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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Syntheseverfahren für ein Aminosäure enthaltenes
Dipeptid, insbesondere ein Syntheseverfahren für ein Alanylglutamine.
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Glutamin
ist der Hauptbestandteil der Aminosäuren im menschlichen Körper, wobei
der Gehalt an Glutamin im Muskelprotein und im Plasmaprotein bei etwa
75% bzw. 26% liegt.
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Glutamin
weist eine wichtige physiologische Wirkung auf. Glutamin ist ein
notwendiges Vorläufermolekül für die Synthese
von Nukleinsäuren
von Organismen, ein Regulator der Synthese und des Abbaus von Protein,
ein Träger
des von dem peripheren Gewebe zu den internen Organen transportierten Aminostickstoffs,
und ein wichtiger Träger
der Stickstoffexkretion durch die Niere. Glutamin ist der wichtigste
Energieträger
von Epithelialzellen der intestinalen Mukosa, der renalen Tubuluszelle,
des Makrophagen und des Fibroblasten. Es spielt eine wichtige Rolle
unter verschiedenen Aspekten wie beispielsweise das Aufrechterhalten
der Intestinalfunktion, das Vermitteln der Immunitätsfunktion,
das Aufrechterhalten eines Alkaligleichgewichtes im Körper und das
Erhöhen
der Anpassungsfähigkeit
des Organismus gegenüber
der Erregbarkeit.
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Im
Notfall und bei hoher Katabolismus Aktivität, beispielsweise wie im Falle
einer ernsthaften klinischen Infektion, einer multiplen Fraktur,
einer großen
Operation, großflächiger Verbrennungen
und der Anaphase eines malignen Tumors etc., übersteigt der Bedarf an Glutamin
die Synthesekapazität
des Körpers
für Glutamin
in hohem Maße,
und der Gehalt an Glutamin im Körper
verringert sich, wodurch eine Abnahme der Nukleinsäure- und
Proteinsynthese hervorgerufen wird. Wird die herkömmliche
vollständige
Phleboklysis Ernährungslösung (TPN)
angepasst, kann dies das Schrumpfen der intestinalen Mukosa bewirken,
wodurch die Durchlässigkeit
der intestinalen Mukosa und der Durchlass von Bakterien erhöht wird,
und dies wird sogar eine Blutvergiftung sowie multiples Organversagen
(Multi-apparatus-Disfunktion) bewirken. Eine große Anzahl von Experimenten
hat gezeigt, dass die Supplementierung der TPN mit GLN deutliche
Wirkung bei der Verhinderung und der Heilung vieler Erkrankungen
zeigt. Wird eine gewisse Menge an Glutamin zu der TPN hinzugefügt, um die
Konzentration an Glutamin im Gewebe wie beispielsweise dem Blut
und Muskel etc. zu erhöhen,
zeigt dies eine wichtige Wirkung für das Beibehalten oder die
Wiederherstellung der Funktion der intestinalen Mukosa. Wird das
mit Glutamin supplementierte TPN ernsthaft infizierten Patienten transfundiert,
zeigen sich evidente Wirkungen im Beibehalten eines positiven Stickstoffgleichgewichts
und der Förderung
der Expression der GLN-Synthetase in Zellen, wodurch die Abnahme
der GLN-Konzentrationen und der Ribosomen innerhalb des Myocyten reduziert
wird.
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In
den letzten Jahren erhielt die Verabreichung von Glutamin über die
Ernährung
außerhalb des
Intestinums in der Öffentlichkeit
allgemein Aufmerksamkeit wegen dessen wichtigen physiologischen
und pharmakologischen Wirkungen. Wie oben erwähnt, ist die Konzentration
an Glutamin im Blut und den Zellen unter dem Zustand der Irritation
wie bei verschiedenen Wunden (einschließlich Unfallwunden, Operationswunden
und Bestrahlungswunden) oder Infektionen etc. verringert, und kann
durch Verabreichung von Aminosäuremedikamenten
(GLN nicht eingeschlossen), die heute verfügbar sind, nicht erhöht werden.
Bestimmte wichtige Funktionen von Zellen wie die Proteinsynthese,
die Phagozytose und die Vermehrung von Lymphozyten etc. sind alle
notwendigerweise von der Verfügbarkeit
von genug GLN bedingt. Aufgrund seiner geringen Löslichkeit und
Stabilität
in Lösung
bildet es die toxische Pyroglutamatsäure und Stickstoff, wenn es
für die
Sterilisation erhitzt wird, so dass Glutamat in einem kommerziell
erhältlichen
Aminosäuremedikament
nicht enthalten ist. Zurzeit wird Glutamin hauptsächlich auf folgenden
Wegen verabreicht: (1) Verwendung direkt nach Herstellung; Zufügen von
GLN-Kristallen zu der Aminosäurelösung und
nachfolgende Filtration und Sterilisation und Transfusion innerhalb
von acht Stunden. Dieses Vorgehen muss unter aseptischen Bedingungen
durchgeführt
werden, die Arbeit ist kompliziert und schwierig, so dass der Anwendungsbereich
limitiert ist. (2) Die Synthese von GLN-Derivaten, wie beispielsweise
Acetylglutamin. Dieses kann einfach synthetisiert werden, ist gegenüber der Erhitzung
stabil und im Körper
kann daraus GLN gebildet werden. Allerdings ist dessen Verwertungsverhältnis gering
und 40% der aufgenommenen Menge wird als Harnstoff ausgeschieden.
(3) Verabreichung von GLN-Dipetiden.
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Zurzeit
sind die in experimentellen Untersuchungen verwendeten Dipeptide
hauptsächlich
zweierlei Art: Glycylglutamin (L-Glycyl-L-Glutamin, L-Gly-L-Gln) und Ananylglutamin
(L-Alanyl-L-Glutamin, L-Ala-L-Gln). Die in Tieren und im menschlichen Körper vorgenommenen
Experimente zeigen, dass diese beiden Arten von Dipeptiden im menschlichen Körper schnell
in die sie zusammensetzenden Aminosäuren abgebaut werden, dass
ihre Halbwertzeit gering ist, dass nur geringe Mengen der Dipeptide
im Blut nachgewiesen werden können,
und dass nur geringe Mengen der Dipeptide als Harnstoff ausgeschieden
werden. Diese Fakten zeigen, dass GLN-Dipeptide effektiv verwertet
werden können, und
dass sie nicht im Blut akkumulieren, so dass die möglichen
pharmakologischen und physiologischen Nebenwirkungen, die durch
die Dipeptide hervorgerufen werden, vermieden werden können. Experimente
beweisen, dass, wenn ein gesunder menschlicher Körper über einen langen Zeitraum intravenös L-Ala-L-Gln
verabreicht bekommt, keine Nebenwirkungen und gefährliche
Reaktionen auftreten, und dass die normalen Nierenfunktionen nicht
beeinflusst werden. Die Löslichkeit
des L-Ala-L-Gln, welches chemisch synthetisiert wird, ist nach Reinigung 20-mal
höher als
die des GLN-Monomers. Es ist stabil sowohl bei Lagerung und bei
Erhitzung zur Sterilisation. Wenn es vom menschlichen Körper aufgenommen
wird, zerfällt
es in GLN und zeigt seine Wirkung, und macht daher die Anwendung
von GLN in TPN einfacher und praktisch durchführbar.
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Es
gibt vier Syntheseverfahren für
Ananylglutamin, die wie folgt dargestellt ausgestaltet sind:
- 1. Zunächst
wird die terminale Aminogruppe in GLN (Glutamin) geschützt, wodurch
beispielsweise ein carbobenzyloxylgeschütztes Glutamin (Cbz-Gln) gebildet
wird. In einem zweiten Schritt wird die Acylaminogruppe im Cbz-Gln
geschützt, wobei
Cbz-Gln (OC13H9)
gebildet wird. In einem dritten Schritt wird die Carbonylgruppe
in Cbz-Gln (OC13H9)
geschützt,
und Cbz-Gln (OC13H9)OMe wird
gebildet. Der vierte Schritt besteht in dem Überleiten von Wasserstoffgas,
um GLN(OC13H9)OMe
zu bilden. In einem fünften Schritt
wird Cbz-Ala hinzugefügt.
Im sechsten Schritt wird Cbz-Ala aktiviert. Der siebte Schritt besteht
darin, Cbz-Ala mit Gln (OC13H9)OMe
zu kombinieren, um ein Peptid zu bilden. Der achte Schritt umfasst
die Entfernung des Methylesters durch Verseifung. Der neunte Schritt
ist die Entfernung aller Schutzgruppen durch Ansäuerung um Alanylglutamin zu
bilden. (Literatur: Yasutsugu Shimomishi, Untersuchungen zur Synthese
von Peptiden die Glutamine am C-Terminus enthalten. Y. Bull. Chem.
Soc. Jpn. 1962, 35, 1966) Dieses Reaktionsverfahren umfasst zu viele
Schritte, wobei die Kosten für
die Reagenzien teuer sind, und es besitzt daher keinen praktischen
Wert.
- 2. Die folgende Reaktion wird verwendet: Unter Einwirkung von
Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) wird das carbobenzyloxyschützende Alanin (Z-Ala)
mit HOSu bei 20~25°C
für fünf Stunden zur
Reaktion gebracht, wonach das Dicyclohexylharnstoff abfiltriert
wird, und die Synthese in einer wässrigen Lösung von Natriumbikarbonat
mit nicht geschütztem
Gln fortgeführt
wird, und das Produkt wird durch Hydrogenierung in Methylalkohol
reduziert, um die Schutzgruppe zu entfernen, wonach das Alanylglutamin
erhalten wird. (Literatur: Katoh, T. Kurauchi, M. Eur, Pat. 311,057,
12. Apr. 1989) Die in dieser Methode verwendeten Reagenzien sind
teuer, es ist schwierig, die Produkte des DCC nach der Reaktion
zu entfernen, und das Produktionsverfahren wird dadurch komplizierter.
- 3. Die folgende Reaktion wird verwendet: Phosgen (COCl2) wird mit Alanyn reagiert, um ein gemischtes
Anhydrid zu bilden, wird dann mit Gln in Wasser zur Reaktion gebracht,
wobei der pH-Wert der Lösung
bei 10,2 gehalten wird, und zuletzt wird die Schutzgruppe in saurer
Lösung entfernt
und das Ananylglutamin wird erhalten. (Literatur: Frerst, P. Pfaendetr,
P. Ger. Offen. DE 3206,784 .
01 Sep. 1983) Das Reaktionsverfahren dieser Methode ist weniger,
allerdings ist Phosgen ein gefährliches
Gas, die Reaktion kann nur schwerlich zur Vollständigkeit geführt werden,
und ist für
den menschlichen Körper
gefährlicher.
- 4. Acylchlorid wird durch Aktivierung des chiralen Reagenz Chloropropionsäure mit
SOCl2 gebildet, und reagiert dann in einer
wässrigen
NaOH-Lösung
mit Gln, wobei der pH-Wert der Lösung
bei 10 gehalten wird. Das Produkt ist das Dichlorpropionylglutamin,
welches mit flüssigem
Stickstoff bei einem gewissen Druck reagiert, wodurch das Alanylglutamin
erhalten wird. (Literatur: Takahiro Sano, Toru Sugaya, Process Research
und Development of 1-Alanul-1-glutamine, [A] Component of Parenteral
Nutrition, Organic Process Research and Development. 2000,4,147-152)
Das Ausgangsmaterial dieser Reaktion ist ein chirales Reagenz, welches
für das
Syntheseverfahren von Acylchlorid sehr teuer ist, die Reaktionstemperatur
ist erhöht,
und es gibt zu viele Seitenreaktionen. Daher können die Produktionskosten
zu teuer werden, wenn es für
die Produktion verwendet wird.
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Syntheseverfahren
für ein
Alanylglutamin zur Verfügung
zu stellen, welches billigere Ausgangsmaterialien betrifft, eine
einfach Synthesetechnik umfasst, geringe Produktionskosten, eine
hohe Produktivität
und vorteilhafte Umweltschutzeigenschaften aufweist.
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Das
Vorgehen bei dem Syntheseverfahren für Alanylglutamin ist wie folgend
dargestellt:
- 1) 10 mmol N-terminal geschütztes Alanin
(I), 10~30 mmol, vorzugsweise 15~20 mmol Triphenylphosphin und 10~30
mmol, vorzugsweise 15~20 mmol Hexachlorethan werden in organischen
Lösungsmitteln
(II) für
0,33 Stunden zur Reaktion gebracht, vorzugsweise für 1,5~2
Stunden, bei einer Reaktionstemperatur von –5~30°C, vorzugsweise bei 0~10°C, um einen
aktivierten Ester zu bilden;
- 2) Das Reaktionsgemisch nach Stufe 1, welches den aktivierten
Ester umfasst, wird mit 10~30 mmol Glutamin in einer gemischten
Flüssigkeit, welche
organische Lösungsmittel
(III) und restliche Lösung
einer anorganischen Basis (IV) enthält (wegen der Anwesenheit eines
organischen Lösungsmittels
in Stufe 1), wobei das Volumenverhältnis von III zu IV bei etwa
0~4 liegt, falls das organische Lösungsmittel (II), welches in
Stufe 1 verwendet wurde, mit dem organischen Lösungsmittel (III) übereinstimmt,
muss in Stufe 2 kein organisches Lösungsmittel mehr verwendet
werden, und in diesem Fall ist das Volumenverhältnis von III zu IV 0, vorzugsweise
0,5~2, und die Reaktionstemperatur ist –5~30°C, vorzugsweise 5~10°C, und der
pH-Wert der Lösung
wird auf 8,5~13 eingestellt, vorzugsweise 9,5~10,5. Das bevorzugteste
Verfahren ist es, wenn Stufe 2 unter Rühren durchgeführt wird,
wobei der aktivierte Ester, der aus Stufe 1 erhalten wurde, mit
10~30 mmol Glutamin in ein gerührtes
Flüssigkeitsgemisch
aus dem organischen Lösungsmittel
(III) und der wässrigen
Lösung
einer anorganischen Base (IV) zur Reaktion gebracht wird. Während der
Reaktion wird weiter gerührt
und der pH-Wert von 9,5–10,5
muss beibehalten werden;
- 3) Ansäuern
der Lösung
auf einen pH-Wert < 3,0, vorzugsweise
2,0–3,0
mit anorganischer Säure (V);
und dann
- 4) Entfernen der N-terminalen Schutzgruppe mit dem Schutzgruppen
abspaltenden Reagenz (VI), wodurch Alanylglutamin in einer Ausbeute
von 30%~65% erhalten wird,
wobei, - (I)
die N-terminal geschützte
Aminosäure
bevorzugt N-(O,=-Dimethyl)Phosphoalanin(DMP-L-Ala),
N-(O,=-Diethyl)phosphoalanin(DEP-L-Ala), N-(O,O-Diiospropyl)Phosphoalanin(DIPP-L-Ala),
N-(O,O-Di-N-Butyl)Phosphoalanin(DBP-Ala),
Carbobenzoxy-Alanin(Z-L-Ala), (Para-Carbomethoxy)Carbobenzoxyaline(MZ-L-Ala),
Tert-Butylcarbonylalanin(Boc-L-Ala)2-(Dibiphenyl)Isopropylcarbonylalanin
(Bpoc-L-ala) etc. ist,
- (II) das organische Lösungsmittel
bevorzugt Dichloromethan, Toluen, Tetrahydrofuran, Acetonitril,
1,2-Dichlorethan etc ist,
- (III) das organische Lösungsmittel
bevorzugt Ethylalkohol, Ethylacetat, Petroliumether, Cyclohexan,
Toluol, Dichloromethan etc ist,
- (IV) die anorganische Basis bevorzugt Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid,
Natriumbikarbonat, Natriumkarbonat, Kaliumkarbonat etc ist,
- (V) die anorganische Säure
bevorzugt Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure etc
ist, und
- (VI) das als Schutzgruppen abspaltendes Gruppe verwendete Reagenz
bevorzugt Trifluoressigsäure,
Salzsäure/Eisessig,
Bromwasserstoff/Eisessig, Methylsulfonsäure, die Reduktion durch Hydrogenierung,
Salzsäure/1,4-Dioxan,
Bromwasserstoff/1,4-Dioxan etc ist.
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Im
Vergleich mit den bisher verfügbaren
Syntheseverfahren liegen die Hauptvorteile dieser Erfindung darin:
- 1) Die Ausgangsmaterialien sind billig.
- 2) Das Syntheseverfahren ist einfach, es ist keine Trennung
der Zwischenprodukte nötig,
wenn die Reaktion beendet ist, und es ist einfach, das Produkt zu
separieren und zu reinigen.
- 3) Der aktivierte Ester bildet sich in einem sauren Medium,
so dass die Razematbildung des Produktes mit der organischen Base
vermieden wird.
- 4) Der Verfahrensschtritt in der wässrigen Phase in der zweiten
Stufe der Reaktion wird so angepasst, dass die Bindung der Schutzgruppe
an die bzw. das Abspalten der Schutzgruppe von der Aminosäure Glutamin
ausgelassen wird, so dass die Syntheseroute vereinfacht und die
Reaktionsdauer verkürzt
wird.
- 5) Da in der zweiten Stufe in einer wässrigen Phase gearbeitet wird,
kann eine anorganische Base die Stelle der organischen Base einnehmen,
wodurch die Produktionskosten reduziert werden und positive Effekte
hinsichtlich der Umweltverträglichkeit
des Verfahrens erzielt werden.
- 6) Am Ende der Reaktion werden zwei Produkte erhalten, das eine
ist Alanylglutamin und das andere ist das Nebenprodukt (Triphenylphosphin). Das
Triphenylphosphin ist ein nicht-flüssiger Feststoff, der einfach
abgetrennt werden kann, und der als Rohmaterial aufbewahrt werden
kann.
- 7) Alle Lösungsmittel,
die in dem gesamten Syntheseverfahren verwendet werden, können wieder
gewonnen und einfach wieder verwendet werden.
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In
Kürze ist
das Syntheseverfahren einfach, die Rohmaterialien sind billig und
einfach zu erhalten, die Synthesetechnik ist rationell, sie ist
vorteilhaft für den
Umweltschutz und die Produktionskosten sind gering, wodurch das
Verfahren einen exzellenten praktischen Wert besitzt.
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Unter
Bezugnahme auf die folgenden Beispiele wird die Erfindung weiter
erläutert.
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Beispiele
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Beispiel 1
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20
mmol Hexachlorethan werden in 10 mmol Dichlormethan gelöst und tropfenweise
in ein Gemisch aus 10 mmol N-(O,O-Dimethyl)Phosphoalanin, 20 mmol
Triphenylphosphin und 20 mmol Toluol eingebracht. Nach Reaktion
bei 0°C über 3 Stunden wird
das Reaktionsgemisch in ein gerührtes
Gemisch aus 25 mmol Glutamin, 20 ml Wasser und 60 ml Pretoläther überführt, der
pH-Wert wird auf 10 mit 20 mmol Kaliumhydroxid und nachfolgend Kaliumbicarbonat
eingestellt, die Reaktionstemperatur wird bei 0°C gehalten, die verbleibende
Reaktionsdauer nach Eintropfen beträgt 1,5 Stunden unter stetigem
Rühren,
der pH-Wert von 10 wird über
die gesamte Reaktionsdauer beibehalten, und dann wird auf einen pH-Wert
von 2,5 angesäuert
mit konzentrierter Salzsäure.
Die aufkonzentrierte wässrige
Phase wird mit Methylsulfonsäure
bei Raumtemperatur für
20 Stunden zur Reaktion gebracht. Zur Beendigung der Reaktion werden
50 ml Äther
zugefügt,
die Feststoffe lagern sich ab, und das Produkt L-Ala-L-Gln mit einer Ausbeute
von 65% wird durch Rekristallisierung in Isopropanol/Wasser erhalten.
[α]D=10.55, C=2, m.p.=214–215.5.
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Beispiel 2
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20
mmol Hexachlorethan werden in 10 mmol Dichlormethan gelöst und tropfenweise
in ein Gemisch aus 10 mmol N-(O,O-Dimethyl)Phosphoalanin, 20 mmol
Triphenylphosphin und 20 ml Toluol eingebracht. Nach Reaktion bei
0°C über 3 Stunden
wird das Reaktionsgemisch in ein gerührtes Gemisch aus 25 mmol Glutamin,
20 ml Wasser und 60 ml Pretoläther überführt, der
pH-Wert wird auf 10 mit 20 mmol Kaliumhydroxid und nachfolgend Kaliumbicarbonat eingestellt,
die Reaktionstemperatur wird bei 0°C gehalten, die verbleibende
Reaktionsdauer nach Eintropfen beträgt 1,5 Stunden, und dann wird
auf einen pH-Wert von 2,5 angesäuert
mit konzentrierter Salzsäure.
Die aufkonzentrierte wässrige
Phase wird mit Methylsulfonsäure
bei Raumtemperatur für
20 Stunden zur Reaktion gebracht. Zur Beendigung der Reaktion werden
50 ml Äther
zugefügt,
die Feststoffe lagern sich ab, und das Produkt L-Ala-L-Gln mit einer Ausbeute
von 45% wird durch Rekristallisierung in Isopropanol/Wasser erhalten.
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Beispiel 3
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30
mmol Triphenylphosphin werden in 30 ml Tetrafuran gelöst und tropfenweise
zu einem Gemisch aus 10 mmol N-(O,O-Dimethyl)Phosphoalanin, 30 mmol
Hexaethan und 10 ml Tetrahydrofuran zugefügt. Nach einer Reaktion bei
10°C für 20 Minuten,
wird es tropfenweise einem flüssigen
Gemisch aus 30 mmol Glutamin, 20 ml Wasser und 20 ml Cyclohexan
zugefügt.
Während
der Reaktion wird der pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 12 eingestellt,
die Reaktionstemperatur beträgt
25°C und
die Reaktionsdauer nach dem tropfenweisen Zufügen beträgt 30 Minuten. Dann wird der
pH-Wert durch Ansäuern mit
verdünnter
Salpetersäure
auf 1,5 eingestellt. Die konzentrierte wässrige Phase wird 20% Bromwasserstoff/Eisessig
bei Raumtemperatur für
5 Stunden zur Reaktion gebracht. Am Ende der Reaktion werden 50
ml Äther
tropfenweise zugefügt,
die Feststoffe scheiden sich ab und das Produkt L-Ala-L-Gln wird mit einer
Ausbeute von 50% durch Rekristallisieren der Feststoffe in Methanol-Wasser
erhalten.
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Beispiel 4
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In
einer Rundbodenflasche werden 10 mmol N-(O,O-Dimethyl)Phosphoalanin,
20 mmol Triphenylphosphin und 30 mmol Hexachlorethan gemischt, wonach
20 ml Toluol zugefügt
werden. Nach Reaktion bei 5°C
für 1 Stunde
wird das Reaktionsgemisch in ein flüssiges Gemisch aus 10 mmol
Glutamin, 20 ml Wasser und 5 ml Ethanol zugefügt. Während der Reaktion wird der
pH-Wert auf 9,5 mit Natriumcarbonat eingestellt, die Reaktionstemperatur
liegt bei 5°C und
die Reaktionsdauer ist 10 Minuten. Dann wird der pH-Wert durch Ansäuern mit
Phosphorsäure
auf 1,0 eingestellt. Die konzentrierte wässrige Phase wird mit Trifluoressigsäure bei
Raumtemperatur für 15
Stunden zur Reaktion gebracht. Am Ende der Reaktion werden 50 ml Äther hinzugefügt, die
Feststoffe scheiden sich ab und das Produkt L-Ala-L-Gln wird mit
einer Ausbeute von 40% durch Rekristallisieren der Feststoffe in
Methanol-Wasser erhalten.
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Beispiel 5
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20
mmol Triphenylphosphin werdein in 10 ml Methylhydrofuran gelöst und tropfenweise
einem Gemisch aus 10 mmol N-(O,O-Dimethyl)Phosphoalanin, 30 mmol
Hexachlorethan und 10 ml Tetrahydrofuran zugefügt. Nach Reaktion bei –5°C für 2 Stunden
wird das erhaltene Gemisch einem flüssigen Gemisch enthaltend 10
mmol Glutamin, 20 ml Wasser und 20 ml Ethanol zugefügt. Während der
Reaktion wird der pH-Wert mit 10 mmol Natriumhydroxid und nachfolgend
Natriumbicarbonat auf 9,5 eingestellt, die Reaktionstemperatur beträgt –5°C, die Reaktionsdauer
nach dem tropfenweisen Zufügen
beträgt
2 Stunden. Dann wird mit konzentrierter Salzsäure angesäuert, um einen pH-Wert von
3,0 einzustellen. Die konzentrierte wässrige Phase reagiert mit gesättigtem
Salzsäure/Eisessig
bei Raumtemperatur für
5 Stunden. Am Ende der Reaktion werden 50 ml Äther zugefügt, die Feststoffe scheiden
sich ab, und das Produkt L-Ala-L-Gln
wird mit einer Ausbeute von 35% durch Rekristallisieren der Feststoffe
mit Ethanol-Wasser erhalten.
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Beispiel 6
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30
mmol Hexaethan werden in 20 ml Dichlormethan gelöst und tropfenweise einem Gemisch
bestehend aus 10 mmol N-(O,O-Diethyl) Phosphoalanin, 30 mmol Triphenylphosphin
und 10 mmol Dichlormethan zugefügt.
Nach einer Reaktion bei 0°C für 40 Minuten
wird das erhaltene Gemisch tropfenweise einem flüssigen Gemisch enthaltend 30
mmol Glutamin, 20 ml Wasser und 10 ml Cyclohexan zugefügt. Während der
Reaktion wird der pH-Wert mit Kaliumhydroxid auf 13 eingestellt,
die Reaktionstemperatur beträgt
20°C und
die Reaktionsdauer nach dem tropfenweisen Zufügen beträgt 30 Minuten. Dann wird mit
verdünnter
Salpetersäure
angesäuert,
um den pH-Wert auf 1,5 einzustellen. Die konzentrierte wässrige Phase
wird mit Trifluoressigsäure
bei Raumtemperatur für
10 Stunden zur Reaktion gebracht. Am Ende der Reaktion werden 50
ml Äther zugefügt, die
Feststoffe scheiden sich ab, und das Produkt Produkt L-Ala-L-Gln
wird mit einer Ausbeute von 60% durch Rekristallisieren der Feststoffe
mit 1,4-Dioxan-Wasser erhalten.
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Beispiel 7
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In
einer Rundkolbenflasche werden 10 mmol N-(O,O-Diethyl)Phosphoalanin,
10 mmol Triphenylphosphin und 15 mmol Hexachlorethan gemischt, wonach
20 ml Acetonitril zugefügt
werden. Nach Reaktion bei 15°C
für 2,5
Stunden wird das erhalten Gemisch tropfenweise einem flüssigen Gemisch
aus 30 mmol Glutamin, 20 ml Wasser und 30 ml Toluol zugefügt. Während der
Reaktion wird der pH-Wert mit Natriumcarbonat auf 8,5 eingestellt,
die Reaktionstemperatur beträgt
30°C und
die Reaktionsdauer nach dem tropfenweisen Zufügen beträgt 1 Stunde. Dann wird mit
verdünnter
Schwefelsäure
angesäuert,
um den pH-Wert auf 2 einzustellen. Die konzentrierte wässrige Phase
wird mit gesättigtem
Bromwasserstoff/1,4-Dioxan bei Raumtemperatur für 5 Stunden zur Reaktion gebracht.
Am Ende der Reaktion werden 50 ml Äther zugefügt, die Feststoffe scheiden sich
ab und das Produkt L-Ala-L-Gln
wird in einer Ausbeute von 40% durch Rekristallisieren der Feststoffe
in Tetrahydrofuran-Wasser erhalten.
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Beispiel 8
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In
einer Rundkolbenflasche werden 10 mmol N-(O,O-Diisopropyl)Phosphoalanin, Triphenylphosphin
und Hexachlorethan gemischt, und dann werden 20 ml Tetrahydrofuran
zugefügt.
Nach Reaktion bei 30°C
für 2 Stunden
wird das Gemisch tropfenweise in ein flüssiges Gemisch enthaltend 15
mmol Glutamin, 20 ml Wasser und 10 ml Ethanol überführt. Während der Reaktion wird der
pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 10,5 eingestellt, die Reaktionstemperatur
ist –5°C, und die
Reaktionsdauer nach dem tropfenweisen Zufügen beträgt 2 Stunden. Dann wird der pH-Wert
mit konzentrierter Salzsäure
auf 3,0 eingestellt. Die wässrige
konzentrierte Phase wird mit gesättigter
Salzsäure/Eisessig
bei Raumtemperatur für 2
Stunden zur Reaktion gebracht. Am Ende der Reaktion werden 50 ml Äther hinzugefügt, die
Feststoffe scheiden sich ab und das Produkt L-Ala-L-Gln wird in einer
Ausbeute von 60% durch Rekristallisieren der Feststoffe in Ethanol-Wasser
erhalten.
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Beispiel 9
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15
mmol Triphenylphosphin werden in 20 ml Dichlormethan gelöst und tropfenweise
einem Gemisch aus 10 mmol N-(O,O-Diisopropyl)Phosphoalanin, 20 mmol
Hexachlorethan und 10 mmol Dichlormethan zugefügt. Nach einer 3-stündigen Reaktion bei
10°C wird
das Gemisch einem flüssigen
Gemisch enthaltend 10 mmol Glutamin, 20 ml Wasser und 20 ml Ethylacetat
zugefügt.
Während
der Reaktion wird der pH-Wert mit 10 mmol Natriumhydroxid und nachfolgend
mit Natriumcarbonat auf 9 eingestellt. Die Reaktionstemperatur liegt
bei 10°C,
und die Reaktionsdauer nach dem tropfenweisen Zufügen liegt
bei einer Stunde. Dann wird mit verdünnter Schwefelsäure angesäuert, um
den pH-Wert auf 2,0 einzustellen. Die konzentrierte wässrige Phase
reagiert mit 20% Bromwasserstoff/Eisessig bei Raumtemperatur für 5 Stunden.
Am Ende der Reaktion werden 50 ml Äther zugefügt, die Feststoffe scheiden
sich ab, und das Produkt L-Ala-L-Gln wird in einer Ausbeute von 45%
durch Rekristallisieren der Feststoffe mit Methylalkohol-Wasser
erhalten.
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Beispiel 10
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15
mmol Hexachlorethan werden in 10 ml 1,2-Dichlorethan gelöst und das
erhaltene Gemisch wird einem Gemisch aus 10 mmol N-(O,O-Diisopropyl)Phosphoalanin,
15 mmol Triphenylphosphin und 10 ml 1,2-Dichlorethan zugefügt. Nach Reaktion bei 20°C für 1,5 Stunden
wird es tropfenweise zu 20 ml Wasser enthaltend 20 mmol Glutamin
zugefügt. Während des
Reaktionsverlaufs wird der pH-Wert mit Kaliumhydroxid auf 13 eingestellt,
die Reaktionstemperatur liegt bei 10°C und die Reaktionsdauer nach dem
tropfenweisen Zufügen
liegt bei 2 Stunden. Dann wird der pH-Wert durch Ansäuern mit
verdünnter
Salpetersäure
auf 1,5 eingestellt. Die konzentrierte wässrige Phase wird mit Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur
für 10
Stunden zur Reaktion gebracht. Am Ende der Reaktion werden 50 ml Äther zugefügt, die
Feststoffe scheiden sich ab, und das Produkt L-Ala-L-Gln wird in
einer Ausbeute von 52% durch Rekristallisieren der Feststoffe mit
Isopropanol-Wasser erhalten.
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Beispiel 11
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In
einer Rundkolbenflasche werden 10 mmol Tert-Butylcarbonylalanin
(Boc-Ala), 15 mmol Triphenylphosphin und 20 mmol Hexachlorethan
vereinigt, und dann in 20 ml 1,2-Dichlorethan überführt. Nach 20-minütiger Reaktion
bei 10°C
wird das Gemisch in ein flüssiges
Gemisch, enthalten 30 mmol Glutamin, 20 ml Wasser und 20 ml Cyclohexan
zugefügt.
Während
der Reaktion wird der pH-Wert mit Kaliumhydroxid auf 11 eingestellt
und die Reaktionstemperatur liegt bei 20°C, die Reaktionsdauer nach dem
tropfenweisen Zufügen
liegt bei 30 Minuten. Dann wird der pH-Wert mit verdünnter Salpetersäure auf
1,5 eingestellt. Die konzentrierte wässrige Phase wird mit Trifluoressigsäure bei
Raumtemperatur für
15 Stunden zur Reaktion gebracht. Am Ende der Reaktion werden 50
ml Äther
zugefügt,
die Feststoffe scheiden sich ab, und das Produkt L-Ala-L-Gln wird
in einer Ausbeute von 40% durch Rekristallisieren der Feststoffe
mit Tetrahydrofuran-Wasser erhalten.
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Beispiel 12
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10
mmol Triphenylphosphin werden in 10 ml Toluol gelöst, und
tropfenweise einem gemischten System aus 10 ml Tert-Butylcarbonylalanin (Boc-Ala), 10 mmol Hexachlorethan
und 20 ml Toluol zugefügt.
Nach 2-stündiger
Reaktion bei 5°C
wird das Gemisch tropfenweise in ein flüssiges Gemisch, enthaltend
15 mmol Glutamin, 20 ml Wasser und 60 ml Petrolether, zugefügt. Während der
Reaktion wird der pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 12 eingestellt, die
Reaktionstemperatur liegt bei 10°C
und die Reaktionsdauer nach dem tropfenweisen Zufügen liegt
bei 1,5 Stunden. Dann wird mit verdünnter Schwefelsäure der
pH-Wert auf 1,5 eingestellt. Die wässrige Phase wird aufkonzentriert
und mit Chlorwasserstoff/1,4-Dioxan bei Raumtemperatur für 5 Stunden zur
Reaktion gebracht. Am Ende der Reaktion werden 50 ml Äther hinzugefügt, die
Feststoffe scheiden sich ab, und das Produkt L-Ala-L-Gln wird durch
Rekristallisieren der Feststoffe mit 1,4-Dioxan-Wasser in einer
Ausbeute von 52% erhalten.
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Beispiel 13
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20
mmol Hexachlorethan werden in 10 ml Tetrahydrofuran gelöst, und
das Gemisch wird tropfenweise in ein Gemisch bestehend aus 10 mmol Tert-Butylcarbonylalanin
(Boc-Ala), 20 mmol Triphenylphosphin und 20 ml Tetrahydrofuran zugefügt. Nach
1,5-stündiger
Reaktion bei 0°C
wird das Gemisch tropfenweise in ein flüssiges Gemisch, enthaltend
20 mmol Glutamin, 20 ml Wasser und 15 ml Dichlormethan zugefügt. Während der
Reaktion wird der pH-Wert mit 20 mmol Kaliumhydroxid und nachfolgend
mit Natriumcarbonat auf 10 eingestellt, die Reaktionstemperatur
liegt bei 8°C,
die Reaktionsdauer nach dem tropfenweisen Zufügen liegt bei 2 Stunden. Dann
wird mit konzentrierter Salzsäure
angesäuert,
um den pH-Wert auf 2,0 einzustellen. Die wässrige konzentrierte Phase
wird bei Raumtemperatur für
20 Stunden mit Methylsulfonsäure
zur Reaktion gebracht. Am Ende der Reaktion werden 50 ml Äther zugefügt, die
Feststoffe scheiden sich ab, und das Produkt L-Ala-L-Gln wird durch
Rekristallisieren der Feststoffe mit Methanol-Wasser in einer Ausbeute
von 45% erhalten.
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Beispiel 14
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In
einer Rundkolbenflasche werden jeweils 10 mmol Carbobenzoxy-Alanin (Z-Ala), triphenylphosphin
und Hexachlorethan gemischt und dann 30 ml Toluen zugefügt. Nach
Reaktion bei 0°C
für 3 Stunden
wird das erhaltene Gemisch in ein flüssiges Gemisch enthaltend 25
mmol Glutamin und 20 ml Wasser überführt. Während der
Reaktion wird der pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 12 eingestellt,
die Reaktionstemperatur liegt bei 15°C, die Reaktionsdauer nach dem
tropfenweisen Zufügen
liegt bei 1,5 Stunden. Dann wird der pH-Wert mit verdünnter wässriger
Säure auf
pH-Wert 2,5 eingestellt. Die konzentrierte wässrige Phase wird in Methanol
mit Wasserstoffgas bei Raumtemperatur für 15 Stunden zur Reaktion gebracht.
Das Produkt L-Ala-L-Gln wird in einer Ausbeute von 48% erhalten.
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Beispiel 15
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15
mmol Triphenylphosphin werden in 10 ml Tetrahydrofuran gelöst, das
erhaltene Gemisch wird in ein Gemisch aus 10 mmol Carbobenzoxy-Alanin (Z-Ala), 20 mmol Hexachlorethan
und 10 ml Tetrahydrofuran eingetropft. Nach Reaktion für 1,5 Stunden bei
0°C wird
das erhaltene Gemisch in ein flüssiges Gemisch
enthaltend 18 mmol Glutamin, 20 ml Wasser und 40 ml Dichlormethan
zugefügt.
Während
der Reaktion wird der pH-Wert mit Kaliumhydroxid auf 13 eingestellt,
die Reaktionstemperatur liegt bei 0°C und die Reaktionsdauer nach
dem tropfenweisen Zufügen
bei 2 Stunden. Dann wird mit verdünnter Schwefelsäure angesäuert, um
den pH-Wert auf 2,0 einzustellen. Die konzentrierte wässrige Phase
wird bei Raumtemperatur für
15 Stunden in Methanol mit Wasserstoff zur Reaktion gebracht. Das
Produkt L-Ala-L-Gln wird in einer Ausbeute von 65% erhalten.
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Beispiel 16
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30
mmol Hexachlorethan werden in 10 ml Acetonitril gelöst, und
das erhaltene Gemisch wird in ein Gemisch aus 10 mmol Carbobenzoxy-Alanin (Z-Ala), 20 ml Triphenylphosphin
und 10 ml Acetonitril eingefügt.
Nach einer Stunde Reaktion bei 5°C wird
das erhaltene Gemisch in 20 ml Wasser enthaltend 10 mmol Glutamin
eingetropft. Während
der Reaktionsdauer wird der pH-Wert mit zunächst 20 mmol Natriumhydroxid
und dann Kaliumcarbonat auf 10 eingestellt, die Reaktionstemperatur
liegt bei 5°C
und die Reaktionsdauer nach dem tropfenweisen Zufügen bei
2 Stunden. Dann wird mit konzentrierter Salzsäure angesäuert, um den pH-Wert auf 3,0
einzustellen. Die konzentrierte wässrige Phase wird bei Raumtemperatur
für 40
Stunden mit Trifluoressigsäure
zur Reaktion gebracht. Am Ende der Reaktion werden 50 ml Äther hinzugefügt, Feststoffe
scheiden sich ab, und das Produkt L-Ala-L-Gln wird in einer Ausbeute
von 45% durch Rekristallisieren der Feststoffe in 1,4-Dioxan-Wasser
erhalten.
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Zusammenfassung
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Es
wird ein Syntheseverfahren für
Alanylglutamin offenbart, welches folgende Stufen umfasst: Das N-terminal
geschützte
Alanin wird mit Triphenylphosphin und Hexachlorethan in einem organischen Lösungsmittel
zur Reaktion gebracht, um einen aktivierten Ester zu bilden, der
aktivierte Ester reagiert in einem Lösungsgemisch, welches ein organisches Lösungsmittel
und eine wässrige
Lösung
einer anorganischen Base enthält,
zur Reaktion gebracht, und das resultierende Gemisch wird mit einer
anorganischen Säure
angesäuert
und dann wird die N-terminale Schutzgruppe entfernt. In diesem Verfahren
sind die verwendeten Rohmaterialien billig, die Synthesetechnik
ist einfach, es sind keine Vorrichtung für die Trennung und Reinigung
nötig,
das Produkt kann einfach separiert und gereinigt werden, die Toxizitäten aller
im Laufe der Produktion verwendeten Reagenzien sind minimal und
das Verfahren ist vorteilhaft für den
Umweltschutz.