WO2012168196A1 - Herstellung und verwendung eines peptids mit einer n-terminalen 11c-markierten acetylgruppe - Google Patents

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WO2012168196A1
WO2012168196A1 PCT/EP2012/060520 EP2012060520W WO2012168196A1 WO 2012168196 A1 WO2012168196 A1 WO 2012168196A1 EP 2012060520 W EP2012060520 W EP 2012060520W WO 2012168196 A1 WO2012168196 A1 WO 2012168196A1
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carbon atom
acetyl group
acetyl
molecule
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Julian KRETZ
Vivien SCHUBERT
Ursus KRÜGER
Oliver Lade
Ines NEUNDORF
Arno Steckenborn
Roderich SÜßMUTH
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Siemens Aktiengesellschaft
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C07K14/68—Melanocyte-stimulating hormone [MSH]

Definitions

  • the invention relates to an N-terminal acetylated peptide, a process for its preparation and the use of the peptide for the production of an agent for the detection of a diseased tissue. It further relates to a radiopharmaceutical which comprises such a peptide, for the localization of a Tu ⁇ mors.
  • the molecules are chosen so that they interact with cell surface molecules that are only or to a particularly high degree expressed by the tumor cells.
  • Such cell surface molecules are often transmembrane receptors, such as epidermal growth factor receptors, growth hormone receptors, or melanocortin-1 receptor (MC1R) receptors.
  • M1R melanocortin-1 receptor
  • the molecules that bind to the surface receptors are labeled with a radionuclide, is a biochemical ⁇ After setting of the tumor cells in vivo possible.
  • radionuclides such as Ga or 64 Cu, using large Chelatormoleküle in ⁇ game as ethylenediamine tetraacetate (EDTA) to the detection molecule coupled.
  • the invention is therefore based on the object to provide a suitable as a PET marker agent whose radioactive isotope labeling can be done in a very short time.
  • the object is achieved by providing an N-terminal acetylated peptide having an 11 C carbon atom.
  • the 11 C-carbon atom is a carbon atom of the acetyl group, the radionuclide with the acetyl group, that is, only after the peptide synthesis is already striglos ⁇ sen attached. After acetylation, the radioactively labeled peptide is immediately available as a PET marker.
  • peptide labeled with 11 C-carbon is inexpensive to produce and readily metabolizable compared to molecules labeled with conventional radionuclides.
  • peptide refers to an organic compound of at least two amino acids linked via a peptide bond. It includes both oligopeptides of up to about 10 amino acids, as well as polypeptides of up to about 30 amino acids, regardless of their primary, secondary or
  • the peptide of the invention is from Amino Text ⁇ ren, that is set up and therefore for patients particularly good treaty ⁇ Lich from autologous or body similar Molekü- len. It is non-toxic and can of course be metabolized, degraded and excreted.
  • acetylation refers to the introduction of an acetyl group (CH 3 CO) into an organic compound, preferably ⁇ as in a peptide.
  • an acetyl group is generally bound to a free hydroxy (OH) or a free amino (NH 2 ) group.
  • Acetylations of peptides and proteins occur naturally at the primary amino group, that is ⁇ -amino group, the N-terminal amino acid, as well as at amino groups of the side residues, especially lysine.
  • N-terminal amino group is mediated.
  • acetylation of the ⁇ -melanocyte stimu ⁇ lierenden hormone ( ⁇ -MSH) Zeptor increases its interaction with the MCl-Re and leads to an increased activity of the Rezep- tors.
  • the acetylated ⁇ -MSH is an up to three times longer half-life than the non-modifi ed ⁇ peptide.
  • beta-endorphin In the case of beta-endorphin, however, was Festge ⁇ assumed that the N-terminal acetylation to a reduction the opiate activity of the molecule compared to the non-acetylated variant leads, so that the modified molecule causes a lower risk of dependency (Polevoda B and Sherman F, 2002).
  • the acetylation of the peptide can therefore also be used to optimize properties of the peptide which are important for its function as a PET marker, such as, for example, stability, reaction specificity and side effects.
  • the detection of the peptide takes place via an 11 C carbon atom integrated in the acetyl group. Upon decay of the 11 C carbon isotope, positrons, also referred to as ⁇ + radiation, are formed.
  • the positrons hit an electron, they form two photons, which move away from each other at an angle of 180 °, ie exactly in the opposite direction.
  • the photons can be detected and from this the position of the positron emission, or of the 11 C carbon atom, can be calculated. Characterized can be made firmly ⁇ both the Po ⁇ sition of the peptide as well as a quantification of the accumulated peptides at a position within a body.
  • the integration of a 11 C carbon atom in the peptide it also allows to avoid the use of chemical ⁇ shear, foreign substances.
  • the integration of the 11 C-carbon atom in the Ace ⁇ tylizi radioactive labeling can also be performed independently of peptide synthesis.
  • the already fer ⁇ tig Asked peptide is radioactively labeled by acetylation and then stands as PET markers are available. This is particularly advantageous because the half-life of the C-carbon isotopes is only about 20 minutes, so that the longer the time between the isotope label of the peptide and its use, the higher the radiation dose originally used must be.
  • the 11 C-labeling with the acetyl group that is, after completion of the eigentli ⁇ chen synthesis of the peptide attached, the peptide may be UNMIT ⁇ telbar then used. In this way, the time span between the processing of the C-carbon and the use of the peptide is reduced and the radiation loss during production is minimized.
  • the ur ⁇ originally used radiation dose can therefore be chosen correspondingly ge ⁇ ringer.
  • the production is both less costly and the radiation exposure for the technical staff, which produces the peptide, less.
  • the C-carbon atom is the primary carbon atom of the acetyl group.
  • ⁇ C carbon isotope In order to introduce the ⁇ C carbon isotope into the acetyl group, it must be provided in the form of a precursor molecule. Since ⁇ at is the use of 1X C0 2 is particularly suitable because it made in routine method using a cyclotron who can ⁇ . Cyclotrons are available for the production of both large and small amounts of radionuclides. Especially in hospitals, small volume cyclotrons are used to produce radionuclides for on-site PET processes.
  • the ⁇ C-carbon atom is the primary carbon atom of the acetyl group, since it, together with the oxygen atom, the carbonyl group of the acetyl bil ⁇ det.
  • the peptide has at least one D-amino acid.
  • D-amino acid With the exception of glycine, amino acids have a chiral center at their alpha carbon atom and can therefore exist as configurational isomers, namely as the D or L amino acid.
  • the body's own peptides and proteins are largely derived from amino acids in L configuration.
  • most natural proteases and peptidases work stereoselectively and mainly metabolize L-amino acids. Therefore, the degradation of D-amino acids by endogenous enzymes takes longer than that of L-amino acids.
  • Another object of the invention is a process for the preparation of an N-terminally acetylated peptide having an 11 C carbon atom, comprising the steps of providing ⁇ a peptide peptide, providing an acetyl group-transferring molecule, reacting the peptide with the molecule, whereby an acetyl group of the molecule on the N-terminal
  • Amino group of the peptide is transferred, and purifying the acetylated peptide.
  • the isotope labeling of the peptide is tidsynthese from the Pep independent.
  • the time required for the processing of the 11 C-carbon isotope, which is critical due to the low half-life, is therefore independent of the time required for peptide synthesis. This is namely already completed before the acetyl group is transferred.
  • the labeling by means of 11 C-labeled acetyl group is therefore possible for any peptides.
  • other modifications of the peptide such as formylations,
  • Phosphorylations, hydroxylations or glycosylations are carried out before the 11 C carbon atom is introduced.
  • the acetyl group is transferred to the alpha N-terminal amino group of the peptide.
  • the transfer of the 11 C carbon in the form of an acetyl group can be carried out in a single reaction ("one-pot" reaction).
  • the peptide is washed with suitable reagents and, for example, purified by filtration.
  • the peptide is provided by means of solid phase synthesis.
  • the solid phase synthesis ⁇ allows peptides of defined sequence, a ⁇ finally chemically produce polypeptides and proteins.
  • an amino acid which forms the starting point of the synthesis, C-terminal to a solid phase, for example ⁇ a resin bound. Subsequently, it is gradually reacted with activated amino acids so that a Amino Text ⁇ rekette is built up from the C to N-terminal.
  • the Amino Text ⁇ resequenz is determined that in each reaction step, only a certain activated amino acid in the reac tion mixture is ⁇ present.
  • the peptide may also be made with ⁇ means of liquid-phase synthesis.
  • the liquid ⁇ phase synthesis is particularly useful to produce large quantities of a specific peptide in stock. The thus synthesized peptide is then, again in a
  • Liquid phase reaction acetylated, wherein the C-terminus of the peptide is covered with a suitable protective group before acetylation.
  • both methods can also be combined to form so-called combinatorial systems (Han et al., 1995).
  • the peptide may be coupled and then made available to a solid phase in a large scale by means of liquid-phase synthesis Herge ⁇ represents. The acetylation is then carried out on the peptide bound to the solid phase.
  • the acetyl group-transferring molecule is acetyl chloride.
  • proteins are usually acetylated by specific enzymes, so-called acetylases, by transfer of an acetyl group of coenzyme A.
  • acetyl chloride AcCl
  • acetyl bromide or acetic anhydride used as a donor of acetyl groups.
  • the pure 11 AcCl is then obtained by fractional distillation.
  • the distillation is carried out by means of micro process engineering.
  • Microprocess engineering apparatus are suitable for processing particularly small amounts of substance, with chemical or physical reactions taking place in so-called microchannels.
  • micro process engineering apparatuses operate in the flow-through process, so that even very small amounts of particularly high substance concentrations can be processed as required.
  • the production as part of a flow process makes it possible to provide sufficient amounts of pure 11 AcCl in a short time, which can be processed immediately.
  • the width ⁇ ren are reactions preferably taking place at room temperature because it hung no additional costs for the increase or decrease of the reaction temperature must be expended. Due to the low half-life of the X1 C carbon isotope, reactions are also preferred which especially fast, preferably within less than 6 minutes, more preferably in 1 to 5 or 3 to 5 minutes.
  • the N-terminal acetylation of the peptide can be carried out by means of acetic anhydride.
  • Acetic anhydride ⁇ for example cellulose
  • acetic anhydride ⁇ traditionally used for the acetylation of organic substances.
  • acetic anhydride ⁇ development established procedures are available, also using molecules that X1 C-
  • Carbon atoms can be carried out. Due to the short half-life of the 11 C carbon, fast and easy to carry out procedures are preferred.
  • acetic anhydride can be achieved for example by the reaction of two AcCl molecules such as ⁇ derum produced using ⁇ CC ⁇ (Lewer P and J MacMillan, 1983).
  • free hydroxyl (OH) groups of the peptide during peptide synthesis and currency ⁇ rend the acetylation, by triphenylmethyl (trityl) ether protected.
  • Free hydroxy (OH) groups are particularly reactive and can lead to undesirable side reactions both during peptide synthesis and during acetylation. They must therefore be protected by chemical groups such as tert-butyl ether. After completion of the synthesis / acetylation, however, these protective groups must be removed again, the chemical cleavage of the protective groups should take as little time as possible because of the low half-life of the carbon iso-tops.
  • the ab ⁇ fission of trityl is particularly preferred in this case because the chemical reaction proceeds rapidly.
  • Another object of the invention is the use of an N-terminally acetylated peptide for the preparation of an agent for the detection of a diseased tissue.
  • diseased tissue refers to cells, parts of organs or whole organs that do not or not fully fulfill their physiological function. These include, for example, viruses or bacteria infected cells, hypertrophic tissue, inflamed tissue and organs, hyperplas ⁇ diagram and neoplastic tissue, such as ulcers, tumors and cancers. Diseased cells often form proteins whose expression is typical of a particular disease. These proteins are preferably located on the surface of Zel ⁇ len.
  • tumor refers, in particular, a local increase in the volume of tissue, such as inflammatory-anti ⁇ che swelling or spontaneous, uninhibited formation of new cells. Tumor cells also often express certain
  • Surface molecules such as receptor molecules, which sit on the cell surface or are anchored in the cell membrane and bound by suitable ligands.
  • a peptide that interacts with a surface molecule that is expressed specifically or in particularly high amounts of diseased cells or tumor cells it can be used to detect these cells in the organism.
  • the peptide binds to the surface morbid Zel ⁇ len or accumulates inside the cells of the diseased tissue. There it can be detected via the positron emission of the X1 C carbon isotope of its acetyl group.
  • Interaction refers to any kind of chemical bond between two atoms or molecules, especially ionic ones Bonding, electrovalence, covalent bonding, van der Waals bonding, metallic bonding, electrostatic interaction, and hydrogen bonding.
  • the peptide is preferably be ⁇ selects the group consisting of receptor ligands, pern Antikör- and parts thereof, aptamers, T cell receptor fragments and peptide transporter binding peptides. Particularly preferred are peptides, because of their acetylation be a ⁇ Sonders strong bond with the surface molecule (as example ⁇ a receptor) enter into the diseased tissue. As a result, the specificity of the peptide is increased, so that the
  • Peptide specifically binds to the surface molecule of the diseased tissue, without interacting with other molecules.
  • the unbound peptides are metabolized and excreted by endogenous proteases, so that an improved signal / background ratio in the case of PET is achieved.
  • the agent is a radiopharmaceutical.
  • radiopharmaceuticals refers to medicines containing radionuclides whose radiation is used for diagnosis and therapy. The main applications are in oncology, Kar ⁇ ogy and neurology, as well as pharmaceutical research.
  • the radionuclides used are gamma or beta-emitting nuclides, for example 133 xenon, 99m technetium, 68 gallium, and 18 fluorine. They are usually attached via Kom ⁇ formers such as DOTA, DTPA or EDTA mono- or polysaccharides.
  • the nuclides depending on the nature of their radiation by scintigraphy, single photon emission Com- puted Tomography (SPECT) or positron emission tomography Tomogra ⁇ (PET) detected.
  • SPECT single photon emission Com- puted Tomography
  • PET positron emission tomography Tomogra ⁇
  • conventional radiopharmaceuticals can Volunteerwir ⁇ diseases, such as anaphylactic or allergic reactions cause in the body of a patient.
  • the use of a peptide from the body's own or similar amino acids significantly reduces this risk because neither the peptide itself nor its degradation products are toxic.
  • carbon unlike technetium or xenon, an element found in the body that naturally can be metabolized.
  • a further subject of the invention is a radiopharmaceutical for the localization of a tumor which comprises an N-terminally acetylated peptide.
  • the radiopharmaceutical invention provides a host ⁇ economically and medically beneficial agent to the posi ⁇ tion of a tumor in vivo to determine.
  • the peptides contained therein distributed in the body and accumulate on the cells of the tumor, where they are detected by the radioactive signal of the C-11 carbon atom. In this way, the position of the tumor is determined in the body of Pa ⁇ tienten.
  • the radiopharmaceutical is a PET biomarker.
  • PET is an established method for detecting the radiation of radioactive elements and determining their position (Massoud TF, Gambhir SS, 2003). With the aid of detector devices arranged annularly around the patient, sectional images are created on which the decay events are represented in their spatial distribution in the interior of the body. In contrast to the usual scintigraphic chromatography method, is by the annular configuration of the PET detectors a more precise spatial localization of the positron ⁇ nenemission and thus a substantially more accurate and detailed ⁇ profiled image of the tumor possible. PET also makes it possible to quantify the amount of labeled molecules in a tissue.
  • FIG. 1 shows schematically the preparation of C-acetyl chloride (AcCl), where CO 2 is preferably ⁇ 1 00 2 and the acetyl chloride formed is 11 C-acetyl chloride.
  • FIG. 2 shows schematically the preparation of N-terminally acetylated peptide 1 by solid phase synthesis and using AcCl, the AcCl being preferably 11 AcCl.
  • Coupling of first amino acid 2 to trityl resin 1 g of trityl resin was introduced into a 10 ml syringe reactor and Fmoc-glycine-OH (1.2 mmol) and diisopropylethylamine (DIPEA, 3.6 mmol, in 4 ml of dichloromethane ( DCM)). To bind glycine to the resin, the mixture was shaken for 30 minutes. The solvent was then removed by suction filtration ⁇ .
  • DIPEA diisopropylethylamine
  • the resin was washed with dimethylformamide (DMF, 2 x 5 mL), MeOH (1 x 5 mL) and DCM (3 x 5 mL).
  • Resin capping The glycine-loaded resin was placed in a 10 ml syringe reactor and, after adding 5 ml of a mixture of DCM, MeOH, DIPEA (80/15/5), shaken for 15 minutes. The solvents were removed at ⁇ closing by suction filtration and the capping procedural repeated.
  • Fmoc deprotection To cleave the Fmoc protecting group from the glycine, the loaded resin was placed in a 10 ml syringe reactor and 5 ml of piperidine in DCM (20%) was added. The mixture was shaken for 1 x 2 minutes and 1 x 15 minutes and the solvents removed by suction filtration.
  • Acetylation The peptide-loaded resin was placed in a 10 ml syringe reactor and acetyl chloride (AcCl, 50 eq), DIPEA (50 eq) in DCM was added. The reaction mixture was shaken for 30 minutes, with the AcCl reacting with the free amino group of the tyrosine and releasing the acetyl group thereto. Then the solution ⁇ medium were removed by suction filtration. The resin was washed with DMF (2 x 5 mL), MeOH (1 x 5 mL) and DCM (3 x 5 mL).
  • Et3 triethylamine
  • NMO N-methylmorpholine N-oxide
  • DIPEA diisopropylethylamine
  • a quantitative reaction of the reactants in an acetylated peptide consisting of the amino acids glycine and tyrosine could be, inter alia, using 2.5 eq of acetyl chloride, 50 eq DIPEA sufficient for a reaction time of only 1 minute he ⁇ .
  • FIG. 3 shows schematically the bond between an N-terminally acetylated peptide 1 and a melanocortin-1 receptor (MCIR) 4.
  • MCIR melanocortin-1 receptor
  • the 11 C-labeled peptide 1 binds specifically to the MCIR 4, but not to other molecules.
  • the positrons released upon decay of the 11 C carbon atom are detected by positron emission tomography (PET).
  • PET positron emission tomography
  • the site of the Po ⁇ sitronenemission corresponds to the location of the peptide 1 and the MCIR attached thereto 4.
  • Peptide 1 can therefore for the determination tion of the position of a tumor 18, which forms the MC1R 4.
  • a patient is administered a radiopharmaceutical which contains the 11 C-labeled peptide 1.
  • the peptide 1 bin ⁇ det specifically to the MC1R 4 and accumulates as the tumor 18, whose cells form the MC1R. 4
  • This concentration of peptides is represented by PET and determines the distribution of the MC1R 4 or the location of the tumor in the body 18 of the Pa ⁇ tienten. In this way can also be new gebil ⁇ finished metastases that carry the MC1R 4, using PET identifi ⁇ grace.
  • MC1R 4-binding molecules such as Example ⁇ ⁇ -MSH analogs can be used to detect early stages of melanoma and melanoma metastases (P McQuade et al., 2005).
  • the medication of a tumor therapeutic peutikums, for example active ingredient and amount of administration ⁇ plan be adjusted according to the position, size and distribution of the tumor 18th
  • FIG. 4 shows a schematic representation of a peptide having the sequence SEQ ID NO: 1 by means of a chemical formula.
  • the peptide of SEQ ID NO. 1 comprises 13 amino acids 2 of the following sequence: serine-tyrosine-serine-methionine-glutamine
  • the peptide carries an acetyl group 3 at the ⁇ -amino group.
  • the N-terminal amino acid 2, serine, is represented by Strukturfor ⁇ mel, the following amino acids 2 by their respective 3-letter code.
  • the sequence of the peptide is also given in SEQ ID NO: 1.
  • the primary carbon atom of the acetyl group 3 at the N-terminus of the peptide is a C-11 carbon atom, represented by the numeral 11 over the pri ⁇ tales carbon atom.
  • Peptide 1 is prepared by solid-phase synthesis and then acetylated using 11 C-labeled acetyl chloride. The peptide 1 can be used after cleavage from the solid phase.
  • SEQ ID NO. : 1 corresponds to the amino acid sequence of the ⁇ -melanocyte stimulating hormone ( ⁇ -MSH), which belongs to the melanotropines.
  • ⁇ -MSH ⁇ -melanocyte stimulating hormone
  • Melanotropins are neuropeptides produced na ⁇ tlichholder in the pituitary, and control the synthesis of melanin in the melanocytes. It binds to the MCIR 4, which is specifically formed by melanocytes and regularly overexpressed in diseased melanocytes
  • the peptide of the sequence SEQ ID NO: 1 therefore specifically binds to MCIR-expressing melanoma tumor cells and their metastases and can be used to localize such tumor cells. Labeling by means of an 11 C-acetyl group 3 is particularly suitable because it enhances the binding of the peptide 1 to MCIR 4 compared to a non-acetylated peptide 1 and thus positively influences the signal background ratio.
  • the stability of the peptide ⁇ formality 1 is increased by the acetylation, where ⁇ can be reduced by the total amount of the radiolabeled peptide 1, which must be administered to the patient. This, as well as the fact that the peptide 1 consists of body-like molecules, contribute significantly to the compatibility of the peptide 1 and the resulting radiodiagnostic drugs.
  • FIG. 5 shows a schematic representation (greatly simplified according to Faller A., Schünke M., The human body, Thieme 2008) of a blood circulation system 10 of an organism and the distribution of the peptide 1 therein.
  • Phase I Peptide 1 is injected into the circulatory system 10 of the organism.
  • Phase II is via the blood circulatory system 10 Peptide 1 in the members 12, 13, 14, 15 and 16 of the body transported ⁇ advantage.
  • Unbound peptide 1 is rapidly metabolised and enzymatically degraded.
  • the organism does not differentiate between its own peptides and the peptide 1, because it is made up of amino acids 2, which correspond to the body's own molecules.
  • the degradation products 17 of the peptide 1 and the amino acids 2 accumulate predominantly in the kidney 16, from where they are excreted via the bladder and ureter.
  • Massoud TF, Gambhir SS Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light; Genes Dev. 2003 Mar 1; 17 (5): 545-80.

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Abstract

Es wird ein N-terminal acetyliertes Peptid, das ein 11C-Kohlenstoffatom aufweist beschrieben, bei dem das 11C-Kohlenstoffatom ein Kohlenstoffatom der Acetylgruppe ist. Es wird auch ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Peptids und Verwendungen desselben zur Positronen-Emissions-Tomographie wiedergegeben. Des Weiteren wird ein Radiopharmakon beschrieben.

Description

Beschreibung
Herstellung und Verwendung eines Peptids mit einer N-termina- len 11C-markierten Acetylgruppe
Die Erfindung betrifft ein N-terminal acetyliertes Peptid, ein Verfahren zu dessen Herstellung und die Verwendung des Peptids zur Herstellung eines Agens zur Detektion eines krankhaften Gewebes. Sie betrifft ferner ein Radiopharmakon, das ein solches Peptid umfasst, zur Lokalisation eines Tu¬ mors.
In der modernen Diagnostik wird zunehmend versucht, physiolo¬ gische Zustände, sowohl im gesunden als auch im kranken Orga- nismus unmittelbar am Körper zu beobachten. Dazu werden unter anderem die Stoffwechselraten verschiedener Gewebe untersucht, indem Probanden radioaktiv markierte Zuckermoleküle verabreicht werden und die Verteilung der Moleküle im Körper, etwa mittels Szintigraphie oder Positronen-Emmisions-Tomogra- phie, erfasst wird. Eine hohe Anreicherung der Zuckermoleküle zeigt dabei hohe Stoffwechselraten an, wie sie auch in Tumorgeweben vorkommen. Derartige diagnostische Verfahren werden daher auch zur Krebsdiagnostik verwendet. In einem anderen Ansatz wird versucht, die Verteilung von Molekülen zu beo- bachten, die mit bestimmten Zellen oder Organen spezifisch interagieren . Dazu werden dem Probanden beispielsweise Antikörper verabreicht, die an Tumorzellen binden, sodass sich die Antikörper an der Oberfläche oder im Inneren der Tumorzellen anreichern. Die Moleküle werden dabei möglichst so ge- wählt, dass sie mit Zelloberflächenmolekülen, die nur oder in besonders hohem Maße von den Tumorzellen exprimiert werden, interagieren. Bei solchen Zelloberflächenmolekülen handelt es sich häufig um Transmembranrezeptoren, wie Rezeptoren epidermaler Wachstumsfaktoren, Rezeptoren von Wachstumshormonen oder Rezeptoren von Melanocortin-l-Rezeptoren (MC1R) . Wenn die Moleküle, die an die Oberflächenrezeptoren binden, mit einem Radionuklid markiert sind, ist ein biochemischer Nach¬ weis der Tumorzellen in vivo möglich. Herkömmlicherweise werden Radionuklide, beispielsweise Ga oder 64Cu, unter Verwendung großer Chelatormoleküle, bei¬ spielsweise Ethylendiamintetraacetat (EDTA) an die Nachweis- moleküle gekoppelt. Die Herstellung solcher radioaktiv markierter Moleküle ist sehr aufwändig, da insgesamt drei Kompo¬ nenten, Ligand, Chelator und Radionuklid, bereitgestellt und verbunden werden müssen. Darüber hinaus verursachen chelator- gebundene Detektionsmoleküle häufig Nebenwirkungen, wie Un- Wohlsein und Allergien.
Alternativ dazu kann ein Radionuklid aber auch direkt in das Detektionsmolekül integriert werden, beispielsweise in Form einer 11C-markierten Aminosäure. Die Herstellung derartiger Aminosäuren wird in den Patentanmeldungen DE 10 2009 035
648.7 und DE 10 2009 035 645.2 beschrieben. Aufgrund der geringen Halbwertszeit des 11C-Kohlenstoffisotops muss die Zeitspanne zwischen der Generierung des Isotops und der Verwendung des markierten Moleküls als Positronen-Emissions-To- mographie (PET) Marker jedoch so gering wie möglich gehalten werden .
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein als PET- Marker geeignetes Agens bereitzustellen, dessen radioaktive Isotopmarkierung in sehr kurzer Zeit erfolgen kann. Die Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines N-terminal acety- lierten Peptids, das ein 11C-Kohlenstoffatom aufweist, gelöst. Indem das 11C-Kohlenstoffatom ein Kohlenstoffatom der Acetylgruppe ist, wird das Radionuklid mit der Acetylgruppe, das heißt erst nachdem die Peptidsynthese bereits abgeschlos¬ sen ist, angebracht. Nach der Acetylierung steht das radioaktiv markierte Peptid unmittelbar als PET-Marker zur Verfügung. Außerdem ist ein mit 11C-Kohlenstoffatom markiertes Peptid im Vergleich zu Molekülen, die mit herkömmlichen Ra- dionukliden markiert sind, kostengünstig herzustellen und gut verstoffwechselbar . Der Begriff "Peptid" bezeichnet eine organische Verbindung aus mindestens zwei, über eine Peptidbindung verknüpften, Aminosäuren. Er umfasst dabei sowohl Oligopeptide aus bis zu ca. 10 Aminosäuren, als auch Polypeptide aus bis zu ca. 30 Aminosäuren, unabhängig von deren Primär-, Sekundär- oder
Tertiärstruktur. Dabei sind sowohl natürlich vorkommende als auch biotechnologisch oder synthetisch hergestellte Verbindungen umfasst. Das erfindungsgemäße Peptid ist aus Aminosäu¬ ren, das heißt aus körpereigenen bzw. körperähnlichen Molekü- len aufgebaut und daher für Patienten besonders gut verträg¬ lich. Es ist nicht toxisch und kann natürlich verstoffwechselt, abgebaut und ausgeschieden werden.
Der Begriff "Acetylierung" bezeichnet die Einführung einer Acetylgruppe (CH3CO) in eine organische Verbindung, vorzugs¬ weise in ein Peptid. Dabei wird eine Acetylgruppe in der Re¬ gel an eine freie Hydroxy- (OH-) oder eine freie Amino- (NH2- ) Gruppe gebunden. Acetylierungen von Peptiden und Proteinen kommen natürlicherweise an der primären Aminogruppe, das heißt α-Aminogruppe, der N-terminalen Aminosäure, als auch an Aminogruppen der Seitenreste, vor allem an Lysin, vor. In Eukaryoten sind posttranslationale Modifizierungen von Prote¬ inen in Form von Acetylierungen sehr häufig, wobei N-termi- nale Acetylierungen überwiegen (Polevoda B und Sherman F, 2002) . Die Acetylierung ist dabei in aller Regel irreversibel und kann die Eigenschaften des modifizierten Proteins beispielsweise hinsichtlich Enzymaktivität, Bindungsspezifität oder Peptidrezeptorinteraktion beeinflussen. Häufig trägt die N-terminale Acetylierung auch zu einer erhöhten Proteinstabi- lität bei, da der proteolytische Abbau von Enzymen über die
N-terminale Aminogruppe vermittelt wird. Beispielsweise wurde festgestellt, dass die Acetylierung des α-Melanozyten stimu¬ lierenden Hormons (α-MSH) dessen Interaktion mit dem MCl-Re- zeptor erhöht und zu einer gesteigerten Aktivität des Rezep- tors führt. Darüber hinaus zeigt das acetylierte α-MSH eine bis zu dreimal höhere Halbwertszeit als das nicht modifi¬ zierte Peptid. Im Fall von ß-Endorphin wurde hingegen festge¬ stellt, dass die N-terminale Acetylierung zu einer Reduktion der Opiataktivität des Moleküls gegenüber der nicht acety- lierten Variante führt, sodass das modifizierte Molekül eine geringere Abhängigkeitsgefährdung verursacht (Polevoda B und Sherman F, 2002) . Die Acetylierung des Peptids kann daher auch verwendet werden, um Eigenschaften des Peptids, die für seine Funktion als PET-Marker bedeutend sind, wie beispiels¬ weise Stabilität, Reaktionsspezifität und Nebenwirkungen, zu optimieren . Die Detektion des Peptids erfolgt über ein in der Ace- tylgruppe integriertes 11C-Kohlenstoffatom. Beim Zerfall des 11C-Kohlenstoffisotops werden Positronen, die auch als ß+- Strahlung bezeichnet werden, gebildet. Stoßen die Positronen auf ein Elektron, bilden sie zwei Photonen, die sich in einem Winkel von 180°, also genau in entgegen gesetzter Richtung, voneinander entfernen. Die Photonen können detektiert und daraus die Position der Positronenemission, bzw. des 11C-Koh- lenstoffatoms , berechnet werden. Dadurch kann sowohl die Po¬ sition des Peptids als auch eine Quantifizierung der an einer Position angesammelten Peptide innerhalb eines Körpers fest¬ gestellt werden. Die Integration eines 11C-Kohlenstoffatoms in das Peptid, ermöglicht es zudem, die Verwendung chemi¬ scher, körperfremder Stoffe zu vermeiden. Durch den direkten Einbau des 11C-Kohlenstoffatoms in die Acetylgruppe des Pep- tids ist die radioaktive Markierung ohne Komplexbildner, wie Diethyltriaminpentaacetat (DTPA), 1, 4, 7, 10-Tetraazacyclodode- can-1, 4, 7, 10-tetraessigsäure (DOTA) oder Ethylendiamintetraa- cetat (EDTA) möglich. Außerdem kann vermieden werden, dass ein radioaktiver Fremdstoff, wie beispielsweise 18Fluor, 133Xenon oder 68Gallium, in den Organismus eingebracht werden muss .
Durch die Integration des 11C-Kohlenstoffatoms in die Ace¬ tylgruppe kann außerdem die radioaktive Markierung unabhängig von der Peptidsynthese durchgeführt werden. Das bereits fer¬ tig gestellte Peptid wird durch die Acetylierung radioaktiv markiert und steht anschließend als PET-Marker zur Verfügung. Dies ist insbesondere vorteilhaft, weil die Halbwertszeit des C-Kohlenstoffisotops nur ca. 20 Minuten beträgt, sodass die ursprünglich eingesetzte Strahlendosis desto höher gewählt werden muss, je mehr Zeit zwischen der Isotopmarkierung des Peptids und seiner Verwendung liegt. Wird die 11C-Markierung mit der Acetylgruppe, das heißt nach Abschluss der eigentli¬ chen Synthese des Peptids, angebracht, kann das Peptid unmit¬ telbar anschließend verwendet werden. Auf diese Weise wird die Zeitspanne zwischen der Verarbeitung des ^C-Kohlenstoffs und dem Einsatz des Peptids reduziert und der Strahlungsver- lust während der Herstellung minimiert. Um eine bestimmte
Strahlungsstärke des Produkts zu gewährleisten kann die ur¬ sprünglich eingesetzte Strahlendosis daher entsprechend ge¬ ringer gewählt werden. Dadurch wird die Herstellung sowohl kostengünstiger als auch die Strahlenbelastung für das tech- nische Personal, welches das Peptid herstellt, geringer.
In einer vorteilhaften Weiterbildung ist das ^C-Kohlenstoff- atom das primäre Kohlenstoffatom der Acetylgruppe. Um das ^C-Kohlenstoffisotop in die Acetylgruppe einzubringen, muss es in Form eines Vorläufermoleküls bereitgestellt werden. Da¬ bei ist die Verwendung von 1XC02 besonders geeignet, weil es in Routineverfahren mittels eines Zyklotrons hergestellt wer¬ den kann. Es stehen Zyklotrone sowohl für die Herstellung großer als auch kleiner Mengen von Radionukliden zur Verfügung. Insbesondere in Kliniken werden Zyklotrone mit kleinen Umsatzmengen verwendet, um Radionuklide für PET-Verfahren vor Ort herzustellen. Wird 1XC02 als Ausgangsstoff für die de¬ markierte Acetylgruppe verwendet, ist das ^C-Kohlenstoffatom das primäre Kohlenstoffatom der Acetylgruppe, da es, zusammen mit dem Sauerstoffatom, die Carbonylgruppe des Acetyls bil¬ det .
In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung weist das Peptid mindestens eine D-Aminosäure auf. Mit Ausnahme des Glycins, besitzen Aminosäuren an ihrem alpha-C-Kohlenstoff- atom ein chirales Zentrum und können daher als Konfigurationsisomere, nämlich als D- oder L-Aminosäure, vorliegen. Körpereigene Peptide und Proteine sind weitgehend aus Amino- säuren in L-Konfiguration aufgebaut. Zudem arbeiten die meisten natürlichen Proteasen und Peptidasen stereoselektiv und verstoffwechseln hauptsächlich L-Aminosäuren . Daher dauert der Abbau von D-Aminosäuren durch körpereigene Enzyme länger als der von L-Aminosäuren. Dieser Umstand kann verwendet werden, um die Halbwertszeit eines Proteins oder Peptids zu ver¬ längern, indem neben L-Aminosäuren auch D-Aminosäuren verwendet werden (Neundorf I et al . , 2008) . Dadurch kann die pharmakologische Clearance, also die Zeit bis das Peptid aus dem Organismus ausgeschieden wird, positiv beeinflusst werden.
Bei dem Austausch einzelner L-Aminosäuren gegen ihre D-Konfiguration ist jedoch darauf zu achten, dass die Bindungsspezi- fität des Peptids nicht verringert wird. Eine weitere Mög¬ lichkeit, die pharmakologische Clearance des Peptids zu be- einflussen, besteht darin einzelne der Aminosäuren des Peptids durch nicht natürliche bzw. proteinogene Aminosäuren mit ähnlichen chemischen Eigenschaften zu ersetzen. Die nicht natürlichen Aminosäuren werden langsamer verstoffwechselt , weil die körpereigenen proteolytischen Enzyme speziell an den Ab- bau natürlicher Aminosäuren angepasst sind. Bei der Modifi¬ zierung des Peptids sollten die nicht natürlichen Aminosäuren jedoch so gewählt werden, dass die Bindungsaffinität des Pep¬ tids nicht verringert wird. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines N-terminal acetylierten Peptids, das ein 11C-Kohlenstoffatom aufweist, umfassend die Schritte Bereit¬ stellen eines Peptids, Bereitstellen eines Acetylgruppen übertragenden Moleküls, Umsetzen des Peptids mit dem Molekül, wodurch eine Acetylgruppe des Moleküls auf die N-terminale
Aminogruppe des Peptids übertragen wird, und Aufreinigen des acetylierten Peptids. Indem die Acetylgruppe, die von dem Mo¬ lekül auf das Peptid übertragen wird, ein 11C-Kohlenstoffatom aufweist, ist die Isotopmarkierung des Peptids von der Pep- tidsynthese unabhängig. Die Zeit, die für die Verarbeitung des 11C-Kohlenstoffisotops benötigt wird und die aufgrund der geringen Halbwertszeit kritisch ist, ist daher unabhängig von dem zeitlichen Aufwand der Peptidsynthese . Diese ist nämlich bereits abgeschlossen bevor die Acetylgruppe übertragen wird. Die Markierung mittels 11C-markierter Acetylgruppe ist daher für beliebige Peptide möglich. Es können beispielsweise auch weitere Modifikationen des Peptids, wie Formylierungen,
Phosphorylierungen, Hydroxylierungen oder Glykosylierungen durchgeführt werden, bevor das 11C-Kohlenstoffatom eingebracht wird. Sobald das Peptid fertig synthetisiert ist, wird die Acetylgruppe auf die alpha N-terminale Aminogruppe des Peptids übertragen. Die Übertragung des 11C-Kohlenstoffatoms in Form einer Acetylgruppe kann in einem einzigen Reaktionsansatz ( "One-Pot-Reaction" ) durchgeführt werden. Anschließend wird das Peptid mit geeigneten Reagenzien gewaschen und beispielsweise mittels Filtration aufgereinigt . In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung wird das Peptid mittels Festphasensynthese bereitgestellt. Die Fest¬ phasensynthese erlaubt es, Peptide definierter Sequenz, ein¬ schließlich Polypeptiden und Proteinen, chemisch herzustellen. Dabei wird eine Aminosäure, die den Ausgangspunkt der Synthese bildet, C-terminal an eine feste Phase, beispiels¬ weise ein Harz, gebunden. Anschließend wird sie schrittweise mit aktivierten Aminosäuren umgesetzt, sodass eine Aminosäu¬ rekette von C- nach N-terminal aufgebaut wird. Die Aminosäu¬ resequenz wird dadurch bestimmt, dass in jedem Reaktions- schritt nur eine bestimmte aktivierte Aminosäure im Reak¬ tionsgemisch vorhanden ist. Durch die Bindung der wachsenden Aminosäurekette an die Festphase, das heißt an eine unlösli¬ che Matrix, etwa aus Polystyrolkugeln, kann die Aminosäurekette nach jedem Reaktionsschritt gewaschen werden. Auf diese Weise können überschüssige Reagenzien, insbesondere akti¬ vierte Aminosäuren aus dem letzten Reaktionsschritt entfernt werden. Darüber hinaus sind die Kopplungszeiten bei der Festphasensynthese im Vergleich zur Flüssigphasensynthese kürzer, wodurch die Gesamtreaktionszeit zur Herstellung eines be- stimmten Peptids verringert wird. Ein weiterer Vorteil der Festphasensynthese ist, dass sie einfach automatisiert und somit kosteneffizient betrieben werden kann. Nachdem die Synthese abgeschlossen ist, wird das Peptid, das nach wie vor an die Festphase gekoppelt ist, acetyliert. Anschließend wird es nochmals gewaschen und von der Festphase abgespalten. Das so erhaltene acetylierte Peptid kann anschließend unmittelbar zur PET eingesetzt werden.
Alternativ zur Festphasensynthese, kann das Peptid auch mit¬ tels Flüssigphasensynthese hergestellt werden. Die Flüssig¬ phasensynthese bietet sich vor allem an um große Mengen eines spezifischen Peptids auf Vorrat zu produzieren. Das so syn- thetisierte Peptid wird dann, wiederum in einer
Flüssigphasenreaktion, acetyliert, wobei der C-Terminus des Peptids vor der Acetylierung mit einer geeigneten Schutzgruppe bedeckt wird. Neben der reinen Festphasen- bzw. Flüssigphasensynthese können beide Verfahren auch zu sogenannten kombinatorischen Systemen (Han et al . 1995) verbunden werden. Dabei kann das Peptid in großem Maßstab mittels Flüssigphasensynthese herge¬ stellt werden und anschließend an eine Festphase gekoppelt zur Verfügung gestellt werden. Die Acetylierung wird dann an dem, an die Festphase gebundenen Peptid durchgeführt.
In einer vorteilhaften Weiterbildung ist das Acetylgruppen übertragende Molekül Acetylchlorid. In eukaryotischen Zell- Systemen werden Proteine in der Regel durch spezifische Enzyme, sogenannte Acetylasen, durch Übertragung einer Ace- tylgruppe von Co-Enzym A acetyliert. Bei der chemischen Ace¬ tylierung von Molekülen dienen dagegen vor allem Acetylchlorid (AcCl) , Acetylbromid oder Essigsäureanyhdrid als Donor von Acetylgruppen.
In einer bevorzugten Weiterbildung ist das Acetylgruppen übertragende Molekül Acetylchlorid und wird durch Umsetzung von R-CO-O-MgCl oder R-CO-O-Li mit Phtalsäuredichlorid be- reitgestellt. Acetylchlorid kann mittels CO2 hergestellt wer¬ den, und ist daher für die Bereitstellung von 11C-Kohlen- stoffhaltigen Acetylgruppen besonders geeignet. Das 11CO2 wird hierbei in Zyklotronen generiert und mittels Grignard-Reagenz (MeMgBr) und Phthalsäuredichlorid in einem einzigen Reaktionsansatz in Acetylchlorid umgewandelt. Das so gene¬ rierte 11AcCl trägt ein 11C-Kohlenstoffisotop als Carbonylkoh- lenstoffatom bzw. primäres Kohlenstoffatom. Das reine 11AcCl wird anschließend durch fraktionierte Destillation erhalten. In einer besonders bevorzugten Weiterbildung wird die Destillation mittels Mikroverfahrenstechnik durchgeführt. Mikrover- fahrenstechnische-Apparaturen sind geeignet, besonders geringe Stoffmengen zu prozessieren, wobei chemische oder phy- sikalische Reaktionen in sogenannten Mikrokanälen stattfinden. Außerdem arbeiten Mikroverfahrenstechnische-Apparaturen im Durchflussverfahren, so dass je nach Bedarf auch sehr geringe Mengen besonders hoher Stoffkonzentrationen verarbeitet werden können. Die Herstellung im Rahmen eines Durchflussver- fahrens ermöglicht es so in kurzer Zeit ausreichende Mengen reinen 11AcCl bereitzustellen, das sofort weiterverarbeitet werden kann.
In einer besonders bevorzugten Weiterbildung wird das Peptid mit Acetylchlorid in Gegenwart von Diisopropylethylamin
(DIPEA) und Dichlormethan (DCM) umgesetzt. Herkömmlicherweise werden Peptide im Rahmen einer Festphasensynthese mit Essig¬ säureanhydrid acetyliert, wohingegen die Acetylierung mit AcCl vorzugsweise in Flüssigphase angewandt wird. Überra- sehend konnte jedoch festgestellt werden, dass auch AcCl un¬ ter spezifischen Bedingungen geeignet ist, Peptide, die an eine Festphase gebunden sind, effektiv zu acetylieren. Insbesondere sind dabei quantitative Umsetzungen der Edukte mög¬ lich. Geeignete Reaktionsbedingungen einschließlich der zu verwendenden Reagenzien sind in Tabelle 1 aufgeführt. Dabei sind solche Bedingungen besonders vorteilhaft, in denen ge¬ ringe Mengen der Edukte eingesetzt werden müssen. Des Weite¬ ren sind Reaktionen bevorzugt, die bei Raumtemperatur stattfinden, weil dadurch keine zusätzlichen Kosten für die Erhö- hung oder Erniedrigung der Reaktionstemperatur aufgewandt werden müssen. Aufgrund der geringen Halbwertszeit des X1C- Kohlenstoffisotops sind zudem Reaktionen bevorzugt, die be- sonders schnell ablaufen, bevorzugt innerhalb von weniger als 6 Minuten, weiter bevorzugt in 1 bis 5 oder 3 bis 5 Minuten.
Alternativ zu AcCl kann die N-terminale Acetylierung des Pep- tids, sowohl in der Flüssigphase als auch in der Festphase mittels Essigsäureanhydrid durchgeführt werden. Essigsäure¬ anhydrid wird traditionell zur Acetylierung von organischen Substanzen (beispielsweise Cellulose) verwendet. Zur Herstel¬ lung von Essigsäureanhydrid stehen etablierte Verfahren zur Verfügung, die auch unter Verwendung von Molekülen, die X1C-
Kohlenstoffatome tragen, durchgeführt werden können. Aufgrund der kurzen Halbwertszeit des 11C-Kohlenstoffatoms sind dabei schnelle und einfach durchzuführende Verfahren vorzuziehen. Unter anderem kann Essigsäureanhydrid beispielsweise durch die Reaktion zweier AcCl-Moleküle erreicht werden, die wie¬ derum unter Verwendung von ^CC^ erzeugt werden (Lewer P und MacMillan J, 1983) .
In einer bevorzugten Weiterbildung werden freie Hydroxy- (OH) -Gruppen des Peptids während der Peptidsynthese und wäh¬ rend der Acetylierung, durch Triphenylmethyl (trityl) ether geschützt. Freie Hydroxy- (OH) -Gruppen sind besonders reaktiv und können sowohl während der Peptidsynthese als auch während der Acetylierung zu unerwünschten Nebenreaktionen führen. Sie müssen daher durch chemische Gruppen wie beispielsweise tert- Butylether geschützt werden. Nach Beendigung der Syn- these/Acetylierung müssen diese Schutzgruppen jedoch wieder entfernt werden, wobei die chemische Abspaltung der Schutzgruppen wegen der geringen Halbwertszeit des Kohlenstoffiso- tops möglichst wenig Zeit in Anspruch nehmen sollte. Die Ab¬ spaltung von Tritylether ist dabei besonders bevorzugt, weil die chemische Reaktion schnell abläuft. Sind neben freien Hydroxylgruppen auch freie Aminogruppen (NH2-) im Peptid vor¬ handen, so müssen auch diese vor ektopischen Reaktionen ge- schützt werden. Dabei bietet es sich an, die Schutzgruppen für Hydroxylgruppen und Aminogruppen so zu wählen, dass sie in derselben chemischen Reaktion wieder abgespalten werden können. In einer besonders bevorzugten Weiterbildung der Er- findung werden daher die Hydroxylgruppen mit Triethylether und die Aminogruppen mit tert-Butylcarbamat (BOC) geschützt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines N-terminal acetylierten Peptids zur Herstellung eines Agens zur Detektion eines krankhaften Gewebes. Indem ein Peptid verwendet wird, das an das krankhafte Gewebe bindet und in seiner Acetylgruppe ein 11C-Kohlenstoffatom aufweist, kann das Agens kostengünstig hergestellt und in dem Organismus, in dem das krankhafte Gewebe nachgewiesen wird, gut verstoff- wechselt werden.
Der Begriff "krankhaftes Gewebe" bezeichnet Zellen, Teile von Organen oder ganze Organe, die ihre physiologische Funktion nicht oder nicht in vollem Umfang erfüllen. Dazu zählen beispielsweise mit Viren oder Bakterien infizierte Zellen, hypertrophes Gewebe, entzündetes Gewebe und Organe, hyperplas¬ tisches und neoplastisches Gewebe, etwa Geschwüre, Tumore und Karzinome. Krankhafte Zellen bilden häufig Proteine, deren Expression für eine bestimmte Erkrankung typisch ist. Diese Proteine befinden sich bevorzugt an der Oberfläche der Zel¬ len. Der Begriff "Tumor" bezeichnet im Besonderen eine örtliche Zunahme des Volumens eines Gewebes, etwa durch entzündli¬ che Anschwellung oder eine spontane, ungehemmte Neubildung von Zellen. Auch Tumorzellen exprimieren häufig bestimmte
Oberflächenmoleküle, wie beispielsweise Rezeptormoleküle, die auf der Zelloberfläche sitzen bzw. in der Zellmembran verankert sind und von geeigneten Liganden gebunden werden. Indem ein Peptid gewählt wird, das mit einem Oberflächenmolekül in- teragiert, das spezifisch oder in besonders hohen Mengen von krankhaften Zellen oder Tumorzellen exprimiert wird, kann es verwendet werden, um diese Zellen im Organismus zu detektie- ren. Das Peptid bindet an die Oberfläche der krankhaften Zel¬ len oder sammelt sich innerhalb der Zellen des krankhaften Gewebes. Dort kann es über die Positronenemission des X1C- Kohlenstoffisotops seiner Acetylgruppe detektiert werden. "Interagieren" bezeichnet dabei jede Art chemischer Bindung zwischen zwei Atomen oder Molekülen, insbesondere ionische Bindung, Elektrovalenz , kovalente Bindung, van-der-Waals-Bin- dung, metallische Bindung, elektrostatische Interaktion und Wasserstoffbrückenbindung . Das Peptid ist bevorzugt ausge¬ wählt aus der Gruppe bestehend aus Rezeptorliganden, Antikör- pern und Teilen davon, Aptameren, T-Zell-Rezeptorfragmenten und Peptidtransporter bindenden Peptiden. Insbesondere bevorzugt sind Peptide, die aufgrund ihrer Acetylierung eine be¬ sonders starke Bindung mit dem Oberflächenmolekül (beispiels¬ weise einem Rezeptor) des krankhaften Gewebes eingehen. Da- durch wird die Spezifität des Peptids erhöht, so dass das
Peptid spezifisch an das Oberflächenmolekül des krankhaften Gewebes bindet, ohne mit anderen Molekülen zu interagieren . Die nicht gebundenen Peptide werden dagegen von endogenen Proteasen verstoffwechselt und ausgeschieden, so dass ein verbessertes Signal/Hintergrundverhältnis bei der PET er¬ reicht wird.
In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist das Agens ein Radiopharmakon . Der Begriff "Radiopharmaka" be- zeichnet Arzneimittel, die Radionuklide enthalten, deren Strahlung zur Diagnostik und Therapie verwendet wird. Die wichtigsten Anwendungsgebiete sind dabei die Onkologie, Kar¬ diologie und Neurologie, aber auch die Arzneimittelforschung. Als Radionuklide werden Gamma- bzw. Beta-Strahlen emittie- rende Nuklide, zum Beispiel 133Xenon, 99mTechnetium, 68Gallium, und 18Fluor, verwendet. Sie werden üblicherweise über Kom¬ plexbildner wie DOTA, DTPA oder EDTA an Mono- oder Polysaccharide gebunden. Die Nuklide werden, je nach der Art ihrer Strahlung, mittels Szintigraphie, Single Photon Emission Com- puted Tomography (SPECT) oder Positronen-Emissions-Tomogra¬ phie (PET) detektiert. Aufgrund ihrer unphysiologischen Bestandteile können herkömmliche Radiopharmaka jedoch Nebenwir¬ kungen, wie anaphylaktische oder allergische Reaktionen, im Körper eines Patienten verursachen. Die Verwendung eines Pep- tids aus körpereigenen bzw. diesen ähnlichen Aminosäuren reduziert diese Gefahr deutlich, weil weder das Peptid selbst, noch seine Abbauprodukte toxisch sind. Zudem ist Kohlenstoff, im Gegensatz zu Technetium oder Xenon, ein im Körper vorkommendes Element, das natürlich verstoffwechselt werden kann.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Radiopharmakon zur Lokalisation eines Tumors, das ein N-terminal acetylier- tes Peptid umfasst. Indem ein Peptid verwendet wird, das an den Turmor bindet und dessen Acetylgruppe ein 11C-Kohlen- stoffatom aufweist, ist das Radiopharmakon für den Patienten gut verträglich und kann kostengünstig produziert werden.
Das erfindungsgemäße Radiopharmakon bietet daher ein wirt¬ schaftlich und medizinisch vorteilhaftes Agens um die Posi¬ tion eines Tumors in vivo zu bestimmen. Nachdem das Ra¬ diopharmakon einem Patienten verabreicht wurde, verteilen sich die darin enthaltenen Peptide in dessen Körper und sammeln sich an den Zellen des Tumors, wo sie durch das radioaktive Signal des 11C-Kohlenstoffatoms nachgewiesen werden. Auf diese Weise wird die Position des Tumors im Körper des Pa¬ tienten bestimmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Radiopharmakon ein PET Biomarker. Die PET ist ein etabliertes Verfahren um die Strahlung radioaktiver Elemente zu erfassen und ihre Position zu bestimmen (Massoud TF, Gambhir SS, 2003) . Mit Hilfe von ringförmig um den Patienten angeordneten Detektorgeräten werden Schnittbilder erstellt, auf denen die Zerfallsereig- nisse in ihrer räumlichen Verteilung im Körperinneren dargestellt werden. Im Gegensatz zu den bisher üblichen Szintigra- phie-Verfahren, ist durch die ringförmige Anordnung der PET- Detektoren eine exaktere räumliche Lokalisation der Positro¬ nenemission und damit eine wesentlich genauere und detail¬ lierter Abbildung des Tumors möglich. Die PET ermöglicht es auch, die Menge an markierten Molekülen in einem Gewebe quantitativ zu bestimmen.
Außerdem wird ein Verfahren zur Lokalisation eines krankhaften Gewebes in einem Organismus offenbart, umfassend die Schritte a) Bereitstellen eines N-terminal acetylierten Pep- tids, das mit einem Oberflächenmolekül einer Zelle des krank¬ haften Gewebes interagiert, b) Verabreichen des Peptids an den Organismus und c) Detektieren des Peptids in dem Organis¬ mus mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) . Dabei bindet das Peptid an das Oberflächenmolekül und weist ein 11C-Kohlenstoffatom in seiner Acetylgruppe auf.
Mit dem erfindungsgemäßen N-terminal acetylierten Peptid wird ein krankhaftes Gewebe im Inneren eines Organismus detektiert und lokalisiert, sodass die Verteilung des krankhaften Gewe¬ bes im Körper eines Patienten beobachtet werden kann. Auf diese Weise kann beispielsweise die Größe oder Ausdehnung einer Infektion oder eines Tumors bestimmt werden. Das erfindungsgemäße Peptid ist daher auch zur Beobachtung von Verlauf und Erfolg einer Behandlung, zur sogenannten Therapieverlaufskontrolle, geeignet.
Im Folgenden werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung anhand der beigefügten schematischen Zeichnungen erläu- tert.
Figur 1 zeigt schematisch die Herstellung von C-Acetylchorid (AcCl) , wobei CO2 vorzugsweise Χ1002 und das gebildete Ace- tylchlorid 11C-Acetylchlorid ist.
CO2 wurde unter Verwendung von MeMgBr und Phthalsäuredichlo- rid zu AcCl umgesetzt. Hierzu wurden 0,2 ml MeMgBr in Dietyh- lether (1 eq, 3 M) in einen runden Flaschenkolben eingebracht und CO2 mittels eines StickstoffStroms (25 %, 10 ml/Minute, 2 Minuten) hinzugefügt. 0,15 ml Phthaloyldichlorid (1,8 eq) wurde hinzugegeben und die Quenchreaktion auf 80 °C erhitzt, um überschüssige Lösungsmittel unter Verwendung eines Stick¬ stoffStroms zu entfernen. Nachdem die Temperatur von 80 °C erreicht war, wurde sie weiter auf 100°C erhöht um das gebil- dete Acetylchlorid mit dem Stickstoffström auszuführen. Figur 2 zeigt schematisch die Herstellung von N-terminal acetyliertem Peptid 1 mittels Festphasensynthese und unter Verwendung von AcCl, wobei das AcCl vorzugsweise 11AcCl ist. Koppeln der ersten Aminosäure 2 an Trityl-Harz: 1 g Trityl- Harz wurde in einen 10 ml Syringe Reaktor eingeführt und Fmoc-Glycin-OH (1,2 mmol) sowie Diisopropylethylamin (DIPEA, 3,6 mmol, in 4 ml Dichlormethan (DCM) ) hinzugefügt. Um Glycin an das Harz zu binden, wurde die Mischung für 30 Minuten ge- schüttelt. Das Lösungsmittel wurde anschließend durch Saug¬ filtration entfernt. Das Harz wurde mit Dimethylformamid (DMF, 2 x 5 ml), MeOH (1 x 5 ml) und DCM (3 x 5 ml) gewaschen . Schützen (Capping) des Harzes: Das mit Glycin beladene Harz wurde in einen 10 ml Syringe Reaktor gegeben und, nach Hinzufügen von 5 ml einer Mischung aus DCM, MeOH, DIPEA (80/15/5), für 15 Minuten geschüttelt. Die Lösungsmittel wurden an¬ schließend durch Saugfiltration entfernt und das Capping-Ver- fahren wiederholt.
Fmoc-Entschützung (Fmoc-deprotection) : Um die Fmoc-Schutz- gruppe vom Glycin abzuspalten, wurde das beladene Harz in einen 10 ml Syringe Reaktor platziert und 5 ml Piperidin in DCM (20 %) hinzugefügt. Die Mischung wurde für 1 x 2 Minuten und 1 x 15 Minuten geschüttelt und die Lösungsmittel durch Saugfiltration entfernt.
Koppeln der zweiten Aminosäure 2: Das entschützte, mit Glycin beladene, Harz wurde in einen 10 ml Syringe Reaktor einge¬ führt und Fmoc-Glycin-OH (4 eq entsprechend der harzgebunde¬ nen Aminosäure 2), O- (Benzotriazol-l-yl) -N, , ' , ' -tetra- methyluronium-tetrafluoroborat (TBTU, 3, 9 eq entsprechend der harzgebundenen Aminosäure 2) und DIPEA (3 eq entsprechend der Fmoc geschützten Aminosäure 2, in DMF) hinzugefügt. Die Mi¬ schung wurde für 16 Stunden geschüttelt und die Lösungsmittel anschließend durch Saugfiltration entfernt. Das Harz wurde mit DMF (2 x 5 ml), MeOH (1 x 5 ml) und DCM (3 x 5 ml) gewa¬ schen .
Die Arbeitsschritte Schützen, Fmoc-Entschützung und Koppeln wurden wiederholt um dem an das Harz gebundenen Peptid eine weitere Aminosäure, nämlich Tyrosin, hinzuzufügen.
Acetylierung : Das mit Peptiden beladene Harz wurde in einen 10 ml Syringe Reaktor platziert und Acetylchlorid (AcCl, 50 eq) , DIPEA (50 eq) in DCM hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten lang geschüttelt, wobei das AcCl mit der freien Aminogruppe des Tyrosins reagierte und die Ace- tylgruppe an diese abgabt. Anschließend wurden die Lösungs¬ mittel durch Saugfiltration entfernt. Das Harz wurde mit DMF (2 x 5 ml), MeOH (1 x 5 ml) und DCM (3 x 5 ml) gewaschen.
Unterschiedliche Basen, unter anderem Triethylamin ( Et3) , N- Methylmorpholin-N-oxid (NMO) , Collidin und Diisopropylethyla- min (DIPEA) wurden verwendet, um das an das Trityl-Harz ge- bundene Dipeptid zu acetylieren. Die verwendeten Lösungsmit¬ tel und Reaktionsbedingungen sind in Tabelle 1 zusammenge- fasst .
Eine quantitative Umsetzung der Edukte in ein acetyliertes Peptid bestehend aus den Aminosäuren Glycin und Tyrosin konnte unter anderem unter Verwendung von 2,5 eq Acetylchlorid, 50 eq DIPEA bei einer Reaktionszeit von nur 1 Minute er¬ reicht werden.
Tabelle 1: Reaktionsbedingungen
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Abspaltung: Um das acetylierte Peptid vom Harz abzuspalten, wurden 50 mg des mit den Peptiden geladenen Harzes in einen 2 ml Syringe Reaktor platziert und 1 ml Trifluoressigsäure (TFA) / DCM (1 %) hinzugefügt. Die Mischung wurde 1 Minute lang geschüttelt, das Harz, nach einer Filtration, mit 1 ml TFA/DCM (1 %) gewaschen und das Lösungsmittel durch Saugfiltration entfernt. Die Acetylierung wurde mit Acetylchlorid in Gegenwart von DIPEA als Base und DCM als Lösungsmittel bis zur quantitati¬ ven Umsetzung des nicht acetylierten Peptids 1 acetyliert, wobei die Reaktionszeit bei Raumtemperatur lediglich 1 Minute betrug. Der gesamte Produktionsprozess einschließlich der Synthese von Acetylchlorid aus CO2, der Destillation des Ace- tylchlorids, Acetylierung eines Dipeptids auf Festphase und Abspaltung des geschützten acetylierten Peptids 1 umfasste etwa 45 Minuten (Tabelle 2) .
Tabelle 2: Übersicht über die Schritte der Synthese eines acetylierten Peptids 1
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Figur 3 zeigt schematisch die Bindung zwischen einem N-termi- nal acetylierten Peptid 1 und einem Melanocortin-l-Rezeptor (MCIR) 4.
Das Peptid 1 umfasst 13 Aminosäuren 2, von denen die N-termi- nale Aminosäure eine Acetylgruppe 3 mit einem 11C-Kohlen- stoffatom trägt. Die radioaktive Markierung ist durch einen Stern (*) dargestellt. Ein Teil des Peptids 1 ist an den schematisch dargestellten MCIR 4 gebunden, der sich auf der Oberfläche eines Tumors 18 befindet bzw. in dessen Membran verankert ist.
Das 11C-markierte Peptid 1 bindet spezifisch an den MCIR 4, nicht aber an andere Moleküle. Die beim Zerfall des 11C-Koh- lenstoffatoms abgegebenen Positronen werden mittels Positro- nen-Emissions-Tomographie (PET) nachgewiesen. Der Ort der Po¬ sitronenemission entspricht dem Ort des Peptids 1 und des daran gebundenen MCIR 4. Das Peptid 1 kann daher zur Bestim- mung der Position eines Tumors 18 verwendet werden, der den MC1R 4 bildet.
Zur Lokalisation eines Tumors 18 im Rahmen einer Krebsdiag- nose wird einem Patienten ein Radiopharmakon verabreicht, welches das 11C-markierte Peptid 1 enthält. Das Peptid 1 bin¬ det spezifisch an den MC1R 4 und reichert sich so am Tumor 18 an, dessen Zellen den MC1R 4 bilden. Diese Konzentrierung von Peptiden wird durch PET abgebildet und die Verteilung des MC1R 4 bzw. die Lokalisation des Tumors 18 im Körper des Pa¬ tienten bestimmt. Auf diese Weise lassen sich auch neu gebil¬ dete Metastasen, die den MC1R 4 tragen, mittels PET identifi¬ zieren. Insbesondere MC1R 4 bindende Moleküle, wie beispiels¬ weise α-MSH-Analoge können verwendet werden um frühe Stadien von Melanomen und Melanommetastasen zu detektieren (McQuade P et al . , 2005) . Außerdem kann die Medikation eines Tumorthera- peutikums, zum Beispiel Wirkstoffmenge und Verabreichungs¬ plan, entsprechend der Position, Größe und Verteilung des Tumors 18 angepasst werden.
Figur 4 zeigt eine schematische Darstellung eines Peptids mit der Sequenz SEQ ID NR.: 1 mittels chemischer Formel.
Das Peptid der SEQ ID NR. : 1 umfasst 13 Aminosäuren 2 der folgenden Sequenz: Serin-Tyrosin-Serin-Methionin-Glutamin-
Histidin-Phenylalanin-Arginin-Tryptophan-Glycin-Lysin-Prolin- Valin. Das Peptid trägt an der α-Aminogruppe eine Ace- tylgruppe 3. Die N-terminale Aminosäure 2, Serin, ist mittels Strukturfor¬ mel dargestellt, die folgenden Aminosäuren 2 durch ihren jeweiligen 3-Buchstabencode . Die Sequenz des Peptids ist auch in SEQ ID NR.: 1 angegeben. Das primäre Kohlenstoffatom der Acetylgruppe 3 am N-Terminus des Peptids ist ein 11C-Kohlen- Stoffatom, dargestellt durch die Ziffer 11 oberhalb des pri¬ mären Kohlenstoffatoms . Das Peptid 1 wird mittels Festphasensynthese hergestellt und anschließend unter Verwendung von 11C-markiertem Acetylchlo- rid acetyliert. Das Peptid 1 kann nach Abspaltung von der Festphase verwendet werden.
Die SEQ ID NR. : 1 entspricht der Aminosäuresequenz des a-Me- lanozyten stimulierenden Hormons (α-MSH) , das zu den Mela- notropinen gehört. Melanotropine sind Neuropeptide, die na¬ türlicherweise im Hypophysenzwischenlappen produziert werden und die Melaninsynthese in den Melanozyten steuern. Es bindet an den MCIR 4, der spezifisch von Melanozyten gebildet und in krankhaften Melanozyten regelmäßig überexprimiert wird
(McQuade P et al . , 2005). Das Peptid der Sequenz SEQ ID NR.: 1 bindet daher spezifisch an MCIR exprimierende Melanomtumor- zellen und deren Metastasen und kann verwendet werden, um solche Tumorzellen zu lokalisieren. Eine Markierung mittels einer 11C-Acetylgruppe 3 ist dabei besonders geeignet, weil sie die Bindung des Peptids 1 an MCIR 4 gegenüber einem nicht acetylierten Peptid 1 verstärkt und so das Signalhintergrund- Verhältnis positiv beeinflusst. Gleichzeitig wird die Stabi¬ lität des Peptids 1 durch die Acetylierung gesteigert, wo¬ durch die Gesamtmenge des radioaktiv markierten Peptids 1, die dem Patienten verabreicht werden muss, reduziert werden kann. Dies, ebenso wie der Umstand, dass das Peptid 1 aus körperähnlichen Molekülen besteht, tragen wesentlich zur Verträglichkeit des Peptids 1 und daraus hergestellter Ra- diopharmaka bei.
Figur 5 zeigt eine schematische Darstellung (stark verein- facht nach Faller A., Schünke M., Der Körper des Menschen, Thieme 2008) eines Blutkreislaufsystems 10 eines Organismus und die Verteilung des Peptids 1 darin.
Der Blutkreislauf 10 umfasst verschiedene schematisch darge- stellte Organe, wie Lunge 12, Herz 13, Leber 14, Darm 15 und Niere 16 und die Hauptadern 11, welche diese Organe verbin¬ den. Das Peptid 1 ist durch Dreiecke entlang der Adern 11 dargestellt. Die Abbauprodukte 17 des Peptids 1 sind durch einzelne Striche innerhalb der Umrisse der Niere 16 darge¬ stellt. Links der Mitte des Blutkreislaufsystems 10 ist zu¬ sätzlich ein Tumor 18 dargestellt, der vermehrt MC1R 4 trägt, an die Peptide 1 angelagert sind.
Die Verteilung des Peptids 1 im Blutkreislaufsystem 10 um- fasst vier Phasen, die entlang der Darstellung von oben nach unten aufgeführt sind. Phase I: Das Peptid 1 wird in das Blutkreislaufsystem 10 des Organismus injiziert.
Phase II: Über das Blutkreislaufsystem 10 wird das Peptid 1 in die Organe 12, 13, 14, 15 und 16 des Organismus transpor¬ tiert .
Phase III: Das zirkulierende Peptid 1 bindet spezifisch an
MC1R 4 und sammelt sich an dem Tumor 18, weil dieser den MC1R 4 produziert.
Phase IV: Nicht gebundenes Peptid 1 wird schnell verstoff- wechselt und enzymatisch abgebaut. Der Organismus unterschei- det nicht zwischen eigenen Peptiden und dem Peptid 1, weil es aus Aminosäuren 2 aufgebaut ist, die den körpereigenen Molekülen entsprechen. Die Abbauprodukte 17 des Peptids 1 und der Aminosäuren 2 sammeln sich vorwiegend in der Niere 16, von wo aus sie über die Blase und Harnleiter ausgeschieden werden.
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DE 10 2009 035 645.2

Claims

N-terminal acetyliertes Peptid (1), das ein C-Kohlen- stoffatom aufweist,
dadurch gekennzeichnet, dass
das 11C-Kohlenstoffatom ein Kohlenstoffatom der Ace- tylgruppe (3) ist.
Peptid (1) nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, dass
das 11C-Kohlenstoffatom das primäre Kohlenstoffatom der
Acetylgruppe (3) ist.
Verfahren zur Herstellung eines N-terminal acetylierten Peptids (1), das ein 11C-Kohlenstoffatom aufweist, um¬ fassend die Schritte:
a) Bereitstellen eines Peptids
b) Bereitstellen eines Acetylgruppen (3) übertragenden Moleküls
c) Umsetzen des Peptids (1) mit dem Molekül, wodurch eine Acetylgruppe (3) des Moleküls auf die N-termi- nale Aminogruppe des Peptids übertragen wird, und d) Aufreinigen des acetylierten Peptids (1),
dadurch gekennzeichnet, dass
die Acetylgruppe (3) , die von dem Molekül auf das Peptid (1) übertragen wird, ein 11C-Kohlenstoffatom aufweist.
Verfahren nach Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Peptid (1) in Schritt a) mittels Festphasensynthese bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Acetylgruppen (3) übertragende Molekül Acetylchlorid ist . Verfahren nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, dass
in Schritt c) das Peptid (1) mit Acetylchlorid in Gegen¬ wart von Diisopropylethylamin (DIPEA) und Dichlormethan (DCM) umgesetzt wird.
Verwendung eines N-terminal acetylierten Peptids (1) zur Herstellung eines Agens zur Detektion eines krankhaften Gewebes (18),
dadurch gekennzeichnet, dass
das Peptid (1) an das krankhafte Gewebe (18) bindet und die Acetylgruppe (3) des Peptids (1) ein 11C-Kohlen- stoffatom aufweist.
Verwendung nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Peptid (1) mit einem Oberflächenmolekül (4) einer Zelle des krankhaften Gewebes (18) interagiert, bevor¬ zugt an ein Oberflächenmolekül (4) einer Zelle des krankhaften Gewebes (18) bindet.
Radiopharmakon zur Lokalisation eines Tumors (18), umfassend ein N-terminal acetyliertes Peptid (1), da¬ durch gekennzeichnet, dass
das Peptid (1) an den Tumor (18) bindet und die Ace¬ tylgruppe (3) des Peptids (1) ein 11C-Kohlenstoffatom aufweist .
Radiopharmakon nach Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet, dass
es ein Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Biomarker ist .
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