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Verfahren zur Herstellung von Cystin Die Bedeutung von Cystein und
Cystein-Hydrochlorid ist bekannt. Ebenso weiß man, daß das Cystein, besonders auf
Grund seiner großen Löslichkeit, nur sehr schwer zu isolieren ist. Bei der synthetischen
Herstellung des Cysteins empfiehlt es sich daher, zuerst Cystin zu synthetisieren
und anschließend dieses Disulfid zu reduzieren.
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Die Synthese von Cystin sowie von Cystein war bereits das Ziel zahlreicher
Arbeiten. Wood und du V i gn e au d (J. Biol. Chem., 131 [1939], S. 267 bis 271)
kondensierten Natriumphthalimidomalonsäureester mit Benzylmercaptochlormethan nach
folgender Gleichung:
Durch Hydrolyse und Decarboxylierung dieser Verbindung erhält man das S-Benzylderivat
von Cystein, das in flüssigem Ammoniak mit Natrium unter Bildung von Cystein reduziert
wird, das durch Oxydation Cystin ergibt.
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Auch wurde der Vorschlag gemacht (Crawhall und Elliolt, J. Chem. Soc.,
1951, S. 2071 bis 2077), eine Oxymethylgruppe an den Thiobenzamidomalonsäureäthylester
zu binden, anschließend die Methylolverbindung zu einem Thiazolin zu dehydratisieren
und dieses schließlich in Cystein umzuwandeln. Nadeau und Gaudry (Can. J. Research,
1949, 27, S. 421) wendeten zur Herstellung von Cystein das Verfahren zur Synthese
von a-Aminosäuren nach B ü c h e r e r (J. Prakt. Chem., 140 [1934], S. 291, und
141 [1934], S. 5) an. Aus dem Diäthylacetal des Benzylmercaptoacetaldehyds wurde
das Benzylmercaptomethylhydantoin hergestellt, dessen Hydrolyse S-Benzylcystein
lieferte.
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Atkinson, Poppeldorf und Williams (J. Chem. Soc.,1935, S. 580) stellten
S-Benzylcystein aus Acetamidomalonsäurediäthylester nach einem komplizierten Verfahren
her, das die Herstellung des a-Acetamido-a-dimethylaminomethyl-malonsäurediäthylesters,
die Umwandlung dieser tert.-Aminoverbindung in das Jodmethylat und die Umsetzung
des Jodmethylats mit Natriumbenzylmercaptid unter Bildung von Acetamidobenzylmercaptomethylmalonsäurediäthylester
umfaßt, der durch Decarboxylierung S-Benzylcystein liefert.
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Ferner seien anschließend die Synthesen, ausgehend von Serin von Erlenmeyer
(Berichte der deutsch. chem. Ges., 36 [1903], S. 2720, und Ann., 337, S. 236), Fry
(J. Organ. Chem., 15 [1950], S. 438), Crawhall und Elliolt (J. Chem. Soc., 1951,
S. 2071), sowie die Synthesen aus Chloracrylnitril (G u n d e r m a n n, Angew.
Chem., 64 [1952], S. 594, und Ann., 578 [1952], S. 45), aus Chloracrylsäuremethylester
(Behringer und P. Zillikens, Ann. 574 [1951], S.140), aus a-Acetamidoacrylsäure
(Schörbel und Wagner, Naturwiss., 34 [1947] S. 189, und Farlow, J. Biol. Chem.,
176 [1948], S. 71), aus Oxazolonen (C. R. Acad. Sci., 240 [1955], S. 208 bis 210)
und
aus der a Acetamidoacrylsäure über den N-Benzylmercaptocarbonylaminomalonsäurediäthylester
(Arnstein und Crawhall, J., 55 [1953], S. 280 bis 285) genannt.
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Der größte Teil dieser Synthesen führt zum S-Benzylcystein, und man
begegnet so dem Problem, das Wood und du V ign e au d gelöst haben. Die von diesen
Autoren angewandte Reduktion, d. h. die Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak,
ist jedoch ein Laboratoriumsverfahren, das auf wirtschaftliche Weise nicht in technischem
Maßstab übertragen werden kann.
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Es wurde nun gefunden, daß man ein Gemisch aus d,1-Cystin und Mesocystin
leicht und mit guten Ausbeuten herstellen kann, indem man zuerst ein Bis-(ß-amino-ß,ßdicarbalkoxyäthyl)-disulfid
mit freien oder blockierten Aminogruppen herstellt und dieses Disulfid nach einem
bekannten Verfahren einer decarboxylierenden Hydrolyse unterwirft.
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Man kann z. B. ein Bis-(ß-acylamido-ß,ß-dicarbalkoxyäthyl)-disulfid,
insbesondere Bis-(ß-acetamido-ß,ß-dicarbäthoxyäthyl)-disulfid
herstellen, indem man ein Natrium- oder Kaliumderivat eines Acylamidomalonsäuredialkylesters,
insbesondere des Acetylamidomalonsäurediäthylesters, mit einem Bis-halogenmethyldisulfid,
insbesondere mit Bis-chlormethyldisulfid in wasserfreiem, organischem Medium, vorzugsweise
in Benzol oder Toluol, im Molverhältnis 2:1 kondensiert.
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Bei Verwendung von Acetylamidomalonsäurediäthylester als Ausgangsmaterial
tritt das erhaltene Disulfid wahrscheinlich zusammen mit den Produkten einer partiellen
Hydrolyse auf, insbesondere mit dem Bis-(ß-acetamido-ß-carboxy-ß-carbäthoxyäthyl)-disulfid,
und der aza-lactonisierten Verbindung
Es wurde gefunden, daß bei der Herstellung von Cystin eine Abtrennung des Bis-(ß-acetamido-ß,ß-dicarbäthoxyäthyl)-disulfids
von den Produkten der partiellen Hydrolyse, die es begleiten können, nicht erforderlich
ist. Man kann, und zwar mit Vorteil, das Rohprodukt aus der vorstehenden Kondensationsreaktion
nach einfacher Abtrennung des organischen Mediums, in dem es gebildet wurde, als
Ausgangsmaterial verwenden. Es genügt z. B., den größten Teil des Benzols durch
Destillation bei Normaldruck und die letzten Spuren durch Vakuumdestillation auszutreiben,
wonach die decarboxyherende Hydrolyse im Destillationsgefäß selbst vorgenommen werden
kann.
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Zur Umwandlung des Disulfids oder des oben beschriebenen Gemisches
aus den Disulfiden in Cystin unter Abspaltung von Alkohol und Kohlendioxyd sowie
Freisetzung der Aminogruppen kann man das Produkt erfindungsgemäß mit verdünnter
Salzsäure kochen. Zur Abtrennung des entstandenen Cystins wird das rohe Reaktionsprodukt
nach dem Filtrieren neutralisiert, anschließend wird der Niederschlag isoliert und
gereinigt.
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Auf diese Weise gewinnt man optisch inaktives Cystin zusammen mit
dem isomeren Mesocystin. Falls erwünscht, kann man die beiden Verbindungen, z. B.
nach dem Verfahren von Loring und du Vigneaud (J. Biol. Chem., 102 [19331, S. 287)
voneinander trennen.
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Das beschriebene Verfahren bietet den Vorteil, daß es die Herstellung
von Cystin auf eine sehr einfache und quantitative Weise gestattet ohne eine zusätzliche
Behandlung, die die Ausführung in technischem Maßstab verbieten würde. Geht man
von N atriumacetamidomalonsäurediäthylester und Bis-chlormethyldisulfid aus, so
beträgt die Ausbeute an Cystin, bezogen auf das Disulfid, im allgemeinen etwa 70
bis 750/,.
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Ferner wurde gefunden, daß die Kondensation viel schneller verläuft,
wenn man die Umsetzung des Natrium-oder Kaliumderivates des Acylamidomalonsäuredialkylesters,
insbesondere eines Acylamidomalonsäurediäthylesters oder des Aminomalonsäuredialkylesters,
insbesondere des Aminomalonsäurediäthylesters, mit einem Bis-halogenmethyldisulfid,
insbesondere Bis-chlormethyldisulfid, statt in einem aromatischen Kohlenwasserstoff,
in absolutem Äthanol durchführt.
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Außerdem wurde gefunden, daß von den Bis-(ß-acylamido-ß,ß-dicarbalkoxyäthyl)-disulfiden
die Bis-ß-formamido-ß,ß-dicarbalkoxyäthyldisulfide, insbesondere das Bis-(ß-formamido-ß,ß-dicarbäthoxyäthyl)-disulfid
und das Bis-(ß-acetamido-ß,ß-dicarbäthoxyäthyl)-disulfid besonders gut als Ausgangsmaterialien
für die Cystinsynthese geeignet sind, da bei ihnen die decarboxylierende Hydrolyse
viel rascher - im Verlauf weniger Stunden - als bei verschiedenen anderen Disulfiden
mit aminierten oder amidierten Gruppen verläuft, bei denen mehrere Tage benötigt
werden.
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Bei der Synthese von Cystin stellt man zweckmäßigerweise ein Bis-(ß-acylamido-ß,ß-dicarbalkoxyäthyl)-disulfid
oder ein Bis-(ß-amino-ß,ß-dicarbalkoxyäthyl)-disulfid, vorzugsweise Bis-(ß-formamido-ß,ß-dicarbäthoxyäthyl)-disulfid,
in absolutem Äthanol her und vertreibt anschließend das Äthanol durch Destillation.
Dann wird die decarboxylierende Hydrolyse des Destillationsrückstandes unter sauren
Bedingungen nach bekannten Verfahren vorgenommen; zur Durchführung der Hydrolyse
kann man allgemein eine starke Säure in verdünntem Zustand verwenden (wäßrige Lösung
mit einem Titer zwischen 5 und 30 A0) und den Destillationsrückstand mit dieser
Säure kochen; vorzugsweise verwendet man 25 °/jge Salzsäure.
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Es wurde gefunden, daß sich durch Zusatz geringer Mengen Essigsäure
zu der vorstehend genannten Säure, vorzugsweise etwa 5 bis 50 °/o, bezogen auf die
25 ° /oige Säurelösung - anscheinend auf Grund des Lösungsvermögens der Essigsäure
für das der Hydrolyse ausgesetzte Disulfid-,die Decarboxylierungsgeschwindigkeit
wesentlich erhöhen läßt. Bei Zusatz von mehr als 701)/, Essigsäure dagegen wird
die Decarboxylierung nicht mehr begünstigt, sondern vielmehr gebremst. Die optimale
Menge an Essigsäure kann in jedem Fall durch Versuche ermittelt werden; so betragen
die wirksamsten Zusätze (bezogen auf 25 0%ige Salzsäure) etwa 5 bis 150/,
für die Formamidverbindung, 20 bis 30 °;'o für die Benzamidverbindung und 30 bis
50 % für die Phthalimidverbindung. An Stelle von Essigsäure ist auch Dioxan
verwendbar, das jedoch den Nachteil hat, teurer zu sein.
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Die Vorteile der direkten Hydrolyse des Zwischenproduktes der Umsetzung
in Äthanol ohne vorhergehende Reinigung entstehen daraus, daß die Verfahrensschritte
vereinfacht und Verluste vermieden werden und
daß in den Mutterlaugen
der Kristallisation der Zwischenprodukte häufig unkristallisierbare Sirupe vorliegen,
die jedoch bei der decarboxylierenden Hydrolyse ebenfalls noch Cystin liefern.
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Arbeitet man auf diese Weise ohne Abtrennung eines reinen Zwischenproduktes,
so kann man das Cystin in einer Ausbeute von etwa 80 bis 85 % erhalten.
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In den folgenden Beispielen sind alle Schmelzpunkte mit dem Thielerohr
gemessen.
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Beispiel 1 Man verwendet reines Bis-chlormethyldisulfid CICH2-S-S-CH,C1,
das z. B. nach Davies und Hambly, Australian J. Chem., 6 [1953', S. 152 bis 155,
hergestellt und gereinigt wurde; zur Erzielung eines hohen Reinheitsgrades muß dieses
Disulfid im Vakuum in einer hohen Kolonne, z. B. einer Vigreuxkolonne von 1,20 m
Höhe, rektifiziert werden.
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Der Natriumacetamidomalonsäurediäthylester kann durch Einwirkung von
Natrium auf Acetamidomalonsäurediäthylester in Xylol hergestellt werden; diese Reaktion
ist jedoch langsam und wenig zweckmäßig.
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Als vorteilhaft erwies sich dagegen folgendes Herstellungsverfahren:
In einem mit einem Rührer ausgestatteten Kolben werden 2,82 g Natrium in 50 ccm
wasserfreiem Äthanol (nach Vo gel, »A text book of practical organic chemistry u,
S. 165 bis 166, über Magnesium destilliert) gelöst. Danach setzt man nach und nach
26,65 g in 300 ccm wasserfreiem Benzol gelösten, wasserfreien Acetamidomalonsäurediäthylester
zu. Der Kolben wird sodann, zusätzlich zu dem Rührer, mit einem Kühler versehen,
der am Ende ein Calciumchloridrohr trägt. Nach 2stündigem Rühren bei Siedetemperatur
erscheint ein weißgelblicher Niederschlag. Man destilliert so lange, bis kein Alkohol
mehr im Destillat enthalten ist. Hierzu müssen etwa 200 ccm Lösungsmittel abdestilliert
werden.
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Dem Destillationsrückstand werden sodann 300 ccm wasserfreies Benzol
zugegeben; anschließend werden auf einmal 10 g des sorgfältig auf 1 c C genau rektifizierten
Bis-chlormethy ldisulfids zugesetzt. Das Gemisch wird 10 Stunden am Rückflußkühler
erhitzt. Ein bei gewöhnlicher Temperatur durchgeführter Versuch zeigte, daß die
Reaktion nach 15stündigem Rühren gleich Null war. Nach der Abkühlung bilden das
Benzol und die Reaktionsprodukte ein weißgelbliches Gel.
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Das Benzol wird bei gewöhnlichem Druck auf einem Ölbad abdestilliert;
durch Destillation bei vermindertem Druck (20 mm) erhält man 36 g eines weißen Produktes.
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In einen 250 ccm fassenden Kolben, der mit einem Kühler ausgestattet
ist, gibt man 10 g des nach Beispiel 1 nach Abdampfen des Benzols erhaltenen Produktes
sowie 100 ccm 25 0/0ige Salzsäure. Das Gemisch wird 6 Stunden oder besser 8 bis
10 Stunden zum Sieden erhitzt. Nach 5 Stunden ist eine vollständige Lösung des Produktes
erreicht. Nach der Abkühlung filtriert man die Lösung ab, um eine sehr geringe Menge
an unlöslichen Stoffen zu entfernen. Das farblose Filtrat wird mit Ammoniak neutralisiert
(Lackmus). :Man läßt die Lösung eine Nacht im Eisschrank stehen; der Niederschlag
wird abzentrifugiert, mit Wasser gewaschen und in 20 %igem Ammoniak gelöst. Die
erhaltene Lösung wird filtriert, und anschließend wird das Cystin durch Zusatz von
Essigsäure bis zum Neutralpunkt (Lackmus) ausgefällt. Das Cystin wird mit Eiswasser,
dann mit Alkohol und mit Äther gewaschen. Die Ausbeute beträgt 80 0/0, bezogen auf
das Zwischenprodukt. Die Verbindung schmilzt bei etwa 260° unter Zersetzung. Sie
ist absolut identisch mit optisch inaktivem Cystin.
| Analyse |
| Berechnet Gefunden |
| C 29,99% C 29,88 bis 29,840/0 |
| H 5,03 % H 4,90 bis 5,03 0/0 |
| N 11,66% N 11,74 bis 11,480% |
| S 26,69% S 26,83 bis 27,100/'o |
Das Produkt zeigt die gleiche Reaktion nach Sullivan wie d,1-Cystin und verhält
sich bei der Papierchromatographie wie nach anderen Verfahren hergestelltes d,l-Cystin
und Mesocystin.
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Durch Anwendung des von Loring und du Vigneaud in J. Biol. Chem.,
102 [1933], S. 287 beschriebenen Verfahrens ist das d,l-Cystin leicht vom
Mesocystin abtrennbar.
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Man kann auch die Betriebsbedingungen abändern. So ist es insbesondere
möglich, die decarboxylierende Hydrolyse mit stärker verdünnter Salzsäure, z. B.
mit 20 0/0iger Säure durchzuführen, bei der Herstellung des Bis-(ßacetylamido-ß,ß-dicarbäthoxyäthyl)-disulfids
das Benzol durch Toluol zu ersetzen, die Reaktion verläuft dann etwas schneller,
und ein Bis-(ß-amino-ß,ß-dicarbalkoxyäthyl)-disulfid zu verwenden, dessen Aminogruppen
frei oder durch eine andere Gruppe als die Acetylgruppe, insbesondere durch die
Formyl- oder Phthalylgruppe acyliert sind. Auch der Alkohol, mit dem die Carboxylgruppen
verestert sind, kann ein anderer als Äthylalkohol sein. Beispie12 In einen 500 ccm
fassenden Kolben, der mit einem mechanischen Rührwerk, einem Rückflußkühler, einem
Tropftrichter und einem Thermometer ausgestattet ist, gibt man 200 ccm absolutes
Äthanol und 4,6 g Natrium. Sobald die alkoholische Lösung eine Temperatur von 40'C
erreicht hat, setzt man 40,6 g in 100 ccm Äthanol gelösten Formamidomalonsäurediäthylester
zu.
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Das Gemisch wird eine halbe Stunde gerührt. Danach, wenn die Temperatur
30°C beträgt, führt man langsam 16,3 g Bis-chlormethyldisulfid zu und erhitzt das
Gemisch 1 Stunde am Rückflußkühler.
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Nach der Abkühlung wird das Gemisch zur Entfernung des entstandenen
Natriumchlorids filtriert.
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Der Alkohol wird im Vakuum abdestilliert. Zu dem gummiartigen Rückstand
werden 400 ccm 25 %ige Salzsäure und 20 ccm konzentrierte Essigsäure zugesetzt.
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Das Gemisch wird 4 bis 6 Stunden am Rückfluß erhitzt, bis zur Beendigung
der Kohlendioxyd-Entwicklung. Während der Hydrolyse wird das Reaktionsgemisch durch
Einleiten von Stickstoff gerührt. Sobald sich kein Kohlendioxyd mehr entwickelt,
wird die Lösung zur Entfernung des größten Teiles der Salzsäure zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wird in destilliertem Wasser aufgenommen und schließlich nach den
Angaben von Beispiel l behandelt.
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Je nachdem, ob man in Ab- oder Anwesenheit von Feuchtigkeit arbeitet,
erhält man das rohe Cystin nach der ersten Ausfällung mit Ammoniak in einer zwischen
60 und 85 0;'o schwankenden Ausbeute. Diese Ausbeute läßt sich immer erzielen, wenn
man mit absolut wasserfreien Lösungsmitteln und Ausgangsprodukten arbeitet. Die
Verwendung von Schwefelsäure zur decarboxylierenden Hydrolyse ist nicht vorteilhaft
wegen der Schwierigkeit, die die nachträgliche Entfernung dieser Säure bereitet.
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Die Decarboxylierungsgeschwindigkeiten scheinen dem Molekulargewicht
der verwendeten Verbindungen umgekehrt proportional zu sein.
Es
lassen sich auch andere Bis-(ß-Amino- oderß-Acylamido-ß,ß-dicarbalkoxyäthyl)-disulfide,
die oben erwähnten, in rohem oder gereinigtem Zustand verwenden.