, die Reaktionstemperatur bei –5~30°C liegt und der pH auf 8,5~13 eingestellt wird; 3) Ansäuern des Reaktionsgemisches aus Stufe 2 mit einer anorganischen Säure auf einen pH-Wert von ≤ 3,0; 4) Erhalten des Alanylglutamins durch Entfernen der N-terminalen Schutzgruppe mit einem Schutzgruppen abspaltenden Reagenz.
Syntheseverfahren für Alanylglutamin nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass 1) die Bildung des aktivierten Esters durch die Reaktion von 10 mmol N-terminal geschütztem Alanin, 15~20 mmol Triphenylphosphin und 15~20 mmol Hexachlorethan in einem organischen Lösungsmittel für 1,5~2 Stunden und einer Reaktionstemperatur von 0~10°C erfolgt; 2) Reagieren des aktivierten Esters aus Stufe 1 in einem flüssigen Gemisch, welches durch Mischen eines organischen Lösungsmittels und einer wässrigen Lösung einer anorganischen Base hergestellt wird, mit 15~20 mmol Glutamin, um ein N-terminal geschütztes Alanylglutamin zu bilden, worin das Volumenverhältnis des organischen Lösungsmittels und der wässrigen Lösung der anorganischen Base bei 0,5~2 liegt, die Reaktionstemperatur 5~10°C ist, und der pH-Wert auf 9,5~10,5 eingestellt wird; 3) Alanylglutamin durch Ansäuern des Reaktionsgemisches aus Stufe 2) auf einen pH-Wert von 2,0~3,0 erhalten wird.
Syntheseverfahren für Alanylglutamin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das N-terminal geschützte Alanin N-(O,O-Dimethyl)Phosphoalanin(DMP-L-Ala), N-(O,O-Diethyl)Phosphoalanin (DEP-L-Ala), N-(O,O-Diisopropyl)Phosphoalanin (DIPP-L-Ala), N-(O,O-Di-N-Butyl)Phosphoalanin(DBP-Ala), Carbobenzoxyalanin(Z-L-Ala), (para-Carbomethoxy)Carbobenzoxyalanin(MZ-L-Ala), Tert-Butylcarboalanin(Boc-L-Ala) oder 2-(Dibiphenyl)Isopropylcarboalanin(Bpoc-L-Ala).
Syntheseverfahren für Alanylglutamin nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das in Stufe 1 verwendete organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dichlormethan, Toluol, Tetrahydrofuran, Acetonitril oder 1,2-Dichlorethan.
Syntheseverfahren für Alanylglutamin nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das in Stufe 2 verwendete organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ethanolethylacetat, Petrolether, Cyclohexan, Toluol und Dichlormethan.
Syntheseverfahren für Alanylglutamin nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die in Stufe 2 verwendete anorganische Base ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumbicarbonat, Kaliumbicarbonat, Natriumcarbonat und Kaliumcarbonat.
Syntheseverfahren für Alanylglutamin nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die in Stufe 2) verwendete anorganische Säure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure und Phosphorsäure.
Syntheseverfahren für Alanylglutamin nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Schutzgruppen abspaltende Reagenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Trifluoressigsäure, Salzsäure/Eisessig, Bromwasserstoff/Eisessig, Methylsulfonsäure, Reduktion mit Wasserstoff, Salzsäure/1,4-Dioxan, Bromwasserstoff/1,4-Dioxan.
Syntheseverfahren für Alanylglutamin nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Stufe 2 wie folgt durchgeführt wird: Der aus Stufe 1) erhaltene aktivierte Ester wird mit Glutamin in einem gerührten flüssigen Gemisch, enthaltend ein organisches Lösungsmittel und eine wässrige Lösung einer anorganischen Base bei Rühren und bei einem pH-Wert 9,5–10,5 während des Reaktionsverlaufs zur Reaktion gebracht wird.