KR100864127B1 - 생식선 자극 활성을 갖는 펩티드 및 그 제법 - Google Patents

생식선 자극 활성을 갖는 펩티드 및 그 제법 Download PDF

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Abstract

무척추동물(실패 불가사리)의 생식선 자극 호르몬의 구조를 해명했다.
이 생식선 자극 호르몬은, 2개의 서브유닛으로 이루어지는 분자량 4500∼4900의 펩티드이며, 이들 2개의 서브유닛에 포함되는 시스테인의 SH기 사이에서 SS가교가 생성해서 결합한 구조를 갖는다. 이 2개의 서브유닛을 합성해서 혼합하여 산화하는 것에 의해 생식선 자극 활성을 갖는 펩티드(생식선 자극 호르몬)를 얻을 수 있다.

Description

생식선 자극 활성을 갖는 펩티드 및 그 제법{THE PEPTIDE HAVING GONADOTROPIC ACTIVITY AND ITS SYNTHESIS}
본 발명은, 실패 불가사리(Asterina pectinifera) 등의 무척추동물 유래의 생식선 자극 호르몬 및 그 제법에 관한 것이다.
척추동물의 생식선 자극 호르몬에는 2종류의 호르몬이 있고, 생식선의 발달, 난ㆍ정자의 발달ㆍ성숙ㆍ방출 등을 제어한다. 어류 등의 척추동물의 생식선 자극 호르몬에 관해서는 해명이 진행되고 있다. 그들의 구조의 유사성은 물고기로부터 인간까지 잘 보존되어 있고, 각각, 하나씩의 α서브유닛과 β서브유닛으로 이루어지는 헤테로 다이머(hetero dimer)구조의 단백질 호르몬이다.
척추동물의 생식선 자극 호르몬은 종을 넘어서 척추동물간에서 생식선 자극 효과가 확인되어 있지만(비특허문헌 1, 특허문헌 1, 2), 무척추동물에는 효과를 나타내지 않는다.
무척추동물의 생식선 자극 호르몬은, 척추동물의 생식선 자극 호르몬 정도로는 해명되지 않고 있다. 무척추동물인 실패 불가사리의 방사 신경으로부터 생식선 자극 호르몬(GSS)이 추출되어, 난소편의 방란을 유기하는 것이 확인되어 있다(비특허문헌 2, 3). 이 생식선 자극 호르몬은, 난소내의 난을 둘러싸는 여포세포로 움직 여서, 난에 직접 작용하는 난성숙 유기 호르몬(1-메틸아데닌)을 새롭게 합성시켜 분비시키는 것이 알려져 있다(비특허문헌 4).
특허문헌 1:일본국특허 제2967945호
특허문헌 2:일본국특개평 06-107689
비특허문헌 1:일본비교내분비학회편 「호르몬의 생물과학5 호르몬과 (II)」학회출판센터, 41∼47페이지, 1979
비특허문헌 2:일본동물학회 편 「현대동물학의 과제4 난과 정자」동경대학출판회, 21∼37페이지, 1975
비특허문헌 3:Shirai H., Gonad-Stimulating and Maturation-Inducing Substance, "Method in Cell Biology" Academic Press, vol.27, pp.73~88, 1986
비특허문헌 4:Mita M. & Nagahama Y., Involvement of G-proteins and adenylate cyclase in the action of gonad-stimulating substance on starfish ovarian follicle cells., Developmental Biology, 1991, 144, 262~8
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
생식선 자극 호르몬은, 성숙 촉진 효과를 갖기 때문에, 그 유래하는 생물의 양식 등에 이용할 수 있으므로 중요하다. 본 발명은 무척추동물의 생식선 자극 호르몬의 구조를 최초로 해명한 결과이며, 새우, 게, 조개 등 무척추동물의 양식 등으로의 응용이 기대된다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은, 실패 불가사리의 신경세포로부터 분비되는 생식선 자극 호르몬의 구조를 해석하는 것에 성공했다. 본 발명자들은, 이 생식선 자극 호르몬은, 분자량이 각각 2000∼2400 및 2400∼2600로 구성되는 서브유닛으로 이루어지는 분자량4500∼4900의 펩티드이며, 이들 2개의 서브유닛에 포함되는 시스테인의 SH기 사이에서 SS가교가 생성해서 결합한 구조를 갖는 것을 처음으로 밝히고, 이 2개의 서브유닛을 합성해서 혼합하여 산화하는 것에 의해 얻어진 펩티드가 생식선 자극 활성을 갖는 것을 확인했다. 본 발명자들에 의한 이와 같은 해석 결과는, 당해 호르몬의 대량생산을 가능하게 하는 등 폭넓은 응용으로의 길을 여는 것이다.
즉, 본 발명은, 이하의 2개의 펩티드로 이루어지고, 6개의 시스테인의 사이에서 SS결합에 의한 가교가 형성된 무척추동물 유래의 생식선 자극 호르몬이다.
(a) 서열번호1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 또는 이 아미노산 서열에 있어서 4 및 16번째의 아미노산(Cys)을 제외한 1 또는 수개(예컨대, 2∼3개)의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어져 생식선 자극 활성을 갖는 펩티드
(b) 서열번호2의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 또는 이 아미노산 서열에 있어서 10, 11, 15 및 24번째의 아미노산(Cys)을 제외한 1 또는 수개(예컨대, 2∼3개)의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어져 생식선 자극 활성을 갖는 펩티드
또한, 본 발명은, 이하의 2개의 펩티드를 혼합하여 산화하여 얻어지는 무척추동물 유래의 생식선 자극 호르몬이다.
(c) 서열번호1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 또는 이 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수개(예컨대, 2∼3개)의 아미노산(바람직하게는 Cys 이외의 아미노산)이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어져 생식선 자극 활성을 갖는 펩티드
(d) 서열번호2의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 또는 이 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수개(예컨대, 2∼3개)의 아미노산(바람직하게는 Cys 이외의 아미노산)이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어져 생식선 자극 활성을 갖는 펩티드
이 2개의 펩티드가, 무척추동물로부터 적출한 신경조직 또는 생식선 자극 활성을 갖는 것이 보고되어 있는 조직을, 무척추동물의 생식선 자극 활성을 지표로 하여 정제해서 얻어진 것이어도 좋다.
또한 본 발명은, 상기 2개의 펩티드를 혼합해서 산화하는 것으로 이루어지는 무척추동물 유래의 생식선 자극 호르몬의 제법이다. 이 2개의 펩티드는 어떠한 방법으로 얻은 것이어도 좋고, 즉, 화학적으로 합성해도 좋고, 하기와 같이 유전자공학을 이용해서 얻어도 좋다.
본 발명은, 상기 2개의 펩티드((c)와 (d))중의 어느 하나를 코드하는 DNA이다. 이 2개의 DNA를 포함해서 이루어지는 벡터에 의해 형질전환된 숙주를 배양하고 또는 생육시켜, 상기 숙주 또는 상기 숙주의 배양액으로부터 펩티드를 채취한다. 얻어진 펩티드를 혼합해서 산화하는 것에 의해 생식선 자극 활성을 갖는 펩티드를 제조할 수 있다.
또한 본 발명은, 상기 2개의 펩티드((c)와 (d))를 코드하는 DNA를 포함하고, 서열번호3의 염기서열과 상동성이 70% 이상인 DNA이다. 이 DNA를 포함해서 이루어지는 벡터에 의해 형질전환된 숙주를 배양하고 또는 생육시키는 것에 의해, 생식선 자극 활성을 갖는 펩티드를 제조할 수 있다. 또한, 이 숙주 또는 숙주의 배양액으로부터 펩티드를 채취하고, 얻어진 펩티드를 혼합해서 산화하여도 좋다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명의 무척추동물의 생식선 자극 호르몬 유전자의 DNA 염기서열은, 서열번호3에 나타내는 염기서열(351염기) 또는 상기 2개의 펩티드((c)와 (d))를 코드하는 DNA를 포함하고 서열번호3의 염기서열과 상동성이 70% 이상인 염기서열로 이루어진다.
인간게놈컨소시엄에 의한 인간 게놈해석 프로젝트의 보고논문중(Science 2001, 291(5507), 1304~1351)에서, 게놈 서열중의 유전자를 컴퓨터 프로그램(Otto시스템)으로 자동유전자 주석할 때의 판단 기준으로서, 이미 알려진 유전자정보가 있는 경우, 그 서열정보와의 상동성으로부터 게놈 중의 유전자영역을 특정하는 기준을 폴리뉴클레오티드의 상동성으로 92% 이상으로 하고 있다. 또한 동일한 논문중에서, 유전자 중복으로 복수로 증가된 유전자(그 후의 진화의 과정에서 변이가 들어가고, 염기서열에 부분적인 차이가 생기고 있다)를 탐지하는 경우의 폴리뉴클레오티드의 상동성 기준을 70%로 두고 있다. 따라서, 본 발명에 있어서 서열번호3의 염기서열과 상동성이 70% 이상, 바람직하게는 92% 이상이면, 근연(近緣)이기는 하지만 다른 동물종으로 적용되는 무척추동물의 생식선 자극 호르몬의 유전자로서 기능하는 것이라 생각된다.
본 발명의 무척추동물의 생식선 자극 호르몬의 아미노산 서열은, 서열번호4에 나타내는 116아미노산, 또는 이 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수개(예컨대, 2∼3개)의 아미노산(바람직하게는 Cys 이외의 아미노산)이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진다. 이 서열(서열번호4) 중, 1번째의 메티오닌(M)으부터 29번째의 글리신(G)까지가 시그널 서열, 30번째의 글루타민산(E)으로부터 48번째의 세린(S)까지가 서브유닛A(GSS-A), 49번째의 리진(K)으로부터 92번째의 아르기닌(R)까지가 서브유닛C(GSS-C), 93번째의 세린(S)으로부터 116번째의 시스테인(C)까지가 서브유닛B(GSS-B)이다.
본 발명의 무척추동물의 생식선 자극 호르몬은, GSS-A와 GSS-B가, 각각의 펩티드에 포함되는 시스테인(서열번호1의 아미노산 서열의 4 및 16번째, 서열번호2의 아미노산 서열의 10, 11, 15 및 24번째) 사이에 산화적으로 SS결합을 형성하고, 1 대 1로 결합해서 형성되는 펩티드를 포함한다. Gss-A와 Gss-B와의 사이의 SS결합의 조합은 최대 12가지가 존재한다.
상기 유전자로부터 합성된 펩티드쇄로부터, 상기 시그널 서열이 절단되고, GSS-A와 GSS-B와의 펩티드 사이에서의 가교구조를 형성하고, 마지막으로 GSS-C부분이 절단되어, 생식선 자극 호르몬의 호르몬 분자로서, GSS-A와 GSS-B의 양쪽 펩티드 사이에 가교구조를 갖는 헤테로 이량체 구조를 갖는 것에 이른다고 생각된다. 또한 최근의 연구성과를 참조하면, GSS-C부분도 생리활성을 가진 것이라 생각된다.
본 발명의 무척추동물의 생식선 자극 호르몬은 어느 것이나 신경계로부터의 분비에 의한다는 것으로부터, 무척추동물의(불가사리 이외의) 다른 종류에 있어서 생식선 자극 호르몬의 추출원으로서는, 그 동물종에 있어서의 신경조직을 주된 대상으로 하였다. 이것 이외에도, 동물종에 의해 생식선 자극 호르몬 작용을 갖는 것이 보고되어 있는 조직ㆍ기관이 있으면, 그들을 추출원으로 하여도 좋다.
무척추동물에는, 산호 등의 강장동물, 섬게, 해삼 등의 극피동물, 낙지나 물오징어 등의 연체동물, 새우ㆍ게 등의 갑각류 등, 수산상의 많은 유용종이 포함된다.
상기의 추출원으로부터 생식선 자극 활성을 지표로 하여 정제해서 펩티드를 얻을 수 있다.
정제는 어떠한 방법으로 행하여도 좋고, 액체 크로마토그래피법이나 수성 2층 분배법 등으로 행하여도 좋지만, 고도의 정제를 행하기 위해서는 고속액체 크로마토그래피를 행하는 것이 바람직하다. 컬럼으로서, 사이즈 배제 크로마토그래피 컬럼, 이온 교환 크로마토그래피 컬럼, 역상 크로마토그래피 컬럼 등을 이용할 수 있다.
이와 같은 정제법에 의해 분리해서 얻어지는 분획을, 생식선 자극 활성을 지표로 하여 선택한다.
생식선 자극 활성은, 이하와 같은 방법으로 측정할 수 있다.
성숙한 무척추동물의 암컷개체 중에서, 난성숙 유기 호르몬에 대해 감수성이 높은 난을 갖는 개체를 선택하여, 검정용 개체로서 나누어 둔다.
검정용 개체로부터 난소를 해수중에 적출하고, 그 난소를 소단편으로 절단해서 나누어 둔다.
다검체용 어세이판에 200μL씩 해수를 준비해 둔다. 생식선 자극 활성을 측정하는 시료 2μL를 398μL의 해수와 섞어 200배 희석한다. 그 중의 반량 200μL를 어세이판의 200μL와 섞어 2배로 희석한다. 그 반량의 200μL를 다음의 200μL와 섞어 더욱이 2배 희석한다. 이것을 반복하여, 2배씩의 희석 계열을 200배 희석으로부터 10만 2400배까지 준비한다. 이것에 난소 소단편을 하나씩 넣어 25℃에서 정치 하고, 1시간 후에 난소 소단편이 수축하여 성숙한 난이 방란되는 것을 가지고 생식선 자극 활성이 있다고 판정한다. 또한, 그 때의 희석도로부터 생식선 자극 활성의 상대적 강도를 판정한다.
생식선 자극 호르몬에는 장기ㆍ단기의 복수의 기능이 있다(장기:생식선의 발달, 단기:산란의 유발). 검정용 개체는, 이 단기의 기능을 이용하기 때문에, 산란가능한 정도로 발달한 난을 가지고 있는 것이 필요조건으로 된다. 검정에 이용하는 개체는 산란기 초기에 채집하여, 실험실의 수조에서 살려서 유지하는 것이 바람직하다. 채집해 온 개체 전부가, 산란할 수 있을 정도로 성숙한 개체라고 하는 것은 아니다. 또한, 산란은 가능하지만, 그 성숙의 정도가 미묘하게 다르고, 통상 개체에 의해 호르몬에 대한 감도에 차이가 있다. 따라서, 생식선 자극 활성을 검정하기 위해서는, 성숙한 개체(산란가능한 난을 가지고 있는 개체)를 미리 탐색하고, 더욱이 호르몬에 대한 감도가 어느 정도 갖추어진 개체를 복수 준비해서 놓을 필요가 있다.
생식선 자극 호르몬은 난소중의 여포세포를 자극하고, 이 여포세포는 다른 호르몬 「난성숙 유도 호르몬」을 분비하고, 이것이 난에 작용하여, 그 결과 방란이 일어난다. 이 난성숙 유도 호르몬은 난에 직접 작용하는 호르몬이지만, 생식선 자극 호르몬의 단기 기능중의 하나는, 이 난성숙 유도 호르몬을 만들게 하는 것에 있다. 감수성을 조사할 때에는 시판의 난성숙 유도 호르몬을 이용해도 좋다.
상기의 정제는 복수회 반복해도 좋다. 그 결과, 분자량 4500∼4900의 단일의 펩티드를 얻을 수 있다.
이 펩티드는, 실시예에서도 나타낸 바와 같이, 2개의 서브유닛(GSS-A와 GSS-B)으로 구성된다. 각 서브유닛의 분자량은 각각 2000∼2400 및 2400∼2600이다. 이들 서브유닛은 상기 고분자량의 펩티드를 환원하는 것에 의해 얻을 수 있다. 이 환원은 여러가지 환원제를 이용해서 행할 수 있지만, 디티오슬레이톨, 2-메르캅토에탄올, 티오글리콜산, 벤젠티올, 파라티오크레졸 등의 비교적 온화한 환원제를 이용해서 행하는 것이 바람직하다.
한편, 이들 2개의 펩티드를 혼합해서 산화하는 것에 의해 상기보다 고분자량의 펩티드(즉, 본 발명의 생식선 자극 호르몬)를 얻을 수 있다.
2개의 서브유닛에는 각각 시스테인이 포함되어 있기 때문에, 산화에 의해 각각의 서브유닛에 포함되는 시스테인의 SH기간에서 SS가교가 생성하고, 이들 2개의 서브유닛이 결합한다.
이 산화 때문에, 실시예에서 나타내는 방법 이외에 하기의 시약을 이용해서 행할 수 있다.
- o-요오도벤조산, 요오드
- 이산화망간, 과망간산칼륨
- 과산화수소
- 분자상 산소(실시예에 있어서 이용한 시약이지만, 분자상 산소에 의한 산화반응은, 미량의 철, 구리이온의 첨가에 의해 반응을 더욱 가속할 수 있다)
또한, 합성 펩티드의 산화 반응시에, 단백질의 SS가교구조의 지적화(리폴딩)에 이용되는 이하의 시약을, 펩티드와 동시에 존재시켜 펩티드 사이의 정확한 SS가교의 생성 효율을 상승시킬 수 있다.
- 티오레독신(생체내에서 산화 환원 작용에 관계하는 단백질)
- 프로틴디설피드이소멜라제(생체내의 단백질 디설피드 교환 효소)
- BMC，(±)-trans-1,2-bis(2-mercaptoacetamido)cyclohexane
- 4-mercaptobenzenacetate
본 발명의 펩티드는, 유전자재조합법에 의해서도 제조할 수 있다. 예컨대, 서열번호1 및 2의 아미노산, 또는 이들의 아미노산 서열에 있어서 Cys를 제외한 1 또는 수개(예컨대, 2∼3개)의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산을 코드하는 DNA(예컨대, 서열번호3의 88∼144번째 및 277∼348번째)를 조립한 벡터, 또는 서열번호3의 염기서열과 상동성이 70% 이상인 DNA를 조립한 벡터를 작성하고, 당해 벡터에 의해 숙주의 형질전환을 행한 후, 상기 숙주를 배양 또는 생육시켜, 상기 숙주 또는 상기 숙주의 배양액으로부터 원하는 펩티드를 정제한다. 얻어진 펩티드는 2개의 서브유닛(GSS-A와 GSS-B)이 결합한 펩티드인 경우도 있지만, 얻어진 펩티드(2개의 서브유닛)를 상기의 산화제로 산화하는 것에 의해, 목적의 생식선 자극 활성을 갖는 펩티드를 얻을 수 있다.
얻어진 생식선 자극 활성을 갖는 펩티드를 이용해서 무척추동물의 성숙 촉진이나 배란 유발을 행하는 방법으로서, 이 펩티드를, 이들 무척추동물의 체강내나 난소에 직접 주사 등에 의해 주입하는, 이들의 사육조의 해수에 혼합하는, 더욱이 혼합해서 주는 등의 방법을 들 수 있다.
이하, 실시예에서 본 발명을 예증하지만 본 발명을 한정하는 것을 의도하는 것은 아니다.
도 1은 생식선 자극 활성의 판단의 기준을 나타내는 사진이다. 오른쪽은, 난이 방란되어, 생식선 자극 활성이 있는 것을 나타낸다.
도 2는 생식선 자극 호르몬 정제의 고속액체 크로마토그래피를 나타내는 도면이다.
도 3은 생식선 자극 호르몬 정제의 고속액체 크로마토그래피를 나타내는 도면이다.
도 4는 생식선 자극 호르몬 정제의 미량 고속액체 크로마토그래피를 나타내는 도면이다.
도 5는 생식선 자극 호르몬 정제의 미량 고속액체 크로마토그래피를 나타내는 도면이다.
도 6은 정제한 생식선 자극 호르몬(heterodimer)의 질량분석계에 의한 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 생식선 자극 호르몬의 서브유닛의 질량분석계에 의한 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 합성한 생식선 자극 호르몬 정제의 고속액체 크로마토그래피를 나타내는 도면이다.
이하의 실시예에 있어서, 생식선 자극 활성은 다음과 같이 해서 조사했다.
성숙한 실패 불가사리(또는 나무 불가사리) 암컷 개체 수십마리 중에서, 난성숙 유기 호르몬(1-메틸아데닌)에 대해 감수성이 높은 난을 갖는 개체를 2~3개 선택하여, 검정용 개체로서 나누어 둔다.
이 선택은 이하와 같이 하여 행하였다. 난성숙 유기 호르몬을 10-6M, 3×10-7M, 10-7M, 3×10-8M, 10-8M, 3×10-9M의 6단계의 농도로 해수에 용해하고, 이것에, 난소의 소편을 넣어서 60분간, 실온에서 정치해서 둔다. 60분 후, 현미경으로, 난이 성숙(난세포 중의 핵의 구조가, 다음의 수정에의 준비 때문에 붕괴된다)하고 있는 것인지 여부를 조사했다. 그 때의 난성숙 유기 호르몬의 농도를 조사하고, 10-7M의 농도 또는 그 이하의 농도에서 성숙하는 개체를 검정용 개체로 했다.
검정용 개체로부터 난소(송이모양의 형태를 갖는)를 해수중에 적출하고, 그 난소를 5mm 길이의 소단편으로 절단해 나누어 갖추었다.
다검체용 어세이판에 200μL씩 해수를 준비해 둔다. 생식선 자극 활성을 조 사하는 시료 2μL를 398μL의 해수와 혼합하여 200배 희석한다. 그 중의 반량 200μL를 어세이판의 200μL와 혼합하여 2배로 희석한다. 그 반량의 200μL를 다음의 200μL와 혼합하여 2배 더 희석한다. 이것을 반복하여, 2배씩의 희석 계열을 200배희석으로부터 10만 2400배까지 준비한다. 이것에 난소 소단편을 하나씩 넣어 25℃에서 정치하고, 1시간 후에 난소 소단편이 수축해서 성숙한 난이 방란되는 것을 가지고 생식선 자극 활성이 있다고 판단했다(도 1). 또한, 그 때의 희석도로부터 생식선 자극 활성의 상대적 강도를 판정했다.
실시예 1
실패 불가사리로부터 방사 신경조직을 핀셋으로 박리하고, 드라이아이스상에서 급속동결하고, 저장했다. 5550마리의 불가사리로부터 습중량으로 126.3g의 신경조직을 채취했다.
분쇄기 내에 액체질소를 채우고, 그 중에 냉동 보존하고 있었던 방사 신경을 분상으로 될때까지 분쇄했다. 분상으로 한 신경조직에 600mL의 10mM 아세트산암모늄(단백질 분해효소 조해제의 1μM의 pepstatin, 0.5mg/L의 1eupeptin, 0.2mM의 4 -(2-aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride를 포함한다) 수용액을 3회로 나누어서 가하여, 전동호모게나이저(피스코트론)에서 더욱 잘게 호모게나이즈했다. 호모게나이즈한 추출액을 원심가속도 2만 2500xg에서 4℃, 30분간 원심하여 상청액을 회수했다. 침전을 다시 200mL의 10mM 아세트산암모늄 수용액에 현탁하여 호모게나이즈하고, 2만 2500xg에서 4℃, 30분간 원심하여 상청액을 회수하고, 앞의 상청액과 합하였다. 2만 2500xg의 원심 상청액을, 10만xg, 4℃, 1시간의 조건에서 더 초원심하 여, 상청액을 회수했다. 이 상청액은 생식선 자극 활성을 나타냈다.
얻어진 상청액을 동결 건조한 후, 100mL의 0.15M 탄산수소암모늄에서 용해하였다. 27500xg, 4℃, 30분간 원심하여 불용물을 제거한 후, 동용액에서 평형화한 PD-10탈염컬럼(Amersham Biotech사제)을 걸어, 생식선 자극 활성을 나타내는 고분자 용출분획(PD-10분획)을 회수했다.
이 고분자 용출 분획(PD-10분획)을 동결 건조한 후, 10mM 인산나트륨(pH7.0) 150mL에 용해했다. 동용액에서 평형화한 SephadexG-50컬럼(500㎤)에 50mL씩 3회로 나누어 걸고, 생식선 자극 활성분획(고분자 단백질을 제외한 부분)을 회수했다(G-50분획, 회수량 약 600mL).
이 G-50분획 약 415mL를 26회로 나누어 고속액체 크로마토그래피(시마즈제작소 LC-6AD형)에 걸었다.
다음에, Develosil RP-Aqueous AR5컬럼(10×250mm, 노무라과학제)을 이용하여, 10mM 인산나트륨(pH7.0)으로부터 30% 아세트니트릴/10mM 인산나트륨으로의 직선농도구배법으로 용출했다. 생식선 자극 활성을 나타내는 분획은 아세트니트릴 농도 18~19%부근에 용출되었다(1st HPLC분획, 도 2).
이 1st HPLC분획을 감압 농축한 후의 45mL를 9회로 나누어서 고속액체 크로마토그래피(시마즈제작소 LC-6AD형)에 걸었다.
다음에, Develosil RP-Aqueous AR5 컬럼(10×250mm, 노무라과학제)을 이용하여, 20% 아세트니트릴/10mM 아세트산트리메틸아민(pH4.0)으로부터 25% 아세트니트 릴/10mM 아세트산트리에틸아민으로의 직선농도구배법으로 용출했다. 생식선 자극 활성을 나타내는 분획은 아세트니트릴 농도 21~22% 부근에 용출되었다(2nd HPLC분획, 도 3).
2nd HPLC 분획을 감압 농축한 후, Develosi RP-Aqueous AR3 컬럼(2×250mm, 노무라과학제)을 이용하여, 16.5% 아세트니트릴/1OmM 인산나트륨(pH6.0)으로부터 17.5% 아세트니트릴/10mM 인산나트륨(pH6.0)으로의 직선농도구배법으로 용출했다. 생식선 자극 활성을 나타내는 분획은 아세트니트릴 농도 17% 부근에 용출되었다.(3 rd SMART분획, 도 4)
Develosil RP-Aqueous AR3 컬럼(1.5×150mm, 노무라과학제)을 이용하여, 15% 아세트니트릴/10mM 인산나트륨(pH6.0)으로부터 30% 아세트니트릴/10mM 인산나트륨(pH6.0)으로의 직선농도구배법으로 용출했다. 생식선 자극 활성을 나타내는 분획은 아세트니트릴 농도 18% 부근에 용출되었다(4th SMART분획, 도 5).
최종 정제 분획(4th SMART분획)의 일부를 Ziptip(밀리포어사제)을 이용해서 탈염처리한 후, MALDI-TOF형 질량분석계(Bruker Daltonics사, ReflexⅢ형)로 분석하면 4737의 분자량 성분이 검출되었다. 50mM 디티오슬레이톨을 이용해서 실온에서 1시간 더 환원처리하고, 다시, 질량분석계로 분석하면, 4737의 시그널이 소실하여 2236과 2507의 2개의 시그널이 나타났다. 또한, 환원제 처리 후, 0.2M 요오드아세트아미드를 이용한 실온 24시간의 알킬화 처리에 의해, SH기가 특이적으로 알킬화된다고 생각되는 57mass(SH1개에 대응) 및 114mass(SH2개에 대응)의 질량증가가, 2236과 2507의 각각에 대하여 생겼다.
4th SMART분획을 프로테인 시퀀서(ABI사, Procise 494HT형)로 분석하면, 2개의 펩티드의 혼재를 나타내는 시그널이 얻어졌다. 이 결과로부터, 최종 분획에 포함되는 생식선 자극 활성 성분은, 분자량 4737의 폴리펩티드이고, 더욱이, 환원 처리에서 2개의 성분으로 분리되는 것으로부터, 각각 2236과 2507의 분자량의 펩티드 1개씩으로 이루어지는 헤테로 다이머(hetero dimer)구조를 가지는 것, 그 가교는 환원제 감수성인 것 등으로부터 시스테인 잔기 사이의 SS결합에 근거하는 것을 알 수 있었다.
2성분의 각각의 아미노산 서열 해석은, 분자량 4737의 폴리펩티드의 환원 처리후의 분자량 2236과 2507의 펩티드의 혼합물을 Q-TOF형 질량분석계(Micromass사)를 이용한 MS/MS해석법에 의해 행하였다(도 6, 도 7).
얻어진 2개의 펩티드의 아미노산 서열은
GSS-A: EKYCDDDFHMAVFRTCAVS(서열번호1)(19 아미노산 잔기, 분자량 2236)
GSS-B: SEYSGIASYCCLHGCTPSELSVVC(서열번호2)(24 아미노산 잔기, 분자량 2507)이었다.
질량분석 및 프로테인 시퀀서의 해석결과로부터, 이들의 펩티드는, 불가사리 신경내에서 생합성된 후, 아미노산의 측쇄나 펩티드의 말단에는 어떤 화학적 수식(세포내에서의 단백질ㆍ펩티드의 번역후 수식 작용)을 받지 않고 있는 것을 알았다
GSS-A 및 GSS-B의 아미노산 서열정보를 기초로, GSS유전자를 클로닝했다.
GSS-A 및 GSS-B의 아미노산 서열로부터, 각각, 5'-primerDF1(서열번호5) 및 5'-primerDF2(서열번호6), 3'-primerDR1(서열번호7) 및 3'-primerDR2(서열번호8)을 합성했다.
실패 불가사리 정소로부터 게놈DNA를 QIAGEN(R) Genomic-tip을 이용해서 분리ㆍ정제했다.
게놈표품을 주형(template)으로 하여, 합성한 축퇴 프라이머(degenerate primer)를 이용하여, nested PCR법으로 GSS유전자서열의 일부를 증폭하고, DNA 시퀀서로 서열을 해독했다.
얻어진 서열을 기초로, 새롭게 5'-primerGR(서열번호9)과 3'-primerGF(서열번호10)를 합성했다.
이들 프라이머와, 전술한 게놈DNA, 및, CLONTECH GenomeWalker(TM) Kits를 이용하여, DNA의 5'상류역과 3'하류역의 서열을 해독했다.
새롭게 얻어진 서열로부터, 다시 5'-primerMF1(서열번호11) 및 5'-primerMF2(서열번호12)와, 3'-primerMR1(서열번호13) 및 3'-primerMR2(서열번호14)를 합성했다.
실패 불가사리의 신경, 관족, 간취장, 정소, 난소로부터, NIPPON GENE ISOGEN 또는 QIAGEN(R) QIAzol(TM)을 이용하여 토탈 RNA를 분리ㆍ정제했다.
정제한 토탈 RNA로부터 QIAGEN(R)Omniscript(TM)RT를 이용해서 cDNA를 합성하였다.
이 cDNA를 주형으로 하여, 앞서 합성한 프라이머(5'-primerMF1, 5'-primerMF2, 3'-primerMR1, 3'-primerMR2)를 이용하여, nested PCR법으로 GSS cDNA 의 서열을 증폭하고, DNA 시퀀서로 서열을 해독했다.
그 결과, 서열번호3에 나타내는 GSS유전자가 얻어졌다.
이 염기서열을 아미노산으로 번역하고, 서열번호4의 아미노산 서열을 얻었다.
질량분석 및 프로테인 시퀀서로 해석한 GSS-A 및 GSS-B의 서열은, 이 아미노산 서열(서열번호4)의 30~48번째(GSS-A)와 93-116번째(GSS-B)에 위치한다.
이 아미노산 서열(서열번호4)의 1~29번째의 부분은, 분비 단백질 특유의 시그널 서열이고, 49~92번째는, 116개로 되는 상기 아미노산이 생합성된 후에, 절단되는 서열(GSS-C라 부른다)이다. GSS-C서열의 양단에는, 생합성 후에 특이적으로 효소절단을 받는 KR서열이 있다.
실시예 2
실시예 1의 결과를 기초로, 2개의 펩티드사슬(GSS-A, GSS-B)을 합성했다(순도 99.5% 이상).
합성 펩티드를 각각 0.4mM 또는 1mM 농도(등몰수)로 되도록 20mM 트리스 완충액에 용해하고, 산화제의 존재하, 실온에서 3일간 또는 20일간 교반하여 반응시켰다. 산화제에는, 99.999% 산소가스 또는 0.1M 산화형 글루타치온을 이용했다. 반응후, 미량 고속액체크로마토그래피 장치로 분리하고, 각 피크 분획의 생식선 자극 활성을 측정했다.
피크 면적 4.2%의 비교적 작은 피크에 생식선 자극 활성이 검출되었다. 또한, 각 피크의 질량분석에 의해, 생식선 자극 활성이 검출된 피크만, 천연의 호르 몬(natura1)과 동일한 4737의 복합체 구조를 나타내는 분자량이 검출되었다(GSS-A/B). 생식선 자극 활성을 나타내지 않는 그 밖의 피크는, 2236 또는 2507의 분자량을 나타냈다(도 8).
얻어진 펩티드의 생식선 자극 활성을 조사했다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.
펩티드 EC50(nM)
실패 불가사리 나무 불가사리
GSS-A 활성 없음 활성 없음
GSS-B 활성 없음 활성 없음
GSS-A/B 0.6~3.6 2~10
천연의 호르몬 0.7~4.0 -
합성 펩티드(GSS-A, GSS-B)는 각각 단독에서는 생식선 자극 활성을 나타내지 않고, 산화 반응에 의해 형성되는 4737의 복합체(GSS-A/B)만이 생식선 자극 활성을 나타냈다. 산화 반응에 의해 생기는 합성 호르몬(GSS-A/B)은, 실패 불가사리 뿐만아니라, 근연 다른 종인 나무 불가사리에 있어서도 호르몬 작용을 나타냈다.
본 발명에 의해 무척추동물 생식선 자극 호르몬의 대량생산이 가능하게 되고, 수산상 중요한, 게류, 새우류, 섬게류, 해삼류, 조개류 등 수중에 서식하는 무척추동물에 대하여 생산량의 향상과 신규한 유용종의 개발이 가능하게 되었다.
또한, 실패 불가사리ㆍ나무 불가사리 수정란의 방류 또는 인공증식 등에 의해, 수산양식이 행해지고 있는 해역에서의 불가사리 개체수의 인위적 관리를 행하고, 해저퇴적 사료의 생물분해를 촉진시켜 수질개선을 도모할 수 있다. 이들 2종은 수산양식 해역에서의 우선종으로, 그 생식역은 홋카이도로부터 구주까지의 전역에 미치므로, 상당한 응용 효과가 기대된다.
SEQUENCE LISTING <110> National Institutes of Natural Sciences et al. <120> INVERTEBRATE-DERIVED GONADOTROPIC HORMONE AND ITS SYNTHESIS <130> FS05-439PCT <160> 14 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Asterina pectinifera <400> 1 Glu Lys Tyr Cys Asp Asp Asp Phe His Met Ala Val Phe Arg Thr Cys 1 5 10 15 Ala Val Ser <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Asterina pectinifera <400> 2 Ser Glu Tyr Ser Gly Ile Ala Ser Tyr Cys Cys Leu His Gly Cys Thr 1 5 10 15 Pro Ser Glu Leu Ser Val Val Cys 20 <210> 3 <211> 351 <212> DNA <213> Asterina pectinifera <400> 3 atgacaagca acaaccgcca tctcttccag gcaacttgcc tagttctcct ccttctacac 60 gctgccttcc acggtggagc cctcggtgag aagtactgcg atgacgattt ccacatggcg 120 gtgttccgga cgtgcgcggt cagcaagcgg agccagccgg ggatgagcct tagcgacgtg 180 ttgaccatga accgctttcg aggtcacaac attaaacgaa gcatcgacag cacacttgaa 240 gacaacgcct ttttcatgag cggtttggag aagagatctg aatacagcgg catcgcctcg 300 tactgttgcc ttcacggatg cacgcccagt gaattgtccg tcgtctgcta a 351 <210> 4 <211> 116 <212> PRT <213> Asterina pectinifera <400> 4 Met Thr Ser Asn Asn Arg His Leu Phe Gln Ala Thr Cys Leu Val Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu His Ala Ala Phe His Gly Gly Ala Leu Gly Glu Lys Tyr 20 25 30 Cys Asp Asp Asp Phe His Met Ala Val Phe Arg Thr Cys Ala Val Ser 35 40 45 Lys Arg Ser Gln Pro Gly Met Ser Leu Ser Asp Val Leu Thr Met Asn 50 55 60 Arg Phe Arg Gly His Asn Ile Lys Arg Ser Ile Asp Ser Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Asn Ala Phe Phe Met Ser Gly Leu Glu Lys Arg Ser Glu Tyr Ser 85 90 95 Gly Ile Ala Ser Tyr Cys Cys Leu His Gly Cys Thr Pro Ser Glu Leu 100 105 110 Ser Val Val Cys 115 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> Y means T or C. <400> 5 tgygaygayg ayttycayat ggc 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> Y means T or C, and N means A, C, G or T. <400> 6 atggcngtnt tycgnacntg cgc 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> N means A, C, G or T, and R means G or A. <400> 7 ggngtrcanc crtgnagrca aca 23 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> N means A, C, G or T, and R means G or A <400> 8 tcrctnggng trcanccrtg 20 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 9 cagcacctat tacacacctc gaaagcggtt ca 32 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 10 cgaagcatcg acagcacact tgaagacaac g 31 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 11 ttccggacgt gcgcggtcag c 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 12 cggacgtgcg cggtcagcaa g 21 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 13 gcaacagtac gaggcgatgc cgctgtattc 30 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 14 cagtacgagg cgatgccgct gtattcagat c 31

Claims (7)

  1. 서열번호1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 및 서열번호2의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드의 2개의 펩티드를 혼합하고, o-요오도벤조산, 요오드, 이산화망간, 과망간산칼륨, 과산화수소 또는 분자상 산소의 시약을 사용하여 산화하여 이루어지는, 서열번호1의 아미노산 서열의 4 및 16번째의 시스테인과, 서열번호2의 아미노산 서열의 10, 11, 15 및 24번째의 시스테인의 SH기 사이에서 SS결합에 의해 가교가 형성된 생식선 자극 활성을 갖는 펩티드.
  2. 서열번호1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 및 서열번호2의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드의 2개의 펩티드를 혼합하고 산화하는 것으로 이루어지고, 상기 산화가, o-요오도벤조산, 요오드, 이산화망간, 과망간산칼륨, 과산화수소 또는 분자상 산소의 시약을 사용하여 행하여지는,
    서열번호1의 아미노산 서열로부터 이루어지는 펩티드 및 서열번호2의 아미노산 서열로부터 이루어지는 펩티드의 2개의 펩티드로부터 이루어지고, 서열번호1의 아미노산 서열의 4 및 16번째의 시스테인과, 서열번호2의 아미노산 서열의 10, 11, 15 및 24번째의 시스테인의 SH기 사이에서 SS결합에 의해 가교가 형성된 생식선 자극 활성을 갖는 펩티드의 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 2개의 펩티드가, 무척추동물로부터 적출한 신경조직 또는 생식선 자극 활성을 가지는 것이 보고되어 있는 조직을, 무척추동물의 생식선 자극 활성을 지표로 하여 정제해서 얻어진 생식선 자극 활성을 갖는 펩티드.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 2개의 펩티드가 무척추동물로부터 적출한 신경조직 또는 생식선 자극 활성을 가지는 것이 보고되어 있는 조직을, 무척추동물의 생식선 자극 활성을 지표로 하여 정제해서 얻어지는 생식선 자극 활성을 갖는 펩티드의 제조방법.
  5. 삭제
  6. 서열번호1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 코드하는 DNA 및 서열번호2의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 코드하는 DNA를 포함해서 이루어지는 벡터에 의해 형질전환된 숙주를 배양 또는 생육시키고, 상기 숙주 또는 상기 숙주의 배양액으로부터 채취한 펩티드를 더 혼합하여 산화하는 것으로 이루어지며, 상기 산화가 o-요오도벤조산, 요오드, 이산화망간, 과망간산칼륨, 과산화수소 또는 분자상 산소의 시약을 사용하여 행하여지는, 생식선 자극 활성을 갖는 펩티드의 제조방법.
  7. 삭제
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