DE60312136T2

DE60312136T2 - Radiofluorierungsverfahren

Info

Publication number: DE60312136T2
Application number: DE60312136T
Authority: DE
Inventors: Alan c/o Amersham CUTHBERTSON; Magne c/oAmersham SOLBAKKEN; Joseph Maduabuchi Arukwe; Hege c/o Amersham KARLSEN
Original assignee: GE Healthcare Ltd
Current assignee: GE Healthcare Ltd
Priority date: 2002-03-22
Filing date: 2003-03-20
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2023-03-21
Also published as: EP1487762A1; JP4365223B2; US20080274052A1; JP2005520857A; DE60312136D1; EP1487762B1; AU2003214446A1; US7368474B2; ES2282607T3; ATE355259T1; WO2003080544A1; US20050142061A1; GB0206750D0

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Reagenzien für die [¹⁸F]-Fluorierung, insbesondere von Peptiden. Die resultierenden ¹⁸F-markierten Verbindungen sind nützlich als Radiopharmazeutika, speziell zur Verwendung in der Positronen-Emissions-Tomographie (PET).
Die Anwendung von radiomarkierten bioaktiven Peptiden für die diagnostische Bildgebung gewinnt an Wichtigkeit in der Nuklearmedizin. Biologisch aktive Moleküle, die selektiv mit spezifischen Zelltypen wechselwirken, sind für die Verabreichung von Radioaktivität an Zellgewebe nützlich. Z.B. besitzen radiomarkierte Peptide ein beträchtliches Potential für die Verabreichung von Radionukliden an Tumore, Infarkte und infizierte Gewebe für die diagnostische Bildgebung und Radiotherapie. ¹⁸F, mit seiner Halbwertszeit von 110 Minuten, ist das Positronen-emittierende Nuklid der Wahl für viele Rezeptor-Bildgebungsstudien. Deshalb besitzen ¹⁸F-markierte bioaktive Peptide ein großes klinisches Potential wegen ihrer Nützlichkeit in PET, um quantitativ eine breite Vielfalt von Erkrankungen zu detektieren und charakterisieren.
WO 99/11590 beschreibt Verfahren zur [¹⁸F]-Fluorierung von Thiol-enthaltenden Peptiden und Proteinen.
US-Patent Nr. 5,144,043 beschreibt Verfahren für das Markieren von Proteinen mit Technetium unter Verwenden von bifunktionellen Kopplungsmitteln, umfassend eine Maleimid-Einheit.
Eine Schwierigkeit mit ¹⁸F-markierten Peptiden ist, dass die existierenden ¹⁸F-markierenden Mittel zeitaufwändig herzustellen sind. Ein effizientes Markieren von Peptiden und Proteinen mit ¹⁸F wird nur erreicht durch Verwenden geeigneter prosthetischer Gruppen. Mehrere derartige prosthetische Gruppen wurden in der Literatur vorgeschlagen, einschließlich N-Succinimidyl-4-[¹⁸F]-Fluorbenzoat, m-Maleimido-N-(p-[¹⁸F]-Fluorbenzyl)-benzamid, N-(p-[¹⁸F]-Fluorphenyl)maleimid und 4-[¹⁸F]-Fluorphenacylbromid. Fast alle die Methodiken, die gegenwärtig heute für das Markieren von Peptiden und Proteinen mit ¹⁸F verwendet werden, nutzen aktive Ester des Fluor-markierten Synthons. Da Peptide und Proteine eine Vielfalt von funktionellen Gruppen enthalten können, die zur Reaktion mit aktiven Estern fähig sind, sind diese gegenwärtigen Verfahren nicht stellenspezifisch. Z.B. besitzt ein Peptid, das 3 Lysin-Reste enthält, drei Aminfunktionen, die alle gleichermaßen gegenüber dem markierten Synthon reaktiv sind. Deshalb gibt es noch einen Bedarf an ¹⁸F-markierten prosthetischen Gruppen und Methodiken, die eine schnelle, chemoselektive Einführung von ¹⁸F, insbesondere in Peptide, unter milden Bedingungen ermöglichen, um ¹⁸F-markierte Produkte in hoher radiochemischer Ausbeute und Reinheit zu ergeben. Zusätzlich gibt es einen Bedarf an derartigen Methodiken, die einer Automatisierung zugänglich sind, um die Herstellung von Radiopharmazeutika im klinischen Szenario zu vereinfachen.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Radiofluoierung bereit, umfassend eine Reaktion einer Verbindung der Formel (I) oder (Ia):
mit einer Verbindung der Formel (II): ¹⁸F-(Linker)-SH (II) wobei:
X eine austretende Gruppe ist, ausgewählt aus Chloro, Bromo und Iodo, und bevorzugt Chloro ist;
Y eine C_1–10-Hydrocarbylgruppe ist, die ggf. umfasst 1 bis 6 Heteroatome; und der Linker in Formel (II) eine C_1–30-Hydrocarbylgruppe ist, die ggf. umfasst 1 bis 10 Hetereoatome;
um eine Verbindung der Formel (III) bzw. (IIIa) zu ergeben
wobei die Linkergruppe ist wie definiert in der Verbindung der Formel (II), Y ist wie definiert in der Verbindung der Formel (Ia) und das Peptid ist wie definiert in der Verbindung der Formel (I) bzw. (Ia).
Die vorliegende Erfindung stellt einen chemoselektiveren Ansatz für die Radiomarkierung bereit, wobei die exakte Stelle der Einführung des Markers zuvor ausgewählt wird während der Synthese des Peptid-Vorläufers. Die Thiol-Funktion des Synthons, das an einer vorbestimmten Stelle im Peptid reagiert, ergibt nur ein mögliches Produkt. Diese Methodik ist deshalb chemoselektiv und seine Anwendung wird als generisch für einen weiten Bereich von Peptiden und Biomolekülen betrachtet.
In einem bevorzugten Aspekt stellt die Erfindung bereit ein Verfahren zur Radiofluorierung, umfassend eine Reaktion einer Verbindung nach der Formel (I):
mit einer Verbindung der Formel (IV), (V) oder (VI): ¹⁸F-(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)_m-SH (IV) ¹⁸F-(CH₂)_p-SH (V)
wobei:
X eine austretende Gruppe ist, ausgewählt aus Chloro, Bromo und Iodo, und bevorzugt Chloro ist,
n eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist;
m eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist;
p eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist;
q eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist;
r eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist;
um eine Verbindung der Formel (VII), (VIII) bzw. (IX) zu ergeben:

wobei m, n, p, q und r sind wie definiert für die Verbindung der Formel (IV), (V) oder (VI).
Diese Reaktion kann bewirkt werden in einem geeigneten Lösungsmittel, z.B. in einem wässrigen Puffer im pH-Bereich 5 bis 11 und bei einer nicht-extremen Temperatur von 5 bis 60°C, bevorzugt bei Umgebungstemperatur.
In einem weiteren bevorzugten Aspekt stellt die Erfindung bereit ein Verfahren zur Radiofluorierung, umfassend eine Reaktion einer Verbindung der Formel (Ia):
mit einer Verbindung der Formel (IV), (V) oder (VI): ¹⁸F-(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)_m-SH (IV) ¹⁸F-(CH₂)_p-SH (V)
wobei:
Y eine C_1–10-Hydrocarbylgruppe ist, die gegebenenfalls umfasst 1 bis 6 Heteroatome;
n eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist;
m eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist;
p eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist;
q eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist;
r eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist;
um eine Verbindung der Formel (X), (XI) bzw. (XII) zu ergeben:
wobei m, n, p, q und r sind wie definiert für die Verbindung der Formel (IV), (V) oder (VI) und Y ist wie definiert für die Verbindung der Formel (Ia).
Diese Reaktion kann bewirkt werden in einem geeigneten Lösungsmittel, z.B. in einem wässrigen Puffer im pH-Bereich von 5 bis 11 und bei einer nicht-extremen Temperatur von 5 bis 60°C, bevorzugt bei Umgebungstemperatur.
In den Formeln (I) und (Ia) können geeignete Peptide zum Markieren Somatostatin-Analoga umfassen, wie Octreotid, Bombesin, vasoaktives intestinales Peptid, chemo taktische Peptid-Analoga, α-Melanocyt-stimulisierendes Hormon, Neurotensin, Arg-Gly-Asp-Peptid und seine Analoga, menschliches Pro-Insulin-verbindendes Peptid, Endothelin, Angiotensin und Formyl-norleucyl-leucyl-phenylalanyl-norleucyl-tyrosyllysin. Bevorzugte Peptide zum Markieren sind Arg-Gly-Asp-Peptid und seine Analoga, wie jene, die beschrieben sind in WO 01/77415 und WO 03/006491. In einem speziellen Aspekt ist das Peptid in der Formel (I) oder (Ia) von der Formel (A):
wobei X⁷ steht für entweder -NH₂ oder
wobei a eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist, bevorzugt ist a 1.
Wie von dem Fachmann anerkannt werden wird, können die Verfahren der Erfindung auch verwendet werden zur Radiofluorierung von anderen Biomolekülen, Proteinen, Hormonen, Oligonukleotiden und Antikörperfragmenten, wie auch kleinen Molekülen, um eine Vielfalt von PET-Tracern bereit zu stellen.
In der Formel (Ia) steht Y für eine C_1–10-Hydrocarbyl-Gruppe, gegebenenfalls umfassend 1 bis 6 Heteroatome, wie Sauerstoff oder Stickstoff, geeigneterweise steht Y für eine C_1–10-Alkyl-Gruppe, die gegebenenfalls eine C_4–7-Cycloalkyl-Gruppe enthält, z.B. kann Y Methylcyclohexyl sein.
In der Formel (II) steht der Linker für eine C_1–30-Hydrocarbyl-Gruppe, gegebenenfalls umfassend 1 bis 10 Heteroatome so wie Sauerstoff oder Stickstoff, und können gewählt sein, um gute in-vivo-Pharmacokinetika, wie günstige Exkretions- Eigenschaften bereitzustellen. Geeignete Linker-Gruppen umfassen Alkyl-, Alkenyl-, Alkinylketten, aromatische, polyaromatische und heteroaromatische Ringe, und Polymere, umfassend Ethyleneglycol, Aminosäure oder Kohlenhydrat-Untereinheiten.
In den Verbindungen der Formeln (IV) und (VII) steht n typischerweise für 2 bis 6, geeigneterweise 3, und m steht typischerweise für 1 bis 4, geeigneterweise 2.
In den Verbindungen der Formeln (V) und (VIII) steht p typischerweise für 1 bis 6, geeigneterweise 3.
In den Verbindungen der Formeln (VI) und (IX) ist die Gruppe ¹⁸F(CH₂)_q-geeigneterweise in der para-Position relativ zu der Amid-Gruppe gebunden, Q steht typischerweise für 0 bis 4, geeigneterweise 1, und r steht typischerweise für 1 bis 4, geeigneterweise 2.
Als ein weiterer Aspekt der Erfindung wird eine Verbindung der Formel (IV), (V) oder (VI) wie oben definiert bereitgestellt. Diese Verbindungen besitzen eine allgemeine Nutzbarkeit als prosthetische Gruppen für Radiofluorierung. Thiol-geschützte Derivate der Verbindungen der Formel (IV), (V), und (VI) besitzen auch eine Nutzbarkeit als synthetischer Vorläufer für derartige prosthetische Gruppen und jene, in denen das Thiol durch eine Tritylgruppe geschützt ist, sind besonders bevorzugt. Andere Thiolschützende-Gruppen in Vorläufern der Formel (IV), (V) und (VI) sind dem Fachmann gut bekannt und beispielsweise beschrieben in Protecting Groups in Organic Synthesis, Theodora W. Greene und Peter G.M.Wuts, veröffentlicht von John Wiley&Sohns Inc.
Als ein weiterer Aspekt der Erfindung ist bereitgestellt eine Verbindung der Formel (VII), (VIII), (XI), (X), (XI) oder in (XII) wie oben definiert. Diese Verbindungen besitzen eine Nutzbarkeit als PET-Tracer. Von diesen Verbindungen sind jene bevorzugt, in denen das Peptid Arg-Gly-Asp-Peptid oder sein Analoga ist, wie die Peptide, die beschrieben sind in WO 01/77145 und WO 03/006491. Speziell bevorzugte Peptide in diesem Aspekt der Erfindung sind jene der Formel (A) wie oben definiert für die Verbindungen der Formel (I) und (Ia).
Verbindungen der Formel (I) können hergestellt werden durch Standardverfahren der Peptid-Synthese, z.B. Festphasen-Peptid-Synthese. z B. wie beschrieben in Atheron, E. and Sheppard, R.C.; „Solid Phase Sythesis"; IRL Press: Oxford, 1989. Der Einbau der Gruppe „X-CH₂C(O)-" in eine Verbindung der Formel (I) kann erreicht werden durch Reaktion des N-Terminus des Peptids mit der Reagenz der Formel (XIII): X-CH₂C(O)Z (XIII)
Unter Standardbedingungen für die Peptid-Bindungsbildung; wobei X ist wie definiert für die Verbindungen der Formel (I) und Z ist -OH oder eine geeignete Aktivierungsgruppe wie Chloro, Bromo, Fluoro, -OC(O)CH₂-X wobei X ist wie definiert für die Verbindung der Formel (I), oder wenn Z für -OH steht, kann die Säure aktiviert werden unter Verwenden von in-situ-Mitteln, wie 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorphosphat (HBTU) or N-[(Dimethylamino)-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridin-1-ylmethylen]-N-methylmethanaminium-hexafluorophosphat-N-oxid (HATU).
Verbindungen der Formel (Ia) können hergestellt werden durch Standardverfahren der Peptid-Synthese, z.B. Festphasen-Peptid-Synthese, z.B. wie beschrieben in Atheron, E. and Sheppard, R.C.; „Solid Phase Synthesis"; IRL Press: Oxford, 1989. Der Einbau der Gruppe „Maleimid-Y-" in eine Verbindung mit der Formel (Ia) kann erreicht werden durch Reaktion des N-terminus des Peptids mit dem Reagenz der Formel (XIV):
unter Standardbedingungen für die Peptid-Bindungsbildung, wobei Y definiert ist für die Verbindung der Formel (Ia) und Z für -OH oder eine geeignete Aktivierungsgruppe steht wie Chloro, Bromo, Fluoro oder aktive Ester wie Pentafluorphenol oder N-Hydroxysuccinimidester, oder wenn Z für -OH steht, dann kann die Säure aktiviert werden durch Verwendung von in-situ-Aktivierungsmitteln wie HBTU oder HATU, wie oben beschrieben für die Verbindung der Formel (XIII).
Verbindungen der Formel (II) können hergestellt werden aus der entsprechenden Verbindung der Formel (IIa): L-(Linker)-SR (IIa)wobei L für eine Austrittsgruppe steht, wie p-Toluolsulphonat, Trifluormethansulphonat oder Methansulphonat und der Linker ist wie definiert für die Verbindung der Formel (II) und R für Wasserstoff oder eine Thiol-Schutzgruppe steht; durch Reaktion mit Cyclotron-erzeugtem wässrigen [¹⁸F]-Fluorid, geeigneterweise voraktiviert durch Verdampfen aus einer Base (z.B. aus Tetrabutylammonium oder K₂CO₃/Kryptofix-222) in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Acetonitril, N,N-Dimethylformamid oder Dimethylsulphoxid, typischerweise bei erhöhter Temperatur, z.B. 60 bis 120°C, gefolgt durch Entfernen einer beliebigen Thiol-Schutzgruppe unter Verwendung von Standardverfahren.
Die Verbindungen der Formel (IV) können hergestellt werden aus der entsprechenden Verbindung der Formel (IVa): L-(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)_m-SR (IVa)wobei L für eine Austrittsgruppe steht, wie p-Toluolsulphonat, Trifluormethansulphonat oder Methansulphonat und n und m sind wie definiert für die Verbindung der Formel (IV) und R für Wasserstoff oder eine Thiol-Schutzgruppe steht; durch Reaktion mit Cyclotron-erzeugtem wässrigen [¹⁸F]-Fluorid, geeigneterweise voraktiviert durch Verdampfen aus einer Base (z.B. aus Tetrabutylammonium oder K₂CO₃/Kryptofix-222) in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Acetonitril, N,N-Dimethylformamid oder Dimethylsulphoxid, typischerweise bei erhöhter Temperatur, z.B. 60 bis 120°C, gefolgt durch Entfernen einer beliebigen Thiol-Schutzgruppe unter Verwendung von Standardverfahren.
Verbindungen der Formel (V) können hergestellt werden aus der entsprechenden Verbindung der Formel (Va): L-(CH₂)p-SR (Va)wobei L für eine Austrittsgruppe steht wie p-Toluolsulphonat, Trifluormethansulphonat oder Methansulphonat und p ist wie definiert für die Verbindung der Formel (V) und R für Wasserstoff oder eine Thiol-Schutzgruppe steht; durch Reaktion mit Cyclotron-erzeugtem wässrigen [¹⁸F]-Fluorid, geeigneterweise voraktiviert durch Verdampfen aus einer Base (z.B. aus Tetrabutylammonium oder K₂CO₃/Kryptofix-222) in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Acetonitril, N,N-Dimethylformamid oder Dimethylsulphoxid, typischerweise bei erhöhter Temperatur, z.B. 60 bis 120°C, gefolgt durch Entfernen einer beliebigen Thiol-Schutzgruppe unter Verwendung von Standardverfahren.
Verbindungen der Formel (VI) können hergestellt werden aus der entsprechenden Verbindung der Formel (VIa):
wobei L' eine Austrittsgruppe ist wie Iodo, p-Toluolsulphonat, Trifluormethansulphonat oder Methansulphonat und wenn q für 0 steht, kann L' für Nitro oder ein Iodonium- oder Ammoniumsalz stehen, und q und r sind wie definiert für die Verbindung der Formel (VI) und R steht für Wasserstoff oder eine Thiol-Schutzgruppe; durch Reaktion mit Cyclotron-erzeugtem wässrigen [¹⁸F]-Fluorid, geeigneterweise voraktiviert durch Verdampfen aus einer Base (z.B. aus Tetrabutylammonium oder K₂CO₃/Kryptofix-222) in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Acetonitril, N,N-Dimethylformamid oder Dimethylsulphoxid, typischerweise bei erhöhter Temperatur, z.B. 60 bis 120°C, gefolgt von Entfernen einer beliebigen Thiol-Schutzgruppe unter Verwendung von Standardverfahren.
In den Formeln (IIa), (IVa), (Va) und VIa) umfassen geeignete Thiol-Schutzgruppen (Phenyl)₃C-(trityl) und andere, wie sie beschrieben gefunden werden können in Protecting Groups in Organic Synthesis, Theodora W. Greene und Peter G.M.Wuts, veröffentlicht von John Wiley&Sohns Inc. Die Entfernung derartiger Thiol-Schutzgruppen kann bewirkt werden durch Standardverfahren wie jene, die beschrieben sind in Greene. Z.B., wo R für Trityl steht, kann das freie Thiol gebildet werden durch Behandlung mit verdünnter Säure, z.B. Trifluoressigsäure, in einem chlorierten Lösungsmittel, wie Dichlormethan.
In einem bevorzugten Aspekt können die Verbindungen der Formeln (IIa), (IVa), (Va), (VIa) an einen festen Träger gebunden sein, wie Polymerkugeln oder Beschichtungen, z.B. ein Trityl- oder Chlortrityl-Harz. In diesem Aspekt können die überschüssigen Reagenzien und Nebenprodukte der Radiofluorierungs-Reaktion getrennt werden von dem Polymer-gebundenen Produkt durch Waschen. Verwenden der Entschützungsverfahren, wie oben beschrieben, bewirkt die Spaltung der Verbindung der Formeln (II), (IV), (V), (VI) vom festen Träger. Dieser Ansatz kann besonders geeignet sein für eine automatisierte Produktion der Verbindungen der Formeln (II), (IV), (V), (VI). Alternativ können die Nebenprodukte der Thiol-Entschützung, wo sie in der Reaktionsmischung unlöslich sind, durch Filtration entfernt werden.
Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung ist bereit gestellt ein Kit für die Herstellung eines radiofluorierten Tracers, umfassend eine prosthetische Gruppe der Formel (IIa), (IVa), (Va), (VIa) oder ein aktiviertes Peptid der Formeln (I) oder (Ia).
Bei Verwendung des Kits würde die Verbindung der Formel (IIa), (IVa), (Va), (VIa) umgewandelt werden zur entsprechenden Verbindung der Formeln (II), (IV), (V), (VI) unter Verwenden der oben beschriebenen Verfahren. Bevorzugt kann die Verbindung der Formel (II), (IV), (V), (VI) oder ein Thiol-geschützter Vorläufer hergestellt werden aus Abfall-Reaktanten durch Durchlaufenlassen der Reaktionsmischung durch eine Solid-Phase-Extraction (SPE)-Kartusche. Die SPE-Kartusche kann ein Graphit-Kissen oder eine stationäre C₁₈-Phase umfassen. Eine beliebige Thiol-Schutzgruppe kann entfernt werden, z.B. durch Zugabe einer Säure, wie Trifluoressigsäure. Wo die Thiolgruppe in der Verbindung der Formel (II), (IV), (V), (VI) geschützt ist mit einer hydrophoben Gruppe, wie einer Tritylgruppe, kann die Entschützung günstigerweise bewirkt werden auf der SPE-Kartusche, wodurch die hydrophobe Thiol-Schutzgruppe (wie Trityl) an die stationäre Phase gebunden bleibt, während die markierte prosthetische Gruppe der Formel (II), (IV), (V), (VI) in hoher Reinheit und Ausbeute eluiert wird. Die Verbindung der Formel (II), (IV), (V), (VI) würde dann zugegeben werden zur Verbindung der Formel (I) oder (Ia), die geeigneterweise in einem wässrigen Puffer aufgelöst sein kann (pH 7–11). Nach der Reaktion bei einer nicht-extremen Temperatur für 1 bis 60 Minuten kann das markierte Peptid gereinigt werden, z.B. durch SPE, und gesammelt werden.
Die Erfindung wird veranschaulicht mittels der folgenden Beispiele.
Beispiele
Herstellung von ¹⁸F
Fluor-18 wurde hergestellt durch ein Cyclotron unter Verwenden der ¹⁸O(p,n)¹⁸F-Reaktion. Angereichertes [¹⁸O]N₂O (95% ¹⁸O) wurde bestrahlt mit Protonen (19 MeV) mit einem integrierten Strahlstrom von 5–10 μAh.
Synthese des ClCH₂CO-Lys-Gly-Phe-Gly-Lys-OH-Peptids
Zusammenbau der Aminosäuresequenz unter Verwenden einer vollautomatisierten Synthese (ABI 433A), Lys-sasrin-Harz (0,10 mmol) und 10mmol-Kartuschen von Aminosäuren. Nach der Peptidsynthese wurde das Peptid auf Harz in einer manuellen Blasendurchperl- Vorrichtung angeordnet und mit N,N-Dimethylformamid (DMF) gewaschen und frisch erzeugtes Chloressigsäureanhydrid (0,5 mmol), (Chloressigsäure (94,5 mg, 1,0 mmol) und Dicyclohexylcarbodiimid (DCCl) (102,6 mg, 0,5 mmol) in Dichlormethan (DCM) für 10 Minuten gewaschen. Dicyclohexylharnstoff (DCU) wurde abfiltriert und die Lösung wurde verdampft unter verringertem Druck, was das Anhydrid ergab) in DMF wurde zugegegeben. Nach einer Stunde war der Kaiser-Test negativ (gelbes, rotes Harz (auf Grund des Anhydrids)), das Lösungsmittel wurde entfernt und das Harz mit DMF acht mal, dann mit DCM und Diethylether (DEE) gewaschen und N₂-getrocknet. Triisopropylsilan (TIS) und ein Tropfen Wasser wurden zugegeben zum Harz, bevor Trifluoressigsäure (TFA) hinzugegeben wurde. Das Harz wurde nach 50 Minuten abfiltriert und die Lösung unter verringertem Druck abgedampft und mit DEE 3 mal gewaschen. Das Rohprodukt wurde gereinigt durch präparative Reversphasen-Chromatographie, was 64,3 mg reines Produkt ergab (Vydac 218TP1022-Säule; Lösungsmittel A=Wasser/0,1% TFA und B=CH₃CN/0,1% TFA; Gradient 00–30% B über 40 Minuten, Fluss 10ml/Minute; Detektion bei 254 nm). (Analytische HPLC: Phenomenex Luna 00B-4251-E0-Säule; Lösungsmittel: A=Wasser/0,1% TFA und B=CH₃CN/0,1% TFA; Gradient 00–30% B über 10 Minuten; Fluss 2,0 ml/Minute; Retentionszeit 5,1 Minuten, detektiert bei 214 und 254 nm). Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von Massenspektrometrie, was einen m/z-Wert von 612,8 [MH⁺] ergab.
Beispiel 1: Herstellung von 4-Fluormethyl-N-[2-(tritylsulphanyl)ethyl]benzamid, Entschützung und stellenspezifische Konjugation an ein Chloracetyl-modifiziertes Peptid.
1.a) S-Tritylcysteamin
Zu einer gerührten Lösung von Cysteamin (Fluka 3,85 g, 50,0 mmol) in Trifluoessigsäure (TFA) (50 ml) wurde Triphenylmethanol (13,0 g, 50,0 mmol) gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt und konzentriert. Zum Rückstand wurde Ether (250 ml) gegeben. Ausgefallenes Material wurde abfiltriert und mit Ether gewaschen. Das TFA-Salz wurde aufgeteilt zwischen 1 M wässriger KOH-Lösung (150 ml) und Ether (150 ml). Die Phasen wurden getrennt und die Etherphase wurde getrocknet (MgSO₄). Die Lösung wurde filtriert und konzentriert und das Produkt wurde aus Ether/n-Hexan kristallisiert, was 9,20 g (58%) weißen Feststoff ergab.
1.b) 4-Hydroxymethyl-N-[2-(tritylsulphanyl)ethyl]benzamid
Zu der Lösung von S-Tritylcysteamin (1,60 mg, 5,00 mmol) und 4-Hydroxylmethylbenzoesäure-pentafluorphenylester (MilliGen, 1,51 g, 5,00 mmol) in Dichlormethan (40 ml) wurde N-Methylmorpholin (0,55 ml, 5,0 mmol) gegeben. Die Mischung wurde gerührt bei Raumtemperatur für 36 Stunden. Ausgefälltes Material wurde abfiltriert, mit Dichlormethan gewaschen und getrocknet, um 1,30 g (57%) weißen Feststoff zu ergeben. Eine NMR-Analyse war gemäß der Struktur.
1.c) Methansulphonsäure 4-[2-(tritylsulphanyl)ethylcarbamoyl]benzylester
Zu einer Lösung von 4-Hydroxymethyl-N-[2-(tritylsulphanyl)ethyl]benzamid (226 mg, 0,500 mmol) in trockenem THF (8 ml) wurde N-Methylpyrrolidinon (NMP) (61 μl, 0,55 mmol) und Mesylchlorid (85 μl, 1,1 mmol) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 48 Stunden lang gerührt, durch Silika filtriert und konzentriert. Das Produkt wurde durch Säulenchromatographie (Silica, 1% Methanol in Chloroform) gereinigt, um 213 mg eines Öls zu ergeben, das sich langsam verfestigte. Eine NMR-Analyse war gemäß der Struktur.
1.d) 4-Fluormethyl-N-[2-(tritylsulphanyl)ethyl]benzamid
Eine Lösung von Kryptofix (Fluka, 15 mg, 40 μmol) in trockenem Acetonitril (200 μl) wurde zugegeben zu festen Kaliumfluorid (2,3 mg, 80 μmol). Die Mischung wurde 5 Minuten lang geschüttelt. Die Kryptofix/KF-Lösung wurde zu einer Lösung von Methansulphonsäure-4-[2-(tritylsulphanyl)ethylcarbamoyl]benzyl ester (21 mg, 40 μmol) in Acetonitril (400 μl) gegeben. Die Mischung wurde bei 65°C 10 Minuten lang erwärmt. Eine aliquote Menge wurde analysiert durch HPLC (Säule Phenomenex Luna 3 μm C 18(2) 50 × 4,60mm; Lösungsmittel: A=Wasser/0,1% TFA und B=Acetonitril/0,1% TFA, Gradient 40–80% B über 10 Minuten; Fluss 2,0 ml/min, UV-Detektion bei 214 und 254 nm), was eine vollständige Umwandlung des Ausgangsmaterials (t_R 5,6 min) zu einem neuen Produkt (t_R 6,3 min) zeigt. Eine Reinigung durch präparative Reversphasen-HPLC (Säule: Phenomenex Luna C18(2)5 μm 250 × 21,2 mm, Lösungsmittel: A=Wasser/0,1% TFA und B=Acetonitril/0,1% TFA, Gradient 40–80% B über 60 Minuten; Fluss 10,0 ml/min, UV-Detektion bei 214 nm) ergab 4,5 mg weißen Feststoff. Die Struktur wurde durch NMR-Spektroskopie bestätigt.
1.e) 4-Fluormethyl-N-(2-mercaptoethyl)benzamid
Zu 1,4 mg (3,0 μmol)) 4-Fluormethyl-N-[2-(tritylsulphanyl)ethyl]benzamid wurde 50 μl TFA/TIS/H₂O(95:2,5:2,5)-Mischung gegeben. Der Kolben wurde sanft 5 Minuten lang verwirbelt und dann in vacuo konzentriert. LC-MS-Analyse (Säule: Phenomenex Luna 3 μm C18(2) 50 × 2,00mm, Lösungsmittel: A=Wasser/0,1% HCOOH und B=Acetonitril/0,1% HCOOH, Gradient 5–60% B über 10 Minuten; Fluss 0,3 ml/min, UV-Detektion bei 214 nm und 254 nm, ESI-MS) ergab einen Peak (t_R 6,8 min) mit m/z bei 214, was MH⁺ entspricht.
1.f) Stellen-spezifische Konjugation an das Chloracetyl-modifizierte Peptid
Der Rückstand von oben wurde aufgenommen in 100 μl 0,1 M Natriumhydrogencarbonat/Dinatriumcarbonat-Buffer bei pH 9,1. Zur Mischung wurde gegeben eine Lösung des Peptids Chloracetyl-KGFGK-OH (3,7 mg, 6,0 μmol) in 150 μl Puffer. Die Mischung wurde erwärmt bei 45°C für 20 Minuten. LC-MS-Analyse (Säule: Phenomenex Luna 3 μm C18(2) 50 × 2,00mm, Lösungsmittel: A=Wasser/0,1% HCOOH und B=Acetonitril/0,1% HCOOH, Gradient 5–60% B über 10 Minuten; Fluss 0,3 ml/min, UV-Detektion bei 214 nm und 254 nm, ESI-MS) zeigte eine vollständige Umwandlung der Fluorverbindung zu einem neuen Produkt (t_R 4,3 min) was ein m/z bei 789,4 ergab, das dem MH⁺ für das Konjugat entsprach. Das Konjugatprodukt wurde gereinigt durch Reversphasen-HPLC (Säule: Phenomenex Luna C18(2) 5 μm 250 × 21,2mm, Lösungsmittel: A=Wasser/0,1% TFA und B=Acetonitril/0,1% TFA, Gradient 5–60% B über 60 Minuten; Fluss 10,0 ml/min, UV-Detektion bei 214 nm), um 2 mg weißen Feststoff zu ergeben.
Beispiel 2: Herstellung von (3-Fluor-propylsulfanyl)triphenylmethan, Entschützung und stellen-spezifische Konjugation an ein Chloracetyl-Peptid
2.a) Synthese von 3-Tritylsulfanyl-propan-1-ol
Tritylchlorid (27,9 mg, 0,1 mmol) und Triethylamin (49 μl, 0,5 mmol) wurden aufgelöst in DCM (2 ml), bevor 3-Mercapto-1-propanol (9 μl, 0,1 mmol) zugegeben wurde. DCM wurde verdampft unter verringertem Druck nach 6 Stunden und das Rohpro dukt durch präparative Reversphasenchromatographie gereinigt (Vydac 218TP1022 Säule; Lösungsmittel: A=Wasser/0,1% TFA und B=CH₃CN/0,1% TFA, Gradient 30–70% B über 40 Minuten; Fluss 10 ml/min, Detektion bei 254 nm). Eine Ausbeute von 6 mg gereinigtem Material wurde erhalten (Analytische HPLC: Säule Phenomenex Luna C18, 00B-4251-E0: Lösungsmittel: A=Wasser/0,1% TFA und B=CH₃CN/0,1% TFA, Gradient 30–70% B über 10 Minuten; Fluss 1,0 ml/min, Retentionszeit 7,73 Minuten, detektiert bei 214 und 254 nm). Struktur verifiziert durch NMR.
2.b) Synthese von Methansulfonsäure-3-tritylsulfanyl-propylester
Mesylchlorid (6 μl, 0,075 mmol) wurde zu einer Lösung von 3-Tritylsulfanyl-propan-1-ol (5 mg, 0,015 mmol) und Triethylamin (32 μl, 0,23 mmol) in THF (1 ml) gegeben. Nach 30 Minuten wurde THF unter verringertem Druck verdampft und das Rohprodukt in DCM aufgelöst, mit einer gesättigten Lösung von Natriumhydrogencarbonat in Wasser, einer gesättigten von Natriumchlorid gewaschen, und mit MgSO₄ getrocknet. Eine Ausbeute von 10 mg wurde erhalten nach dem Verdampfen unter verringertem Druck (Analytische HPLC: Säule Luna C18, 00B-4251-E0: Lösungsmittel: A=Wasser/0,1% TFA und B=CH₃CN/0,1% TFA, Gradient 40–80% B über 10 Minuten; Fluss 1,0 ml/min, Retentionszeit 7,12 Minuten, detektiert bei 214 und 254 nm). Struktur verifiziert durch NMR.
2.c) Synthese von (3-Fluor-propylsulfanyl)triphenylmethan
KF (1,4 mg, 0,024 mmol) und Kryptofix 222 (9,0 mg, 0,024 mmol) wurden in Acetronitil (0,2 ml) (Erwärmen) aufgelöst. Methansulfonsäure-3-tritylsulfanyl-propylester (5 mg, 0,012 mmol) in Acetonitril (0,2 ml) wurde zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde erwärmt auf 80 Grad für 90 Minuten. Das Rohprodukt wurde gereinigt durch präparative Reversphasenchromatographie (Vydac 218TP1022 Säule; Lösungsmittel: A=Wasser/0,1% TFA und B=CH₃CN/0,1% TFA, Gradient 40–90% B über 40 Minuten; Fluss 10 ml/min, Detektion bei 254 nm). Eine Ausbeute von 2 mg gereinigtem Material wurde erhalten (analytische HPLC: Säule Phenomenex Luna C18, 00B-4251-E0: Lösungsmittel: A=Wasser/0,1% TFA und B=CH₃CN/0,1% TFA, Gradient 40–80% B über 10 Minuten; Fluss 1,0 ml/min, Retentionszeit 8,2 Minuten, detektiert bei 214 und 254 nm). Struktur verifiziert durch NMR.
2.d) Konjugation von 3-Fluor-propan-1-thiol mit Cl-Ac-Lys-Gly-Phe-Gly-Lys-OH
Die Tritylgruppe von (3-Fluor-propylsulfanyl)triphenylmethan (1,0 mg, 0,003 mmol) wurde mit TFA (25 μl) bei Vorhandensein von TIS (5 μl) und Wasser (5 μl) (5 Minuten) gespalten. Die TFA-Lösung wurde auf Eis während der Zugabe von Ammoniak (25%) gekühlt, bis der pH 9 betrug. Eine Lösung von ClCH₂CO-KGFGK-OH 3,6 mg, 0,006 mmol) in 50 μl Wasser wurde zu gegeben und der pH eingestellt auf 9 mit Ammoniak. Die Reaktionsmischung wurde erwärmt auf 60 Grad für 30 Minuten. Die Reaktionsmischung wurde gequencht mit Wasser +0,1% TFA und gereinigt unter Verwenden von präparativer Reversphasenchromatographie (Phenomenex, C18, 00G-4253-N0 Säule; Lösungsmittel: A=Wasser/0,1% TFA und B=CH₃CN/0,1% TFA, Gradient 00–30% B über 30 Minuten; Fluss 5 ml/min, Detektion bei 254 nm): Eine Ausbeute von 0,4 mg gereinigtem Material wurde erhalten (analytische HPLC: Säule Luna 00B-4251-E0: Lösungsmittel: A=Wasser/0,1% TFA und B=CH₃CN/0,1% TFA, Gradient 00–30% B über 10 Minuten; Fluss 1,0 ml/min, Retentionszeit 6,88 Minuten, detektiert bei 214 und 254 nm). Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von Massenspektrometrie, was einen m/z Wert von 670,35 [M-H⁺] ergab.
Beispiel 3: Herstellung von (2-{2-[2-(2-Fluoro-ethoxy)-ethoxy]-ethoxy}-ethyl)-tritylsulfid, Entschützung und stellen-spezifische Konjugation an ein Chloracetyl-modifiziertes Peptid.
3 a) Toluol-4-sulfonsäure 2-{2-[2-(2-hydroxy-ethoxy)-ethoxy]-ethoxy}-ethylester
Zu einer gerührten Suspension von p-Toluolsulfonylchlorid (9,82 g, 51,5 mmol) in 2-{2-[2-(2-Hydroxy-ethoxy)-ethoxy]-ethoxyl-ethanol, (20 g, 103 mmol) bei 0°C wurde tropfenweise Triethylamin hinzugegeben (13 ml, 93 mmol). Die Suspension wurde gerührt bei 0°C für eine Stunde und dann bei Raumtemperatur für weitere 16 Stunden. Die resultierende Mischung wurde aufgelöst in Dichlormethan (350 ml). Die klare und farblose Lösung, die erhalten wurde, wurde mit 1 M Salzsäure (2 × 100 ml) und einmal mit Wasser (200 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und verdampft, um ein farbloses Öl zu ergeben. Das Rohprodukt wurde gereinigt durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von Acetylacetat. Tetraethylenglycolditosylat eluierte zuerst, gefolgt von Toluol-4-sulfonsäure-2-{2-[2-(2-hydroxy-ethoxy)-ethoxy]-ethoxy}-ethylester, als ein farbloses Öl; 8,89 g (49%).
3 b) 2-(2-[2-(2-Mercapto-ethoxy)-ethoxy]-ethoxy}-ethanol
Eine Lösung von Thioharnstoff (0,94 g, 12.35 mmol) und Toluol-4-sulfonsäure-2-{2-[2-(2-hydroxy-ethoxy)-ethoxy]-ethoxy}-ethylester (4,09 g, 11,75 mmol) in absolutem Alkohol (32 ml) wurde bis zu Rückfluss gekocht unter Argon-Atmosphäre für 24 h. Die Mischung wurde gekühlt und eine Lösung von NaOH (1,23 g, 30,75 mmol) in 15 ml Ethanol/Wasser (9:1, v/v) wurde zugegeben. Rückflusskochen wurde fortgesetzt für weitere 2,5 h unter Argon. Die Reaktionsmischung wurde dann auf Umgebungstemperatur gekühlt und angesäuert auf pH 2 unter Verwenden von konzentrierter Salzsäure und dann konzentriert unter verringertem Druck. Der Rückstand wurde gereinigt durch Flash-Chromatographie unter Verwenden von Acetylacetat/absolutem Ethanol (10:1), um das Produkt als ein farbloses Öl zu ergeben. Ausbeute 1,55 g (66%).
3 c) 2-{2-[2-(2-Tritylsulfanyl-ethoxy)-ethoxy]-ethoxy}-ethanol
Zu 2-{2-[2-(2-Mercapto-ethoxy)-ethoxy]-ethoxy}-ethanol (310 mg, 1,47 mmol) und Tritylchlorid (452 mg, 1,62 mmol, 1.1 eq.) in einem Rundkolben wurde gleichzeitig Tritylamin (2,1 ml, 10 eq.) und THF (25 ml) unter Argon gegeben. Die anfängliche rote Farbe verschwand beim Rühren bei Umgebungstemperatur für eine Stunde. Die Reaktion wurde überwacht durch TLC, Ethylacetat/Ethanol (1:1) und nach 6 Stunden abgeschlossen. Danach wurde Methanol (6 ml) zugegeben, um überschüssiges Tritylchlorid zu verbrauchen und die Mischung für 5 Minuten gerührt, vor dem Verdampfen der Lösungsmittel. Der Rückstand wurde gereinigt durch Flash-Chromatographie unter Verwenden von 100% Ethylacetat, um das Produkt (550 mg, 83%) als ein farbloses Öl zu ergeben.
3 d) Methansulfonsäure-2-{2-[2-(2-tritylsulfanyl-ethoxy)-ethoxy]-ethoxy}-ethylester
Zu einer gerührten THF (12 ml) Lösung von 2-{2-[2-(2-Tritylsulfanyl-ethoxy)-ethoxy]-ethoxy}-ethanol (227 mg, 0,50 mmol) und Triethylamin (139 μl, 1,0 mmol) wurde Methylsulfonylchlorid gegeben (47 μl, 0,60 mmol, 1,2 eq.). Nach dem Rühren für 2 Stunden bei Umgebungstemperatur wurde die Mischung filtriert, um präzipitiertes Triethylaminhydrochlorid-Salz zu eliminieren, die Lösungsmittel wurden verdampft. Der Rückstand wurde gereinigt mit Flash-Chromatographie, um das Produkt (238 mg, 90%) als ein farbloses Öl zu ergeben.
3 e) Synthese von 2-{2-[2-(2-Fluor-ethoxy)-ethoxy]-ethoxy}-ethyl)-tritylsulfid
Eine gerührte Lösung von Methansulfonsäure-2-{2-[2-(2-tritylsulfanyl-ethoxy)-ethoxy]-ethoxy}-ethylester (71,67 mg, 0,14 mmol) und Tetrabutylammoniumfluorid (1,1 M in THF, 127 μl, 0,14 mmol) wurde bei 90°C 30 Minuten lang erwärmt. Die Mischung wurde auf Umgebungstemperatur gekühlt und zum Trocknen verdampft. Eine Reinigung des Produktes erfolgte durch Flash-Chromatographie unter Verwenden von Ethylacetat/Hexan (1:1), um das Produkt (71%) als ein farbloses Öl zu ergeben.
Beispiel 3 f) Entschützung der Tritylgruppe und stellen-spezifische Konjugation an das Chloracetyl-Peptid
Entschützung der Tritylgruppe und stellen-spezifische Konjugation an das Chloracetyl-funktionalisierte Peptid wurde ausgeführt wie beschrieben in Bsp. 1.e) und f) oben.
HPLC-Verfahren für die Beispiele 4 bis 6
Beckmann System und Gold^®, Säule: Luna Phenomenex, C18,3 μm, 50 × 4,6 mm i.d.; Fluss 1 ml/min; Lösungsmittel A: Wasser (0,1%) TFA, Lösungsmittel B: Acetonitril (0,1% TFA).
Gradientensystem 1:1 min 40% B, 15 min 40 → 80% B, 5 min 80% B
Gradientensystem 2:1 min 0% B, 10 min 0 → 30% B, 5 min 30% B, 5 min 30 → 80% B
Beispiel 4: Herstellung von 4-[¹⁸F]-Fluormethyl-N-[2-(tritylsulphanyl)ethyl]benzamid, Entschützung und stellen-spezifische Konjugation an ein Chloracetyl-modifiziertes Peptid
4.a) Herstellung von 3-[¹⁸F]-Fluormethyl-N-(2-mercaptotrityl-ethyl)-benzamid
Die Herstellung wurde ausgeführt durch Verfahren analog zu jenen, die im Beispiel 5a) beschrieben sind. Der Mesylat-Vorläufer, der hergestellt wurde wie beschrieben im Beispiel 1c), wurde gerührt bei Raumtemperatur für 15 Minuten, um das gewünschte Produkt in einer 22%igen radiochemischen Ausbeute (HPLC) zu ergeben.
4 b) Chemoselektive Ligation an das Peptid Cl-CH₂CO-Lys-Gly-Phe-Gly-Lys-OH
Die Entschützung und Ligierung des ¹⁸F-Synthons vom Beispiel 4a mit dem Peptid-Vorläufer Cl-CH₂CO-Lys-Gly-Phe-Gly-Lys-OH, wurde ausgeführt nach den Verfahren, die in Bsp. 5 beschrieben sind. HPLC-Analyse zeigte die Bildung des gewünschten Produktes mit einer radiochemischen Reinheit von 80%.
Beispiel 5: Herstellung von (3-[¹⁸F]-Fluor-propylsulfanyl)triphenylmethan, Entschützung und stellen-spezifische Konjugation an ein Chloracetyl-Peptid
5 a) Herstellung eines ¹⁸F-Synthons: 3-[¹⁸F]Fluor-1-mercaptotrityl-propan
Zu einem Wheaton-Fläschchen (2 ml), beladen mit Kryptofix ^®222 (10 mg), Kaliumcarbonat (1 mg aufgelöst in 50 μl Wasser) und Acetronitril (0,8 ml), wurde das Fluor-18 enthaltene Wasser (10 mCi, 1 ml) gegeben. Das Lösungsmittel wurde entfernt durch Erwärmen bei 110°C für 1 Stunde unter einem Stickstoffstrom. Wasserfreies Acetonitril (0,5 ml) wurde zugegeben und wieder verdampft wie zuvor. Dieser Schritt wurde zweimal wiederholt. Das Fläschchen wurde auf Raumtemperatur gekühlt, gefolgt vom Injizieren einer Lösung des Mesylats, das hergestellt war wie beschrieben in Beispiel 2b) (1 mg) in wasserfreiem DMSO (0,2 ml). Die Reaktionsmischung wurde gerührt bei 80°C für 5 Minuten und analysiert durch HPLC (Gradient 1, radiochemische Ausbeute 90%).
Die Reaktionsmischung wurde verdünnt mit DMSO/Wasser (1:1 v/v, 0,15 ml) und auf eine SepPak-Plus-Kartusche (^tC18, Waters) geladen, die konditioniert worden war (10 ml Acetonitril, 20 ml Wasser). Die Kartusche wurde mit Wasser (10 ml) gewaschen und das Produkt unter Verwenden von Acetonitril eluiert. Die radiochemische Reinheit betrug 99%.
5 b) Chemoselektive Ligierung von a) zu Cl-CH₂CO-Lys-Gly-Phe-Gly-Lys-OH
Eine Lösung des Produktes aus 5a) in Acetonitril (0,5 ml, 1,1 mCi) wurde zum Trocknen verdampft unter Verwenden eines Stickstoffstroms und Erwärmen bei 100°C. Eine Mischung von TFA (0,05 ml), Triisopropylsilan (0,01 ml) und Wasser (0,01 ml) wurde zugegeben, gefolgt von Erwärmen für 10 Minuten bei 80°C. Nach dem das Fläschchen auf 0°C gekühlt war, wurde Ammoniak (27% in Wasser, 0,1 ml) und Cl-CH₂CO-Lys-Gly-Phe-Gly-Lys-OH (1 mg) in Wasser (0,05 ml) zugegeben. Die Mischung wurde gerührt für 30 Minuten bei 80°C. Analyse durch HPLC (Gradient 2) zeigte eine Bildung des erwünschten Produktes mit einer radiochemischen Reinheit von 93%.
Beispiel 6: Herstellung von 2-{2-[2-(2-[¹⁸F]-Fluor-ethoxy)-ethoxy]-ethoxy}-ethyl)-tritylsulfid, Entschützung und stellen-spezifische Konjugation an ein Chloracetyl-modifiziertes Peptid
6 a) Herstellung des ¹⁸F-Synthons: 2-{2-[2-(2-[¹⁸F]-Fluor-ethoxy)-ethoxy]-ethoxy}-mercaptotrityl-ethan
Diese Herstellung wurde durchgeführt wie in Beispiel 5a) beschrieben. Nach dem Umsetzen des Mesylat-Vorläufers, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 3d), für 15 Minuten in DMSO bei 80°C wurde eine radiochemische Ausbeute von 76% des Produktes erhalten (HPLC). Eine Extraktion durch Sep-Pak ergab das erwünschte Produkt in einer radiochemischen Reinheit von 97%.
6.b) Chemoselektive Ligation an das Peptid Cl-CH₂CO-Lys-Gly-Phe-Gly-Lys-OH
Die Entschützungs- und Ligationsreaktion des ¹⁸F-Synthons aus Beispiel 6a) mit dem Peptid-Vorläufer Cl-CH₂CO-Lys-Gly-Phe-Gly-Lys-OH wurde ausgeführt nach den Verfahren, die in Beispiel 5 beschrieben sind. Eine HPLC-Analyse zeigte eine Bildung des gewünschten Produktes in einer radiochemischen Reinheit von 41%.
Beispiel 7
Synthese von [Cys^2–6]cyclo[CH₂CO-Lys(4-{3-[2-(4-Fluormethyl-benzoylamin)-ethylsulfynyl]-2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl-methyl}-cyclohexan-1-carbonyl)-Cys²-Arg-Gly-Asp-Cys⁶-Phe-Cys]-NH₂
7 a) Synthese von [Cys^2–6]cyclo[CH₂CO-Lys-Cys²-Arg-Gly-Asp-Cys⁶-Phe-Cys]-NH₂
Die Titelverbindung wurde synthetisiert wie beschrieben in WO 03/006491.
7.b) Synthese von [Cys^2–6]cyclo[CH₂CO-Lys(4-[N-maleimidomethyl]-cyclohexan-1-carbonyl)-Cys²-Arg-Gly-Asp-Cys⁶-Phe-Cys]-NH₂
Zu 5 mg des Peptids aus 4a) oben in DMF 1 ml wurden 3 mg Sulfosuccinimidyl-4-[N-maleimidomethyl]-cyclohexan-1-carboxylat (Pierce) und 0,05 ml NMM hinzugegeben. Die Reaktion ließ man bei Raumtemperatur zwei Stunden lang rühren, sie wurde dann mit 5 ml Wasser verdünnt und geladen auf eine halb-präparative Luna-C18-Säule. Die Produktfraktion wurde gesammelt und gefriergetrocknet, was 1 mg des erwünschten Produktes ergab. Die Struktur wurde bestätigt durch MALDI-MS: Erwartet M+H+, 1189; gefunden 1190.
7. c) Stellen-spezifische Konjugation an das Maleimid-modifizierte Peptid
Zu 0,16 mg (0,34 μmol) 4-Fluormethyl-N-[2-(tritylsulphanyl)ethyl]benzamid (aus Beispiel 1d oben) wurden 50 μl TFA/TIS/H₂O(95:2,5:2,5)-Mischung gegeben. Der Kolben wurde sanft 5 Minuten lang verwirbelt und dann in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde in 50 μl Wasser aufgenommen. Zu der Mischung wurde eine Lösung von 0.4 mg (0,34 μmol) Maleimid-modifiziertes Peptid in 50 μl Wasser gegeben und der pH eingestellt auf 6,5 mit 0,001 M Natriumhydroxid. Nach 50 Minuten LC-MS-Analyse (Säule Phenomenex Luna 3 μm C18(2) 50 × 2,00mm; Lösungsmittel: A=Wasser/0,1% HCOOH und B=Acetonitril/0,1% HCOOH; Gradient 0–50% B über 10 Minuten; Fluss 0,3ml/min, UV-Detektion bei 214 und 254 nm, ESI-MS) zeigte eine fast vollständige Umwandlung des Maleimid-modifizierten Peptids zu einem neuen Produkt (t_R 7,6 min) was m/z bei 1400,7 ergab, entsprechend dem M+H+ für das Konjugat.
Beispiel 8
Synthese von [Cys^2–6]cyclo[CH₂CO-Lys(4-{3-[2-(4-[¹⁸F]-fluormethyl-benzoylamino)-ethylsulfanyl]-2,5-dioxo-pyrrolidin-1-ylmethyl}-cyclohexan-1-carbonyl)-Cys²-Arg-Gly-Asp-Cys⁶-Phe-Cys]-N
Die Titelverbindung wird hergestellt aus dem modifizierten Peptid des Beispiels 7b durch Reaktion mit 4-[¹⁸F]-Fluormethyl-N-[2-(tritylsulphanyl)ethyl]benzamid (Beispiel 4) unter Verwenden von Verfahren, die analog zu jenen sind, die im Beispiel 7c beschrieben sind.

Claims

Verfahren zur Radiofluorierung, umfassend eine Reaktion einer Verbindung der Formel (I) oder (Ia):
mit einer Verbindung der Formel (II): ¹⁸F-(Linker)-SH wobei: X eine austretende Gruppe ist, ausgewählt aus Chloro, Bromo und Iodo, und bevorzugt Chloro ist; Y eine C_1–10-Hydrocarbylgruppe ist, die gegebenenfalls umfasst 1 bis 6 Heteroatome; und der Linker in Formel (II) eine C_1–30-Hydrocarbylgruppe ist, die gegebenenfalls umfasst 1 bis 10 Heteroatome; um eine Verbindung der Formel (III) bzw. (IIIa) zu ergeben
wobei die Linkergruppe ist wie definiert in der Verbindung der Formel (II), Y ist wie definiert in der Verbindung der Formel (Ia).
Verfahren zur Radiofluorierung nach Anspruch 1, umfassend eine Reaktion einer Verbindung nach der Formel (I):
mit einer Verbindung der Formel (IV), (V) oder (VI): ¹⁸F-(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)_m-SH (IV) ¹⁸F-(CH₂)_p-SH (V)
wobei: X eine austretende Gruppe ist, ausgewählt aus Chloro, Bromo und Iodo, und bevorzugt Chloro ist, n eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist; m eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist; p eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist; q eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist; r eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist; um eine Verbindung der Formel (VII), (VIII) bzw. (IX) zu ergeben:
wobei m, n, p, q und r sind wie definiert für die Verbindung der Formel (IV), (V) oder (VI).
Verfahren zur Radiofluorierung nach Anspruch 1, umfassend eine Reaktion einer Verbindung der Formel (Ia):
mit einer Verbindung der Formel (IV), (V) oder (VI): ¹⁸F-(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)_m-SH (IV) ¹⁸F-(CH₂)_p-SH (V)
wobei: Y eine C_1–10-Hydrocarbylgruppe ist, die gegebenenfalls umfasst 1 bis 6 Heteroatome; n eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist; m eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist; p eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist; q eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist; r eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist; um eine Verbindung der Formel (X), (XI) bzw. (XII) zu ergeben:
wobei m, n, p, q und r sind wie definiert für die Verbindung der Formel (IV), (V) oder (VI) und Y ist wie definiert für die Verbindung der Formel (Ia).
Verbindung der Formel (IV): ¹⁸F-(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)_m-SH (IV)oder einen Thiol-geschützten Vorläufer davon, wobei: n eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist; m eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist.
Verbindung der Formel (V): ¹⁸F-(CH₂)_P-SH (V)oder einen Thiol-geschützten Vorläufer davon, wobei p eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist.
Verbindung der Formel (VI):
oder einen Thiol-geschützten Vorläufer davon, wobei: q eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist; und r eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist.
Verbindung der Formel (VII), (VIII) oder (IX):
wobei: n eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist; und m eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist. p eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist. q eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist; und r eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist.
Verbindung der Formel (X), (XI) oder (XII):

wobei: n eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist; m eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist; p eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist; q eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist; r eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist; und Y eine C_1–10-Hydrocarbylgruppe ist, die gegebenenfalls umfasst 1 bis 6 Heteroatome.
Verbindung der Formel (XII) gemäß Anspruch 8, welche ist:
Ein Radiofluorierungs-Kit, umfassend: (i) eine Verbindung der Formel (IIa) L-(Linker)-SR (IIa)wobei L eine austretende Gruppe ist, wie p-Toluolsulfonat, Trifluormethansulfonat oder Methansulfonat, der Linker eine C_1–30-Hydrocarbylgruppe ist, gegebenenfalls umfassend 1 bis 10 Heteroatome; R Wasserstoff oder eine Thiol-Schutzgruppe ist; und (ii) ein aktiviertes Peptid der Formel (I) oder (Ia) wie definiert in Anspruch 1.
Radiofluorierungs-Kit gemäß Anspruch 10, umfassend (i) eine Verbindung der Formel (IVa), (Va) oder (VIa) L-(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)_m-SR (IVa) L-(CH₂)_p-SR (Va)
n ist eine ganze Zahl von 1 bis 20; m ist eine ganze Zahl von 1 bis 10; p ist eine ganze Zahl von 1 bis 20; q ist eine ganze Zahl von 0 bis 4; r ist eine ganze Zahl von 1 bis 10; L ist eine austretende Gruppe, wie p-Toluolsulfonat, Trifluormethansulfonat oder Methansulfonat; L' ist eine austretende Gruppe, wie Iodo, p-Toluolsulfonat, Trifluormethansulfonat oder Methansulfonat, und wenn q Null ist, kann L' Nitro oder ein Iodonium- oder Ammonium-Salz sein, R ist Wasserstoff oder eine Thiol-Schutzgruppe; und (ii) ein aktiviertes Peptid der Formel (I) oder (Ia) wie definiert in Anspruch 1.