KR100954881B1 - 넙치 유래의 항균성 펩타이드 헵시딘 - Google Patents

Abstract

본 발명은 넙치(olive flounder Paralichthys olivaceus) 유래의 항균성 신규 펩타이드인 헵시딘(Hepcidin) 및 이를 암호화하는 유전자에 관한 것으로서, 구체적으로는 넙치의 주요 조직으로부터 cDNA 라이브러리(library)를 제조하여 분리해 낸 항균성 신규 펩타이드인 헵시딘 I , 헵시딘 II 및 이를 암호화하는 유전자에 관한 것이다. 본 발명의 신규 펩타이드인 넙치의 헵시딘은 기존에 밝혀진 어류나 마우스의 헵시딘과 같이 병원균에 대한 면역반응을 매개하여 항균활성을 나타내므로 항생제나 사료 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.

헵시딘, 항균활성

Description

넙치 유래의 항균성 펩타이드 헵시딘{Antibiotic peptide, hepcidin produced from olive flounder Paralichthys olivaceus}

도 1은 본 발명의 헵시딘 유전자와 넙치 게놈 유전자 라이브러리 간의 서던 하이브리다이제이션(southern hybridization) 결과를 나타낸 사진이고,

도 2는 넙치 헵시딘 유전자의 게놈 DNA와 cDNA의 염기서열 분석 결과를 나타낸 개열지도이고,

도 3은 RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)을 실시하여 넙치 헵시딘 전사물(transcript)의 조직 내 발현 양상을 나타낸 전기영동 사진이고,

도 4는 리포다당을 주사한 후 1 일과 3 일 후에 RT-PCR을 실시하여 넙치 헵시딘 전사물의 조직 내 발현 양상을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 넙치(olive flounder Paralichthys olivaceus) 유래의 항균성 신 규 펩타이드인 헵시딘(Hepcidin) 및 이를 암호화하는 유전자에 관한 것으로서, 보다 바람직하게는 넙치의 주요 조직으로부터 cDNA 라이브러리(library)를 제조하여 분리해 낸 항균성 신규 펩타이드인 헵시딘 I , 헵시딘 II 및 이를 암호화하는 유전자에 관한 것이다.

항균 펩타이드는 생물체의 선천성 면역체제(innate immune system)를 구성하는 중요한 생체방어인자로 알려진 단백질이다. 이제까지 발견된 항균 펩타이드는 대개 20 ~ 50 개의 아미노산으로 이루어져 있으며 분자량은 2 ~ 6 kDa이다. 지난 20 여 년간 전 세계적으로 많은 연구자들이 항균 펩타이드에 관심을 나타내었는데 이는 항균 펩타이드가 다양한 계통 진화단계의 동물군들에서 광범위하게 발견됨으로써 포유류 선천성 면역계에 존재하는 생체방어 물질의 원시 형태(proto-form)일 것이라는 가설과 병원균에 작용하는 이들의 항균기전이 기존의 항생제들과 상이하여 기존의 항생제에 대한 내성균들에 효과가 있는 새로운 종류의 항생제로 개발할 수 있을 것이라는 가능성 때문이다(Cindy N. R., et. al., Nature Genetics 2004, 36:481-485).

항균 펩타이드는 식물과 동물, 곤충 등에 광범위하게 존재하며, 미생물로부터 숙주를 보호하는 역할을 한다고 알려져 있다. 항균 펩타이드는 주로 2 차 구조와 아미노산 배열의 상동성을 기초로 하여 알파-나선(alpha-helix) 구조, 시스테인이 풍부한 베타-시트(cystein-rich beta-sheet) 구조, 프롤린(prolin) 혹은 글리신(glycine) 잔기의 함유율이 높은 구조의 3가지로 분류되는데 대부분 친수성과 소수 성을 동시에 갖는 양극성이며, 친수성 부위는 양이온을 띄므로 음이온을 띠는 병원성 미생물의 세포막과 결합하여 이를 용해시키는 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 지금까지 진골어류(teleostei)에서 분리, 동정한 항균 펩타이드로는 winter flounder의 피부에서 분리한 플루로시딘(pleurocidin), 혀가자미의 파라닥신(pardaxin), 미꾸라지의 미스구르닌(misgurnin), 먹장어의 HFA-1, 농어의 피시딘(piscidin)과 모로네디시딘(moronedicidin), 메기의 파라신(parasin) 등이 있다.

한편, 헵시딘(hepcidin)은 20 여개의 아미노산으로 이루어진 시스테인이 풍부한 베타-시트(cystein-rich beta-sheet) 구조의 펩타이드로 hybrid bass의 아가미(Shike H. et al (2002) Eur. J. Biochem., 269, 2232-2237), winter flounder와 대서양 연어(Atlantic salmon) (Douglas S.E. et al. (2003) Dev. Comp. Immunol., 27, 589-601), 제브리피쉬 (Hiroko S. et al. (2004) Dev. Comp. Immunol., 28, 747-754), 사람의 요로(Park C.H. et al. (2001) J. Biol. Chem., 276, 7806-7810), 마우스의 간 (Pigeon C. et al. (2001) J. Biol. Chem., 276 7811-7819) 등에 존재한다는 것이 보고되어 있다. 상기 생물체에서 분리한 헵시딘은 그람양성, 그람 음성균 뿐만이 아니라, 곰팡이에까지 다양하게 항균작용을 갖는 항균성 펩타이드로 알려져 있다(Krause A. et. al., FEBS Lett, 2000, 480:147-150) 이와 더불어 장에서 철의 흡수를 조절하고 대식세포(macrophage)에 의한 혈액내로의 재투하를 조절하는 등 철 물질의 대사를 조절하는 철분의 균형 조절에 핵심적인 역할을 한다는 것이 규명되어, 철의 호르몬이라고도 불리어지고 있으므로 철 분 과잉병인 `혈색소 침착증`의 치료제 개발에 유력한 후보물질로 거론되고 있다(Nicolas G. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, 98: 8780-8785).

이에, 본 발명자들은 기존에 알려지지 않은 넙치의 헵시딘 cDNA 유전자의 분리ㆍ동정, 각 유전자의 프로모터 부위를 포함한 게놈 DNA의 분석 및 리포다당(lipopolysaccharide) 자극에 의한 넙치 조직 내 헵시딘 발현량의 차이를 분석함으로써 헵시딘의 항균 작용을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 넙치 유래의 헵시딘 펩타이드, 이를 코딩하는 유전자, 프로모터 부위를 포함한 헵시딘 게놈 DNA, 상기 헵시딘 펩타이드를 생산할 수 있는 재조합 벡터 및 헵시딘 펩타이드를 함유하는 항생제 및 사료 첨가제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 헵시딘 I 펩타이드 또는 그 유도체를 제공한다.

또한, 본 발명은 헵시딘 I 펩타이드를 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 헵시딘 I 펩타이드를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 헵시딘 II 펩타이드 또는 그 유도체를 제공한다.

또한, 본 발명은 헵시딘 II 펩타이드를 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 헵시딘 II 펩타이드를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 헵시딘 I 또는 헵시딘 II 펩타이드를 함유하는 항생제를 제공한다.

아울러, 본 발명은 헵시딘 I 또는 헵시딘 II 펩타이드를 함유하는 사료 첨가제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열(***은 종결코돈에 해당하는 부위이다) 갖는 헵시딘 I의 펩타이드, 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열(***은 종결코돈에 해당하는 부위이다)을 갖는 헵시딘 II의 펩타이드 또는 그 유도체를 제공한다. 상기 유도체는 상기 펩타이드와 한 개 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 의미한다.

헵시딘(Hepcidin)은 20 여개의 아미노산으로 이루어진 시스테인이 풍부한 펩타이드로서, 지금까지 밝혀진 연어, 제브라피쉬, 마우스 등의 헵시딘 펩타이드는 그람양성, 그람 음성균 뿐만이 아니라, 곰팡이에까지 다양하게 항균작용을 갖는 항균성 펩타이드 및 철분의 균형 조절에 핵심적인 역할을 하는 철분 조절 펩타이드로 알려져 있다.

본 발명에서는 넙치의 주요조직의 mRNA를 추출하여 cDNA 라이브러리를 제작하고 이로부터 신규한 넙치의 헵시딘 I 및 헵시딘 II 유전자를 동정하였다. 그 결과, 상기 유전자가 코딩하는 헵시딘 I 및 헵시딘 II 펩타이드는 넙치의 주요조직에서 골고루 발현되며(헵시딘 II 는 간에서만) 면역반응에도 관여하는 것으로 나타났다. 펩타이드의 구조는 헵시딘 I 펩타이드가 전체 89개 아미노산(24개 시그날도메인, 39개 프로도메인, 26개 활성 펩타이드)으로 구성되어 있고 헵시딘 II 펩타이드는 전체 81개 아미노산(24개 시그날도메인, 38개 프로도메인, 19개 활성 펩타이드)으로 구성되어 있는 것으로 확인되었다(도 2 참조).

또한, 본 발명은 헵시딘 I 펩타이드를 코딩하는 유전자 및 헵시딘 II 펩타이드를 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 헵시딘 I(Hepsidin I) 유전자 및 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 헵시딘 II(Hepsidin II) 유전자를 제공한다.

본 발명자들은 넙치의 주요조직으로부터 mRNA를 분리한 후, cDNA 라이브러리를 제작하여 분리ㆍ동정한 결과, 비장 조직에서 신규한 cDNA인 헵시딘 I 유전자, 간 조직에서 헵시딘 II 유전자를 분리하였다. 헵시딘 I의 cDNA는 5'-미해독 부위(195nt), 전사해독틀(open reading frame, 267nt) 및 3'-미해독 부위(98nt)로 이루어져 있고 헵시딘 II의 cDNA는 5′-미해독 부위(81nt), 전사해독틀(open reading frame, 243nt) 및 3′-미해독 부위(70nt)로 이루어져 있다(도 2 참조). 상기 헵시딘 I 및 헵시딘 II의 cDNA를 프로브로 넙치의 게놈 라이브러리에 서던 하이브리다이제이션(southern hybridization)을 실시한 결과, 프로브와 게놈 DNA 간에 교잡반응이 있어났으므로 본 발명의 헵시딘 I 및 헵시딘 II 유전자가 넙치로부터 유래한 것임을 확인하였다(도 1 참조).

한편, 헵시딘 유전자의 발현 상의 특성을 알아본 결과, 대장균의 리포다당(lipopolysaccharide, LPS) 처리시 헵시딘 II 유전자의 발현 레벨이 증가함을 확인하였고(도 4B 참조) 조직별로 헵시딘 유전자의 RT-PCR을 실시한 경우, 헵시딘 I은 간, 비장, 두신, 유문수, 췌장, 아가미, 심장, 뇌, 장에서 모두 발현되고 헵시딘 II는 단지 간에서만 발현됨을 확인하였다(도 3 참조). 상기 결과 중 리포다당 처리시 헵시딘 II 유전자의 발현이 증가한 것은 넙치의 헵시딘이 다른 종(어류나 마우스)의 헵시딘과 마찬가지로 병원균에 대한 숙주반응을 매개하는 항균성 펩타이드임을 의미하는 결과라고 생각할 수 있다.

본 발명자들은 cDNA 이외에 프로모터 부위를 포함한 헵시딘 유전자의 게놈 DNA를 분리하여 염기서열을 확인한 결과, 서열번호 11로 기재되는 염기서열을 갖는 헵시딘 I의 게놈 DNA 및 서열번호 12로 기재되는 염기서열을 갖는 헵시딘 II의 게놈 DNA에서도 어류나 마우스 등 다른 헵시딘 유전자의 프로모터에서와 같이 C/EBPα와 β, NF-κB/c-Rel, HNF-4와 3β와 같은 전사요소(transcription factor)의 결합 사이트로 추정되는 부위가 존재하는 것을 알아내었다. 이로써 헵시딘 cDNA 뿐 아니라 게놈 DNA의 서열을 알아내고 전사에 관여하는 프로모터 부위의 구성요소를 확인하였다(도 2 참조).

또한, 본 발명은 헵시딘 I 유전자의 일부 또는 전체를 포함하는 재조합 벡터 및 헵시딘 II 유전자의 일부 또는 전체를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명자들은 넙치 주요조직의 mRNA를 추출하여 λ 파지(phage)에 팩킹(packing)된 cDNA를 만든 후, 생체 내 절단(in vivo excision)을 통해 상기 cDNA 라이브러리의 유전자를 pBluescript 벡터로 삽입하였다. 이로써 cDNA 라이브러리 내의 헵시딘 Ⅰ, 헵시딘 II 유전자의 일부 또는 전체가 pBluescript에 삽입된 재조합 벡터를 제조하였다.

아울러, 본 발명은 헵시딘 Ⅰ 또는 헵시딘 II를 함유하는 항생제 및 사료 첨가제를 제공한다.

본 발명의 넙치의 헵시딘 유전자는 리포다당 첨가시 발현이 증가되므로 다른 종에서 발현되는 헵시딘처럼 자가면역의 주요 구성요소로서 병원균에 대한 숙주반응을 매개한다고 생각할 수 있다. 따라서 이러한 항균성 헵시딘 펩타이드를 함유하는 물질은 유해한 미생물의 생장을 억제하기 위한 항생제 또는 사료의 부패를 방지하기 위한 사료 첨가제로 사용될 수 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

〈실시예 1〉넙치의 주요 조직으로부터 mRNA 분리

본 발명자들은 넙치의 주요조직으로 부터 mRNA를 분리하였다.

구체적으로 넙치로부터 아가미, 간, 위, 비장, 장, 뇌, 두신 및 피부를 적출한 후 액체질소를 이용하여 막자사발로 분쇄하였다. 여기에 TRIzol 시약(GIBCO BRL)을 넣어 전체 RNA를 추출,분리하였다. 이 중 소량의 RNA를 전기영동한 결과 28S rRNA 및 18S rRNA가 본래 크기에서 나타났는데 이는 RNA가 깨지거나 잘리지 않고 추출, 분리 상태가 양호함을 나타낸다. 상기 전체 RNA로부터 PolyA Tract mRNA isolation system(Promega사)을 사용하여 mRNA 만을 순수 분리하였다.

〈실시예 2〉 분리한 mRNA로 부터 cDNA 라이브러리 제작

<2-1> cDNA 라이브러리 제작

본 발명자들은 상기에서 추출, 분리한 mRNA로 부터 ZAP-cDNA Synthesis kit(Stratagene사)를 사용하여 cDNA 라이브러리를 제작하였다.

구체적으로 <실시예 1> 에서 추출,분리한 mRNA 5 ㎍을 RNAse-free tube에 넣고 여기에 5 ㎕의 10× first-strand buffer, 3 ㎕의 first-strand methyl nuleotide mixture, 2 ㎕의 linker-primer와 1 ㎕의 RNAse block ribonuclease inhibitor를 넣고 잘 섞은 후 실온에서 10 분 동안 반응시켜 RNAse를 제거하고, 10 분이 지나면 여기에 1.5 ㎕의 MMLV(Moloney Murine Leukemia Virus) 역전사 효소(50U/㎕)를 넣고 전체량을 50 ㎕로 맞추어 37℃에서 1 시간 동안 반응시킴으로써 역전사를 통해 first-strand cDNA 합성을 완료하였다.

상기 first-strand mixture에 20 ㎕의 10× second-strand buffer, 6 ㎕의 second-strand dNTP mixture, 2 ㎕의 RNAse H(1.5U/㎕)와 1 ㎕의 DNA pol I(9.0U/㎕)를 넣고 잘 섞은 뒤, 16℃에서 2.5시간 동안 반응시켜 second-strand cDNA를 합성하였다.

이로써 first-strand cDNA에 이어 second-strand cDNA 까지 두 가닥(double strand)의 cDNA 합성을 완료하였다.

<2-2> cDNA 말단에 EcoRI 제한효소 부위 접합

본 발명자들은 상기의 합성된 cDNA의 양 말단에 EcoRI 제한효소부위를 삽입하기 위하여 상기 cDNA 말단에 염기를 추가하여 돌출말단(stivky end)을 평활말단화(blunt end)하고 여기에 EcoRI 어댑터(adptor)를 접합시킴으로써 cDNA의 양 말단에 EcoRI 제한효소 부위를 추가하기로 하였다.

이를 위하여 실시예 <2-1> 에서 제작한 double strand cDNA mixture에 먼저 23 ㎕의 blunting dNTP mix, 2㎕의 cloned Pfu DNA 중합효소(2.5U/㎕)를 넣어 72℃에서 30분 동안 반응시켜 돌출말단(sticky end)을 평활말단화(blunt end) 하였다. 상기 평활말단화한 cDNA를 페놀/클로로포름으로 정제한 후 9 ㎕의 EcoRI 어댑터(adapter)에 녹여 4℃에서 30분 정도 반응시켜 각 성분이 골고루 섞이도록 하였다. 여기에 1 ㎕의 10× ligase buffer, 2 ㎕의 10mM rATP, 6 ㎕의 멸균수, 1 ㎕의 T4 polynucleotide kinase(10U/㎕)를 넣고 잘 섞은 뒤 37℃에서 30분 동안 반응시켜 EcoRI 제한효소부위의 접합 및 나중에 벡터와 접합시키기 위해 양 말단 인산화를 수행하였다.

이로써, 양 말단에 EcoRI 제한효소부위가 접합된 cDNA를 완성하였다.

<2-3> 재조합 벡터 제조

본 발명자들은 EcoRI 제한효소부위가 접합된 상기 cDNA를 Uni-ZAP XR 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였다.

구체적으로 EcoRI 제한효소부위가 접합된 상기 cDNA에 28 ㎕의 XhoI buffer, 3 ㎕의 Xho I(40 U/㎕)를 넣고 잘 섞은 뒤 37℃에서 1.5 시간 동안 반응시켜 Xho I 제한효소 부위를 절단하였다. 상기 cDNA를 Xho I 제한효소로 절단된 상태인 Uni-ZAP XR 벡터(1 ㎍/1 ㎕, Stratagene사), 0.5 ㎕의 10×ligase buffer, 0.5 ㎕의 10 mM rATP(pH 7.5)와 0.5 ㎕의 T4 DNA ligase(4 U/㎕)를 넣고 12℃에서 하룻밤 동안 접합(ligation) 반응을 수행하였다. 이로써 Uni-ZAP XR 벡터에 EcoRI 제한효소부위가 달린 cDNA가 접합된 플라스미드를 제조하였다.

이를 Gigapack II gold packaging extract(Stratagene사)와 섞은 뒤 22℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 500 ㎕의 SM buffer를 넣어 λZAP II 파지(phage)로 팩킹(Packing)을 실시하였다. 이로써 Uni-ZAP XR 벡터에 접합된 cDNA library를 포함한 λZAP II 파지를 제작하였다. 상기 파지를 E. coli XL1-Blue MRF'(O.D. ₆₀₀=0.5) 세포에 감염시켜 적정(titration)하고 증폭(amplification)시켰다.

그 결과, 조직별로 5 × 10⁵ ~ 1.4 × 10⁷ pfu/ml 의 크기를 갖는 cDNA 라이브러리를 제작함으로써 본 발명자들은 다양한 유전자 자원을 포함한 cDNA 풀(pool)을 확보하였다.

〈실시예 3〉 넙치 유래의 헵시딘 유전자 분리

cDNA 라이브러리를 포함한 λZAP II 파지(phage)의 플라크(plaque)를 plasmid rescue system을 이용하여 생체내 절단(in vivo excision)을 실시하여 pBluscript 벡터로 벡터를 전환하였다(STRATAGENE).

이를 플라스미드 분리용 키트(Quiagen사)를 이용하여 플라스미드만을 분리한 후, Big Dye Sequencing kit(Applied Biosystems, UK)와 ABI 3100 염기서열 분석기(PE Applied Biosystems)를 사용하여 염기서열을 분석(sequencing)하고 BLAST program으로 GenBank, EMBL DDBJ database를 검색하여 pBluescript에 삽입된 상기 cDNA를 동정하였다.

그 결과, 넙치의 비장과 간 조직의 cDNA 라이브러리에서 각각 서열번호 1과 3으로 기재되는 두 종류의 신규 펩타이드인 헵시딘 유전자(헵시딘 I 와 II)를 분리하였다.

헵시딘 I은 비장 조직에서 분리하였고 헵시딘 II는 간 조직에서 분리하였다. 헵시딘 I의 cDNA는 5'-미해독 부위(195nt), 전사해독틀(open reading frame, 267nt) 그리고 3'-미해독 부위(98nt)로 이루어진 전체 89개 아미노산(24개 시그날도메인, 39개 프로도메인, 26개 활성 펩타이드)으로 구성되어 있었다. 헵시딘 II 의 cDNA는 5′-미해독 부위(81nt), 전사해독틀(open reading frame, 243nt) 그리고 3′-미해독 부위(70nt)로 이루어진 전체 81개 아미노산(24개 시그날도메인, 38개 프로도메인, 19개 활성 펩타이드)으로 구성되어 있음을 확인하였다(도 2).

〈실시예 4〉 헵시딘 유전자의 서던 하이브리다이제이션 반응

본 발명자들은 상기에서 동정한 헵시딘 cDNA가 넙치의 게놈내에 존재하는지 확인하기 위하여 서던 하이브리다이제이션(southern hybridization)을 실시하였다. 먼저 서던 하이브리다이제이션 실시를 위한 프로브를 제작하였는데 구체적으로 <실시예 2>에서 분리한 cDNA를 주형으로 헵시딘 I의 경우 서열번호 5로 기재되는 프라이머 1과 서열번호 6으로 기재되는 프라이머 2를, 헵시딘 II의 경우 서열번호 7로 기재되는 프라이머 3과 서열번호 8로 기재되는 프라이머 4를 사용하여 PCR을 수행하였다.

그 결과 헵시딘 I 의 경우 524bp의 DNA 절편을 얻었고 헵시딘 II의 경우 531 bp의 DNA 절편을 얻었다. PCR 결과 얻어진 상기의 524 bp의 헵시딘 I 과 531 bp의 헵시딘 II DNA를 DIG(digoxigenin)으로 표지하여 서던 혼성화를 위한 프로브를 제조하여 상기 프로브가 쉽게 탐지되도록 하였다.

한편 넙치의 염색체 DNA를 각각 Pst I, Hind III, Sal I, Sac I의 제한효소를 이용하여 자르고 전기영동 수행 후 나일론 막에 이동시킨 후 상기 DIG로 표지한 524 bp의 헵시딘 I 과 531 bp의 헵시딘 II DNA과 서던 혼성화 반응을 수행한 결과, 헵시딘 I의 경우 Pst I-절단 라이브러리에서 1.8 kb, Sac I-절단 라이브러리에서 5.0 kb의 염색체 절편으로부터 신호를 확인하였다. 헵시딘 II의 경우 Pst I-절단 라이브러리에서 1.2 kb와 1.3 kb 염색체 절편으로부터 신호를 확인하였다(도 1).

이로써 본 발명에서 분리,동정하여 밝혀낸 헵시딘 I과 헵시딘 II 유전자가 넙치의 염색체 내에 존재한다는 것을 검증하였다.

〈실시예 5〉프로모터 부위를 포함한 헵시딘 유전자의 게놈 DNA 분리

본 발명자들은 mRNA로부터 얻어진 헵시딘 유전자 뿐 아니라 비암호화 서열(uncoding region)을 포함하는 헵시딘 게놈 DNA의 염기서열을 분석하기로 하였다.

구체적으로 헵시딘 유전자의 프로모터 부위를 클로닝하기 위하여 Universal Genome Walker kit(Clontech사)를 이용하여 PCR을 실시하였다. 먼저 넙치의 염색체 DNA를 TNES-Urea buffer를 이용하여 분리하였다(Takashi A., Fisheries Science, 1996,62: 727-730). 먼저 넙치 근육 100mg을 분리 후 TNES-Urea buffer(8M Urea, 10mM This-HCl pH 7.5, 125mM NaCl, 10mM EDTA, 1% SDS)에 담그고 37℃에 2시간 이상 방치 후 0.8mg의 protease K를 처리한다. Phenol/Chloroform 처리 후 에탄올 침전을 통해 염색체 DNA를 분리한다. 분리한 염색체 DNA를 각각 제한효소 DraI, EcoRV, PvuII, StuI으로 절단한 후 Universal Genome Walker kit(Clontech사)의 Genome Walker 어뎁트 프라이머(Adapt Primer)인 두 가닥(double strand)인 AP1과 접합(ligation)시켜 4 종류의 제한효소 절단-라이브러리 를 제작하여 PCR을 위한 주형을 만들었다. 상기 AP1 접합 부위는 PCR 시 정방향 프라이머(forward primer)인 단일가닥(single strand) AP1이 결합하는 부위가 된다.

한편, 헵시딘 I과 헵시딘 II의 유전자 염기서열 3'-말단 에 해당하는 각각의 프라이머를 제작하였는데 헵시딘 I의 경우 서열번호 9로 기재되는 GSPI 프라이머(Gene Specific Primer I) 헵시딘 II의 경우 서열번호 10으로 기재되는 GSPII 프라이머(Gene Specific Primer II)를 제작하였다.

AP1과 GSPI 또는 AP1과 GSPII을 프라이머로 PCR을 수행한 결과 헵시딘 I의 경우에는 EcoRV-절단 라이브러리에서 1.6 kb, 헵시딘 II의 경우에는 EcoRV-절단 라이브러리에서 2.0 kb의 PCR 산물을 확인하였다. 증폭된 DNA 단편을 젤로부터 분리하여 정제한 후 EcoRV로 절단한 T-벡터(Promega사) 상기 증폭된 PCR 단편을 접합시켰다. 이를 시퀀싱하여 접합시킨 PCR 단편의 염기서열을 확인하였다.

그 결과, 상기 PCR 단편에서도 어류나 마우스 등 다른 헵시딘 유전자의 프로모터에서 공동으로 발견된 C/EBPα와 β, NF-κB/c-Rel, HNF-4와 3β와 같은 전사요소(transcription factor)의 결합 사이트로 추정되는 부위가 존재하는 것을 확인하였다. 헵시딘 I은 전사 시작점에서 31 bp 떨어져 TATA box가 있으며, 전사 시작점에서 750 bp와 571 bp 떨어져 각각 CAAT enhancer 부위와 C/EBPβ 결합부위, 전사 시작점에서 742 bp와 384 bp 떨어져 간세포 핵 요소(hepatocyte nuclear factor)인 HNF-3β과 NF-κB/c-Rel 결합부위가 각각 존재하였다. 헵시딘 II은 전사 시작점에서 70 bp 떨어져 TATA box가 있으며, 전사 시작점에서 109 bp와 669 bp 떨어져 각각 C/EBPα와 β 결합부위, 전사 시작점에서 138 bp 떨어져 NF-κB/c-Rel 결합부위, 전사 시작점에서 197 bp와 249 bp 떨어져 HNF-4와 HNF-3β 결합부위가 각각 존재하였다(도 2 참조).

이로써, 프로모터 부위를 포함한 헵시딘 유전자의 게놈 DNA를 분리하고 시퀀싱(sequencing)을 통하여 서열을 확인하였다.

〈실시예 6〉 헵시딘 유전자의 조직 특이적 발현

본 발명자들은 RT-PCR을 이용하여 각 조직에서 헵시딘의 발현 레벨을 조사하였다.

구체적으로 <실시예 1>에서 넙치의 간, 비장, 뇌, 두신, 체신, 아가미, 심장, 유문수, 근육, 위, 피부, 직장의 12개 조직으로부터 추출한 전체 RNA 2 ㎍과 서열번호 5와 6으로 기재되는 헵시딘 I의 프라이머, 서열번호 7과 8로 기재되는 헵시딘 II의 프라이머, Omniscript RT kit(QIAGEN사)를 이용하여 각 조직에서 발현되는 헵시딘의 cDNA를 합성하였다. 역전사(reverse transciption)로 cDNA를 합성한 데 이어 상기 cDNA를 주형으로 PCR을 실시하였다. PCR은 Roche사의 PCR Master를 사용하였으며 PCR 반응 조건은 95℃에서 5분 반응, 95℃에서 30초간 변성, 58℃에서 30 초간 프라이머 annealing, 72℃에서 30초 동안 중합반응을 하는 것을 1 사이클로 하여 30 사이클을 수행한 다음, 마지막으로 72℃에서 7분 동안 마무리를 하였다.

그 결과, 헵시딘 I의 경우 288 bp의 증폭된 DNA 단편을 얻었고 헵시딘 II의 경우 264 bp의 증폭된 DNA 단편을 얻었다. 한편, PCR로 증폭된 DNA 단편의 양을 비교해 본 결과, 도 3에서와 같이 헵시딘 I는 간, 비장, 두신, 유문수, 췌장, 아가미에서 높은 발현레벨을 보였으며 심장, 뇌, 장에서 낮은 발현을 그리고 위, 직장, 피부에서는 거의 발현되지 않았다. 반면 헵시딘 II는 단지 간에서만 발현될 뿐 다른 조직에서는 발현되지 않았다.

〈실시예 7〉 리포다당 처리시 헵시딘 유전자의 조직 특이적 발현

본 발명자들은 항원으로 작용하는 대장균의 리포다당(lipopolysaccharide, LPS)을 처리한 후 헵시딘 유전자의 발현양상을 알아보았다.

구체적으로 넙치 3 마리에 대장균 0127:B8 유래 리포다당(SIGMA 사) 100 ㎍을 주사한 후 1 일과 3 일째에 넙치를 희생시키고 개체별로 간, 두신, 아가미, 비장의 각 조직을 분리하였다. 이로부터 <실시예 1>과 같은 방법으로 전체 RNA를 분리한 후 <실시예 6>와 같은 방법으로 RT-PCR을 수행하였으며 대조구로 리포다당 대신 동량의 PBS를 주사한 넙치 3 마리를 사용하였다.

그 결과, 리포다당 주사 1일 후에 넙치의 4개 조직 모두에서 헵시딘 II의 발현레벨이 유의성 있게(P〈0.05) 증가하였으며 주사 3 일 후에는 감소하였다(도 4B). 반면에 헵시딘 I은 주사 1 일과 3 일 후 모두에서 발현 레벨의 증가를 보이지 않아 리포다당이 헵시딘 I의 발현레벨에 영향을 주지 않음을 확인하였다(도 4A).

마우스의 간 조직에서 항원인 리포다당 주사에 의한 헵시딘 전사물(transcript)의 발현량 증가와 Atlantic salmon 과 hybrid stripped bass의 간을 포함한 일부 조직에서 세균감염(bacterial challenge)에 의한 헵시딘 발현량 증가 등이 보고되고 있는 것에 비추어 볼 때, 리포다당 주사시 본 발명의 헵시딘 II의 발현 증가는 마우스, Atlantic salmon, hybrid stripped bass의 헵시딘 유전자와 마찬가지로 본 발명의 넙치의 헵시딘 II 도 자가면역의 주요 구성요소로서 병원균에 대한 숙주반응을 매개한다고 생각할 수 있다.

이상, 넙치의 주요 조직으로부터 mRNA를 추출ㆍ분리하여 각 조직별 cDNA 라이브러리를 제작하고 이로부터 넙치 유래의 헵시딘 유전자를 분리, 동정하였다. 또한, 넙치의 염색체 DNA 로부터 헵시딘의 프로모터 부위를 포함한 게놈 DNA를 분리하여 프로모터 서열을 분석하고 RT-PCR을 통하여 헵시딘 유전자의 조직 특이적 발현을 확인하였으며 리포다당 처리시 헵시딘 유전자의 발현레벨 증가를 확인하여 헵시딘 유전자의 항균 활성의 가능성을 예측할 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 헵시딘 유전자 및 이를 포함하는 재조합 벡터는 헵시딘 펩타이드 및 재조합 헵시딘 단백질을 유전공학적으로 대량생산하는데 이용될 수 있고 헵시딘 펩타이드 또는 재조합 헵시딘 단백질은 전통적인 항생제에 저항성을 갖는 미생물에 의한 감염질환을 치료하는 약물 및 어류 양식을 위한 사료첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.

<110> National Fisheries Research and Development <120> Antibiotic peptide, hepcidin produced from olive flounder Paralichthys olivaceus <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 591 <212> DNA <213> Hepcidin I <400> 1 catcaagctg tgcacacgct gacagggggt caccacaaca tctgaagaaa cccacattcc 60 tagagaacca gcatccatca caggagccga agaatacaag acgctgtggt gctcgtcggt 120 ggcctgacac ccatgagaca gaagacctgc aaactctaat tttgatttcc taacaaacat 180 catctaaacc tcaaaatgaa ggcattcagc attgcagttg cagtgacact cgtgctcgcc 240 tttgtttgca ttcaggacag ctctgccgtc ccattccagg gggtgcagga gctggaggag 300 gcagggggca atgacactcc agttgcggca catcaaatga tgtcaatgga atcgtggatg 360 gagagtcccg tcaggcagaa gcgtcacatc agccacatct ccatgtgccg ctggtgctgc 420 aactgctgca aggccaaggg ctgtggcccc tgctgcaagt tctgaggatt cccgcaacaa 480 cctcaaaata tattaattta ttacacttgt ttgtcaagaa atgacctttt tcttgacctc 540 ttttgtaatt ttgtataatc tgtaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 591 <210> 2 <211> 90 <212> PRT <213> Hepcidine I peptide <400> 2 Met Lys Ala Phe Ser Ile Ala Val Ala Val Thr Leu Val Leu Ala Phe 1 5 10 15 Val Cys Ile Gln Asp Ser Ser Ala Val Pro Phe Gln Gly Val Gln Glu 20 25 30 Leu Glu Glu Ala Gly Gly Asn Asp Thr Pro Val Ala Ala His Gln Met 35 40 45 Met Ser Met Glu Ser Trp Met Glu Ser Pro Val Arg Gln Lys Arg His 50 55 60 Ile Ser His Ile Ser Met Cys Arg Trp Cys Cys Asn Cys Cys Lys Ala 65 70 75 80 Lys Gly Cys Gly Pro Cys Cys Lys Phe *** 85 90 <210> 3 <211> 482 <212> DNA <213> Hepcidine II <400> 3 atcagacagg tgaactgaga ggagctgaca agagtcacca gcagagtcga agaacttaaa 60 caacttaact cagtctcaaa gcggcacgag gcaagagtca ccagcagagt cgaagaactt 120 aaacaactta actcagtctc aaagatgaag acattcagtg ttgcagtcac cgtggccgtc 180 gtgctcgtct ttatttgcat ccagcagagc tctgccactt ctcctgaggt acaagagctg 240 gaggaggcag tgagcagtga caatgcagct gctgaacatc aggagcaatc agcggactca 300 tggatgatgc cacaaaacag acagaagcgt gacgtcaagt gtggtttttg ctgcaaagat 360 ggtggctgtg gagtgtgctg caatttctga gagatgtgac tgtatcaccc acgcattttc 420 tctattgagg agtattttca ataaatgcca atcctccttt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480 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gacggcccgg gctggtaaat ataaagggtc ttttctgggc taaagaaaac 60 tacaattcat ccaatttaga tgaaatgaac tggtgaaaaa catcatgagg attattctac 120 attaaatttc tgccaatagt tccctttcag atgaatctta cacactgaac ctttaagtca 180 tgatatacaa tcctgtattt ttgctgcagc gtaaaaacac ctgaagcaat gtttcttttt 240 gctgttcaga cgtaataaac ctcatcagaa gacattaaat ccatctttat cgaattcata 300 ttgaagcacc ttgactctca aatgaacgtt tttaatcctg gctactattc cactgctctc 360 aaagggattt aatttggttc cactgcaggt tccatgtgta ttatgcaaaa accgaatgtg 420 ttgaaaatga gaggctaatt gttccatttg agaggttgta attacatcct ttagaatgag 480 caaaggatcg agagtgtctc cttctccgca gcgaaggatt tccagcgtgg tgccactcag 540 tcggccgtgc agcacactga cccgtacagt ctctgccttt tcagtgggaa tttccagctc 600 tcgctgcccg tttgctctgg gaaaagtcac aagtatttaa taagcactag aatacaggat 660 cataatgtaa aaaaatcatg gtctccagca gcagcagcag cgggttgctc atgagtggaa 720 ttgtgtgctc tatctgagga aagtaattta ttattaaagt tcatggctga tttttcgagc 780 acactctaaa atagatgggg gcatttcaga agaagagttg cagaagtacg aggaggtgaa 840 attaggaggt cagaacttcc ccagcagagt gaggtaactg ctgccaggaa tgggacgggc 900 ctgcagcagc gatgaggcaa cacagagaca aagtgcatat aaatacaagt gcactctgca 960 aacccgacca tcaagctgtg cacacgctga cagggggtca ccacaacatc tgaagaaacc 1020 cacattccta gagaaccagc atccatcaca ggagccgaag aatacaagac gctgtggtgc 1080 tcgtcggtgg cctgacaccc atgagacaga agacctgcaa actctaattt tgatttccta 1140 acaaacatca tctaaacctc aaaatgaagg cattcagcat tgcagttgca gtgacactcg 1200 tgctcgcctt tgtttgcatt caggacagct ctgccgtccc attccagggg gtaagaacgc 1260 aactttaact cgcttcattt gcttattagc cataaatgtt ttgtcaggat gctgagacac 1320 ggctcctaaa tgtgtataat tcattaacag gtgcaggagc tggaggaggc agggggcaat 1380 gacactccag ttgcggcaca tcaaatgatg tcaatggaat cgtggatggt atgttcaatc 1440 tgttcaatcg actggatgaa ttaagccaat tactgtgagc gcgttaacat ttaagtggct 1500 gtgttccagc ccggtgctgt agggaataaa acccctcgtt catgtgtctt gtcgtccaca 1560 ggagagtccc gtcaggcaga agcgtcacat cagccacatc tccatgtgcc gctggtgctg 1620 caactgctgc aaggccaagg gctgtggccc ctgctgcaag ttctgaggat tcccgcaaca 1680 acctcaaaat atattaattt attacacttg tttgtcaaga aatgaccttt ttcttgacct 1740 cttttgtaat tttgtataat ctgt 1764 <210> 12 <211> 2192 <212> DNA <213> Hepcidin II genome DNA <400> 12 acgcgtggtc gacggccctg gctggtatcc tttgtggtag tctttggccc ataaaaaatg 60 aaatgagatc tcagcaaaaa aaagcaatat ttctccttta aacagcacaa atgtccacac 120 attagcatta atgtgaaaca tccatgaacg taatgatgat gtggtagcag aagtaaaaag 180 tcacagcaga acggtcaaat agtaccttca atgaaaccaa catgtaaaca agtgtagaga 240 gcagtcattt cataggtcag attacagtca ggtccaaaca tcacaccatt tacatgtcat 300 aatgcattcc tattatcttt aacacgctct aagtatacac agatcccctt gtgagcttac 360 ttgaaataat aaaatgcatc tacgattgta gattagcttc tagtatgaga atgacaatat 420 attcacttca cacaatgtga ctggttttgc tctatgagtt cctgaaatta actaatttgt 480 atcattaatc agataaagga tagccgtggt cgttcagaag agagaagagc acataacaca 540 gctccatcag aaagtgactc tctcaacttc agtatcccca gtcccacttg cacaaattgt 600 tagtcatttt gttcttctcc agaccaaacc tcactttcct gtgtacatca tagtcctgca 660 acaattcaag gttcaaaggt tcaaaggttt tattgtcatc tgcacaacag atacagcgta 720 catgttggca atgaaaatct taaatcccag gcacctcaag caactcaaca tgcaagtgtc 780 ataaaataag agtaactaaa aatacaataa catacactag tgcaaatgaa acaataagta 840 caaatgtcag tactagtgca aaaaaattaa gtaatgacat aatgacataa tgatgatgat 900 gcagagaaaa tgcaccaaat agtgtccaaa agcgtttttt ttctttcgcc aatgacctca 960 ctgtatagtc ctctacatag aagtccctat acatgagtag gacatgagga gtgagtaggt 1020 gatttctgac acagcctgac aaagataaac aaccagccca gcagccaaaa gagatgggga 1080 tgtcacacaa tcactttgtg ccagtaaaac agaaacataa atgcatccac atctgtgaga 1140 ataaactgca caatactgct ctcatacttt ctagtgaaca caatatctca cgagcaactc 1200 ataggacttt cttcaaattt ggcagaaacc tcatgaacgc aaaactgtat ctcagaaaat 1260 tgccttgaaa aaacttcaaa tttggaataa acaatcactt tgactcaaag ttgaactgat 1320 ttgattttgg tgatcaaaaa ggtcaaaggt cactatgaga aaaatccctc caaatatcta 1380 atgtgtttaa aaaaaggaat ttcccaactg caggatgtca aaatatttgg atactggcaa 1440 ctgttcctga aagcaggcag agtaaatgct gccagtgatg aggaaacggt gtcctctgtc 1500 agtacaaata ccagcacagt gcacattcaa ccatcagaca ggtgaactga gaggagctga 1560 caagagtcac cagcagagtc gaagaactta aacaacttaa ctcagtctca aagatgaaga 1620 cattcagtgt tgcagtcacc gtggccgtcg tgctcgtctt tatttgcatc cagcagagct 1680 ctgccacttc tcctgaggta agaacctgac ttcagatcat ttcatttgct cattagccat 1740 gaacctctca tcaaatactg acagttgatt tcttctttat caggtacaag agctggagga 1800 ggcagtgagc agtgacaatg cagctgctga acatcaggag caatcagcgg actcatggat 1860 ggtatgttca gttcactgag tggatcaaac caattcacat cacatctttc agatggaagt 1920 caacatgttt tagtcacaaa agttctctga agctcagtct acaccagaag agaaaacaaa 1980 cacagtaagt tatgatggtg ctgatgaatg tctcctcatg tctcatgtcc ctcacacaga 2040 tgccacaaaa cagacagaag cgtgacgtca agtgtggttt ttgctgcaaa gatggtggct 2100 gtggagtgtg ctgcaatttc tgagagatgt gactgtatca cccacgcatt ttctctattg 2160 aggagtattt tcaataaatc caatcctcct tt 2192

Claims (13)

1. 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 헵시딘 I 펩타이드.
2. 제 1항의 펩타이드를 코딩하는 유전자.
3. 제 2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자.
4. 제 2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 11로 기재되는 염기서열을 갖는 게놈 DNA인 것을 특징으로 하는 유전자.
5. 제 2 항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
6. 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 헵시딘 II 펩타이드.
7. 제 6항의 펩타이드를 코딩하는 유전자.
8. 제 7항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자.
9. 제 7항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 12로 기재되는 염기서열을 갖는 게놈 DNA인 것을 특징으로 하는 유전자.
10. 제 7항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
11. 제 2항 또는 제 7항에 있어서, 상기 유전자는 넙치(olive flounder, Paralichthys olivaceus)로 부터 유래한 것을 특징으로 하는 유전자.
12. 제 1항 또는 제 6항의 펩타이드를 함유하는 항생제.
13. 제 1항 또는 제 6항의 펩타이드를 함유하는 사료 첨가제.

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