CN109705190A - 磷酰化寡肽库的合成方法 - Google Patents

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袁航
马雪
屈梦媛
宫珺
陈晨
张书胜
赵玉芬
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Abstract

本发明提供了磷酰化寡肽库的合成方法，包括：在碱性条件下，苯基亚磷酸单酯a与氨基酸b反应，得到磷酰化寡肽库c，氨基酸b的Cα处的构型为内消旋、D型或L型。本发明工艺简单、高效省时、操作方便。

Description

磷酰化寡肽库的合成方法
技术领域
本发明涉及一系列苯基亚磷酸酯和非保护氨基酸为原料合成磷酰化寡肽库的方法，属有机化合物的制备技术领域。
背景技术
磷是生命活动中必不可少的一种重要元素，在能量转移、信息传递以及新陈代谢等活动中发挥着举足轻重的作用(Isakova T,Gutierrez O M,Chang Y,et al.Phosphorus Binders and Survival on Hemodialysis.Journal ofTheAmerican SocietyofNephrology,2009,20(2):388-396.)。氨基酸、肽等作为最基本的生命物质在细胞传递、信息传导等生命过程中起着重要的作用。研究表明磷酰化肽类化合物生物活性高，因此被广泛的应用于农药、药物研发、保健、免疫治疗等多个领域 (Martin I,Kim J W,Lee B D,et al.Ribosomal Protein s15Phosphorylation Mediates LRRK2Neurodegeneration inParkinson’s Disease.Cell,2014,157(2): 472-485.)。
已有的报道涉及磷酰化寡肽库的制备需要对氨基酸或小肽磷酰化后，再进行皂化、酸化方可获得相应的磷酰化寡肽，此方法步骤繁琐，耗时耗力。因此需要一种合成步骤少、操作简单、高效的磷酰化寡肽库的合成方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种工艺简单、高效省时、操作方便的磷酰化多肽库的合成方法。
本发明的磷酰化寡肽库的合成方法，包括：
在碱性条件下，式a所示的苯基亚磷酸单酯a与式b所示的氨基酸b反应，得到式c所示的磷酰化寡肽库
R2为氨基酸侧链，氨基酸b的Cα(与羧基、R2相连的C)处的构型为内消旋、D型或L型，氨基酸b涵盖脯氨酸那样R2取代α-NH2形成亚氨基酸的情形；
R1为取代或未取代的开链脂肪烃基(优选未取代)，C原子数可为1-3个，如为2个，优选为乙基。
任选地，所述氨基酸b的R2不含伯氨基、仲氨基、游离羧基。
任选地，所述氨基酸b可为天然氨基酸，如蛋白质氨基酸，优选自20种标准氨基酸(又叫基本氨基酸、常见氨基酸)。
任选地，所述氨基酸b为丙氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或甘氨酸，其中，手性氨基酸的Cα的构型更优选为L型。
任选地，所述反应使用的碱为水溶性有机碱，如三乙胺。
任选地，所述苯基亚磷酸单酯a与氨基酸b的mol比为1:1。
任选地，所述反应的温度低于室温(如为0℃)，比如，反应在冰盐浴下进行。
任选地，所述反应的溶剂体系中包含有水、可溶解苯基亚磷酸单酯a的非极性溶剂(如四氯化碳)、可混溶水及所述非极性溶剂的混溶剂，所述混溶剂为极性质子溶剂，如为C1-C4的醇，优选为乙醇。
任选地，所述苯基亚磷酸单酯a与氨基酸b反应后，经酸化处理，得到所述磷酰化寡肽库；酸化可处理至pH为2～3，可用无机酸，如盐酸、硫酸或磷酸。当然，磷酰化寡肽库需经萃取处理得到，萃取可使用二氯甲烷或乙酸乙酯。
任选地，所述反应的时间为30分钟或以下。
作为工艺路线的示例，反应流程可如下：
更具体的合成步骤可如下：
在冰盐浴下，将含有所述氨基酸b的水、三乙胺和乙醇的混合溶液搅拌30 分钟后逐滴加入苯基亚磷酸单酯a的四氯化碳溶液，搅拌反应30分后，用盐酸调节pH至2～3后，乙酸乙酯萃取得到相应的磷酰化寡肽库。
本发明是采用一锅法进行反应，30分钟内即可实现磷酰化寡肽库的合成，同时无需对氨基酸进行保护，且步骤简化，设备简单，反应时间短，而且氨基酸原料的转化率不低于80％。
附图说明
各图中，横坐标为质荷比(m/z)，纵坐标为相对强度％：
图1为本发明制备的苯基亚磷酸单乙酯诱导丙氨酸成磷酰化二肽的正离子二级质谱图。
图2为本发明制备的苯基亚磷酸单乙酯诱导丙氨酸成磷酰化三肽的正离子二级质谱图。
图3为本发明制备的苯基亚磷酸单乙酯诱导苯丙氨酸成磷酰化二肽的正离子二级质谱图。
图4为本发明制备的苯基亚磷酸单乙酯诱导苯丙氨酸成磷酰化三肽的正离子二级质谱图。
图5为本发明制备的苯基亚磷酸单乙酯诱导苯丙氨酸成磷酰化四肽的正离子二级质谱图。
图6为本发明制备的苯基亚磷酸单乙酯诱导苯丙氨酸成磷酰化五肽的正离子二级质谱图。
图7为本发明制备的苯基亚磷酸单乙酯诱导甲硫氨酸成磷酰化二肽的正离子二级质谱图。
图8为本发明制备的苯基亚磷酸单乙酯诱导甲硫氨酸成磷酰化三肽的正离子二级质谱图。
图9为本发明制备的苯基亚磷酸单乙酯诱导甲硫氨酸成磷酰化四肽的正离子二级质谱图。
图10为本发明制备的苯基亚磷酸单乙酯诱导甲硫氨酸成磷酰化五肽的正离子二级质谱图。
图11为本发明制备的苯基亚磷酸单乙酯诱导甲硫氨酸成磷酰化六肽的正离子二级质谱图。
图12为本发明制备的苯基亚磷酸单乙酯诱导缬氨酸成磷酰化二肽的正离子二级质谱图。
图13为本发明制备的苯基亚磷酸单乙酯诱导缬氨酸成磷酰化三肽的正离子二级质谱图。
图14为本发明制备的苯基亚磷酸单乙酯诱导甘氨酸成磷酰化二肽的正离子二级质谱图。
图15为本发明制备的苯基亚磷酸单乙酯诱导甘氨酸成磷酰化三肽的正离子二级质谱图。
具体实施方式
以下实例将结合附图对本发明进行说明，所用氨基酸均为L-氨基酸。
实施例1：磷酰化丙氨酸多肽库的合成
实验步骤：向10mL离心管加入1mmol丙氨酸，再依次加入100μL水，600μL 三乙胺和200μL乙醇，冰盐浴下搅拌30分钟后，在搅拌下逐滴加入1mmol苯基亚磷酸单乙酯和500μL四氯化碳的混合溶液，冰浴下反应30分钟后，用质量分数为10％的稀盐酸水溶液中和至pH为3，用乙酸乙酯(3×1mL)洗涤后取上清液，甲醇稀释后采用ESI–MS/MS分析，产物中检测到磷酰化的2～3肽。
实施例2：磷酰化苯丙氨酸多肽库的合成
实验步骤：向10mL离心管加入1mmol苯丙氨酸，再依次加入100μL水，600μL 三乙胺和200μL乙醇，冰盐浴下搅拌30分钟后，在搅拌下逐滴加入1mmol苯基亚磷酸单乙酯和500μL四氯化碳的混合溶液，冰浴下反应30分钟后，用10％的稀盐酸水溶液中和至pH为3，用乙酸乙酯(3×1mL)洗涤后取上清液，甲醇稀释后采用ESI-MS/MS分析，产物中检测到有磷酰化2-5肽；另经测算，苯丙氨酸的转化率高达80％。
实施例3：磷酰化甲硫氨酸多肽库的合成
实验步骤：向10mL离心管加入1mmol甲硫氨酸，再依次加入100μL水，600μL 三乙胺和200μL乙醇，冰盐浴下搅拌30分钟后，在搅拌下逐滴加入1mmol苯基亚磷酸单乙酯和500μL四氯化碳的混合溶液，冰浴下反应30分钟后，用10％的稀盐酸水溶液中和至pH为3，用乙酸乙酯(3×1mL)洗涤后取上清液，甲醇稀释后采用ESI-MS/MS分析，产物中检测到磷酰化的2～6肽。
实施例4：磷酰化缬氨酸多肽库的合成
实验步骤：向10mL离心管加入1mmol缬氨酸，再依次加入100μL水，600μL 三乙胺和200μL乙醇，冰盐浴下搅拌30分钟后，在搅拌下逐滴加入1mmol苯基亚磷酸单乙酯和500μL四氯化碳的混合溶液，冰浴下反应30分钟后，用10％的稀盐酸水溶液中和至pH为3，用乙酸乙酯(3×1mL)洗涤后取上清液，甲醇稀释后采用ESI-MS/MS分析，产物中检测到磷酰化的2～3肽。
实施例5：磷酰化甘氨酸多肽库的合成
实验步骤：向10mL离心管加入1mmol甘氨酸，再依次加入100μL水，600μL 三乙胺和200μL乙醇，冰盐浴下搅拌30分钟后，在搅拌下逐滴加入1mmol苯基亚磷酸单乙酯和500μL四氯化碳的混合溶液，冰浴下反应30分钟后，用10％的稀盐酸水溶液中和至pH为3，用乙酸乙酯(3×1mL)洗涤后取上清液，甲醇稀释后采用ESI-MS/MS分析，产物中检测到磷酰化的2～3肽。
本发明制备的苯基亚磷酸单乙酯诱导五种氨基酸(丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸)的正离子一级质谱图总结见下表1，二级质谱图见附图。
表1
1-5代表n为对应数值的磷酰化产物。

Claims (10)

1.磷酰化寡肽库的合成方法，包括：
在碱性条件下，式a所示的苯基亚磷酸单酯a与氨基酸b反应，得到式c所示的磷酰化寡肽库
n＝1,2,3…
各式中R1为取代或未取代的开链脂肪烃基；
氨基酸b的Cα处的构型为内消旋、D型或L型。
2.如权利要求1所述的合成方法，其特征是，所述R1为未取代的开链脂肪烃基，C原子数为1-3个；所述氨基酸b的氨基酸侧链不含伯氨基、仲氨基及游离羧基，优选为天然氨基酸，如为蛋白质氨基酸，更优选自20种标准氨基酸。
3.如权利要求1或2所述的合成方法，其特征是，所述氨基酸b为丙氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或甘氨酸。
4.如任一在先权利要求所述的合成方法，其特征是，所述R1为未取代的烷烃。
5.如任一在先权利要求所述的合成方法，其特征是，所述R1的C原子数为2个，如为乙基。
6.如任一在先权利要求所述的合成方法，其特征是，所述苯基亚磷酸单酯a与氨基酸b的mol比为1:1。
7.如任一在先权利要求所述的合成方法，其特征是，所述反应使用的碱为水溶性有机碱，如三乙胺。
8.如任一在先权利要求所述的合成方法，其特征是，所述反应的温度低于室温，如为0℃，再如，反应在冰盐浴下进行。
9.如任一在先权利要求所述的合成方法，其特征是，所述反应的溶剂体系中包含有水、可溶解苯基亚磷酸单酯a的非极性溶剂(如四氯化碳)、可混溶水及所述非极性溶剂的混溶剂，所述混溶剂为极性质子溶剂，如为C1-C4的醇，优选为乙醇。
10.如任一在先权利要求所述的合成方法，其特征是，所述苯基亚磷酸单酯a与氨基酸b反应后，经酸化处理，得到所述磷酰化寡肽库。
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