ES2639395T3 - Compuestos modificados isotópicamente y su uso como complementos alimentarios - Google Patents

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Abstract

Una composición nutritiva para su uso en un método de aumento de la resistencia a procesos perjudiciales o degradantes mediados por especies reactivas de oxígeno, especies reactivas de nitrógeno o radiación, que comprende: un nutriente esencial, que es un ácido graso, un ácido nucleico, un nucleótido, un aminoácido o un péptido, en el que al menos un H intercambiable es 2H o al menos un átomo de C es 13C; en el que el nutriente esencial se sintetiza químicamente y se modifica isotópicamente; en el que el nutriente esencial se incorpora en un constituyente corporal a un organismo cuando es ingerido por el organismo; y en el que el organismo es un ser humano o un animal.

Description

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DESCRIPCION
Compuestos modificados isotopicamente y su uso como complemented alimentarios Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a compuestos modificados isotopicamente y a su uso como complemented alimentarios.
Antecedentes de la invencion
Una teona del envejecimiento aceptada en la actualidad culpa de los cambios irreversibles en la maquinaria celular y la reduccion de la eficiencia de los procesos metabolicos sobre los efectos perjudiciales de los radicales libres y otras especies reactivas de oxfgeno (ROS) o especies reactivas de nitrogeno (RNS), que se encuentran normalmente presentes en la celula como parte del proceso respiratorio. Las ROS y RNS oxidan/nitran el ADN, las protemas, los lfpidos y otros componentes celulares. De estos, la oxidacion de las protemas, que convierte la arginina, la lisina, la treonina, el triptofano y la prolina en los compuestos de carbonilo correspondientes, no puede ser reparada por las proteasas tras la oxidacion de un cierto numero umbral de restos de aminoacido.
La protema danada pierde su actividad catalttica o estructural, pero las proteasas son incapaces de desintegrar cadenas fuertemente carboniladas, de modo que las especies danadas se acumulan y agregan, obstruyendo los pasajes celulares. Este proceso similar a la oxidacion va desgastando gradualmente todos los mecanismos celulares, ralentizando todo, causando, finalmente, la muerte celular.
Aparte del envejecimiento, muchas enfermedades como el Alzheimer, el Parkinson, la demencia, las cataratas, la artritis, la insuficiencia renal cronica, el smdrome respiratorio agudo, la fibrosis qmstica, la diabetes, la psoriasis y la sepsia, por dar algunos ejemplos, se asocian con una mayor carbonilacion de las protemas. Por lo general, los niveles fisiologicos de los carbonilos proteicos estan en aproximadamente 1 nmol/mg de protema, mientras que los niveles patologicos llegan a 8 nmol/mg y superiores.
Para las dos moleculas implicadas en el proceso de dano oxidativo de las protemas, es decir, un oxidante y su sustrato, el oxidante ha sido objeto de muchos estudios con el objetivo de neutralizarlo o eliminarlo mediante el aumento del numero de antioxidantes (vitaminas, glutation, peptidos o enzimas). El sustrato, por ejemplo, los restos de aminoacido (AA) que se convierten en carbonilos, han recibido menos atencion.
Una caractenstica comun de todos los restos de AA (excepto la prolina) vulnerables a la carbonilacion es que pertenecen al grupo de AA esenciales, que no pueden ser sintetizados por vertebrados y deben ser ingeridos, por ejemplo, consumidos con los alimentos. El grupo incluye fenilalanina, valina, triptofano, treonina, isoleucina, metionina, histidina, arginina, lisina y leucina (la arginina es esencial para los ninos de hasta 5 anos).
La oxidacion tanto de la Arg como de la Lys por las ROS produce semialdetedo aminoadfpico y procede a traves del reemplazo secuencial de u>-hidrogenos con hidroxilos. La oxidacion de Lys, Arg, Trp, Thr, Phe e His se muestra en la Fig. 1. Las cadenas laterales experimentan las mismas transformaciones si estos AA forman parte de polipeptidos/protemas. Otros AA esenciales sometidos a oxidacion impulsada por ROS incluyen Leu (a 5- hidroxileucina), Val (3-hidroxivalina) y lie (varios productos).
Otros tipos de danos oxidativos que afectan a los AA esenciales implican especies reactivas de nitrogeno (RNS). En la Fig. 2, se muestran ejemplos.
Otro proceso mas que es perjudicial para las protemas es una escision de enlaces peptfdicos conducida por ROS, que esta precedida por la oxidacion de las protemas mediada por radicales libres de oxfgeno. Un atomo de hidrogeno se extrae de un atomo Ca de la cadena polipeptfdica, lo que conduce a la formacion de un radical alcoxilo. Esto puede conducir al derivado proteico del hidroxilo o a la escision del enlace peptfdico por (1) diamida o (2) la ruta de la a-amidacion. Esto se ilustra en la Fig. 3.
Los acidos nucleicos normalmente no se consideran componentes esenciales de la dieta, pero tambien son danados por las ROS. Un ejemplo particularmente importante para el funcionamiento mitocondrial es la formacion de 8-oxi-G, como se ilustra en la Fig. 4. Esto conduce a mutaciones en el genoma mitocondrial, que no se mantiene ni se repara tan eficazmente como el genoma nuclear, con consecuencias perjudiciales para la eficiencia de los procesos respiratorios en la celula. Otra causa de degradacion es la radiacion.
El efecto isotopico cinetico se usa ampliamente para dilucidar los mecanismos y las etapas determinantes de la velocidad de las reacciones qmmicas y bioqmmicas. La velocidad de reaccion que implica la escision del enlace C- 1H es normalmente de 5 a 10 veces mas rapida que la escision del enlace C-2H (2H-D = deuterio) correspondiente, debido a una diferencia del doble en las masas de los isotopos H y D. La diferencia en las velocidades de reaccion es aun mayor para el tritio (3H o T), ya que es 3 veces mas pesado que el hidrogeno, pero ese isotopo es inestable.
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El segundo componente del enlace C-H, el atomo de carbono, tambien se puede sustituir por un isotopo 13C mas pesado, pero la disminucion de la velocidad de escision del enlace sera mucho menor, ya que 13C es solo una fraccion mas pesada que 12C. Vease Park et al., JACS (2006) 128: 1868-72.
Las reacciones de oxidacion son un buen ejemplo del efecto isotopico, ya que la sustraccion de hidrogeno por un oxidante normalmente es una etapa limitante de la velocidad del proceso. Darngaard, Biochemistry (1981) 20: 566269, ilustra esto: el efecto isotopico cinetico sobre V/K para la oxidacion de (1-R)[1-2H2]- y (1-R)[1-3H2]-etanol por la alcohol deshidrogenasa del hngado (ADH) a acetaldehfdo, medida a pH 6, fue de 3 (D(V/K)) y 6,5 (T(V/K)), disminuyendo hasta 1,5 y 2,5 respectivamente a pH 9. Las velocidades mas bajas de lo esperado confirman la distinta funcion de los sistemas no ADH como rutas alternativas. Experimentos in vivo en hngado de rata perfundido, como se describe en Lundquist et al., Pharm. & Tox. (1989) 65: 55-62, dieron el valor medio de D(V/K) de 2,89. Por lo tanto, en todos los casos, la oxidacion de etanol deuterado se ralentizo sustancialmente.
Se ha administrado material marcado isotopicamente a animales, y tambien a seres humanos, con fines de diagnostico. Gregg et al., Life Sciences (1973) 13: 755-82, desvelan la administracion a ratones destetados de una dieta en la que la fraccion de carbono digerible contema un 80 % de atomos de 13C. El aditivo era acido acetico marcado con 13C. El examen de tejidos no revelo anomalfas claramente atribuibles al alto enriquecimiento isotopico.
El documento US2006/0035382A1 desvela un metodo de metabolomica de RMN para la observacion de un animal mediante el marcaje del animal con un isotopo estable. El animal se produce mediante su alimentacion con comida marcada con el isotopo estable.
Sumario de la invencion
La presente invencion se basa en la realizacion de que la sustitucion isotopica puede usarse para sintetizar una clase de compuestos que, cuando se ingieren, producen la formacion de constituyentes corporales (por ejemplo, protemas, acidos nucleicos, grasas, hidratos de carbono, etc.) que son funcionalmente equivalentes a los constituyentes corporales normales, pero que tienen una mayor resistencia a los procesos de degradacion/perjudiciales, por ejemplo, los mediados por ROS y RNS o radiacion. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invencion, una composicion nutritiva comprende un nutriente esencial en el que al menos un atomo de H intercambiable es 2H y/o al menos un atomo de C es 13C.
Los compuestos para su uso en la invencion son identicos a los nutrientes o constituyentes normales de los alimentos, excepto que contienen isotopos estables que, cuando se incorporan en los constituyentes corporales, hacen que dichos constituyentes corporales sean mas resistentes a los procesos de degradacion de lo que senan de otro modo. Proporcionan un metodo de proteccion de la funcionalidad preferida de biomoleculas naturales; el metodo comprende el suministro de un compuesto de manera que se incorpore a las biomoleculas y, al hacerlo, confiere propiedades a la biomolecula que protegen frente a las alteraciones qrnmicas nocivas o perjudiciales.
Los compuestos para su uso en la invencion se sintetizan qmmicamente y, cuando son ingeridos por un organismo, y se metabolizan de modo que se produce la incorporacion del compuesto a una biomolecula funcional; haciendo la incorporacion del compuesto que la biomolecula tenga un mayor grado de resistencia a los cambios moleculares perjudiciales que el caso de la biomolecula equivalente que no comprendfa el compuesto. Dichos compuestos pueden actuar como imitadores de elementos precursores naturales de biomoleculas. Pueden imitar a un aminoacido esencial. El organismo es normalmente una planta, un microbio, un animal o un ser humano.
Normalmente, un compuesto para su uso en la invencion, no es degradado por enzimas de la ruta P450. Por lo tanto, puede acumularse en un sujeto para el que sea esencial.
La invencion se define de acuerdo con las reivindicaciones anexas.
Descripcion de los dibujos
Cada una de las Fig. 1 a 4 muestran reacciones que degradan nutrientes esenciales.
Descripcion de la invencion
La presente invencion se refiere al hecho de que los complementos esenciales pueden experimentar transformaciones qrnmicas irreversibles, tales como oxidacion, nitracion, etc., que conducen a la aparicion de senescencia o enfermedades. Los componentes alimentarios esenciales no pueden ser sintetizados de novo por un organismo, por ejemplo, un mairnfero, primate o ser humano y, por lo tanto, necesitan ser suministrados con la dieta. Para los fines de la presente memoria descriptiva, un acido nucleico es esencial, aunque se puede describir mas adecuadamente como condicionalmente esencial. Los nutrientes condicionalmente esenciales se deben suministrar con la dieta en ciertas circunstancias.
Para los seres humanos, (hasta los cinco anos), 10 aminoacidos son esenciales, es decir, Phe, Val, Trp, Thr, lie,
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Met, His, Leu, Lys y Arg. Los nucleosidos de purina y pirimidina son condicionalmente esenciales. Los acidos grasos esenciales son u>-3 y u>-6, mientras que el acido oleico monoinsaturado, en general, no es esencial.
De acuerdo con la presente invencion, se pueden ralentizar los efectos no deseados propuestos tales como el envejecimiento/las enfermedades. Los compuestos consumidos se deben modificar para ralentizar las reacciones no deseadas, conservando al mismo tiempo su identidad qmmica. En una realizacion esto se puede conseguir sustituyendo atomos de hidrogeno sometidos a abstraccion durante la oxidacion/sustitucion oxidativa en los sitios de carbono mas reactivos, o en los sitios que se sabe que sufren dano infligido por ROS/RNS, como se ilustra en las Fig. 1-4, con deuterios, que, debido al efecto isotopico, disminuyen la velocidad de las reacciones. La sustitucion de los atomos de carbono en lugar de, o ademas de, la sustitucion de los atomos de H, puede requerir un mayor grado de sustitucion, ya que no se anade tanto a la disminucion de la velocidad de reaccion (D es el doble del peso de H, y 13C es menos del 10 % mas pesado que 12C).
Dependiendo en parte del metodo de preparacion, un compuesto para su uso en la invencion puede comprender una sustitucion isotopica parcial o total. Por ejemplo, la sustitucion de deuterio puede estar solamente en uno o dos atomos de hidrogeno que se consideran intercambiables qmmicamente, por ejemplo, en OH o CH2 adyacente a un grupo funcional. La sustitucion de 13C total en lugar de parcial se puede lograr con mayor eficacia.
En una realizacion preferida de la invencion, los (o solamente los) hidrogenos sensibles a la oxidacion se deben sustituir con deuterios para reducir al mmimo el riesgo de que otros procesos metabolicos se ralenticen cuando se usen fragmentos de estos AA para construir otras estructuras. En casos especiales, para aumentar aun mas la resistencia a la oxidacion, se pueden sustituir tanto 1H como 12C de un enlace H-C por 2H y 13C. Para reducir al mmimo cualquier posible efecto negativo de los isotopos, tal como la ralentizacion no deseada de las reacciones bioqmmicas que utilizan fragmentos de AA protegidos con isotopos, preferentemente solo deben derivatizarse las partes mas sensibles de los AA, por ejemplo, los atomos de w de Lys y Arg. Los compuestos preferidos de este tipo son
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Si el estres oxidativo es tan grave que los beneficios de proteger los sitios vulnerables superan a los posibles efectos perjudiciales de ralentizar otras rutas metabolicas (como es el caso de algunas enfermedades), entonces se pueden emplear los AA protegidos con isotopos mas pesados, como se muestra en las siguientes formulas ilustrativas:
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Como todos los vertebrados han perdido la capacidad de sintetizar los AA esenciales y requieren el suministro externo de AA esenciales o de acidos grasos, son posibles formas no dolorosas de administrar los AA deuterados/deuterados y modificados con 13C en las fuentes de alimentacion para los seres humanos. Para los AA, un ejemplo de proceso es la creacion de levaduras/algas/bacterias/etc. deficientes en AA esenciales, cultivandolas sobre medios/sustratos apropiados "protegidos" isotopicamente y despues alimentando a peces o a ganado con la biomasa obtenida. Los peces o el ganado pueden despues introducirse en la cadena alimentaria de la manera normal. Otro ejemplo es la administracion directa de una pfldora/un complemento.
Los componentes no esenciales de los alimentos son los compuestos que pueden ser producidos por un organismo, tales como bases de acido nucleico, pero cuando estos se consumen como alimento, algunos de los componentes no esenciales se digieren/usan como precursores para otros compuestos, aunque una cierta fraccion se utiliza directamente en procesos metabolicos, por ejemplo, bases de acido nucleico (NA), incorporadas en el ADN. Por lo tanto, como ejemplo, algunas de las bases de NA suministradas con la comida pueden estar protegidas isotopicamente, como se muestra en las siguientes formulas ilustrativas:
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Dichas especies son menos vulnerables a la oxidacion tras su incorporacion al ADN. En otras palabras, se puede reducir la velocidad de oxidacion del ADN, incluyendo el ADN mitocondrial.
Tanto los componentes esenciales como los no esenciales pueden administrarse a traves de un sistema digestivo para conseguir un efecto deseado de ralentizacion de los cambios perjudiciales asociados con el proceso de envejecimiento y diversas enfermedades. Sin embargo, se pueden prever otros medios distintos del tracto digestivo, por ejemplo, la administracion por via intravenosa. El aspecto importante de cualquier sistema de administracion es conseguir que los compuestos manipulados isotopicamente se incorporen en los constituyentes corporales/bioqmmicos.
Una composicion de la invencion puede proporcionarse como cualquier complemento alimentario. Por lo general, ademas del componente esencial marcado isotopicamente, comprende uno o mas nutrientes. Puede comprender material vegetal, material microbiano o material animal. La composicion puede ser un producto alimentario normal, un comprimido u otro medicamento solido, o un lfquido inyectable u otro lfquido.
La composicion puede comprender compuestos no modificados ademas de los que han sido marcados. El compuesto marcado normalmente esta presente en una cantidad mayor y ciertamente superior a la que puede estar presente de manera natural.
Los compuestos para su uso en la invencion se pueden preparar mediante procedimientos que son conocidos o que pueden ser modificados segun sea apropiado por un experto en la materia. Por ejemplo, el analogo deuterado de Lys, acido 2,6-diaminohexanoico-6,6-D2, se puede sintetizar a partir de un nitrilo precursor mediante hidrogenolisis en D2 de acuerdo con procedimientos convencionales.
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El analogo deuterado de Arg, acido 2-amino-5-guanidinopentanoico-5,5-D2, se puede sintetizar a partir de un nitrilo correspondiente.
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NM —-------------------------- NH D D O
Acido 2-amino-4-ciano-butirico
Acido(S)-2-amino-5- guanidinopentanoico-5,5-D2
La ornitina-D2, obtenida mediante hidrogenolisis de una manera similar a la descrita anteriormente para Lys, se disolvio en agua y se mezclo con un volumen igual de O-metilisourea 0,5 M, pH 10,5, ajustado con NaOH. Despues de 4-5 h, se anadio TFA al 1 % para detener la reaccion. El compuesto se purifico mediante RP-HPLC (los tampones fueron A: TFA al 0,1 %/H2O; B: TFA al 0,1 %/(MeCN al 80 %/H2O al 20 %), B del 0 al 65 % durante 40 min. Vease Kimmel, Methods Enzymol. (1967), 11:584-589, y Bonetto et al., Anal. Chem. (1997), 69:13154319.
Los ciano-aminoacidos son precursores de aminoacidos. La smtesis de ciano-aminoacidos se puede llevar a cabo por varias rutas, partiendo de una variedad de precursores. Los alcoholes (Davis y Untch, J. Org. Chem. (1981), 46: 2985-2997), las aminas (Mihailovic et al., Tet. Lett. (1965) 461-464), las amidas (Yamato y Sugasawa, Tet Lett. (1970) 4383-4384) y la glicina (Belokon et al., JACS (1985) 107:4252-4259) pueden servir como materiales de partida en dichas smtesis. Algunos metodos pueden producir compuestos sustituidos tanto con 13C como con 2H, mientras que otros son solo compatibles con la deuteracion.
La deuteracion se puede llevar a cabo usando gas de deuterio (por ejemplo, como se describe en White et al., JACS (1994) 116:1831-1838) o diferentes compuestos deuteridos, por ejemplo, NaBD4 (Satoh et al., Tet. Let. (1969) 45554558); la eleccion entre estos metodos debe basarse en la disponibilidad y el precio de los derivados de deuterio correspondientes. Algunas de las estrategias ensayadas se describen en detalle a continuacion.
Los sitios que se van a proteger de los acidos grasos esenciales para el fin de la presente invencion son los grupos metileno de los sistemas 1,4-dieno (posiciones “bis-alilo”). Son los mas reactivos, y se pueden derivatizar facilmente usando una variedad de metodos. La bromacion de esta posicion seguida de la reduccion con 2H2 da lugar a la sustitucion de un hidrogeno cada vez. Para sustituir ambos, el procedimiento debe repetirse dos veces. Un metodo mas atractivo puede ser una sustitucion directa en una etapa en agua pesada. Un ejemplo de dicho intercambio se da a continuacion (Ejemplo 6) para la 8-deuteracion de la desoxiguanosina.
Un enfoque alternativo para la smtesis de acidos grasos insaturados deuterados se basa en un tratamiento con base fuerte de 1,4-dienos seguido de la inactivacion con agua pesada. Esto se ilustra en el Ejemplo 7.
Hay ejemplos en la literatura de las sustituciones en cualquier posicion de todas las bases de nucleotidos principales con todos los tipos principales de isotopos (2H2, 3H2, 13C, 14C, 15N, 18O etc.). A continuacion, se describen solo dos procedimientos basados en el trabajo previamente publicado para la deuteracion selectiva de las purinas (Esaki et al., Heterocycles (2005) 66:361-369 y Chiriac et al., Labeled Compd. Radiopharm. (1999) 42:377-385). Tambien son adecuados otros numerosos protocolos. A menudo es posible intercambiar hidrogenos por deuterios en una base de acido nucleico/nucleosido existente, mientras que para incorporar 13C, las bases se deben ensamblar (por ejemplo, vease Folesi et al., “Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids” (2000)).
Se conocen smtesis de algunos componentes dieteticos esenciales “reforzados” isotopicamente adecuados para su uso en la presente invencion; vease, por ejemplo, 6,6-2H2,1,1-13H2-L-Lys: Lichtenstein et al., J. Lipid Res. (1990) 31:1693-1701 y 8-deutero-desoxi-guanosina: Toyama et al., J. Raman Spectrosc. (2002)33: 699-708).
La invencion no esta limitada por los metodos de qmmica organica sintetica descritos anteriormente, ya que existe un gran arsenal de diferentes metodos que tambien se pueden usar para preparar los componentes anteriormente mencionados y otros componentes protegidos isotopicamente adecuados para su uso en la presente invencion. Por ejemplo, ademas de los metodos desvelados en los ejemplos, se pueden emplear otros metodos adecuados para la conversion de una funcion de grupo amino primario en una funcion CN (con el objetivo de la posterior deuteracion del atomo de carbono alfa (con respecto al N)), por ejemplo:
- una oxidacion directa por oxfgeno catalizada por un sistema de cloruro cuproso-dioxfgeno-piridina (Nicolaou et al., Synthesis (1986) 453-461; Capdevielle et al., Tet. Lett. (1990) 31: 3305-3308);
- una conversion directa usando bromosuccinimida (Gottardi, Monatsh. Chem. (1973) 104:1690-1695);
- una oxidacion directa de yodosobenceno (Moriarty et al., Tet. Lett. (1988) 29: 6913-6916);
- una conversion en dos etapas a traves de un derivado de ditosilo y un derivado de yodo (DeChristopher et al., JACS (1969) 91:2384-2385).
Los siguientes Ejemplos 1 a 9 ilustran la preparacion de materiales adecuados para su uso en la invencion.
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Los espectros de masas (MA)LDI-TOF se obtuvieron usando una estacion de investigacion de bioespectrometffa Voyager Elite (PerSeptive Biosystems, Vestec Mass Spectrometry Products) en un modo de iones positivos; los espectros de FAB se adquirieron usando un instrumento Varian. La cromatograffa analftica en capa fina se realizo en las placas de aluminio precocidas Kieselgel 60 F254 (Merck) o placas de aluminio precocidas oxido de aluminio 60 F254 (Merck), las manchas se visualizaron bajo UV o segun lo especificado. La cromatograffa en columna se realizo sobre gel de silice (Merck Kieselgel 60 0,040-0,063 mm) u oxido de aluminio (oxido de aluminio Aldrich, activado, neutro, Brockmann I, malla 150, 58 A).
Los reactivos para los experimentos biologicos, a menos que se especifique lo contrario, eran de Sigma-Aldrich. La 13C-glucosa era de Sigma y Reakhim (Rusia).
Los reactivos obtenidos de proveedores comerciales se usaron como se recibieron. Todos los disolventes eran de Aldrich; el acido trifluoroacetico procedfa de Pierce; los disolventes de calidad HPLC procedfan de Chimmed (Rusia), y se usaron sin purificacion adicional. El acido (S)-2-amino-5-cianopentanoico procedfa de Genolex (Rusia). El gas de deuterio se genero por electrolisis mediante un modulo de suministro de hidrogeno de GC (salida de 607,95 kPa [6 atm], Himelectronika, Moscu, Rusia), usando agua pesada como fuente. El agua pesada (2H2O, D2O), NaBD4 y Na13cN procedfan de Reakhim (Rusia) y Gas-Oil jSc (Rusia). La DMF se destilo recientemente bajo presion reducida y se almaceno sobre tamices moleculares de 4 A bajo nitrogeno. El DCM siempre se uso recien destilado sobre CaH2. El THF se destilo sobre LiAlH4.
Ejemplo 1 - Acido (S)-2-amino-4-ciano( C)-butirico (un precursor para C-Arg y C, H2-Arg)
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Se disolvieron 2,19 g (10 mmol) de N-Boc-homo-Serina (Bachem, desecada durante una noche sobre P2O5) en 10 ml de una mezcla de acetonitrilo/dimetilformamida (1:1). Se anadieron Na13CN seco (Gas-Oil JSC, Rusia, 1 g, 2 eqv) y Nal (10 mg, cat), y se desgasifico la mezcla. A continuacion, se anadio Me3SiCl (2,55 ml, 2 eqv) con una jeringa a TA bajo argon. Se agito la mezcla de reaccion bajo argon a 60 °C durante 6 h, controlando mediante TLC (cloroformo/metanol 2:1, visualizacion en vapor de yodo). Una vez finalizada, se enfrio la mezcla de reaccion a TA, se diluyo con agua (100 ml) y se extrajo con eter diefflico (2 x 50 ml). Se lavo la fase organica con agua (4 x 50 ml) y salmuera (50 ml), se seco (Na2SO4), se decanto y se concentro al vacfo, proporcionando (2,07 g, 91 %) de un aceite incoloro. La estructura del Boc-nitrilo se confirmo mediante MALDI-TOF (Voyager Elite, PerSeptive Biosystems), con HPA como matriz. Encontrado: 229,115 (Ml), 230,114 (Ml + H+), 252,104 (Ml + Na+). No se detectaron maximos relacionados con el material de partida.
Se llevaron a cabo la eliminacion del grupo protector Boc y el tratamiento usando un protocolo de smtesis de peptidos convencional (TFA al 50 % en DCM, 30 min, TA). La estructura del nitrilo se confirmo mediante MALDI-TOF (Voyager Elite, PerSeptive Biosystems) con HPA como matriz. Encontrado: 129,062 (Ml), 130,070 (Ml + H+). No se detecto ninguna senal relacionada con el material de partida.
Ejemplo 2 - Acido (S)-2-amino-4-ciano-butfrico (un precursor para 2H?-Arg)
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Se disolvieron 4,93 g (20 mmol) de N-Boc-L-Glutamina (Sigma) en 30 ml de THF anhidro, y se anadieron con agitacion a una mezcla de trifenilfosfina (10,49 g, 40 mmol, Aldrich) y 40 ml de tetraclorometano anhidro. Se agito la mezcla de reaccion con calentamiento suave durante 3 h (control mediante TLC, cloroformo/metanol 2:1, visualizacion en vapor de yodo), se enfrio y se separo por filtracion el precipitado de oxido de trifenilfosfina. Se diluyo el aceite obtenido tras la evaporacion y la reevaporacion con 15 ml mas de THF con 30 ml de agua. Se saturo la fraccion acuosa con salmuera, se lavo con eter diefflico (2 x 20 ml) y se acidifico a pH 3,5 con acido sulfurico. El producto se extrajo con acetato de etilo (2 x 20 ml). Se secaron las fracciones organicas combinadas (salmuera, Na2SO4), se decantaron y se evaporaron, dando 3,46 g (76 %) de aceite incoloro. La estructura del Boc-nitrilo se confirmo mediante MALDl-TOF (Voyager Elite, PerSeptive Biosystems), con HPA como matriz. Encontrado: 228,114 (Ml), 229,114 (Ml + H+), 251,103 (Ml + Na+). No se detectaron maximos relacionados con el material de partida.
La eliminacion del grupo protector de Boc y el tratamiento se llevaron a cabo usando un protocolo de smtesis de peptidos convencional (TFA al 50 % en DCM, 30 min, TA). La estructura del nitrilo se confirmo mediante MALDI-TOF (Voyager Elite, PerSeptive Biosystems) con HPA como matriz. Encontrado: 128,069 (MI), 129,075 (MI + H+). No se detecto ninguna senal relacionada con el material de partida.
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Se disolvio acido (S)-2-amino-5-cianopentanoico (Genolex, Rusia, 14,21 g, 100 mmol) en 100 ml de metanol. A esto, 10 se anadio mquel de Raney, preparado a partir de 4 g de aleacion (Ni al 30 %) de acuerdo con (Adkins H., et al., Org, Syntheses. Coll. Vol. Ill, 1955, pag. 180), y se agito la mezcla de reaccion bajo deuterio (10132,5 kPa [100 atm]) a 90 °C durante 24 h. (TLC: n-butanol-piridina-acido acetico-agua: 15-10-3-12; visualizacion por vapor de yodo y fluorescamina). Se filtro la mezcla de reaccion y se evaporo al vado. Se volvio a disolver el producto en agua-etanol (3:1, 20 ml), seguido de la evaporacion al vado (x4) y luego se cristalizo en acetato de etilo, dando 11,55 g (78 %) 15 del producto deuterado. La estructura de la lisina deuterada fue confirmada por MALDI-TOF (Voyager Elite, PerSeptive Biosystems), con HPA como matriz. Encontrado: 148,088 (MI); 149,089 (MI + H+).
Ejemplo 4 - (5-13C.5.5-?H?)-Arginina
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Se disolvieron acido (S)-2-amino-4-ciano(13C)-butmco (182 mg, 1,41 mmol) y CoCl2 x 6H2O (Aldrich, 670 mg, 2,82 mmol) en agua (6 ml), y se anadio NaBD4 (Reakhim, Rusia; 540 mg. 14,1 mmol) en dos porciones durante 20 min. Se redujo el nitrilo en 30 min (control mediante TLC: n-butanol-piridina-acido acetico-agua: 15-10-3-12; 25 deteccion de fluorescamina/UV para aminoacidos protegidos con Boc, visualizacion de vapor de yodo para aminoacidos no protegidos).
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-Ah rs D' P 13 A 0 MH MeO^NH? HN D D O
1 NHS NHj
Acido (S)-2-amino-4-ciano(,sC)- butirico
Acido (S)-2-amino-5-guanidino- pentanoico-5-13C,5,5-D2
Se inactivo la mezcla de reaccion mediante acidificacion (HCl 1 M) seguida de acetona, y se purifico mediante intercambio ionico (Amberlite IR120P (H+), Aldrich). Se lavo la columna con agua hasta un pH neutro. A 30 continuacion se recupero el producto lavando la columna con NH4OH (0,3 M) seguido de la evaporacion. Se disolvio la ornitina -13C,2H2 resultante (rendimiento: 158 mg, 83 %; MALDI-TOF (Voyager Elite. PerSeptive Biosystems), con matriz HPA; encontrado: 135,071 (MI), 136,068 (MI + H+) en agua y se mezclo con un volumen igual de O- metilisourea 0,5 M (Kimmel, supra), pH 10,5, ajustada con NaOH. Tras 4-5 h, se anadio TFA al 1 % para detener la reaccion (Bonetto et al., supra). El compuesto se purifico mediante RP-HPLC (los tampones fueron A: TFA al 35 0,1 %/H2O; B: TFA al 0,1 %/(MeCN al 80 %/H2O al 20 %), B del 0 al 65 % durante 40 min, dando 140 mg (68 %);
MALDI-TOF (Voyager Elite, PerSeptive Biosystems), con matriz HPA; encontrado: 177,402 (MI), 178,655 (MI + H+).
Ejemplo 5 - (5.5-?H?)-Arginina
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MeBOj
Acido S)-2-amino-5-guamdino-
Acido (S)-2-amino-4-ciano-
pentanoico-5,5-D2
butinco
El compuesto del tftulo se sintetizo usando el protocolo anterior, partiendo del acido (S)-2-amino-4-ciano-butmco (Technohim, Rusia). MALDI-TOF (Voyager Elite, PerSeptive Biosystems), con matriz HpA; encontrado: 176,377 (MI), 177,453 (MI + H+).
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Ejemplo 6 - Acido 11.11-di-deutero-linoleico (18:2)
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Se disolvio acido linoleico (7 g, 25 mmol, Aldrich) en 25 ml de tetracloruro de carbono secado sobre P2O5. Se anadieron W-bromosuccinimida (4,425 g, 25 mmol, desecada durante la noche sobre P2O5) y 0,05 g de AIBN, y se agito la mezcla de reaccion en un matraz con un condensador inverso con calentamiento suave hasta que se inicio la reaccion segun lo manifestado por una ebullicion intensa (si el reflujo es demasiado intenso, el calentamiento debe disminuir). Cuando la succinimida dejo de acumularse en la superficie, se continuo el calentamiento durante otros 15 min (aproximadamente 1 h en total). Se enfrio la mezcla de reaccion hasta la TA, y se separo el precipitado por filtracion y se lavo con CCl4 (2 x 5 ml). Se evaporaron las fracciones organicas combinadas, y se anadio el acido 11-bromolinoleico obtenido gradualmente a una solucion de NaBD4 (390 mg, 10 mmol) en 30 ml de isopropanol. Despues de una agitacion durante la noche, se anadio lentamente una solucion diluida de HCl hasta que no se produjo mas gas de deuterio. Tras un tratamiento convencional, se bromo el acido mono-deuterado y se redujo de nuevo, proporcionando un derivado di-deuterado diana (p.e. 230-231 °C/15 mm; 4,4 g; 63 %). mAlDI-TOF MS: derivado de mono-bromo; encontrado: 358,202; 360,191 (doblete, aproximadamente 1:1, MI); derivado di-deuterado, encontrado: 282,251 (MI).
Ejemplo 7
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Se sintetizo acido 11,11-D2-linoleico (18:2) tratando el acido linoleico con un equivalente de una mezcla de BuLi- tBuK (Sigma-Aldrich) en hexano, seguido de la inactivacion con D2O. Para mejorar los rendimientos, este procedimiento debe repetirse 3-4 veces. Se encontro que este procedimiento tambien genera una cantidad detectable de producto alfa-deuterado (FAB MS, iones Xe, tioglicerina: encontrado: 283,34 (72; MI + 1)+, 284,33 (11; derivado alfa-monodeuterado, MI + 1)+, 285,34 (10; derivado alfa-dideuterado, MI + 1)+; la naturaleza de los maximos de “284” y “285” se establecio usando MS/MS. La sustitucion en la posicion alfa se puede prevenir utilizando proteccion de orto-ester transitoria (Corey y Raju, Tetrahedron Lett. (1983) 24: 5571), pero esta etapa encarece la preparacion.
Ejemplo 8 - 8-D-Desoxiguanosina a partir de desoxiguanosina
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Se disolvio desoxiguanosina (268 mg, 1 mmol, Aldrich) en 4 ml de D2O. Se anadio Pd/C al 10 % (27 mg, 10 % en peso del sustrato, Aldrich), y se agito la mezcla a 160 °C en un tubo sellado bajo atmosfera de H2 durante 24 h.
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Despues de enfriar hasta la TA, se filtro la mezcla de reaccion usando un filtro de membrana (Millipore Millex®-LG). Se lavo el catalizador filtrado con agua hirviendo (150 ml), y se evaporaron las fracciones acuosas combinadas al vado, dando desoxiguanosido-d en forma de un solido blanco (246 mg, 92 %). La estructura del nucleosido se confirmo mediante MALDI-TOF (Voyager Elite, PerSeptive Biosystems), con HPA como matriz. Encontrado: 268,112 (MI).
Ejemplo 9 - 8-D-desoxiguanosina a partir de 8-bromodesoxiguanosina
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Se anadio catalizador de Pd/C al 7 %, preparado a partir de PdCh como se describe en Chiriac et al., (1999) 42: 377-385, a una solucion de 8-bromodesoxiguanosina (Sigma) y NaOH en agua. Se agito la mezcla en D2 (202,65 kPa [2 atm]) a 30 °C. Se separo el catalizador por filtracion, y la mezcla de reaccion se neutralizo con HCl 2
N. El procedimiento proporciona un rendimiento del aproximadamente 85-90 % del producto. Se pueden emplear otros agentes reductores, tales como NaBD4 (vease la smtesis de acido D,D-linoleico).
Los siguientes Ejemplos 10 a 12 ilustran la utilidad de la invencion. Con el fin de establecer un intervalo de posibles sustituciones de isotopos pesados para la invencion (del isotopo ligero al 100% al isotopo pesado al 100%, asf como la proteccion localizada del sitio, como se muestra en las Fig. 1-4, usando compuestos como los mostrados anteriormente), y para ensayar la posible toxicidad de grandes cantidades de isotopos pesados en un organismo, se ensayo la influencia del carbono pesado (13C) y bloques de construccion espedficamente “protegidos” de biopolfmeros (componentes de acido nucleico (nucleosidos), lfpidos y aminoacidos) en la esperanza de vida de un nematodo Caenorhabditis elegans.
Estudios previos del organismo modelo C elegans han empleado casi exclusivamente el cultivo en una dieta bacteriana. Dicho cultivo introduce el metabolismo bacteriano como una preocupacion secundaria en los estudios toxicologicos de farmacos y medio ambiente (pueden emplearse cepas bacterianas deficientes en metabolitos espedficos para evaluar la influencia de determinados nutrientes esenciales sobre la longevidad de los nematodos). El cultivo axenico de C. elegans puede evitar estos problemas, sin embargo, algunos trabajos previos sugieren que el crecimiento axenico no es saludable para C. elegans. (Szewczyk et al., Journal of Experimental Biology 209, 4129-4193 (2006)). Para la presente invencion, se emplearon dietas tanto de NGM como axenicas en combinacion con componentes nutraceuticos enriquecidos isotopicamente.
Ejemplo 10
Se uso 13C6-glucosa (99 % de enriquecimiento; Sigma) como fuente de alimentacion de carbono para el cultivo de Escherichia coli; el control era identico excepto para 12C6-glucosa. Se cultivaron C. elegans (N2, tipo silvestre) sobre un medio convencional (peptona, sales y colesterol) sembrado con Escherichia coli preparado como se ha descrito anteriormente. El unico componente que contema carbono aparte de E. coli era 12C-colesterol (Sigma; un precursor hormonal que es esencial para C. elegans), puesto que el derivado de 13C correspondiente no estaba disponible. Por lo tanto, los nematodos se cultivaron en una dieta "pesada" y "ligera" (control) en el intervalo de temperaturas de 15 a 25 °C, en agrupaciones de 50-100 gusanos cada una. Los animales de ambas dietas se desarrollaron normalmente con todas las caracteristicas principales muy similares.
Los datos de longevidad se analizaron usando el paquete de software Prism (software GraphPad, EE.UU.), de acuerdo con procedimientos publicados (Larsen et al., Genetics 139: 1567 (1995)). Se encontro que los animales de la dieta "pesada" tienen un aumento de la esperanza de vida del aproximadamente 10 % (en un experimento tfpico, 14 dfas para los animales de 12C frente a 15,5 dfas para los gusanos alimentados con 13C, a 25 °C).
Ejemplo 11
Se adapto la composicion basica de los medios axenicos usados de (Lu y Goetsch, Nematologica (1993) 39:303311). Se prepararon componentes hidrosolubles y solubles en TEA (vitaminas y factores de crecimiento), sales, aminoacidos no esenciales, sustituyentes de acido nucleico, otros factores de crecimiento y la fuente de energfa como se describe (0,5 l de x 2). A esto, se anadio una mezcla de aminoacidos esenciales, que contema (para 0,5 l como x 2): 0,98 g de L-(D2)-Arg (vease anteriormente); 0,283 g de L-Hys; 1,05 g de L-(D2)-Lys (vease mas abajo);
O, 184 g de L-Trp; 0,389 g de L-Met; 0,717 g de L-Thr; 1,439 g de L-Leu; 0,861 g de L-IIe; 1,02 g de L-Val y 0,623 g de L-Phe. Antes de la adicion del resto de componentes, se agito esta mezcla a 55 °C durante 4 horas hasta que se
formo una solucion transparente, y despues se enfrio hasta la temperatura ambiente.
Se cultivaron C. elegans (N2, tipo silvestre) sobre un medio. Para el experimento de control, los nematodos se cultivaron en un medio preparado como anteriormente, pero que contema L-Arg y L-Lys convencional en lugar de los 5 analogos deuterados, en el intervalo de temperaturas de 15 a 25 °C, en agrupaciones de 50-100 gusanos cada una. Los datos de longevidad se analizaron usando el software Prism, como se describe en el Ejemplo 10.
Ejemplo 12
10 Se enriquecio una dieta de 12C-NGM con 5,5-di-deutero-arginina y 6,6-di-deutero-lisina, acido 11,11-di-deutero- linoleico (18:2) y 8-D-desoxiguanosina. Se cultivaron C. elegans sobre un medio convencional (peptona, sales y colesterol) sembrado con Escherichia coli preparado como se ha descrito anteriormente, a lo que se anadieron derivados “reforzados” con deuterio (vease lo expuesto anteriormente), a una concentracion total de 1 g/l de cada compuesto deuterado. De este modo, los nematodos se cultivaron sobre una dieta “pesada” y “ligera” (control - 15 mediante el que se usaron L-arginina, L-lisina, acido linoleico (18:2) y desoxiguanosina no deuterados en lugar de analogos deuterados a concentraciones de 1 g/l) en el intervalo de temperaturas de 15 a 25 °C, en agrupaciones de 50 a 100 gusanos cada una. Los datos de longevidad se analizaron usando el paquete de software Prism, como se describe en el Ejemplo 10.

Claims (12)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    REIVINDICACIONES
    1. Una composicion nutritiva para su uso en un metodo de aumento de la resistencia a procesos perjudiciales o degradantes mediados por especies reactivas de oxfgeno, especies reactivas de nitrogeno o radiacion, que comprende:
    un nutriente esencial, que es un acido graso, un acido nucleico, un nucleotido, un aminoacido o un peptido, en el que al menos un H intercambiable es ~H o al menos un atomo de C es 13C; en el que el nutriente esencial se sintetiza qmmicamente y se modifica isotopicamente;
    en el que el nutriente esencial se incorpora en un constituyente corporal a un organismo cuando es ingerido por el organismo; y
    en el que el organismo es un ser humano o un animal.
  2. 2. La composicion para el uso de la reivindicacion 1, siendo esta una composicion inyectable.
  3. 3. La composicion para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el nutriente esencial es o comprende un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en Phe, Val, Trp, Thr, lie, Met, His, Leu, Lys y Arg.
  4. 4. La composicion para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el nutriente esencial es acido graso u>-3 u u>-6.
  5. 5. La composicion para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el nutriente esencial es acido 11,11-D2-linoleico.
  6. 6. La composicion para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el 2H reemplaza a un hidrogeno sensible a la oxidacion del nutriente esencial.
  7. 7. La composicion para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el nutriente esencial es 2,6- diaminohexanoico-6,6-D2.
  8. 8. La composicion para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el nutriente esencial es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en:
    imagen1
    COOH
    H
    Up-0
    rhr-D
    rnnu
    COOH
    imagen2
    PtifrDl
    kis-D
    HN PD O
    imagen3
    NH?
    imagen4
    Lys-p31*C2 Arg-D3'»C2 Tro-D^C*
    Val-03l3Q3 Thr-iy^ .
    una base de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:
    imagen5
    5 un acido graso es un acido graso w-3 y w-6 que tiene una sustitucion parcial o total de deuterio.
  9. 9. La composicion para el uso de la reivindicacion 6, en la que la oxidacion es carbonilacion enzimatica.
  10. 10. La composicion para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores para ralentizar el envejecimiento.
    10
  11. 11. La composicion para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el nutriente esencial no es degradado por enzimas de la ruta P450.
  12. 12. La composicion para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en forma de una pfldora.
    15
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