CN1302008C - N（2）－l－丙氨酰－l－谷氨酰胺二肽合成方法 - Google Patents

N（2）－l－丙氨酰－l－谷氨酰胺二肽合成方法 Download PDF

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N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法，涉及一种含氨基酸的二肽合成方法。提供一种原料便宜、合成工艺简单、设备简单、成本低、产率高、中间产物不需要分离和提纯处理，产物容易分离提纯，有利于环保的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法。其步骤为N端保护的氨基酸10mmol，与三苯基氧磷、三光气在有机溶剂中反应形成活泼酯；活泼酯与谷氨酰胺在无机碱水溶液进行反应；用无机酸酸化，脱去N端保护基团。

Description

N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法
技术领域
本发明涉及一种含氨基酸的二肽合成方法，尤其是涉及一种N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法。
背景技术
谷氨酰胺是人体中含量最多的氨基酸，谷氨酰胺在肌肉蛋白质和血浆蛋白质中含量约分别为75％和26％。
谷氨酰胺具有重要的生理作用。谷氨酰胺是生物合成核酸的必需前体物质，是蛋白质合成与分解的调节物，是氨基氮从外周组织转动至内脏的携带者，是肾脏排泄氨的重要基质。谷氨酰胺是肠粘膜上皮细胞、肾小管细胞、巨噬细胞和成纤维细胞的重要能量物质，在维持肠道机能、促进免疫功能、维持体内碱平衡及提高机体对应激的适应等方面都发挥着极其重要的作用。
已有的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法有如下7种：
1、首先将Gln(谷氨酰胺)的氨基进行保护，形成Cbz-Gln；第二步，将Cbz-Gln的酰氨基保护形成Cbz-Gln(OC13H9)；第三步，将Cbz-Gln(OC13H9)的羧基保护形成Cbz-Gln(OC13H9)OMe；第四步，通氢气形成Gln(OC13H9)OMe；第五步，加入Cbz-Ala；第六步，对Cbz-Ala活化；第七步，Cbz-Ala和Gln(OC13H9)OMe结合成肽；第八步，皂化脱甲酯；第九步，酸化脱去全部保护，形成N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。(文献YasutsuguShimomishi，Studies on the Synthesis of Peptides Containing Glutamine as theC-Terminal.Y.Bull.Chem.Soc.Jpn.1962，35，1966)该方法反应步骤太多，而且试剂昂贵，无实际应用价值。
2、利用Z-Ala与HOSu在DCC作用下，于20～25℃反应5h，过滤去二环己基脲，然后与未保护的Gln于碳酸氢钠的水溶液中进行合成。产物在甲醇中还原氢化，脱去保护基，即可得到N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。(文献Katoh，T.Kurauchi，M.US 5,032,675，Jul.16，1991)该方法的试剂昂贵，而且DCC反应后的产物难以除去，生产过程复杂。
3、利用COCl2与Ala反应生成混酐，然后与Gln在水中反应，pH保持在10.2。最后在酸溶液中脱去保护，即可得到N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。(文献Frerst，P.Pfaendetr，P.Ger.Offen.DE3，206，784，01.Sep.1983)此方法的反应步骤少，但该反应难以反应完全，副产物较多。
4、利用手性试剂氯代丙酸通过SOCl2活化，形成酰氯，然后与Gln在NaOH的水溶液中反应，pH保持在10。产物为氯代丙酰谷氨酰胺，再与液氨在一定的压力下反应，即可得到N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。(文献Kunimi Inou，Yoshiyuki Yamada，US 5,380,934，Jan 10，1995)该反应的原料为手性试剂，价格较高，在合成酰氯步骤中，温度较高，副反应较多。
5、通过Boc保护的丙氨酸，与HOSu在DCC作用下，形成活泼酯，该活泼酯滴加到谷氨酸r甲酯的饱和的碳酸氢钠水溶液中，最后酸化，得到Boc保护的丙氨酰谷氨酸r甲酯二肽，产物通过三氟乙酸脱去Boc保护基，产物该甲酯产物与浓氨水室温反应24小时，即可得N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。(潘和平，王良友，陈正英，徐琪寿，CN 1295079，2001.05.16)
6、利用丙氨酸酯与谷氨酸或者谷氨酰胺在水和有机溶剂的混合溶剂中，在微生物的作用下，反应温度维持在20～60℃，pH保持在8～10，即可得到N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。(Behensky Peter Ing，Mirzajevova Marcela Ing，Netrval Jiri Rndr，SK70898，Oct.13，1999)
7、通过氨基保护的丙氨酸，在三苯基氧磷和六氯乙烷的作用下，形成活泼酯，该活泼酯滴加到谷氨酰胺的饱和的碱水溶液中，得到氨基保护的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，然后脱去保护基，即可得到N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。(文献赵玉芬，唐果，周宁，ZL 02123369.1，2004.09.01)
发明内容
本发明的目的在于提供一种原料便宜、合成工艺简单、设备简单、成本低、产率高、有利于环保的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法。
N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法的步骤：
1)N端保护的氨基酸(I)10mmol，与三苯基氧磷(Ph3PO)10～20mmol，最佳15～20mmol，三光气(C3O3Cl6)10～20mmol，最佳15～20mmol，在有机溶剂(II)中反应1～5h，最佳2～3h，反应温度-5～30℃，最佳0～10℃，形成活泼酯；
2)活泼酯与谷氨酰胺10～20mmol，最佳为15～20mmol，无机碱水溶液(III)的溶液中进行反应，反应温度为-5～10℃，最佳为0～5℃，pH控制在8.5～11，最佳为9.5～10.5；
3)用无机酸(IV)酸化至pH≤3.0，最佳为2.0～3.0，然后脱去N端保护基团(V)，可得到N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，产率为30～65％。
其中(I)，N端保护的氨基酸主要选自苄氧羰基丙氨酸，叔丁氧羰基丙氨酸，N-(O，O-二甲基)磷酰丙氨酸，N-(O，O-二乙基)磷酰丙氨酸，N-(O，O-二异丙基)磷酰丙氨酸，N-(O，O-二正丁基)磷酰丙氨酸，等其中的一种；
(II)有机溶剂主要选自二氯甲烷，甲苯，四氢呋喃，乙腈，1，2-二氯乙烷，二氧六环等其中的一种；
(III)无机碱主要选自氢氧化钠，氢氧化钾，碳酸氢钠，碳酸氢钾，碳酸钠，碳酸钾，等其中的一种；
(IV)无机酸主要选自盐酸，硫酸，硝酸，等其中的一种；
(V)脱保护基所用试剂主要选自三氟乙酸，氯化氢/冰乙酸(含氯化氢的冰乙酸溶液)，溴化氢/冰乙酸(含溴化氢的冰乙酸溶液)，氯化氢/二氧六环(含氯化氢的二氧六环溶液)，溴化氢/二氧六环(含溴化氢的二氧六环溶液)，氢气，等中的一种。
与已有的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法相比，本发明的主要优点是：
1)原料极为便宜；
2)合成工艺简单，中间产物不需要分离，直接进行下一步反应，反应结束后，产物容易分离提纯；
3)活性酯在酸性介质中形成，避免了有机碱引起的产物消旋化；
4)在第二步反应，采用了水相法，省去了谷氨酰胺氨基酸接保护基团保护和脱除保护基团，简化了合成路线，缩短了时间；
5)由于第二步采用了水相法，用无机碱代替了有机碱，降低了生产成本，有利于环保；
6)反应结束后，生成两个产物，其一为所需的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，另一个为三苯基氧磷，三苯基氧磷为不挥发的固体，容易回收，还可为反应原料重新投入反应；
7)整个合成过程中所采用的溶剂均易于回收再利用。
总之，本方法合成路线短，原料便宜易得，有利于环保，生产工艺合理，成本低，有着良好的应用价值。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：三光气20mmol用10mL二氯甲烷溶解，滴加到N-(O，O-二甲基)磷酰丙氨酸10mmol，三苯基氧磷20mmol，和20mL二氯甲烷的混合体系内，于-5℃反应3h后，滴加到含有20mmol谷胺酰胺和20mL水中，反应中用氢氧化钾调pH为10，反应温度为0℃，滴加后反应1.5h，然后用浓盐酸酸化至pH为2.5，萃取得到含保护基的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，该中间体用氯化氢/冰乙酸室温反应20h，反应结束后加入乙醚50mL，析出固体，将固体用异丙醇-水重结晶得产物N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。产率45％。
实施例2：三苯基氧磷10mmol用30mL四氢呋喃溶解，滴加到N-(O，O-二乙基)磷酰丙氨酸10mmol，三光气15mmol，和10mL四氢呋喃的混合体系内，于10℃反应1h后，滴加到含有10mmol谷氨酰胺和20mL水中，反应中用氢氧化钠调pH为9，反应温度为10℃，滴加后反应30min。然后用稀硝酸酸化至pH为1.5，萃取得到含保护基的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，该中间体用溴化氢/冰乙酸室温反应15h，反应结束后加入乙醚50mL，析出固体，将固体用甲醇-水重结晶得产物N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。产率40％。
实施例3：将三光气15mmol溶于20mL甲苯中，5℃下滴加到N-(O，O-二异丙基)磷酰丙氨酸10mmol，三苯基氧磷15mmol的20mL甲苯中，然后5℃反应2h后，滴加到含有20mmol谷氨酰胺和20mL水，5mL乙醇的混合液中，反应中用碳酸钾调pH为9.5，反应温度为5℃，滴加后反应10min。然后用硫酸酸化至pH为1.0，萃取得到含保护基的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，该中间体用三氟乙酸室温反应10h，反应结束后加入乙醚50mL，析出固体，将固体用乙醇-水重结晶得产物N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。产率50％。
实施例4：三苯基氧磷10mmol溶于1，2二氯乙烷10mL中，滴加到三光气10mmol的1，2二氯乙烷10mL中，滴加温度维持在0℃，滴加后，反应2小时，反应液滴加到叔丁氧羰基丙氨酸10mmol的1，2二氯乙烷10mL中，反应1小时后滴加到含有10mmol谷氨酰胺，水20mL中，反应用氢氧化钾调pH为11，反应温度为-5℃，滴加后反应30min。然后用稀硝酸酸化至pH为1.5，萃取得到含保护基的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，该中间体用三氟乙酸室温反应5h，反应结束后加入乙醚50mL，析出固体，将固体用乙醇-水重结晶得产物N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。产率35％。
实施例5：三苯基氧磷10mmol用10mL二氧六环溶解，滴加到10mmol苄氧羰基丙氨酸，和三光气10mmol，20mL二氧六环的混合体系内，于15℃反应5h后，滴加到含有15mmol谷氨酰胺，水20mL中，反应中用碳酸氢钠调pH为10.5，反应温度为0℃，滴加后反应1.5h。然后用稀硫酸酸化至pH为1.5，萃取得到含保护基的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，该中间体用氯化氢/二氧六环室温反应15h。反应结束后加入乙醚50mL，析出固体，将固体用甲醇-水重结晶得产物N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。产率30％。
实施例6：三光气20mmol用10mL二氧六环溶解，滴加到叔丁氧基丙氨酸10mmol，和三苯基氧磷20mmol，10mL二氧六环的混合体系内，于30℃反应1h后，滴加到含有20mmol谷氨酰胺，水20mL中，反应中用碳酸钠调pH为10，反应温度为8℃，滴加后反应2h，然后用浓盐酸酸化至pH为2.0，萃取得到含保护基的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，该中间体溴化氢/冰乙酸室温反应20h，反应结束后加入乙醚50mL，析出固体，将固体用甲醇-水重结晶得产物N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。产率55％。
实施例7：：三苯基氧磷10mmol溶于甲苯10mL中，滴加到三光气10mmol的甲苯10mL中，滴加温度维持在20℃，滴加后，反应4小时，反应液滴加到苄氧羰基丙氨酸10mmol的甲苯10mL中，反应1小时后滴加到含有15mmol谷氨酰胺，水20mL中反应中用碳酸氢钠调pH为8.5，反应温度为5℃，滴加后反应1.5h。然后用盐酸酸化至pH为2.5，固体用氢气在甲醇-水中室温反应15h，得产物N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。产率48％。
实施例8：三光气15mmol用10mL乙腈溶解，滴加到苄氧羰基丙氨酸10mmol，和三苯基氧磷15mmol，10mL乙腈的混合体系内，于0℃反应3h后，滴加到含有10mmol谷氨酰胺，水20mL中，反应中用碳酸氢钾调pH为8.8，反应温度为5℃，滴加后反应2h。然后用硫酸酸化至pH为3.0，固体用氢气在甲醇-水中室温反应15h，得产物N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。产率65％。

Claims (9)

1、N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法，其特征在于其步骤为：
1)N端保护的氨基酸10mmol，与三苯基氧磷10～20mmol，三光气10～20mmol，在有机溶剂中反应1h～5h，反应温度-5～30℃，形成活泼酯；
2)活泼酯与谷氨酰胺10～20mmol，在无机碱水溶液进行反应，反应温度为-5～10℃，pH控制在8.5～11；
3)用无机酸酸化至pH≤3.0，然后脱去N端保护基团，得到N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。
2、如权利要求1所述的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法，其特征在于在步骤1)中，所说的三苯基氧磷15～20mmol，三光气15～20mmol，在有机溶剂中反应2～3h，反应温度0～10℃，形成活泼酯。
3、如权利要求1所述的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法，其特征在于在步骤2)中，所说的谷氨酰胺15～20mmol，在无机碱水溶液进行反应，反应温度为0～5℃，pH控制在9.5～10.5。
4、如权利要求1所述的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法，其特征在于在步骤3)中，所说的pH为2.0～3.0。
5、如权利要求1所述的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法，其特征在于N端保护的氨基酸选自N-(O，O-二甲基)磷酰丙氨酸，N-(O，O-二乙基)磷酰丙氨酸，N-(O，O-二异丙基)磷酰丙氨酸，N-(O，O-二正丁基)磷酰丙氨酸，苄氧羰基丙氨酸，叔丁氧羰基丙氨酸中的一种。
6、如权利要求1所述的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法，其特征在于有机溶剂选自二氯甲烷，甲苯，四氢呋喃，乙腈，1，2-二氯乙烷中的一种。
7、如权利要求1所述的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法，其特征在于无机碱选自氢氧化钠，氢氧化钾，碳酸氢钠，碳酸氢钾，碳酸钠，碳酸钾中的一种。
8、如权利要求1所述的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法，其特征在于无机酸选自盐酸，硫酸，硝酸中的一种。
9、如权利要求1所述的N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法，其特征在于脱保护基所用试剂选自三氟乙酸，氯化氢/冰乙酸，溴化氢/冰乙酸，氢气，氯化氢/二氧六环，溴化氢/二氧六环中的一种。
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