DE102009035645A1

DE102009035645A1 - Verfahren zur Herstellung eines radioaktiv markiertren Peptids

Info

Publication number: DE102009035645A1
Application number: DE102009035645A
Authority: DE
Inventors: Markus Dr. Kinzl; Oliver Dr. Lade; Arno Dr. Steckenborn
Original assignee: Siemens AG
Current assignee: Siemens AG
Priority date: 2009-07-29
Filing date: 2009-07-29
Publication date: 2011-02-03
Also published as: CA2769395A1; RU2012107472A; EP2459504A1; WO2011012414A1; US20120232250A1; SG178137A1; CN102471178A; JP2013500295A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines radioaktiv markierten Peptids, bei dem ein Vorläufermolekül in einem organischen Lösungsmittel bereitgestellt wird; eine radioaktiv markierte Verbindung, die eine Carboxylfunktion aufweist, hinzugefügt wird; die Carboxylfunktion aktiviert wird; und die aktivierte radioaktiv markierte Verbindung mit dem Vorläufermolekül zu dem radioaktiv markierten Peptid verknüpft wird, wobei die radioaktiv markierte Verbindung eine Isocyanocarbonsäure ist. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer radioaktiv markierten Isocyanocarbonsäure zur Herstellung eines radioaktiv markierten Peptids.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das technische Gebiet radioaktiv markierter Kohlenstoffverbindungen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines radioaktiv markierten Peptids sowie die Verwendung einer radioaktiv markierten Isocyanocarbonsäure zur Herstellung eines radioaktiv markierten Peptids.
Die Entwicklung der Festphasen- und Flüssigphasenchemie ermöglicht heutzutage die Herstellung von sequenziell definierten Peptiden und Proteinen mit Molekulargewichten von 3.000–10.000 Da und Kupplungsausbeuten von mehr als 99,5%. Bei der 1963 von Merrifield konzipierten Festphasensynthese wird das zu synthetisierende Peptid über einen Linker, d. h. eine abspaltbare Ankergruppe, an ein unlösliches Trägerharz aus vernetztem Polymer gekoppelt. Die Aminosäuren werden in der gewünschten Sequenz nacheinander mit einem aktivierten C-Terminus und in großem Überschuss an die Aminofunktion, der jeweils letzten angehängten Aminosäure gekuppelt. Übrige Reaktanden und Nebenprodukte können aus dem Reaktionsgefäß gespült werden, da das Zwischenprodukt bzw. Produkt am unlöslichen Harz gebunden ist. Im letzten Schritt wird der Linker vom Harz abgespalten, sodass das Peptid frei vorliegt.
Sowohl die Festphasen- als auch die Flüssigphasenpeptidsynthese beruhen auf einer komplexen Schutzgruppenchemie. Die alpha-Aminoschutzgruppe der Aminosäure muss temporär für die Kupplung geschützt werden, da die Aminosäure sonst nach der Aktivierung der Carbonsäure mit sich selbst reagieren würde. Nach der Kupplung muss diese Schutzgruppe schnell und mild abgespalten werden, damit eine weitere Kupplung erfolgen kann.
Im Organismus physiologisch aktive Peptide und Proteine, in deren chemische Struktur ein oder mehrere Radionuklide eingebaut werden, liefern die Basis für die Herstellung von Radiopharmaka. Der Organismus unterscheidet zumindest bei chemisch identischen Radiopharmaka nicht zwischen Radiopharmaka und den entsprechenden nicht radioaktiv markierten Verbindungen, sodass Radiopharmaka physiologisch verstoffwechselt werden. Anhand des Zerfalls des Radionuklids kann das Radiopharmakon aufgespürt und optisch dargestellt werden.
Radioaktiv markierte Peptide sind wertvolle Tracer für die Positronen-Emissions-Tomographie (PET), einem Verfahren der Nuklearmedizin, das Schnittbilder von lebenden Organismen erzeugt. Bei der PET wird aus der zeitlichen und räumlichen Verteilung der registrierten Zerfallsereignisse auf die räumliche Verteilung des Radiopharmakons im Körper geschlossen und Vorgänge wie Absorption, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung können abgebildet werden.
Die Verwendbarkeit von Radiopharmaka wird durch die kurze Halbwertszeit der Radionuklide von typischerweise unter 2 Stunden eingeschränkt. Eine besonders kurze Halbwertszeit weist das Radionuklid ¹¹C mit nur ca. 20 Minuten auf. Der unerwünschte Abfall der Radioaktivität beginnt bereits bei der Herstellung des Radionuklids im Zyklotron und setzt sich bei der Herstellung des Radiopharmakons, dessen Lieferung zum PET-Standort und schließlich bis zur Verabreichung an den Patienten und die Messung fort.
Um einen möglichst weiten Lieferradius, in dem sich der zu beliefernde Positronen-Emissions-Tomograph befindet, um das Zyklotron herum zu erreichen, muss eine möglichst hohe Radioaktivität des Radiopharmakons nach dessen Herstellung vorliegen. Dies kann durch eine möglichst kurze Herstellungszeit des Radiopharmakons aus dem Radionuklid erreicht werden, da der Abfall der Radioaktivität für ein gegebenes Radionuklid von der Zeit abhängt.
Jedoch sind die meisten Radiomarkierungsverfahren für Peptide mehrstufig, zeitaufwändig, schwierig zu automatisieren und nur mit geringen radiochemischen Ausbeuten darzustellen. Herkömmliche Verfahren zur Herstellung von Radiopharmaka nutzen den Weg über das Methylierungsagens ¹¹CH₃I, um zum Beispiel Amine oder Carbonsäuren sowie Aminosäuren mit ¹¹C radioaktiv zu markieren (Denutte et al., 1983; Vandersteene und Slegers, 1996). Dabei muss jedoch das im Zyklotron anfallende ¹¹CO₂ noch in einem zweistufigen Prozess mit LiAlH₄ und HI zu ¹¹CH₃I umgesetzt werden. Erst in einer dritten Stufe kann das radioaktiv markierte Methylierungsagens auf das zu markierende Pharmakon übertragen werden. Durch diese langwierige Synthese des Radiopharmakons geht ein hoher Anteil der ursprünglich durch ¹¹CO₂ bereitgestellten Radioaktivität verloren.
Eine wichtige Technologie wurde für neue PET-Kontrastmittel im Bereich der ¹⁸F-Markierung durch die sogenannte ”Klick-Chemie” eingeführt. Dieses Verfahren erlaubt die Synthese von radioaktiven Kontrastmitteln in einem einzigen Schritt (Devaraj et al., 2009; Li et al., 2007). In der Arbeit von Bruus-Jensen (2006) werden HYNIC-funktionalisierte Peptide und Proteine als Vorläufer zur Darstellung ¹⁸F- und ⁹⁹mTc-markierter Radiopharmaka verwendet. Mit Technetium oder Fluor markierte Radiopharmaka, wie z. B. ¹⁸F-6-Fluoro-DOPA oder ¹⁸F-Fluor-2-desoxy-D-glucose, unterscheiden sich allerdings von ihren analogen nicht markierten Ursprungsmolekülen im Organismus.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein effizientes und schnelles Syntheseverfahren bereitzustellen, das innerhalb einer kurzen Herstellungszeit eine hohe Ausbeute an radioaktiv markierten natürlichen und artifiziellen Peptiden liefert.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Herstellung eines radioaktiv markierten Peptids gelöst, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Bereitstellen eines Vorläufermoleküls, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Aminosäure, einem Peptid und einem primären Amin, in einem organischen Lösungsmittel;
(b) Hinzufügen einer radioaktiv markierten Verbindung zu dem Vorläufermolekül, die eine Carboxylfunktion aufweist;
(c) Aktivieren der Carboxylfunktion der radioaktiv markierten Verbindung; und
(d) Verknüpfen der aktivierten radioaktiv markierten Verbindung mit dem Vorläufermolekül zu dem radioaktiv markierten Peptid,

Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung einer radioaktiv markierten Isocyanocarbonsäure zur Herstellung eines radioaktiv markierten Peptids.
Die abhängigen Patentansprüche enthalten vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung.
1 zeigt eine konventionelle Festphasen-Peptidsynthese mit Aminosäuren, deren Aminofunktion durch die Schutzgruppe 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) blockiert ist.
2 zeigt eine erfindungsgemäße Festphasen-Peptidsynthese mit markierter Isocyanocarbonsäure.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines radioaktiv markierten Peptids, umfassend die folgenden Schritte:

Der Begriff ”Peptid”, wie hier verwendet, bezeichnet eine organische Verbindung, die aus mindestens zwei über eine Amid- bzw. Peptidbindung miteinander verknüpften Aminosäuren aufgebaut ist. Der Begriff ”Peptid” umfasst Oligopeptide aus bis zu 10 Aminosäuren, Polypeptide aus mehr als 10 Aminosäuren und Makropeptide aus mehr als 100 Aminosäuren sowie Proteine unabhängig von der Primär-, Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur. Peptide umfassen artifizielle als auch natürlich vorkommende organische Verbindungen. Sie können chemisch und auch mittels Biosynthese hergestellt werden.
Der Begriff ”Vorläufermolekül”, wie hier verwendet, bezeichnet Monomere, Oligomere und polymere Ausgangsmoleküle der Peptidsynthese, die Aminosäuren, Peptide und/oder primäre Amine der Formel RNH₂ umfassen.
Der Begriff ”Carboxylfunktion”, wie hier verwendet, bezeichnet eine funktionelle Gruppe der Carbonsäure mit der Formel -COOH oder des Carbonats mit der Formel -COO^–.
Der Begriff ”Aktivieren der Carboxylfunktion”, wie hier verwendet, bezeichnet das Umwandeln einer Carbonsäure in eine reaktive Substanz.
Der Begriff ”Isocyanocarbonsäure”, wie hier verwendet, bezeichnet eine organische Verbindung, die eine Carboxylgruppe, -COOH, oder ein Carboxylat, -COO^–, und eine Isocyanogruppe, -CN, umfasst. Die Isocyanocarbonsäure weist z. B. die Summenformel CNR₁R₂CCOOH oder CNR₁R₂CCOOX auf.
Die Reste R, R₁, R₂ etc., wie hier verwendet, bezeichnen identische oder unterschiedliche aromatische, heteroaromatische und aliphatische Reste sowie Stickstoff-, Halogenverbindungen und Wasserstoffgruppen. Die aliphatischen Reste umfassen azyklische verzweigte und unverzweigte, zyklische und alizyklische, gesättigte und ungesättigte Kohlenstoffverbindungen. X umfasst Metallionen, wie Alkali- und Erdalkalimetallionen, z. B. Lithium.
Zur Herstellung eines radioaktiv markierten Peptids wird beim erfindungsgemäßen Verfahren radioaktiv markierte Isocyanocarbonsäure eingesetzt. Die Isocyanogruppe der Isocyanocarbonsäure muss in der Peptidsynthese – anders als die Aminogruppe einer Aminosäure – nicht durch eine Schutzgruppe blockiert werden. Daher wird wertvolle Reaktionszeit eingespart, die bei der konventionellen Synthese mittels Verknüpfen von Aminosäuren erforderlich ist, um 1.) die Schutzgruppe in einem zusätzlichen Reaktionsschritt an die Aminogruppe anzulagern und 2.) die Schutzgruppe nach der Verknüpfung der Aminosäure mit dem Peptid in einem weiteren Reaktionsschritt wieder abzuspalten. Somit wird durch das erfindungsgemäße Verfahren die Peptidsynthesedauer verkürzt.
Durch die verkürzte Peptidsynthesezeit des erfindungsgemäßen Verfahrens werden radiochemische Ausbeuteverluste durch den natürlichen Zerfall des Radionuklids in Abhängigkeit von der Zeit verringert. Die in der Synthese des radioaktiv markierten Peptids eingesetzte Menge an radioaktiver Ausgangssubstanz kann daher verringert werden, wodurch Kosten eingespart werden und die Belastung des Radiochemikers bei der Synthese verringert wird.
Die Herstellung von radioaktiv markiertem Peptid mittels radioaktiv markierter Isocyanocarbonsäure ist sehr einfach und mit vergleichsweise geringem Aufwand durchzuführen. Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher direkt in der Klinik oder radiologischen Praxis angewandt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das organische Lösungsmittel Methylenchlorid, Chloroform, Dichlorethan, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Tetrahydrofuran, Ethylacetat, Acetonitril und/oder eine Kombination davon.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die radioaktiv markierte Isocyanocarbonsäure radioaktiv markierten Kohlenstoff, vorzugsweise ¹¹C.
Die Isocyanocarbonsäure wird durch die Carboxylierung von CNR₁R₂CH oder CNR₁R₂CX mit radioaktiv markiertem Kohlendioxid, z. B. ¹¹CO₂, hergestellt. Der Einbau des Radionuklids erfolgt also im letzten Syntheseschritt der radioaktiv markierten Isocyanocarbonsäure, die unmittelbar in der erfindungsgemäßen Peptidsynthese verwendet werden kann. Somit wird bereits in der Isocyanocarbonsäuresynthese Reaktionszeit eingespart, wodurch radiochemische Ausbeuteverluste durch den Zerfall des Radionuklids verringert werden und die eingesetzte Menge radioaktiv markierter Isocyanocarbonsäure verringert wird. Dadurch werden wiederum Kosten eingespart, und die Belastung des Radiochemikers bei der Peptidsynthese wird verringert.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren ferner die Schritte:

(a1) Hinzufügen einer weiteren Aminosäure oder einer nicht markierten Isocyanocarbonsäure, die jeweils eine Carboxylfunktion umfassen, zu dem bereitgestellten Vorläufermolekül;
(a2) Aktivieren der Carboxylfunktion der weiteren Aminosäure oder der nicht markierten Isocyanocarbonsäure;
(a3) Verknüpfen des bereitgestellten Vorläufermoleküls mit der weiteren Aminosäure oder der nicht markierten Isocyanocarbonsäure über eine Amidbindung zu einem Peptid; und
(a4) Wiederholen der Schritte (a1) bis (a3) bis eine erwünschte Größe des Peptids erreicht ist.

In den Schritten (a1) bis (a4) der Ausführungsform werden im Anschluss an Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens oligomere und polymere Vorläufermoleküle synthetisiert, wie Oligo- und Polypeptide, indem weitere monomere Aminosäuren zu dem Vorläufermolekül, d. h. der Aminosäure, dem Peptid oder dem primären Amin, hinzugefügt werden. Die radioaktiv markierte Isocyanocarbonsäure kann im erfindungemäßen Verfahren daher zu Vorläufermolekülen beliebiger Länge hinzugefügt werden (vgl. Schritt (b) oben).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Isocyanocarbonsäure eine alpha-Isocyanocarbonsäure. Der Begriff ”alpha-Isocyanocarbonsäure”, wie hier verwendet, bezeichnet eine organische Verbindung, die eine Carboxylgruppe oder ein Carboxylat und eine Isocyanogruppe am selben Kohlenstoffatom umfasst (IUPAC-Bezeichnung: 2-Isocyanocarbonsäure).
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Aktivieren der Carboxylfunktion, das Umwandeln der Isocyanocarbonsäure und/oder der weiteren Aminosäure in eine reaktive Substanz, die Aktivester, Anhydrid, Pentafluorphenylester, Thioester, Imidazolid, Carbonsäurehalogenid und/oder Dimethylaminopyridin umfasst.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Isocyanocarbonsäure mit einem Kopplungsreagenz zu dem Aktivester umgesetzt, wobei das Kopplungsreagenz Guanidiniumreagenz, ein Uroniumreagenz, vorzugsweise 2-(H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluor-phosphat (HBTU), O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluor-borat (TBTU) oder 2-(1H-7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorophosphate (HATU), ein Benzotriazolreagenz, vorzugsweise 1-Hydroxybenzotriazolreagenz (HOBt), ein Immoniumreagenz, ein Carbodiimidreagenz, vorzugsweise N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) oder Diisopropylcarbodiimid (DIPCDI), ein Imidazoliumreagenz, ein organophosphoriges Reagenz, ein saures halogenierenden Reagenz, ein Phosphoniumreagenz, vorzugsweise Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium-hexafluorphosphat (BOP; auch als Castros-Reagenz bekannt) oder Benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphoniumhexafluor-phosphat (PyBOP), ein Morpholinreagenz, vorzugsweise N-Methylmorpholin (NMM), ein Chloroformatreagenz und/oder eine Kombination davon umfasst.
HOBt ist vorteilhaft, weil es die Bildung der Peptidbindung beschleunigt, die Racemisierung unterdrückt und bewirkt, dass z. B. die Asn und Gln Seitengruppen nicht dehydratisieren. Mit Hilfe von DCC lassen sich die Aminosäuren in situ in Aktivester überführen, die so stabil sind, dass sie isoliert und chromatographiert werden können.
Besonders bevorzugt wird ein Gemisch aus HOBt und DCC eingesetzt. DCC aktiviert die Carbonsäure unter Bildung eines sehr reaktiven Acylisoharnstoffs. Dieser regiert mit dem HOBt zu einem HOBt-Aktivester, der einen sehr großen Teil der anfänglichen Reaktivität konserviert. Der HOBt-Aktivester wird nukleophil von der Aminofunktion des Peptids oder einer weiteren Aminosäure angegriffen. Unter der Abspaltung von Wasser wird eine Peptidbindung gebildet. Eine direkte Umsetzung des Acylisoharnstoffs ist wenig ratsam, da die Reaktivität so hoch ist, dass eine Racemisierung eintritt. Der Zusatz von DIPEA zu HOBt wirkt als Katalysator, der die Racemisierungstendenz von HOBt reduzieren.
Alternativ zum DCC wird häufig DIPCDI mit HOBt verwendet, da der sich in dieser Reaktion bildende Harnstoff löslicher ist und leichter abgetrennt werden kann.
Besonders bevorzugt wird ferner BOP oder ein Gemisch aus HBTU und HOBt. Wichtig ist, dass das Gegenion von BOP bzw. HBTU sehr wenig nukleophil ist, wie z. B. PF^–. Das BOP-Reagenz ist stabil, nicht hygroskopisch und in organischen Lösungsmitteln sehr gut löslich. Generell ist das BOP-Reagenz effizienter als die Kombination DCC/HOBt. Ein Nachteil des BOP-Reagenz ist jedoch, dass während der Reaktion carcinogenes Hexamethylphosphorsäuretriamid entsteht. Das neue Reagenz PyBop weist dagegen keine Carzinogenität auf. Dieses Reagenz besitzt Pyrrolidineinheiten statt Methylgruppen.
Die Reagenzien HBTU und HATU weisen eine besonders hohe Reaktivität auf. Carbonsäurechloride und -fluoride sind einfach erhältliche und preisgünstige Reagenzien.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird/werden eine Funktion einer Seitenkette des Vorläufermoleküls, der Isocyanocarbonsäure und/oder der weiteren Aminosäure durch eine Schutzgruppe blockiert. Die Funktion umfasst eine Hydroxylfunktion, eine Carboxylfunktion und eine Aminofunktion.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird/werden eine Carboxylfunktion und/oder Aminofunktion einer Hauptkette des Vorläufermoleküls und/oder eine Aminofunktion einer Hauptkette der weiteren Aminosäure durch eine Schutzgruppe blockiert.
Der Begriff „Schutzgruppe”, wie hier verwendet, umfasst Verbindungen, welche die Reaktionsfähigkeit von chemischen Gruppen gezielt blockieren und ausschalten, indem sie an diese chemischen Gruppen binden. Der Begriff „Seitenkette”, wie hier verwendet, umfasst die Reste R₁, R₂ etc., die vom Hauptstrang des Vorläufermoleküls, der Isocyanocarbonsäure oder der weiteren Aminosäure abzweigen. Der Begriff „Hauptkette”, wie hier verwendet, bezeichnet das N- und C-terminale Rückgrat, das die Achse bzw. den Stamm des Vorläufermoleküls, der Isocyanocarbonsäure oder der weiteren Aminosäure bildet.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Schutzgruppe eine basenstabilen Schutzgruppe, eine t-Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe (Boc) und/oder eine 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Schutzgruppe (Fmoc).
Wird der N-Terminus mit Fmoc geschützt, so werden für die Seitenketten z. B. basenstabile, säurelabile Schutzgruppen verwendet. Beispiele hierfür sind Boc, das die Aminofunktionen z. B. in Lysin schützt; tert-Butyl, das die Carboxyl- und Hydroxylgruppen z. B. in Asparaginsäure und Serin schützt; und Trityl, das Amide z. B. in Glutamin schützt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren ferner die Schritte:

(a1) Abspalten der Schutzgruppe von der Aminofunktion der Hauptkette des bereitgestellten Vorläufermoleküls;
(a2) Hinzufügen der weiteren Aminosäure, deren Aminogruppe der Hauptkette geschützt ist, zu dem Vorläufermolekül;
(a3) Aktivieren der Carboxylfunktion der Hauptkette der weiteren Aminosäure
(a4) Verknüpfen des Vorläufermoleküls mit der weiteren Aminosäure über eine Amidbindung zu dem Peptid; und
(a5) Wiederholen der Schritte (a1) bis (a4) bis eine erwünschte Größe des Peptids erreicht ist.

In den Schritten (a1) bis (a5) der Ausführungsform werden im Anschluss an Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens oligomere und polymere Vorläufermoleküle synthetisiert, wie Oligo- und Polypeptide, indem weitere monomere Aminosäuren zu dem Vorläufermolekül, d. h. der Aminosäure, dem Peptid oder dem primären Amin, hinzugefügt werden. Die N-terminale Aminofunktion des Vorläufermoleküls ist durch die abspaltbare Schutzgruppe blockiert. Die radioaktiv markierte Isocyanocarbonsäure kann daher im erfindungemäßen Verfahren zu mit Schutzgruppen versehenen Vorläufermolekülen beliebiger Länge hinzugefügt werden (vgl. Schritt (b) oben).
Die Fmoc-Schutzgruppe wird in einer bevorzugten Ausführungsform durch Ammoniak, ein primäres Amin oder ein sekundäres Amin, vorzugsweise 4-Aminomethylpiperidin, Piperidin oder Tris(2-aminoethyl)amin, abgespalten.
Die t-Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe wird in einer bevorzugten Ausführungsform durch Protonen abgespalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren ferner den Schritt des Hydrolysierens der an das Vorläufermolekül geknüpften Isocyanocarbonsäure. Dadurch wird die Isocyanogruppe in eine funktionelle Aminogruppe umgewandelt. An dieser Aminogruppe kann die Peptidsynthese abbrechen oder fortgesetzt werden. Das Radionuklid kann sich daher innerhalb der Peptidkette oder an einem Ende der Peptidkette befinden. Ferner kann das erfindungsgemäß synthetisierte radioaktiv markierte Peptid ein oder mehrere Radionuklide aufweisen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren ferner den Schritt des Abspaltens der Schutzgruppe von dem radioaktiv markierten Peptid. Nach Abschluss der Peptidsynthese werden z. B. bedingt säurestabile Schutzgruppen durch Halogenwasserstoffe, wie HF, und säurelabile Schutzgruppen durch Trifluoressigsäure (TFA) abgespalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Vorläufermolekül an eine Festphase gekoppelt.
Der Begriff „Festphase”, wie hier verwendet, bezeichnet einen polymeren festen Träger, an den das Peptid während seiner Synthese gebunden ist. Durch dieses Immobilisieren können die verwendeten Substanzen in großem Überschuss zugesetzt und sehr schnell ausgewaschen werden, wodurch die Kupplungsausbeute beim erfindungemäßen Verfahren deutlich gesteigert wird. Die Festphasenchemie ermöglicht es ferner, die Peptidsynthese zu automatisieren. So wird bei der Peptidsynthese an der festen Phase eine sequentielle Wiederholung der Schritte Hinzufügen der Vorläufermoleküle, Monomere und Reagenzien, Aktivieren der Carboxylfunktion, Verknüpfen von Vorläufermolekül und Monomer und Abspalten der temporären Schutzgruppe durchgeführt.
Die Festphase umfasst einen Linker, der das Bindeglied zwischen dem polymeren Träger und dem Peptid darstellt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Festphase ein Polystyrolharz, ein 2',4'-Dimethoxyphenyl-hydroxymethylphenoxy-Harz, ein p-Methylbenzhydrylamin-Harz, ein Phenalacetamidomethyl-Harz und/oder ein Oxim-Harz.
Polystyrolharz quillt leicht, sodass die Reagenzien leicht an die Synthesestelle gelangen können. Zudem ist es inert gegenüber den Reagenzien. Das Polystyrol ist zur Quervernetzung vorzugsweise mit 1% m-Divinylbenzol versetzt. Die Funktionalisierung geschieht z. B. über eine Chlormethylierung. Zwischen die Chlormethylgruppe und die erste Aminosäure wird vorteilhafterweise ein Linker gesetzt, z. B. ein p-Alkoxybenzylesterlinker, der die Abspaltung des fertigen Peptides vom Harz am Ende der Synthese erlaubt. Polystyrolharze mit Alkoxybenzylesterlinkern werden vorzugsweise im Rahmen der Fmoc-Peptidsynthese eingesetzt, ermöglichen die Synthese von C-terminalen Carbonsäuren und werden durch Umsetzen der Chlormethylpolystyrole mit 4-Hydroxybenzyl-alkohol hergestellt. Das Abspalten des fertigen Peptids erfolgt mit TFA.
2',4'-Dimethoxyphenylhydroxymethyl-phenoxy-Harze werden entweder als Amid- oder Säure-Harze eingesetzt. Das Amid-Harz liefert C-terminale Amide und wird für die Fmoc-Synthese eingesetzt. Das Säure-Harz ermöglicht eine Peptidsynthese mittels der N-terminalen Boc-Schutzgruppe. Es liefert C-terminale Carbonsäuren. Der Linker des Säureharzes ist ebenso wie der Chlortrityl-Linker so säurelabil, dass die Peptide z. B. mit verdünnter TFA geschützt vom Harz abgespalten werden können. Diese Fragmente können dann in einer Fragmentkondensation eingesetzt werden.
p-Methylbenzhydrylamin-Harze und Phenalacetamidomethyl-Harze werden im Rahmen der Boc-Peptidsynthese verwendet. Die Abspaltung der fertigen Peptide erfolgt am Ende mit HF. Mit den p-Methylbenzhydrylamin-Harzen werden Peptidamide erhalten. Die Phenalacetamidomethyl-Harze liefern Carbonsäuren.
Mittels Oxim-Harze können vollständig Boc-geschützte Peptide hergestellt werden. Die Spaltung findet mit NH₃ oder H₂N-NH₂ statt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren ferner den Schritt des Entkoppelns des radioaktiv markierten Peptids von der Festphase.
Um das radioaktiv markierte Peptid freizusetzen, wird es nach Abschluss der Peptidsynthese von der Festphase oder dem Linker der Festphase entkoppelt. Im Fall der N-terminalen Boc-Schutzgruppe wird die Spaltung mit HF und im Fall der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe mit ca. 80%-iger TFA realisiert. Neben diesen unterschiedlich starken Säuren werden z. B. Nitrobenzyl-Harze mit Licht und Allyl-Harze mit Pd(0) orthogonal abgespalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform findet das Hydrolysieren zeitgleich mit dem Entkoppeln des Vorläufermoleküls von der Festphase statt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform findet das Hydrolysieren zeitgleich mit dem Entkoppeln des radioaktiv markierten Peptids von der Festphase und dem Abspalten der Schutzgruppe vom radioaktiv markierten Peptid statt.
Das gleichzeitige Entkoppeln und Hydrolysieren bzw. Entkoppeln, Hydrolysieren und Abspalten verringert die Prozesszeit und reduziert damit radiochemische Ausbeuteverluste. Daher kann die in der Synthese eingesetzte Menge radioaktiver Isocyanocarbonsäure verringert werden.
Das gleichzeitige Hydrolysieren und Entkoppeln des radioaktiv markierten Peptids von der Festphase sowie das Abspalten der Boc-Schutzgruppe erreicht man mit flüssigem HF, Trifluormethansulfonsäure in Trifluoressigsäure oder HBr in Essigsäure. Im Fall der Fmoc-Schutzgruppe wird TFA (ca. 80%-ig) in CH₂Cl₂ verwendet. Vorzugsweise werden Abfangreagenzien, wie Anisol, Ethandithiol oder Dimethylsulfid zugesetzt, um reaktive Intermediate abzufangen, die das Peptid schädigen können.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer radioaktiv markierten Isocyanocarbonsäure zur Herstellung eines radioaktiv markierten Peptids.
1 zeigt eine konventionelle Festphasensynthese zur Herstellung von Peptiden. Das Vorläufermolekül ist ein durch Fmoc geschütztes primäres Amin, das über einen Aminomethyl-3,5-dimethoxyphenoxyvaleryl-Linker (PAL) an eine Festphase (doppelt schraffierter Kreis) gekoppelt ist. Fmoc wird durch eine Base vom Amin abgespalten, und eine hinzugegebene Aminosäure wird als HOBt-Ester aktiviert. Anschließend wird die Aminosäure, deren Aminogruppe ebenfalls durch Fmoc geschützt ist, mit dem immobilisierten Amin verknüpft. In einem weiteren Schritt wird die Fmoc-Gruppe von der Aminogruppe des immobilisierten Vorläufermoleküls wiederum abgespalten, und eine weitere hinzugegebene und aktivierte Aminosäure wird an das Vorläufermolekül geknüpft. Diese Schritte werden wiederholt bis die erwünschte Länge des Peptids erreicht ist. Abschließend werden die Schutzgruppen abgespalten, und das Peptid wird von der Festphase abgekoppelt.
2 zeigt schematisch eine erfindungsgemäße Synthese eines radioaktiv markierten Peptids mittels radioaktiv markierter Isocyanocarbonsäure. Zunächst wird konventionell aus einer Fmoc-Aminosäure und einem an eine Festphase gekoppelten Amin ein Vorläufermolekül synthetisiert (vgl. 1). An das Vorläufermolekül wird eine aktivierte radioaktiv markierte alpha-Isocyanocarbonsäure angelagert, deren CN-Gruppe nicht geschützt werden muss, wodurch Reaktionszeit eingespart wird. Die CN-Gruppe wird anschließend zur NH₂-Aminogruppe hydrolysiert, und gleichzeitig wird das synthetisierte radioaktiv markierte Peptid von der Festphase abgekoppelt.
Referenzen

Bruus-Jensen, Dissertation, INSTITUT FÜR RADIOCHEMIE DER TECHNISCHEN UNIVERSITÄT MÜNCHEN, 2006 (Einleitung)
Denutte et al., J Nucl Med 24, 1185–1187, 1983
Abstract zu Devaraj et al., Bioconjugate Chem 20 (2), 397–401, 2009
Abstract zu Li et al., Bioconjugate Chem, 18 (6), 1987–1994, 2007
Erste Seite von Merrifield, J Am Chem Soc, 85, 2149–2154, 1963
Abstract zu Vandersteene und Slegers, Applied Radiation and Isotopes 47 (2), 201–205, 1996

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Denutte et al., 1983 [0008]
- Vandersteene und Slegers, 1996 [0008]
- Devaraj et al., 2009 [0009]
- Li et al., 2007 [0009]
- Bruus-Jensen (2006) [0009]

Claims

Verfahren zur Herstellung eines radioaktiv markierten Peptids, umfassend die folgenden Schritte: (a) Bereitstellen eines Vorläufermoleküls, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Aminosäure, einem Peptid und einem primären Amin, in einem organischen Lösungsmittel; (b) Hinzufügen einer radioaktiv markierten Verbindung zu dem Vorläufermolekül, die eine Carboxylfunktion aufweist; (c) Aktivieren der Carboxylfunktion der radioaktiv markierten Verbindung; und (d) Verknüpfen der aktivierten radioaktiv markierten Verbindung mit dem Vorläufermolekül zu dem radioaktiv markierten Peptid, dadurch gekennzeichnet, dass die radioaktiv markierte Verbindung eine Isocyanocarbonsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Methylenchlorid, Chloroform, Dichlorethan, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Tetrahydrofuran, Ethylacetat, Acetonitril und einer Kombination davon.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die radioaktiv markierte Isocyanocarbonsäure radioaktiv markierten Kohlenstoff, vorzugsweise ¹¹C umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner umfassend die Schritte: (a1) Hydrolysieren der an das vorherige Vorläufermolekül geknüpften Isocyanocarbonsäure, wobei aus der Isocyanogruppe eine Aminogruppe gebildet wird; (a2) Hinzufügen einer weiteren Aminosäure oder einer nicht markierten Isocyanocarbonsäure, die jeweils eine Carboxylfunktion umfassen, zu dem bereitgestellten Vorläufermolekül; (a3) Aktivieren der Carboxylfunktion der weiteren Aminosäure oder der nicht markierten Isocyanocarbonsäure; (a4) Verknüpfen des bereitgestellten Vorläufermoleküls mit der weiteren Aminosäure oder der nicht markierten Isocyanocarbonsäure über eine Amidbindung zu einem Peptid; und (a5) Wiederholen der Schritte (a2) bis (a4) bis eine erwünschte Größe des Peptids erreicht ist, wobei für den Fall, dass im Schritt (a2) eine nicht markierten Isocyanocarbonsäure hinzugefügt wurde auch der Schritt (a1) wiederholt wird, und für den Fall, dass in dem Schritt (a2) eine weitere Aminosäure eingesetzt wird, ein Abspalten einer Schutzgruppe von der Aminofunktion der Hauptkette des bereitgestellten Vorläufermoleküls erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Isocyanocarbonsäure eine alpha-Isocyanocarbonsäure ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Aktivieren der Carboxylfunktion das Umwandeln der Isocyanocarbonsäure und/oder der weiteren Aminosäure in eine reaktive Substanz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Aktivester, Anhydrid, Pentafluorphenylester, Thioester, Imidazolid, Carbonsäurehalogenid und Dimethylaminopyridin.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Isocyanocarbonsäure mit einer Kopplungsreagenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Guanidiniumreagenz, einem Uroniumreagenz, vorzugsweise 2-(H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU), O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluor-borat (TBTU) oder 2-(1H-7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate (HATU), einem Benzotriazolreagenz, vorzugsweise 1-Hydroxybenzotriazolreagenz (HOBt), einem Immoniumreagenz, einem Carbodiimidreagenz, vorzugsweise N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) oder Diisopropylcarbodiimid (DIPCDI), einem Imidazoliumreagenz, einem organophosphorigen Reagenz, einem sauren halogenierenden Reagenz, einem Phosphoniumreagenz, vorzugsweise Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium-hexafluorphosphat (BOP) oder Benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium-hexafluor-phosphat (PyBOP), einem Morpholinreagenz, vorzugsweise N-Methylmorpholin (NMM), einem Chloroformatreagenz und einer Kombinationen davon, zu dem Aktivester umgesetzt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Funktion einer Seitenkette des Vorläufermoleküls, der Isocyanocarbonsäure und/oder der weiteren Aminosäure durch eine Schutzgruppe blockiert wird/werden, die Funktion ist aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Hydroxylfunktion, einer Carboxylfunktion und einer Aminofunktion.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Carboxylfunktion und/oder Aminofunktion einer Hauptkette des Vorläufermoleküls und/oder eine Aminofunktion einer Hauptkette der weiteren Aminosäure durch eine Schutzgruppe blockiert wird/werden.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzgruppe aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer basenstabilen Schutzgruppe, einer t-Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe und einer 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Schutzgruppe.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, ferner umfassend die Schritte: (a1) Abspalten der Schutzgruppe von der Aminofunktion der Hauptkette des bereitgestellten Vorläufermoleküls; (a2) Hinzufügen der weiteren Aminosäure zu dem Vorläufermolekül, deren Aminogruppe der Hauptkette geschützt ist; (a3) Aktivieren der Carboxylfunktion der Hauptkette der weiteren Aminosäure (a4) Verknüpfen des Vorläufermoleküls mit der weiteren Aminosäure über eine Amidbindung zu dem Peptid; und (a5) Wiederholen der Schritte (a1) bis (a4) bis eine erwünschte Größe des Peptids erreicht ist.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Schutzgruppe durch Ammoniak, ein primäres Amin oder ein sekundäres Amin, vorzugsweise 4-Aminomethylpiperidin, Piperidin oder Tris(2-aminoethyl)amin, abgespalten wird.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die t-Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe durch Protonen abgespalten wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner umfassend den Schritt: Hydrolysieren der an das Vorläufermolekül geknüpften Isocyanocarbonsäure, wobei aus der Isocyanogruppe die Aminogruppe gebildet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner umfassend den Schritt: Abspalten der Schutzgruppe von dem radioaktiv markierten Peptid.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Vorläufermolekül an eine Festphase gekoppelt ist.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphase aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Polystyrolharz, einem 2',4'-Dimethoxyphenylhydroxymethyl-phenoxy-Harz, einem p-Methylbenzhydrylamin-Harz, einem Phenalacetamidomethyl-Harz und einem Oxim-Harz.
Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, ferner umfassend den Schritt: Entkoppeln des radioaktiv markierten Peptids von der Festphase.
Verfahren nach den Ansprüchen 14 und 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrolysieren zeitgleich mit dem Entkoppeln des Vorläufermoleküls von der Festphase statt findet.
Verfahren nach den Ansprüchen 14, 15 und 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrolysieren zeitgleich mit dem Entkoppeln des radioaktiv markierten Peptids von der Festphase und dem Abspalten der Schutzgruppe vom radioaktiv markierten Peptid statt findet.
Verwendung einer radioaktiv markierten Isocyanocarbonsäure zur Herstellung eines radioaktiv markierten Peptids.