RU2349601C2 - Гонадотропный гормон, полученный из беспозвоночных, и его синтез - Google Patents
Гонадотропный гормон, полученный из беспозвоночных, и его синтез Download PDFInfo
- Publication number
- RU2349601C2 RU2349601C2 RU2007111137/13A RU2007111137A RU2349601C2 RU 2349601 C2 RU2349601 C2 RU 2349601C2 RU 2007111137/13 A RU2007111137/13 A RU 2007111137/13A RU 2007111137 A RU2007111137 A RU 2007111137A RU 2349601 C2 RU2349601 C2 RU 2349601C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- amino acid
- peptides
- seq
- gonad
- peptide
- Prior art date
Links
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title abstract description 12
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title abstract description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims abstract description 50
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims abstract description 50
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 47
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 42
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 34
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 claims description 28
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 claims description 28
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 claims description 28
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 7
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 6
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 239000002758 invertebrate hormone Substances 0.000 claims description 5
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 17
- 241000258745 Patiria pectinifera Species 0.000 abstract description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 10
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 abstract description 9
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000002710 gonadal effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract 1
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 28
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 27
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 16
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 13
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 13
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 12
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000001456 gonadotroph Effects 0.000 description 8
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 8
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 8
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 241000258957 Asteroidea Species 0.000 description 5
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 5
- HPZMWTNATZPBIH-UHFFFAOYSA-N 1-methyladenine Chemical compound CN1C=NC2=NC=NC2=C1N HPZMWTNATZPBIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000257468 Asterias amurensis Species 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 101150000435 GSS gene Proteins 0.000 description 3
- 102100034294 Glutathione synthetase Human genes 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000002979 radial nerve Anatomy 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- RMVRSNDYEFQCLF-UHFFFAOYSA-N thiophenol Chemical compound SC1=CC=CC=C1 RMVRSNDYEFQCLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SATCOUWSAZBIJO-UHFFFAOYSA-N 1-methyladenine Natural products N=C1N(C)C=NC2=C1NC=N2 SATCOUWSAZBIJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238366 Cephalopoda Species 0.000 description 2
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000257465 Echinoidea Species 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 2
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 2
- 210000002394 ovarian follicle Anatomy 0.000 description 2
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KYWVDGFGRYJLPE-UHFFFAOYSA-N trimethylazanium;acetate Chemical compound CN(C)C.CC(O)=O KYWVDGFGRYJLPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XMKXCDBWFOFXJS-HTQZYQBOSA-N 2-sulfanyl-n-[(1r,2r)-2-[(2-sulfanylacetyl)amino]cyclohexyl]acetamide Chemical compound SCC(=O)N[C@@H]1CCCC[C@H]1NC(=O)CS XMKXCDBWFOFXJS-HTQZYQBOSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000242757 Anthozoa Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014653 Carica parviflora Nutrition 0.000 description 1
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 description 1
- 241000258955 Echinodermata Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101710114187 Gonad-stimulating substance Proteins 0.000 description 1
- 241000251511 Holothuroidea Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006010 Protein Disulfide-Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 1
- MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N aebsf Chemical compound NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 229940019748 antifibrinolytic proteinase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 210000004186 follicle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000004545 gene duplication Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 230000026109 gonad development Effects 0.000 description 1
- 210000000514 hepatopancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N hydrogen peroxide Substances OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- NUJOXMJBOLGQSY-UHFFFAOYSA-N manganese dioxide Inorganic materials O=[Mn]=O NUJOXMJBOLGQSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000012286 potassium permanganate Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108020003519 protein disulfide isomerase Proteins 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 1
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к получению гормонов, и может быть использовано в разведении беспозвоночных. Из беспозвоночного Asterina pectinifera выделяют гонадотропный гормон, представляющий собой пептид с молекулярной массой 4500-4900 и состоящий из двух субъединиц, белковая структура которого связана SS-мостиками, образованными между остатками SH цистеинов, содержавшихся в субъединицах. Смешивание и окисление этих двух субъединиц после их синтеза позволяет получить гонадотропный гормон, обладающий гонад-стимулирующей активностью. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к гонадотропному гормону, полученному из беспозвоночных, таких как Asterina pectinifera и т.п., и его синтезу.
Уровень техники
Существует два вида гонадотропных гормонов позвоночных животных, которые управляют развитием половых органов и развитием, созреванием и высвобождением яйцеклеток и сперматозоидов. Сделано значительное продвижение в изучении гонадотропных гормонов позвоночных животных, например, рыб и т.п. Структурное подобие этих гормонов хорошо сохраняется от рыб к людям, и эти гормоны являются белковыми гормонами с гетеродимерной структурой, включающей α-субъединицу и β-субъединицу.
Было подтверждено, что гонадотропные гормоны позвоночных оказывают межвидовое воздействие (непатентная ссылка 1, патентные ссылки 1 и 2) на позвоночных животных, но не на беспозвоночных.
Гонадотропные гормоны беспозвоночных не были настолько изучены, как гонадотропные гормоны позвоночных. Гонадотропный гормон (GSS) был экстрагирован из радиального нерва Asterina pectinifera, то есть беспозвоночного, и, как было подтверждено, вызвал размножение из овариального компонента (непатентные ссылки 2 и 3). Сообщается, что гонадотропный гормон стимулирует овариальные фолликулярные клетки, окружающие яйцеклетки в яичнике, к синтезу и секреции гормона, индуцирующего созревание ооцита (1-метиладенина), непосредственно влияющего на яйцеклетки (непатентная ссылка 4).
Патентная ссылка 1: Japan patent No. 2967945.
Патентная ссылка 2: Japan patent Application Public Disclosure No. H06-107689.
Непатентная ссылка 1: Ed., The Japanese society for comparative endocrinology, "Biological Science of Hormone 5, Hormone and Reproduction (II)", Japan Scientific Societies Press, pp. 41-47, 1979.
Непатентная ссылка 2: Ed., The Japanese society for zoology, "Problems in Modern Zoology 4, Oocytes and Sperms", Tokyo University Press, pp. 21-37, 1975.
Непатентная ссылка 3: Shirai H., Gonad-Stimulating and Maturation-Inducing Substance, "Method in Cell Biology" Academic Press, vol. 27, pp. 73-88, 1986.
Непатентная ссылка 4: Mita M. & Nagahama Y., Involvement of G-proteins and adenylate cyclase in the action of gonad-stimulating substance on starfish ovarian follicle cells, Developmental Biology, 1991, 144, 262-8.
Задачи, решаемые настоящим изобретением
Так как гонадотропные гормоны оказывают стимулирующий эффект на созревание, их важно применять для культивирования материнского живого организма. Настоящее изобретение основано на инновационном раскрытии структуры гонадотропного гормона беспозвоночного и может найти перспективное применение в культивировании беспозвоночных, например, креветок, крабов, морских ракушек и т.п.
Способы решения задач
Авторы изобретения успешно проанализировали структуру гонад-стимулирующего гормона, секретируемого нервными клетками Asterina pectinifera. Изобретатели впервые показали, что гонадотропный гормон - это пептид с молекулярной массой 4500-4900, состоящий из субъединиц с молекулярной массой 2000-2400 и 2400-2600, и что его структура образована SS-мостиками, сформированными между SH-остатками цистеинов, содержащимися в этих двух субъединицах, и подтвердили, что пептид, полученный при смешивании и окислении двух синтезированных субъединиц, имел гонад-стимулирующую активность. Результат, проанализированный авторами настоящего изобретения, может открыть новые возможности для широкого диапазона прикладных областей, чтобы наладить массовое производство гормона и др.
А именно, настоящее изобретение представляет собой гонадотропный гормон беспозвоночного, включающий следующие два пептида, в которых SS-мостики сформированы между 6 цистеинами этих двух пептидов:
(a) пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, или аминокислотную последовательность, включающую делецию, замену или добавление одной или нескольких аминокислот (то есть 2-3) в указанной аминокислотной последовательности кроме аминокислот 4 и 16 (Cys) указанной аминокислотной последовательности, и обладающий гонад-стимулирующей активностью;
(b) пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, или аминокислотную последовательность, включающую делецию, замену или добавление одной или нескольких (то есть 2-3) аминокислот в указанной аминокислотной последовательности кроме аминокислот 10, 11, 15 и 24 (Cys) указанной аминокислотной последовательности, и обладающий гонад-стимулирующей активностью.
Также настоящее изобретение представляет собой гонадотропный гормон беспозвоночного, полученный путем смешивания и окисления двух следующих пептидов:
(a) пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, или аминокислотную последовательность, включающую делецию, замену или добавление одной или нескольких (то есть 2-3) аминокислот в указанной аминокислотной последовательности (предпочтительно аминокислоты кроме Cys); и обладающий гонад-стимулирующей активностью;
(b) пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, или аминокислотную последовательность, включающую делецию, замену или добавление одной или нескольких (то есть 2-3) аминокислот в указанной аминокислотной последовательности (предпочтительно аминокислоты кроме Cys), и обладающий гонад-стимулирующей активностью.
Эти два пептида могут быть получены путем очистки (a) нервного органа, выделенного из беспозвоночного, или (b) определенного органа, который, как сообщалось, обладает гонад-стимулирующей активностью, основанной на гонад-стимулирующей активности беспозвоночного в качестве индикатора.
Кроме того, настоящее изобретение представляет собой способ получения пептидов с гонад-стимулирующей активностью, включающий смешивание и окисление двух указанных пептидов. Эти два пептида могут быть получены любым способом, то есть они могут быть химически синтезированными или могут быть получены при помощи генной инженерии.
Настоящее изобретение представляет собой ДНК, кодирующую любой из двух указанных пептидов ((c) и (d)). Пептиды выделяют из организмов-хозяев или среды культивирования, при этом эти организмы-хозяева трансформируют вектором, содержащим две вышеупомянутые ДНК, культивируют и выращивают в культуральной среде. Пептид с гонад-стимулирующей активностью может быть получен путем смешивания и окисления пептидов.
Кроме того, настоящее изобретение представляет собой ДНК, которая содержит ДНК, кодирующую два указанных пептида ((c) и (d)), с более чем 70% гомологии с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3. Пептиды c гонад-стимулирующей активностью могут быть получены путем культивирования и выращивания организма-хозяина, трансформированного вектором, содержащим ДНК. Кроме того, пептиды могут быть выделены из организмов-хозяев или их среды культивирования, при этом пептиды могут быть смешаны и окислены.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 - фотография, показывающая критерии гонад-стимулирующей активности. Правая сторона показывает, что яйцеклетки зародились и гонад-стимулирующая активность присутствует.
Фиг.2 показывает профиль очистки гонадотропного гормона высокоэффективной жидкостной хроматографией.
Фиг.3 показывает профиль очистки гонадотропного гормона высокоэффективной жидкостной хроматографией.
Фиг.4 показывает профиль очистки гонадотропного гормона микродозовой высокоэффективной жидкостной хроматографией.
Фиг.5 показывает профиль очистки гонадотропного гормона микродозовой высокоэффективной жидкостной хроматографией.
Фиг.6 показывает результат анализа очищенного гонадотропного гормона (гетеродимера) на масс-спектрометре.
Фиг.7 показывает результат анализа субъединиц гонадотропного гормона на масс-спектрометре.
Фиг.8 показывает профиль очистки синтезированного гонадотропного гормона высокоэффективной жидкостной хроматографией.
Подробное описание изобретения
Последовательность ДНК гена гонадотропного гормона беспозвоночного согласно настоящему изобретению включает нуклеотидную последовательность (351 основание) SEQ ID NO:3, ДНК, кодирующую два указанных пептида ((c) и (d)), или последовательности нуклеотидов, которая является гомологичной более чем на 70% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:3.
В докладе по проекту анализа генома человека консорциума генома человека (Science 2001, 291 (5507), 1304-1351) предложен критерий автоматической аннотации гена в последовательности генома с помощью компьютерной программы (Otto system), причем этот критерий, основанный на гомологии к полинуклеотидной последовательности с известной генетической информацией, должен обладать более чем 92%-ной идентичностью для того, чтобы точно определить область гена в геноме. В том же докладе предлагается критерий гомологии полинуклеотида на 70%, для отыскания геномов, увеличенных генной дупликацией (более поздняя эволюция могла ввести генную мутацию и могла содействовать частичным изменениям нуклеотидной последовательности). Поэтому нуклеотидная последовательность с гомологией больше чем 70%,и предпочтительно, больше чем 92%, к SEQ ID NO:3 в настоящем изобретении может функционировать как ген гонадотропного гормона беспозвоночного, который применяется к тесно связанным, но различным разновидностям животных.
Аминокислотная последовательность гонадотропного гормона беспозвоночного согласно настоящему изобретению включает 116 аминокислот, показанных в SEQ ID NO: 4, или аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько (например, 2-3) аминокислот (предпочтительно аминокислоты кроме Cys) делетированы, заменены или добавлены. В аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 4) последовательность, начиная с аминокислоты 1, метионина (M), до аминокислоты 29, глицина (G), является сигнальной последовательностью, последовательность, начиная с аминокислоты 30, глутамина (E), до аминокислоты 48, серина (S), является субъединицей А (GSS-A), последовательность, начиная с аминокислоты 49, лизина (K), до аминокислоты 92, аргинина (R), является субъединицей C (GSS-C), и последовательность, начиная с аминокислоты 93, серина (S), до аминокислоты 116, цистеина (C), является субъединицей B (GSS-B).
Гонадотропный гормон беспозвоночного согласно настоящему изобретению содержит пептид, сформированный связыванием GSS-A и GSS-B 1 к 1, при этом пептид содержит SS-мостики, окислительно сформированные между цистеинами (аминокислоты 4 и 16 из SEQ ID NO: 1 и аминокислоты 10, 11, 15 и 24 из SEQ ID NO: 2), содержащимися в каждом пептиде. Максимальная возможность образования SS-мостиков между GSS-A и GSS-B составляет 12.
Гетеродимерная структура с мостиковой конструкцией между пептидами GSS-A и GSS-B может быть собрана в виде гонадотропного гормона после удаления сигнальной последовательности из цепи пептида, синтезированной на основе гена, с последующим заключительным удалением GSS-C части от мостиковой структуры. Однако GSS-C часть все еще может также иметь физиологическую активность согласно недавней научной публикации.
Так как все гонадотропные гормоны беспозвоночных согласно настоящему изобретению секретируются из нервных тканей, источник гонадотропных гормонов беспозвоночных от других видов, кроме Asterina pectinifera, был ограничен нервными тканями исходных видов. Если другие виды животных, как сообщается, обладают гонад-стимулирующей активностью в других тканях и органах, эти ткани и органы могут использоваться как источники для экстракции.
Беспозвоночные включают много полезных морских видов, таких как кишечнополостные, например кораллы, иглокожие, например морские ежи и морские слизняки, моллюски, например осьминоги и кальмары, и ракообразные, например креветки и крабы.
Пептиды могут быть очищены из указанных источников путем экстракции с использованием гонад-стимулирующей активности в качестве маркера.
Очистка может проводиться любыми способами, могут использоваться как жидкостная хроматография, так и двухфазовый водный метод разделения. Однако для высокой очистки предпочтительно используется высокоэффективная жидкостная хроматография. Гель-фильтрация, ионообменная хроматография или обращенно-фазовая хроматография могут использоваться в качестве колонок. Таким образом, фракции, разделенные методом очистки, подвергаются отбору с использованием в качестве маркера гонад-стимулирующей активности.
Гонад-стимулирующая активность может быть измерена следующими методами:
Те особи, яйцеклетки которых очень чувствительны к гормону, стимулирующему созревание ооцита, выбираются из зрелых женских особей беспозвоночных и отделяются как контрольные особи.
У контрольных особей извлекаются яичники в морскую воду и разрезаются на маленькие части. Аналитический планшет для большого числа исследуемых проб заполняют 200 мкл морской воды. Два мкл пробы, исследуемой на гонад-стимулирующую активность, разбавляют в 200 раз, смешивая с 398 мкл морской воды. Половину пробы (200 мкл) разбавляют в два раза, смешивая с 200 мкл морской воды на аналитическом планшете. Половину пробы (200 мкл) далее разбавляют в два раза, смешивая с 200 мкл морской воды на аналитическом планшете. Повторение процедуры приводит к получению серий двукратного разведения от 200-кратного разведения до 102,400-кратного разведения. Маленькую часть яичника добавляют к каждой разведенной пробе и оставляют при температуре 25˚C. Гонад-стимулирующую активность оценивают по образованию зрелых яйцеклеток из отрезанной маленькой части яичника после 1 часа. Относительную гонад-стимулирующую активность оценивают по степени разбавления.
Гонадотропный гормон имеет много функций, а именно длительные и короткие периоды (долгосрочный: развитие гонады, краткосрочный: индукция выброса яйцеклеток). Так как анализ зависит от краткосрочной функции, контрольные особи должны нести зрелые ооциты со способностью к продукции яйцеклеток. Предпочтительно отбирать контрольные особи в их ранний период нереста и поддерживать их в лабораторном аквариуме. Не всегда все собранные особи настолько зрелые, чтобы производить икру. Кроме того, если особи когда-либо являются способными к производству икры, степень их зрелости едва отличается, и обычно чувствительность к гормону варьируется в зависимости от особи. Поэтому для оценки гонад-стимулирующей активности необходимо отбирать зрелые особи (те, которые несут ооциты со способностью к производству икры) и, кроме того, готовить несколько особей с одинаковой чувствительностью к гормону.
Гонадотропный гормон стимулирует овариальные клетки фолликула, при этом клетки фолликула выделяют другой гормон - "гормон, стимулирующий созревание ооцита", который стимулирует ооциты к производству икры. Так как гормон, стимулирующий созревание ооцита, непосредственно влияет на ооциты, одна из краткосрочных функций гонадотропного гормона заключается в индукции образования гормона созревания ооцита. Для оценки чувствительности может использоваться коммерчески доступный гормон, стимулирующий созревание ооцита.
Вышеупомянутая очистка может быть повторена несколько раз. В качестве результата может быть получен уникальный пептид с молекулярной массой 4500-4900.
Как показано в следующих Примерах, пептид включает две субъединицы (GSS-A и GSS-B), где молекулярная масса субъединиц - 2000-2400 и 2400-2600. Эти субъединицы могут быть получены при восстановлении вышеупомянутого пептида с высокой молекулярной массой. Различные восстановители используются для восстановительной реакции, при этом предпочтительно используются такие умеренные восстановители, как дитиотреитол, 2-меркаптоэтанол, тиогликолевая кислота, тиофенол, паратиокрезол и другие.
Напротив, смешивание и окисление этих двух пептидов приводят к образованию пептида (т.е. гонадотропного гормона настоящего изобретения) с более высокой молекулярной массой, чем вышеописанные пептиды. Так как каждая из этих двух субъединиц содержит цистеины, окисление дает SS-мостики между SH-группами цистеинов, содержащихся в субъединицах, чтобы связать эти две субъединицы.
Вышеупомянутое окисление может быть выполнено следующими окислителями кроме способа, показанного в Примерах:
- o-Иодобензойная кислота, иод
- Диоксид марганца, перманганат калия
- Перекись водорода
- Свободный кислород (это реагент, используемый в следующих Примерах, реакция окисления свободным кислородом может быть ускорена в присутствии следовых количеств иона и ионов меди).
Кроме того, возможно увеличить выход образования правильных SS-мостиков между пептидами в присутствии следующих реактивов, которые используются для рефолдинга SS-мостиков белка во время реакции окисления синтетических пептидов:
- тиоредоксин (белок, используемый для окислительно-восстановительного взаимодействия в живой системе),
- протеин дисульфид изомераза (фермент обмена дисульфидов белка в живых организмах),
- BMC, (±)-транс-1,2-бис(2-меркаптоацетамидо)циклогексан,
- 4-меркаптофенилацетат.
Пептид согласно настоящему изобретению может также быть получен генной рекомбинацией. Например, вектор, содержащий ДНК (т.е. основания 88-144 и 277-348 из SEQ ID NO: 3), кодирующую аминокислотные последовательности из SEQ ID NOs: 1 и 2 или аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько (то есть 2-3) аминокислот кроме Cys делетированы, заменены или добавлены, или вектор, содержащий ДНК, в которой нуклеотидная последовательность более чем на 70% гомологична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3, создают, вводят в организмы-хозяева с целью трансформации. Затем трансформированные организмы-хозяева культивируют и выращивают. Целевые пептиды выделяют из организмов-хозяев или их культуральной среды. Иногда полученные пептиды представляют собой пептиды со связью между двумя субъединицами (GSS-A и GSS-B). Однако окисление полученных пептидов (две субъединицы) в присутствии указанных окислителей приводит к пептидам с гонад-стимулирующей активностью.
Способы стимуляции ускорения созревания и овуляции при помощи полученных пептидов с гонад-стимулирующей активностью включают введение этих пептидов непосредственно во вторичную полость или яичник беспозвоночных путем добавления к морской воде в аквариуме или смешивания с кормом.
Следующие Примеры приводятся для пояснения настоящего изобретения, но не предназначены для ограничения его объема.
В следующих Примерах гонад-стимулирующая активность исследована следующим путем:
Две-три особи, несущие ооцит с высокой чувствительностью к гонадотропному гормону (1-метиладенину), отобирают из нескольких десятков зрелых женских особей Asterina pectinifera (или Asterias amurensis) и отделяют как контрольные особи.
Выбор был осуществлен следующим образом:
Гормон, стимулирующий созревание ооцитов, был растворен в морской воде в 6 различных концентрациях, т.е. 10-6 M, 3×10-7 M, 10-7 M, 3×10-8 M, 10-8 M и 3×10-9 M, при этом маленький фрагмент яичника был добавлен к различным концентрациям вызывающего созревание гормона и выдержан 60 минут при комнатной температуре. Созревание ооцита было исследовано под микроскопом после 60 минут, чтобы увидеть, была ли структура ядер в ооците вырождена для подготовки к следующему оплодотворению. Была проверена концентрация гормона, стимулирующего созревание ооцита при созревании, и те особи, которые созревали при меньшей, чем 10-7 М концентрации, использовались как контрольные особи.
Яичники (с пучкообразной морфологией) были извлечены у контрольных особей в морскую воду и разделены на фрагменты размером около 5 мм. Аналитический планшет для большого числа исследуемых проб заполняли 200 мкл морской воды. Два мкл пробы, исследуемой на гонад-стимулирующую активность, разбавляли в 200 раз, смешивая с 398 мкл морской воды. Половину пробы (200 мкл) разбавляли в два раза, смешивая с 200 мкл морской воды на аналитическом планшете. Половину пробы (200 мкл) далее разбавляли в два раза, смешивая с 200 мкл морской воды на аналитическом планшете. Повторение процедуры приводит к получению рядов двукратного разбавления от 200-кратного до 102,400-кратного разбавления. Маленькую часть яичника добавляют к каждой разведенной пробе и оставляют при температуре 25˚C. Гонад-стимулирующую активность оценивают по образованию зрелых яйцеклеток из отрезанной маленькой части яичника после 1 часа. Относительную гонад-стимулирующую активность оценивают с учетом степени разбавления.
Пример 1
Ткани радиального нерва были извлечены из Asterina pectinifera щипцами, заморожены на сухом льду и помещены на хранение. Нервные ткани влажным весом 126,3 г были отобраны у 5550 морских звезд. Жидким азотом заполнили пушку и ткани радиального нерва, сохраненные в замороженном состоянии, были раздроблены в порошок. Порошкообразные нервные ткани были добавлены к 600 мл 10 мМ водного раствора ацетата аммония (содержащего ингибиторы протеиназ, т.е. 1 μM пепстатина, 0,5 мг/л лейпептина, 0,2 мМ 4-(2-аминоэтил) фенилсульфонилфторида) в три приема и были гомогенизированы далее до тонкого порошка электрогомогенизатором (Physcotron). Экстракты из гомогенизированных тканей центрифугировались при 22,500xg при 4˚C в течение 30 мин с последующим отделением супернатанта. Осадок был гомогенизирован с 200 мл 10 мМ раствора ацетата аммония и отцентрифугирован при 22,500xg при 4˚C в течение 30 мин. Супернатант был отделен и смешан с предыдущим супернатантом. Полученный при 22,500xg супернатант ультрацентрифугировали при 100,000xg при 4˚C в течение 1 часа, и отделяли супернатант. Супернатант имел гонад-стимулирующую активность.
После того, как полученный супернатант был заморожен и высушен, его растворили в 100 мл 0,15 М карбоната аммония. После того, как нерастворенные остатки удалили центрифугированием при 27,500xg при 4˚C в течение 30 минут, раствор нанесли на обессоливающую колонку PD-10 (Amersham Biotech Co.), уравновешенную раствором карбоната аммония, и выделили фракцию элюата с высокой молекулярной массой (фракция PD-10), обладающую гонад-стимулирующей активностью.
После того, как фракция элюата с высокой молекулярной массой (фракция PD-10) была заморожена и высушена, ее растворили в 150 мл 10 мМ фосфата натрия (pH 7,0). Раствор нанесли в три приема порциями по 50 мл на колонку Sephadex G-50 (500 см3), уравновешенную фосфатом натрия, и выделили фракцию (фракция без белков высокой молекулярной массы) с гонад-стимулирующей активностью (фракция G-50, выход составил приблизительно 600 мл).
Приблизительно 415 мл фракции G-50 были обработаны высокоэффективной жидкостной хроматографией (Shimazu Corporation, Type LC-6AD) в 26 приемов. Затем активные фракции были элюированы линейным градиентом концентрации от 10 мМ фосфата натрия (pH 7,0) до 30% ацетонитрила/10 мМ фосфата натрия с колонки Девелосил RP-Aqueous AR5 (10Ч250 мм, Nomura Science). Фракции с гонад-стимулирующей активностью были элюированы в пределах концентрации ацетонитрила 18-19% (1-я фракция ВЭЖХ, фиг.2).
1-я фракция ВЭЖХ была сконцентрирована до 45 мл под уменьшенным давлением, и концентрат обработали высокоэффективной жидкостной хроматографией (Shimazu Corporation, Type LC-6AD) в 9 приемов. Затем, активные фракции были элюированы в линейном градиенте концентрации от 20% ацетонитрила/10 мМ триметиламинацетата (pH 4,0) до 25% ацетонитрила/10 мМ триметиламинацетата с колонки Девелосил RP-Aqueous AR5 (10×250 мм, Nomura Science). Фракции с гонад-стимулирующей активностью были элюированы в пределах концентрации ацетонитрила 21-22% (2-я фракция ВЭЖХ, фиг.3).
2-я фракция ВЭЖХ была сконцентрирована под пониженным давлением. Активные фракции были элюированы в линейном градиенте концентрации от 16,5% ацетонитрила/10 мМ фосфата натрия (pH 6,0) до 17,5% ацетонитрила/10 мМ фосфата натрия (pH 6,0) с колонки Девелосил RP-Aqueous AR5 (10×250 мм, Nomura Science). Фракции с гонад-стимулирующей активностью были элюированы в пределах концентрации ацетонитрила 17% (3-я SMART фракция, фиг.4).
Активные фракции были элюированы в линейном градиенте концентраций от 15% ацетонитрила/10 мМ фосфата натрия (pH 6,0) до 30% ацетонитрила/10 мМ фосфата натрия (pH 6,0) с колонки Девелосил RP-Aqueous AR5 (10×250 мм, Nomura Science). Фракции с гонад-стимулирующей активностью были элюированы в пределах концентрации ацетонитрила 18% (4-я SMART фракция, фиг.5).
Часть последней очищенной фракции (4-я SMART фракция) обессолили при помощи Ziptip (Milipore Co.) и проанализировали на масс-спектрометре типа MALDI-TOF (Bruker Daltonics Co., ReflexIII type). Результат показал наличие компонента с молекулярной массой 4737. Кроме того, последняя фракция была восстановлена 50 мМ дитиотреитола при комнатной температуре в течение 1 часа и снова была проанализирована масс-спектрометром. Результат показал наличие двух сигналов с массами 2236 и 2507 вместо 4737. Более того, последнюю фракцию обработали восстановителем и алкилирующим агентом, типа 0,2 М иодацетамида при комнатной температуре в течение 24 часов. Так как молекулярные массы пиков 2236 и 2507 были увеличены на 57 (в соответствии с 1 остатком SH) и 114 массовых единиц (в соответствии с 2-мя остатками SH) соответственно, остатки SH могли быть специфично алкилированы.
Анализ 4-й SMART фракции секвенатором белка (ABI, Procise Type 494HT) дал два сигнала, которые указывают на смесь двух пептидов. Так как вышеупомянутые результаты показывают, что компонент с гонад-стимулирующей активностью, содержавшийся в последней фракции, был полипептидом с молекулярной массой 4737, и компоненты были разделены на два компонента восстановлением, то активный компонент имеет гетеродимерную структуру, включающую две пептидные субъединицы с молекулярной массой 2236 и 2507, где связь димерной структуры чувствительна к восстановителю и, как показано, является SS-мостиком между остатками цистеина.
Аминокислотный анализ смеси пептидов молекулярной массы 2236 и 2507, полученный восстановлением полипептида с молекулярной массой 4737, был выполнен при помощи масс-спектрометрии на масс-спектрометре типа Q-TOF (Micromass Co.) (фиг.6 и фиг.7).
Аминокислотные последовательности этих двух пептидов были:
GSS-A: EKYCDDDFHMAVFRTCAVS (SEQ ID NO: 1) (19 аминокислотных остатков, молекулярная масса 2236);
GSS-B: SEYSGIASYCCLHGCTPSELSVVC (SEQ ID NO: 2) (24 аминокислотных остатка, молекулярная масса 2507).
Из результатов масс-спектрометра и анализа секвенатора белка было установлено, что эти пептиды освобождены от любой химической модификации (внутриклеточная пост-трансляционная модификация белка и пептида) в боковых цепях и концевых аминокислотах после биосинтеза в нервных клетках морской звезды.
Ген GSS был клонирован, исходя из аминокислотных последовательностей GSS-A и GSS-B. Были синтезированы основанные на аминокислотных последовательностях GSS-A и GSS-B: 5'-праймер DF1 (SEQ ID NO: 5) и 5'-праймер DF2 (SEQ ID NO: 6), соответственно; 3'-праймер DR1 (SEQ ID NO: 7) и 3'-праймер DR2 (SEQ ID NO: 8), соответственно.
Геномная ДНК была выделена и очищена из семенника Asterina pectinifera при помощи QIAGEN(R) Genomic-tip.
Часть генной последовательности GSS была амплифицирована методом гнездовой ПЦР при помощи образца генома в качестве матрицы и синтезированных вырожденных праймеров, и в результате нуклеотидная последовательность была расшифрована ДНК-секвенатором. На основе вновь полученной последовательности были синтезированы 5'-праймер GR (SEQ ID NO: 9) и 3'-праймер GF (SEQ ID NO: 10). 5'-прямые и 3'-обратные последовательности ДНК были расшифрованы при помощи праймеров, геномной ДНК и наборов CLONTECH Genome Walker (ТМ). На основе полученных последовательностей были синтезированы 5'-праймер MF1 (SEQ ID NO: 11) и 5'-праймер MF2 (SEQ ID NO: 12); 3'-праймер MR1 (SEQ ID NO: 13) и 3'-праймер MR2 (SEQ ID NO: 14).
Суммарная РНК была выделена и очищена из нервов, амбулакральных ног, гепатопанкреаса, семенников и яичников Asterina pectinifera при помощи NIPPON GENE ISOGEN или QUIAGEN (R) QIAzol (TM). cDNA синтезировали с очищенной суммарной РНК при помощи QIAGEN (R) Omniscript (ТМ) RT.
Последовательность cDNA GSS была амплифицирована при помощи cDNA в качестве матрицы и синтезированных праймеров (5'-праймера MF1, 5'-праймера MF2, 3'-праймера MR1, 3'-праймера MR2) методом гнездовой ПЦР, и последовательность cDNA GSS была расшифрована ДНК-секвенатором.
Таким образом, был получен ген GSS, показанный в SEQ ID NO: 3. Нуклеотидная последовательность была переведена в аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. Последовательности GSS-A и GSS-B, проанализированные масс-спектрометрией и секвенатором белка, расположены в районах аминокислот 30-48 (GSS-A) и 93-116 (GSS-B) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.
Аминокислоты 1-29 из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 являются характерной сигнальной последовательностью секреторных белков, а аминокислоты 49-92 из аминокислотной последовательности представляют собой состоящую из 116 аминокислот последовательность (обозначенную как GSS-C), вырезаемую после биосинтеза аминокислотной последовательности. Последовательность KR, которая специфически и энзиматически удаляется после биосинтеза, расположена на обоих концах последовательности GSS-C.
Пример 2
На основе результата Примера 1 были синтезированы две пептидные цепи (GSS-A и GSS-B) (чистота > 99,5%).
Два синтезированных пептида, растворенных в 20 мМ Tris-буфере в концентрациях 0,4 мМ или 1 мМ (каждый в эквимолярном количестве), реагировали при комнатной температуре в течение 3 или 20 дней в присутствии окислителей с постоянным перемешиванием. 99,999%-ный газообразный кислород или 0,1 М окисленная форма глутатиона использовались как окислители. После реакции реактанты были разделены микродозовой высокоэффективной жидкостной хроматографией, при этом была оценена гонад-стимулирующая активность каждой пиковой фракции.
Гонад-стимулирующая активность была обнаружена в относительно маленькой пиковой фракции с площадью пика 4,2%. Кроме того, молекулярная масса 4737 (GSS-A/B), которая указывает на сложную структуру и является такой же, как молекулярная масса природного гормона, была обнаружена только в пиковой фракции с гонад-стимулирующей активностью согласно анализу каждого пика массовой спектрометрией. Другие пики без гонад-стимулирующей активности показали молекулярную массу 2236 или 2507 (фиг.8).
Была оценена гонад-стимулирующая активность полученных пептидов. Результаты показаны в таблице.
Пептид | EC50(nM) | |
Asterina pectinifera | Asterias amurensis | |
GSS-A | Нет активности | Нет активности |
GSS-B | Нет активности | Нет активности |
GSS-A/B | 0,6-3,6 | 2-10 |
природный | 0,7-4,0 | - |
Синтезированный пептид (GSS-A или GSS-B) по отдельности не проявлял гонад-стимулирующей активности, и только комплекс (GSS-A/B) с молекулярной массой 4737, синтезированный в реакции окисления, показал активность. Синтезируемый в реакции окисления гормон (GSS-A/B) показал гормональную функцию не только в Asterina pectinifera, но также и в таких родственных видах, как Asterias amurensis.
Настоящее изобретение позволяет наладить массовое производство гонад-стимулирующего гормона беспозвоночного и увеличить объем производства водных беспозвоночных, типа крабов, креветок, морских ежей, морских огурцов и моллюсков, а также разрабатывать новые ценные виды.
Кроме того, искусственный контроль количества морской звезды в морской области водного хозяйства за счет снабжения оплодотворенными яйцами Asterina pectinifera и Asterias amurensis или их искусственного быстрого размножения может улучшить качество воды, ускоряя биологическое разложение корма, накопленного на морском дне. Так как эти две разновидности морской звезды - доминирующие разновидности в морской области водного хозяйства, и их среда обитания покрывает целую область от Хоккайдо до Кюсю, может ожидаться обширное применение.
Claims (4)
1. Гонадотропный гормон беспозвоночного, включающий следующие два пептида, в которых SS-мостики сформированы между 6 цистеинами этих двух пептидов:
(a) пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1,
(b) пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.
(a) пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1,
(b) пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.
2. Гонадотропный гормон беспозвоночного, полученный при смешивании и окислении следующих двух пептидов:
(a) пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1,
(b) пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.
(a) пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1,
(b) пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.
3. Гонадотропный гормон беспозвоночного по п.1 или 2, где указанные два пептида получены при очистке (а) нервного органа, выделенного из беспозвоночного или (b) определенного органа, о котором известно, что он обладает гонад-стимулирующей активностью, основанной на гонад-стимулирующей активности беспозвоночного как индикаторе.
4. Способ получения гонадотропного гормона, включающий (1) культивирование и выращивание организма-хозяина, трансформированного вектором, содержащим две ДНК, каждая из которых кодирует следующие пептиды:
(a) пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1,
(b) пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2,
(2) смешивание и окисление пептидов, полученных из организма-хозяина или из культуральной среды культуры организма-хозяина, и
(3) выделение продукта.
(a) пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1,
(b) пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2,
(2) смешивание и окисление пептидов, полученных из организма-хозяина или из культуральной среды культуры организма-хозяина, и
(3) выделение продукта.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004-247779 | 2004-08-27 | ||
JP2004247779 | 2004-08-27 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2007111137A RU2007111137A (ru) | 2008-10-10 |
RU2349601C2 true RU2349601C2 (ru) | 2009-03-20 |
Family
ID=35967550
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2007111137/13A RU2349601C2 (ru) | 2004-08-27 | 2005-08-25 | Гонадотропный гормон, полученный из беспозвоночных, и его синтез |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20080096251A1 (ru) |
JP (1) | JPWO2006022343A1 (ru) |
KR (1) | KR100864127B1 (ru) |
CN (1) | CN101048503A (ru) |
AU (1) | AU2005275728A1 (ru) |
CA (1) | CA2578136A1 (ru) |
NO (1) | NO20071296L (ru) |
RU (1) | RU2349601C2 (ru) |
WO (1) | WO2006022343A1 (ru) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5401736B2 (ja) * | 2008-08-26 | 2014-01-29 | 国立大学法人九州大学 | ナマコ放卵・放精誘起剤、及びそれを用いたナマコの生産方法 |
JPWO2018079861A1 (ja) * | 2016-10-28 | 2019-09-19 | 国立大学法人九州大学 | 放卵又は放精を誘起するペプチド |
CN107032504B (zh) * | 2017-05-18 | 2020-09-04 | 郑州永丰生物肥业有限公司 | 水产用水质改良剂及其制备方法 |
CN114720570B (zh) * | 2020-12-22 | 2023-08-29 | 上海市环境科学研究院 | 一种检测鱼肉中8种雌激素的方法 |
-
2005
- 2005-08-25 JP JP2006532593A patent/JPWO2006022343A1/ja active Pending
- 2005-08-25 US US11/661,140 patent/US20080096251A1/en not_active Abandoned
- 2005-08-25 KR KR1020077004276A patent/KR100864127B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2005-08-25 AU AU2005275728A patent/AU2005275728A1/en not_active Abandoned
- 2005-08-25 RU RU2007111137/13A patent/RU2349601C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2005-08-25 WO PCT/JP2005/015458 patent/WO2006022343A1/ja active Application Filing
- 2005-08-25 CA CA002578136A patent/CA2578136A1/en not_active Abandoned
- 2005-08-25 CN CNA200580036846XA patent/CN101048503A/zh active Pending
-
2007
- 2007-03-09 NO NO20071296A patent/NO20071296L/no not_active Application Discontinuation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
MITA M. et al. Involvement of G-proteins and adenylate cyclase in the action of gonad-stimulating substance on starfish ovarian follicle cells, Dev. Biol., 1991, v.l44, n.2, p.262-268. CHAET A.B. Neurochemical control of gamete release in starfish, Biol. Bull., 1966, v.130, n.1, p.43-58. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20070056069A (ko) | 2007-05-31 |
AU2005275728A1 (en) | 2006-03-02 |
US20080096251A1 (en) | 2008-04-24 |
CN101048503A (zh) | 2007-10-03 |
KR100864127B1 (ko) | 2008-10-16 |
CA2578136A1 (en) | 2006-03-02 |
WO2006022343A1 (ja) | 2006-03-02 |
RU2007111137A (ru) | 2008-10-10 |
NO20071296L (no) | 2007-05-25 |
JPWO2006022343A1 (ja) | 2008-05-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8222385B2 (en) | Germ cell marker using fish vasa gene | |
RU2349601C2 (ru) | Гонадотропный гормон, полученный из беспозвоночных, и его синтез | |
Alam et al. | The rat prolactin gene family locus: species-specific gene family expansion | |
Schaffeld et al. | Type II keratin cDNAs from the rainbow trout: implications for keratin evolution | |
US20060105426A1 (en) | mcFP encoding nucleic acids, polypeptides, antibodies and methods of use thereof | |
JP2009254234A (ja) | 真珠貝の貝殻、真珠の色調を制御する遺伝子とそのタンパク質 | |
Schaffeld et al. | Evolution of tissue-specific keratins as deduced from novel cDNA sequences of the lungfish Protopterus aethiopicus | |
JP5783522B2 (ja) | 魚類gthタンパク質および該タンパク質を用いる魚類の成熟誘導方法 | |
US6379912B1 (en) | Motor proteins and method for their use | |
WO2004072226A2 (en) | Marker for undifferentiated state of cell and composition and method for separation and preparation of stem cells | |
CN111849997B (zh) | 脊尾白虾复眼发育调控基因与引导rna和获取及应用 | |
JP2007236356A (ja) | 真珠貝の貝殻又は真珠の構造遺伝子 | |
JP2006262726A (ja) | マガキの炭酸脱水酵素遺伝子 | |
US20030143673A1 (en) | Barnacle adhesion proteins | |
US7091318B2 (en) | mmFP encoding nucleic acids, polypeptides, antibodies and methods of use thereof | |
US20040072175A1 (en) | Novel motor proteins and methods for their use | |
JP2002531059A (ja) | ラットmdr1aをコードするポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列、ならびにそれらのスクリーニング方法 | |
US20030211453A1 (en) | Fertility associated antigens and method of use thereof | |
WO2002042323A2 (en) | Fluorescent proteins | |
Rahman et al. | Identification and function of new proteins in calcified endoskeleton: A new insight in the calcification mechanism of soft corals | |
氏家義史 et al. | Prediction of Proteolytic Process Based on N-Terminal Sequences and Molecular Weights by Proteomics and Proteome Analysis | |
Hartman et al. | Biology Division progress report, October 1, 1991--September 30, 1993 | |
EP1439228A1 (en) | Sodium-independent transporter transporting small-sized neutral amino acid, gene thereof and method of analyzing transporter function by constructing fused proteins enabling the specification of the function | |
Karl et al. | To be published in PROTEOMICS 07/2014; DOI: 10.1002/pmic. 201300519 | |
Gannon | Cysteine rich biomaterials and a new ratiometric method of protein redox potential measurement |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20090826 |