DE69011861T2

DE69011861T2 - Zum wirkort hingeführte und dort angereicherte aktivsubstanzen.

Info

Publication number: DE69011861T2
Application number: DE69011861T
Authority: DE
Inventors: David Roy Bard; Clive Graham Knight; David Peter Page-Thomas
Original assignee: Cancer Research Campaign Technology Ltd
Current assignee: Cancer Research Campaign Technology Ltd
Priority date: 1989-06-23
Filing date: 1990-06-22
Publication date: 1995-02-16
Anticipated expiration: 2010-06-23
Also published as: NZ234173A; WO1991000111A1; AU636365B2; EP0478631A1; DK0478631T3; ES2057572T3; EP0478631B1; DE69011861D1; ATE110280T1; AU5839190A; JPH04506343A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft zielgerichtete Mittel, die gegen bösartige Melanoma gerichtet sind und ihre Herstellung sowie Verwendung. Bösartige Melanoma treten weltweit mit einer jährlichen Häufigkeit von 1 bis 6 Fällen pro 100,000 Einwohner auf. Sie sind ganz besonders häufig bei der kaukasischen Bevölkerung von Australasien, in den Vereinigten Staaten von Nordamerika, in der Schweiz und in Skandinavien anzutreffen und sie haben in den letzten zwei Dekaden eine markante Steigerung ihres Auftretens erfahren. Die Voraussage ist, verglichen mit anderen Hautcarcinoma, schlecht im Hinblick auf die Tendenz der Melanoma zur frühen Metastasierung und ihre Resistenz gegen gamma Bestrahlung und systemische cytotoxische Chemotherapie. Der Erfolg der Therapie würde mit Hilfe eines Mittels, das Diagnostika und Therapeutika auf primäre Melanoma und ihr Metastasenziel richten könnte, wesentlich verbessert werden.
Viel Arbeit wurde auf diesem Gebiet auf die Entwicklung von monoklonalen Antikörpern gegen spezifische Zellen Oberflächenmarker aufgewendet. Solch eine Annahme leidet jedoch unter der Schwierigkeit einen Zell Oberflächenmarker aufzufinden, der nur auf Melanoma ausgerichtet ist, jedoch von allen Varianten des Tumors und der Erkennung und Entfernung des Antikörpermoleküls durch das Immunsystem des Patienten geteilt wird.
Eine alternative Annahme benützt die Beobachtung, dass sowohl die bösartigen als auch die normalen Melanocyten, Rezeptoren für das Peptidhormon Alpha- Melanocyten stimulierendes Hormon (MSH) besitzen. MSH stimuliert die Bildung von Melanin durch Melanocyten in einem weiten Bereich der Chordata Spezies. Bei Säugetieren erfolgt dies durch Kombination mit Zell Oberflächenrezeptoren, wodurch eine Aufeinanderfolge von Ereignissen ausgelöst wird die schliesslich zur Stimulierung der Synthese von Tyrosinase führen, dem Enzym, das Tyrosin in L- DOPA umwandelt, dem unmittelbaren Vorgänger von Melanin.
MSH kann am N-Terminus mit nur geringem oder keinem Verlust an hormonaler Aktivität modifiziert werden und es wurde gezeigt, dass MSH, das in dieser Weise an Diphterie Toxin gebunden ist, in vitro selektiv Melanoma Zellen töten kann. (Murphy, J.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8258-8262 (1986).
So genannte "super potente" synthetische Analoga von MSH wurden in der Literatur beschrieben, beispielsweise [Nle&sup4;, D-Phe&sup7;]-α-MSH (Sawyer T.K. et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 5754-5788 (1980)). Ein weiteres super potentes Analoges [Nle&sup4;, Asp&sup5;, D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;] α-MSH4-10.
MSH, das am N-Terminus (MSH-DTPA) durch den Chelat Bildner, Diethylentriamin pentaessigsäure (DTPA), substituiert ist, vereinigt sich rasch mit Melanoma Zellen sowohl in vitro als auch in vivo (Bard, D.R. et al. , Biochem. Soc. Trans. London 14 614-615 (1986)).
Es wurde nunmehr überraschenderweise gefunden, dass neue zielgerichtete Mittel, die [Nle&sup4;, Asp&sup5;, D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;] alpha-MSH4-10-NH&sub2; enthalten, eine verbesserte Bindung an Melanozyten und insbesondere ein rasches Verschwinden des nicht gebundenen Mittels aus den Tieren, denen die Mittel verabreicht worden sind, bewirken. Das extrem rasche Verschwinden solcher zielgerichteter Mittel aus dem Blut gestattet die Verwendung von kurzlebigen, jedoch aktiveren Radioisotopen als zielgerichtete Teile zur Behandlung von Melanoma, weil die Strahlungsdosis spezifischer an das Melanoma abgegeben wird und dadurch die Strahlungsdosis an den Patienten als ganzes, tatsächlich, reduziert werden kann.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung eine Verbindung der Formel (I)
R-[Nle&sup4;, Asp&sup5;, D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;] α-MSH4-10 -NH&sub2;. (I)
worin R ein zielgerichteter Teil ist, der gegebenenfalls über eine Verknüpfungsgruppe gebunden ist. In der Formel (I) bedeutet die Gruppe "-NH&sub2;" nur, dass der C- Terminus des α-MSH4-10 analogen Polypeptids amidiert ist; solch eine C-Terminus Amidierung ist wichtig für die Aktivität.
Die Gruppe R kann ein direkt gebundener zielgerichteter Teil sein, der zumindest eine Stelle besitzt an die der N-Terminus des α-MSH4-10 analogen Polypeptids gebunden sein kann, ohne die Verwendbarkeit des zielgerichteten Teils zu zerstören. Andererseits kann die Gruppe R über eine Verknüpfungsgruppe, die selbst an das α-MSH4-10 Analoge gebunden ist, gebunden sein.
Geeignete zielgerichtete Teile umfassen cytotoxische Mittel, wie Dacarbazin (5- [3,3-Dimethyl-1-triazenyl]-1H-imidazol-4-carboxamid), Actinomycin D, Methotrexat und Methyl CCNU (N-(2-Chlorethyl)-N'-(trans-4-methylcyclohexyl)-N-nitrosoharnstoff) und ihre Vorgänger und cytokine Mittel, wie Tumor Nekrosis Faktor(TNF) und gamma Interferon.
Andere zielgerichtete Teile sind nachweisbare Marker, wie Radiomarker zur Lokalisierung und Sichtbarmachung von Tumoren. Besonders geeignete Radionuklide zur Verwendung als cytotoxische Mittel umfassen Beta-Strahler mit kurzer Halbwertszeit wie Erbium 169, Yttrium 90, Rhenium 186 und Lutetium 177 und zur Verwendung als sichtbarmachende Mittel umfassen sie Indium 111, Indium 113m und Gallium 67 und ganz besonders Indium 113m.
Im allgemeinen ist es unwahrscheinlich, dass kleine zielgerichtete Teile wie Radionuklide für eine direkte Bindung an das α-MSH4-10 Analoge geeignet sind und sie werden deshalb über eine Verknüpfungsgruppe gebunden. Geeignete Verknüpfungsgruppen zur Bindung von vielen Arten von zielgerichteten Teilen an Peptide werden denen, die auf dem Gebiet bewandert sind, bekannt sein. Zur Verknüpfung von Radionukliden ist es besonders bevorzugt Chelat bildende Mittel, wie Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA); Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA); Ethylenglykol-O,O'-bis(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA); Triethylentetraminhexaessigsäure (TTHA) (Subramanian, K.M. et al, J. Nucl. Med. 31(4) 480-488 (1990); N,N'-bis(Hydroxybenzyl)ethylendiamin-N,N'-diessigsäure (HBED), N,N',N",N"'-Tetrnessigsäure Derivate von Tetraazacycloalkanen, wie 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N",N"'-tetraessigsäure (Deshpande, S.V. et al. J.Nucl. Med., 31( ), 473-479 (1990), dieses ist ein ideales Chelat bildendes Mittel für Yttrium, die Bildung von Komplexen durch diesen Typus von rigiden Rngstrukturen wird jedoch sehr empfindlich beeinflusst durch den Ionenradius des Liganden); 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan-N,N',N",N"'-tetraessigsäure und 1,4,8,12-Tetraazacyclopentadecan-N,N',N",N"'-tetraessigsäure. In einer anderen Hinsicht betrifft die vorliegende Erfindung eine Verbindung der Formel (II) L-[Nle&sup4;, Asp&sup5;, D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;] α-MSH4-10-NH&sub2; (II)
worin L eine Verknüpfungsgruppe, vorzugsweise ein Chelat bildendes Mittel, wie DTPA bedeutet.
Eine besonders bevorzugte Verbindung der Formel (II) ist die Verbindung der Formel
DTPA-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH&sub2;
Die Verbindungen gemäss der vorliegenden Erfindung können auf an sich bekannte Weise hergestellt werden. Um das Peptid mit dem zielgerichteten Teil oder der Verknüpfungsgruppe zu verknüpfen, wird es öfters zweckmässig sein, dass das Peptid an ein festes Substrat gebunden ist, beispielsweise an Harzperlen die üblicherweise in der Peptidsynthese verwendet werden. In den Fällen, in denen der zielgerichtete Teil oder die Verknüpfungsgruppe in der Lage sind zwei oder mehr Peptidketten zu binden, ist es bevorzugt einen Überschuss des zielgerichteten Teils oder der Verknüpfungsgruppe und eines Acylierungskatalysators, wie 1- Hydroxybenzotriazol, zu verwenden, um die Bildung einer einfach substituierten Verbindung zu begünstigen. Falls die Verknüpfungsgruppe DTPA ist, kann die Umsetzung unter Verwendung einer stöchiometrischen Menge von DTPA bisanhydrid durchgeführt werden, vorzugsweise wird jedoch ein Überschuss von DTPA bisanhydrid verwendet. Es ist jedoch ebenfalls möglich die Umsetzung unter Verwendung eines grossen Überschusses von DTPA bis-anhydrid durchzuführen. Die Erfindung betrifft daher ferner auch ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I), das die Umsetzung einer Gruppe R, oder eines reaktiven Derivates hiervon, mit dem α-MSH4-10 Analogen, oder einem reaktiven Derivat hiervon, umfasst. Falls die Gruppe R ein zielgerichteter Teil ist, der über eine Verknüpfungsgruppe gebunden ist, wird das Verfahren im allgemeinen die Stufen a) Umsetzung einer Gruppe L, oder eines reaktiven Derivates hiervon, mit dem α-MSH4-10 Analogen, oder einem reaktiven Derivat hiervon, um eine Verbindung der Formel (II), die oben definiert wird, zu bilden und b) Umsetzung der Verbindung der Formel (II), oder eines reaktiven Derivates hiervon, mit einer Verbindung R', oder eines reaktiven Derivates hiervon, die den zielgerichteten Teil R enthalten, umfassen.
Die Reaktionsbedingungen, wie Temperatur, Dauer und Auswahl der Lösungsmittel und die Art der reaktiven Derivate wird durch die Natur der Gruppen R, L und R' bestimmt und es liegt innerhalb des Geschicks des Fachmannes, diese gemäss ihrer Eignung auszuwählen.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren ferner auch die Trennung und die Reinigung der Verbindung. Für die Herstellung von Verbindungen, worin der zielgerichtete Teil R' über eine Verknüpfungsgruppe L, welche ein Chelat bildendes Mittel, wie DTPA, ist, gebunden ist, umfasst das Herstellungsverfahren vorzugsweise die Synthese der Peptidketten auf einem Harzsubstrat durch aufeinanderfolgende Zugabe von geschützten Aminosäure Resten, eine N-terminale Entschützung ist in diesem Stadium notwendig, gefolgt von der Umsetzung der Peptidketten mit dem Verknüpfungsreagenz. Anschliessend erfolgt die vollständige Entschützung der Seitenketten der Aminosäure Reste und die Entfernung der Peptidketten vom Harzsubstrat in jeder beliebigen Reihenfolge. Schliesslich wird die so hergestellte Verbindung gereinigt beispielsweise durch Phasenumkehr Chromatographie. Die Verbindungen gemäss der vorliegenden Erfindung sind verwendbar zur Diagnose und der chirurgischen und therapeutischen Behandlung von Melanoma. Die vorliegende Erfindung betrifft deshalb ferner auch eine Verbindung der Formel (I) oder (II) zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines menschlichen oder tierischen Körpers durch Chirurgie oder Therapie oder in einem Diagnoseverfahren, das an einem menschlichen oder tierischen Körper ausgeübt wird. Es werden ebenfalls Diagnoseverfahren zur Verfügung gestellt, die Verbindungen der Formel (I) oder (II) zur Untersuchung von Gewebeproben, die menschlichen oder tierischen Körpern entnommen wurden, verwenden. Die Erfindung betrifft ferner auch ein Verfahren zur Behandlung oder zur Diagnose von Melanoma, das darin besteht, dass man eine wirksame, nicht toxische Menge einer Verbindung der Formel (I) oder (II) einem Menschen oder Tier verabreicht, die ein Melanom haben oder im Verdacht stehen ein solches zu haben.
Die Verbindungen der Formel (I) oder (II) können direkt verwendet oder in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden, die die Verbindungen der Formel (I) oder (II) und ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel oder Träger enthalten. Solche Verdünnungsmittel und Träger umfassen Tablettierungsmittel, Netzmittel, Bindemittel und Füllstoffe, Konservierungsmittel, wie Antioxidantien und keimtötende Mittel, Pufferungsmittel und Salze als auch übliche Injektionsmedien, insbesondere Wasser zur Injektion. Solche pharmazeutische Zusammensetzungen und Verfahren zu deren Herstellung bilden einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung, wie dies auch die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) oder (II) bei der Herstellung eines Medikamentes ist, das zur Diagnose oder der chirurgischen oder therapeutischen Behandlung von Melanoma verwendet werden kann. Die Verbindungen der Formel (I) oder (II), oder diese enthaltenden Zusammensetzungen, werden auf jedem üblichen Weg verabreicht, inbegriffen auf enteralen oder parenteralen Wegen, insbesondere durch Injektion auf dem intravenösen, intramuskulären, subkutanen oder peritonealen Weg.
Dosierungen und Dosisbereiche werden davon abhängen ob das Mittel zur Lokalisierung oder zur Sichtbarmachung oder als Heilmittel verabreicht wurde als auch vom Alter, der Gesundheit, dem Gewicht und dem Geschlecht des Empfängers. Charakteristische Dosierungen befinden sich wahrscheinlich im Bereich von 0.001 mg/kg bis 0.5 mg/kg, beispielsweise von 0.003 mg/kg bis 0.2 mg/kg täglich oder sogar 0.02 oder vorzugsweise von 0.03 mg/kg bis 0.2 mg/kg täglich. Für erwachsene Menschen ist eine normale tägliche Dosis von 0.05 mg bis 50 mg, vorzugsweise von 0.01 mg bis 10 mg, beispielsweise von 0.5 mg bis 5 mg vorgesehen. Diese Dosis kann als Einzeldosis oder in Teildosen in zeitlichem Abstand verabreicht werden. Die Dosierungen würden, falls notwendig, wiederholt werden.
Die Erfindung wird nunmehr durch die begleitenden Zeichnungen und die nachfolgenden Beispiele dargestellt.
In den begleitenden Zeichnungen:
Abbildung 1 zeigt einen Vergleich zwischen der Aktivität von MSH, Ac-[Nle&sup4;, Asp&sup5;, D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;] α-MSH4-10 -NH&sub2; und einer Verbindung gemäss der Erfindung, DTPA-[Nle&sup4;, Asp&sup5;, D-Phe&sup7;,Lys¹&sup0;] α-MSH4-10 -NH&sub2; in einem Tyrosinase Untersuchungstest.
Abbildungen 2 und 3 zeigen die Verteilung im Gewebe der Maus nach 4 Stunden(Abb. 2) und 24 Stunden (Abb.3) im Anschluss an die Injektion von 2.5 x 10&supmin;¹&sup0; Mol von DTPA-[Nle&sup4;, Asp&sup5;, D-Phe&sup7;,Lys¹&sup0;] α-MSH4-10 -NH&sub2; (schraffierte Balken) oder 2MSH-DTPA (offene Balken), jedes mit 3.6 Mikrocurie (0.13 Mbq) InIII komplexiert. 2MSH-DTPA steht für die Verbindung:
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH&sub2; DTPA
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH&sub2;
Abbildung 4 zeigt die Beseitigung der Radioaktivität aus dem Kreislauf der Mäuse im Anschluss an die Injektion von 2.5 x 10&supmin;¹&sup0; Mol von DTPA-[Nle&sup4;, Asp&sup5;, D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;] - MSH(4-10) -NH&sub2;, das mit 3.6 Mikrocurie (0.13 MBq) ¹¹¹In komplexiert wurde.

BEISPIEL 1

Herstellung von In¹¹¹ markiertem [Nle&sup4;, Asp&sup5;, D-Phe&sup7; Lys¹&sup0;] alpha-MSH4-10

Synthese von DTPA-(Nle&sup4;, Asp&sup5;, D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;] MSH4-10

Das Peptid wurde stufenweise ausgehend vom C-Terminus mit Hilfe des Fmocpolyamid Verfahrens unter Verwendung von üblichen Arbeitsweisen auf einem Cambridge Research Biochemical Peptidsynthesiser (vergl. Dryland, A. & Sheppard, R.C. Tetrahedron 44, 859-876 (1988)) synthetisiert. Es wurde das Pepsyn KB Harz (1g, 0.2 mMol von Norleucin/g) verwendet und das Verknüpfungsmittel war Fmoc-amino-(2,4-dimethoxy-4'-carboxymethoxy) diphenylmethan. Die Fmoc Gruppe des Verknüpfungsmittels wurde entfernt und das erhaltene Amino- Harz mit Fmoc-lysin (Boc) pentafluorophenyl ester und 1-Hydroxybenzotriazol (0.6 mMol von jedem) behandelt. Nach 1 Stunde war die Kupplung zum Amin vollendet und das Harz wurde vor der Entfernung der Fmoc Gruppe gewaschen. Der nächste Rest, Tryptophan, wurde ebenfalls als Pentafluorophenyl ester hinzugefügt. Die dritten und vierten Reste, Arginin und D-Phenylalanin, wurden als freie Säuren in Anwesenheit von Benzotriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphat (BOP) und di-Isopropylethylamin (0.6 mMol von jedem Reagenz) gekuppelt. Die verbleibenden Reste wurden als Pentafluorophenyl ester hinzugefügt. Die Seitenketten wurden als tert.-Butyl Derivate geschützt mit der Ausnahme von Arginin,für das die 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulphonyl Gruppe verwendet wurde.
Nach Vollendung der Zusammenstellung des Peptids, wurde die Fmoc Gruppe vom N-terminalen Rest entfernt und das Peptid Harz mit DTPA bis-anhydrid (214 mg, 0.6 mMol) in Anwesenheit von 1-Hydroxybenzotriazol und Diisopropylethylamin (0.6 mMol von jedem) umgesetzt. Die Umsetzung war nach 1.5 Stunden beendet und das Harz wurde mit Dimethylformamid (DMF), Wasser, DMF, Essigsäure und Ether gewaschen. Nach dem Trocknen wurde das Harz (1.32 g) mit einem Gemisch bestehend aus Trifluoressigsäure (58 ml), Anisol (1 ml), Ethandithiol (0.5 ml) und Indol (1 g) sanft gerührt. Nach 2 Stunden wurde das Harz abfiltriert, mit Trifluoressigsäure (TFA) gewaschen und die vereinigten Filtrate am Rotationsverdampfer verdampft. Ether (100 ml) wurde zu dem Rückstand hinzugefügt um das rohe Peptid (192 mg) auszufällen. Dieses wurde mittels Ionenaustausch-Chromatographie auf einer Kolonne (15 mm x 350 mm) von Fractogel TSK CM-650(M) gereinigt, wobei mit 0.01M Ammoniumacetat,pH 4.5 eluiert wurde. Die Peptide enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und gefriergetrocknet und das Produkt (53 mg) mit Hilfe der Umkehrphasen- Chromatographie auf einer Kolonne (15 mm x 350 mm) von Vydac C18 (15-20 um) in einem Niederdruck-System weiter gereinigt. Es wurde ein linearer Gradient von 5% (v/v) bis 50% (v/v) Acetonitril in 0.1% TFA angelegt. Der Hauptpeak des Peptids wurde gefriergetrocknet wobei 35 mg eines bei Hochdruckflüssigkeitschromatographie homogenen Materials erhalten wurden. Die Identität des Produktes wurde mittels Aminosäureanalyse und einer Schnell-Atombeschuss- Massenspektrometrie bestätigt, die eine relative Molekülmasse von 1374 ergab. Die Verbindung wurde mit In¹¹¹ markiert unter Verwendung des im nachfolgenden Vergleichsbeispiel 1 beschriebenen Verfahrens.

BEISPIEL 2

Synthese von DTPA-(Nle&sup4;, Asp&sup5;, D-Phe&sup7;, Dab¹&sup0;) MSH4-10.

Dieses wurde in exakt der gleichen Weise hergestellt und gereinigt wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass die erste Aminosäure L-Diaminobuttersäure (Dab) war. Die Verbindung wurde mit In¹¹¹ unter Verwendung des im nachfolgenden Vergleichsbeispiel 1 beschriebenen Verfahrens markiert.

VERLEICHSBEISPIEL 1

A) SYNTHESE VON 2MSH-DTPA

Das Peptid wurde stufenweise ausgehend vom C-Terminus mit Hilfe des Fmoc- Polyamid Verfahrens unter Verwendung von üblichen Arbeitsweisen auf einem Cambridge Research Biochemicals Pepsynthesiser (vergl. Dryland, A. & Sheppard, R.C. Tetrahedron 44 859-876 (1988)) synthetisiert. Es wurde das Pepsyn K Harz (2 g, 0.1 mMol von Norleucin/g) verwendet und das Verknüpfungsmittel war Fmoc- amino-(2,4-dimethoxy-4'-carboxymethoxy)diphenylmethan. Die Fmoc Gruppe des Verknüpfungsmittels wurde entfernt und das erhaltene Amino-Harz mit Fmoc-valinpentafluorophenylester und 1-Hydroxybenzotriazol (0.8 mMol von jedem) behandelt. Nach 30 Minuten war die Kupplung zum Amin vollendet und das Harz wurde vor der Entfernung der Fmoc Gruppe und dem Kuppeln des nächsten Restes gewaschen. Dieser Vorgang wurde in jeder Stufe unter Verwendung von Fmoc-Aminosäurepentafluorophenylester wiederholt, mit Ausnahme des Serins, das als Oxobenzotriazin ester gekuppelt wurde. Die Seitenketten wurden als tert- Butyl Derivate geschützt, mit Ausnahme des Arginins, bei dem die 4-Methoxy- 2,3,6-trimethyl-benzolsulphonyl Gruppe verwendet wurde.
Nachdem die Zusammenstellung des Peptids vollendet war, wurde die Fmoc Gruppe vom N-terminalen Rest entfernt und das Peptid-Harz mit DTPA bis-anhydrid (108 mg, 0.3 mMol) in Anwesenheit von Diisopropylethylamin (0.025 ml, 0.15 mMol) umgesetzt. Die Umsetzung war nach 1 Stunde vollendet und das Harz wurde mit Dimethylformamid (DMF), Wasser, DMF, Dichlormethan und Ether gewaschen. Nach dem Trocknen, wurde ein Teil des Harzes (0.7 g) über Nacht mit einem Gemisch von Trifluoressigsäure (TFA), Ethan-dithiol, Phenol und Anisol (97 : 1 : 1 : 1, Volumsverh.) behandelt.
Verdampfen der TFA Lösung gefolgt von Digerieren mit Ether ergab einen weissen Feststoff (110 mg). Dieser wurde mit Hilfe der Phasenumkehr-Chromatographie auf einer Kolonne (15 mm x 500 mm) von Vydac C18 (15-20 um) in einem Niederdruck-System gereinigt. Es wurde ein linearer Gradient von 0.1% TFA in Wasser bis 35% (v/v) Acetonitril in 0.1% TFA über 1.5 L angelegt.
Fraktionen,enthaltend 2MSH-DTPA, wurden mit Hilfe der Hochdruckflüssigkeitschromatographie identifiziert und vereinigt und lyophilisiert um 11 mg zu ergeben. Die Identität des Produktes wurde mit Hilfe der Schnell-Atombeschuss- Massenspektrometrie bestätigt die eine relative Molekülmasse von 3602± 2 ergab.

B HERSTELLUNG VON¹¹¹ lNDIUM MARKIERTEM 2MSH-DTPA

Peptid (0.5 mg) wurde in Wasser (0.5 ml) gelöst und Citrat puffer (0.1M pH 5.6,1.0 ml) hinzugefügt. Diese Lösung wurde mit ¹¹¹InCl&sub3; (1.0 MCi in 0.1 ml 0.04M Chlorwasserstoffsäure (Amersham) ) markiert. Die Bindung zum Peptid wurde durch Dünnschichtchromatographie auf Silicagel unter Verwendung eines Doppel- Aufsteigesystems bestätigt. Das erste Lösungsmittel war 10%iges wässriges Ammoniumacetat/Methanol (1 : 1, v/v) und das zweite, Methanol/Wasser (8,5 1.5, v/v). In diesem System bildet das nicht gebundene Indium ein kolloidales Hydroxid, welches einen Rf Wert von 0.5 besitzt, während sich das markierte Peptid an der Lösungsmittelfront bewegt. 100% der Radioaktivität wurden an der Lösungsmittelfront lokalisiert, als die Lösung unmittelbar nach der Zugabe von Indium und nach Stehenlassen während 5 Stunden bei 18ºC gemessen wurde.

BIOLOGISCHE DATEN:

A) Tyrosinase Aktivität In Vitro

Cloudman S91 wurden in Monolagen zu einer Dichte von annähernd 25,000 Zellen cm&supmin;² in einem Züchtungskolben, unter Verwendung von 4 ml Ham's F10 Medium, das durch 10% Hitze inaktiviertes foetales Kalbsserum ergänzt wurde, gezüchtet. Das Medium wurde ersetzt und 10&supmin;&sup5; und 10&supmin;&sup9; Molare Konzentrationen der Test- und der Kontrollverbindungen hinzugefügt. Nach 24 Stunden wurden das Medium und die Melantropine erneuert und 1uCi, 3,5-³H-Tyrosin eingefügt. Die endgültige spezifische Aktivität des 3,5-³H-Tyrosinase Inkubationsmediums betrug 0.1 Ci/mMol.
Nach weiteren 24 Stunden wurden jeweils 0.2 ml des Mediums jeder Inkubation in Zentrifugenröhren übergeführt, die 1 ml aktivierter Aktivkohlesuspension (100 mg/ml in 0.1M Citronensäure) enthielten. Die Röhren wurden gewirbelt und bei 700 x g während 5 Minuten zentrifugiert. Aliquote Teile (0.5 ml) jedes Überstandes wurden in Szintillationsfläschchen übergeführt und am Packard Tri-Carb 300D Szintillationszähler gezählt. Aliquote Teile (0.1 ml) des nicht extrahierten Mediums wurden ebenfalls gezählt. Das verbleibende Medium wurde schliesslich entfernt und die Zellen Monolage in 1 ml isotonischer Trypsin/EDTA suspendiert.Die dispergierten Zellen wurden in einem Coulter Zähler gezählt.
Die per 10&sup5; Zellen vom Tyrosin freigesetzte Wassermenge wurde berechnet und die Ergebnisse durch den Wert dividiert, der von der Melanotropin freien Kontrolle erhalten wurde. Die Ergebnisse werden in Abbildung 1 gezeigt. Die Aktivitäten des Melanotropins wurden als molare Konzentrationen ausgedrückt, die benötigt werden um Reaktionen, die gleich dem halben Maximum (EC&sub5;&sub0;) sind, zu ergeben, die in Tabelle 1 registriert sind. TABELLE 1 Verbindung

B Vergleichsuntersuchung in Vivo

2MSH-DTPA und die Verbindung der Formel (IIa) wurden mit ¹¹¹In unter Verwendung der allgemeinen Methode, die im Vergleichsbeispiel 1(B) beschrieben wird, markiert, jedoch unter Verwendung von 2.5 nMol DTPA-Peptid in 0.05 ml Wasser, 0.2 ml Citrat Puffer und 5uCi ¹¹¹In. Die Lösung wurde nach Zugabe des Indiums mit physiologischer Kochsalzlösung auf 2.5 ml eingestellt. 0.1 ml dieser Lösung wurde i.p. 20 DBA2 Mäusen, die 14 Tage vorher i.p. mit Cloudman 891 Zellen inokuliert wurden, in Form einer Injektion verabreicht. In einigen Experimenten wurde Mäusen ebenfalls eine Lösung in Form einer Injektion verabreicht, die wie oben hergestellt wurde, jedoch unter Weglassung des DTPA-Peptids.
Die Tiere wurden in 5er Gruppen, 0.5, 1, 2, 4 und 24 Stunden, nach Injektion des markierten Peptids, getötet. Blut (0.1-0.3 g), Gehirn (ganz), Augen, Leber (annähernd 1 g), Milz (ganz), Herz (ganz), Lungen (ganz), Skelettmuskulatur (annähernd 0.1 g) und der Tumor (0.1-0.5 g), die intradermal (Tid) oder intraperitoneal (Tip) induziert wurden, wurden entfernt. Die einzelnen Gewebe wurden gewogen und auf einem Packard Multi-Prias 4 gamma Szintillationszähler unter Verwendung eines Fensters von 50-500 KeV gezählt. Die Ergebnisse wurden als CPM/g Nassgewicht ausgedrückt und durch den Blutwert zu jedem Zeitpunkt dividiert. Die Ergebnisse werden in den Abb. 2 bis 3 gezeigt. Die Entfernung der Radioaktivität aus der Zirkulation wird in Abb. 4 gezeigt.

Claims

1. Eine Verbindung der Formel

R-M

worin R ein zielgerichteter Teil ist, der gegebenenfalls durch eine Verknüpfungsgruppe an den N-Terminus eines zu α-MSH4-10 analogen Polypeptids dargestellt durch M und die Formel

[Nle&sup4;, Asp&sup5;, D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;] α-MSH4-10 -NH&sub2; hat, gebunden ist.

2. Eine Verbindung gemäss Anspruch 1 worin R von 5-(3,3-Dimethyl- 1-triazenyl)-1H-imidazol-4-carboxamid, Actinomycin D, Methotrexat, N-(2-chloroethyl)-N'-(trans-4-methylcyclohexyl)-N- nitrosoharnstoff oder Vorgängern davon, Tumor Necrosis Faktor, gamma Interferon hergeleitet oder ein Radionuklid ausgewählt aus Erbium 169, Yttrium 90, Rhenium 186, Lutetium 177, Indium 111, Indium 113m und Gallium 67 ist.

3. Eine Verbindung gemäss Anspruch 1 oder Anspruch 2 worin der Teil R ein Radionuklid ist, das an die Gruppe M mittels einer Verknüpfungsgruppe hergeleitet von Diethylentriaminpentaessigsäure, Ethylendiamintetraessigsäure, Ethylenglycol-0,0'-bis- (2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraessigsäure, Triethylentetraminhexaessigsäure oder N,N'-Bis(hydroxybenzyl)-ethylendiamin-N,N'- diessigsäure gebunden ist.

4. Eine Verbindung der Formel

L-M

worin L eine Verknüpfungsgruppe und M wie in Anspruch 1 definiert ist.

5. Eine Verbindung gemäss Anspruch 4 worin L von Diethylentriaminpentaessigsäure, Ethylendiamintetraessigsäure, Ethylenglycol-0,0'-bis(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraessigsäure, Triethylentetraminhexaessigsäure oder N,N'-bis(hydroxybenzyl)- ethylendiamin-N,N'-diessigsäure hergeleitet ist.

6. Die Verbindung der Formel

DTPA-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH&sub2;

7. Die Verbindung der Formel

DTPA-(Nle&sup4;,Asp&sup5;,D-Phe&sup7;,Dab¹&sup0;)MSH4-10

8. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, das die Umsetzung eines Teils R oder eines reaktiven Derivates davon mit einem zu α-MSH4-10 analogen Polypeptid der Formel

[Nle&sup4;,Asp&sup5;,D-Phe&sup7;,Lys¹&sup0;]α-MSH4-10 -NH&sub2; oder einem reaktiven Derivat davon umfasst.

9. Verfahren gemäss Anspruch 8 worin das reaktive Derivat des zu α-MSH4-10 analogen Polypeptids eine Verbindung der Formel gemäss Anspruch 4 ist.

10. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäss Anspruch 4 oder Anspruch 5, das die Umsetzung eines Teils L oder eines reaktiven Derivates davon mit einem zu α-MSH4-10 analogen Polypeptid der Formel

[Nle&sup4;,Asp&sup5;,D-Phe&sup7;,Lys¹&sup0;] α-MSH4-10 -NH&sub2; oder einem reaktiven Derivat davon umfasst.

11. Eine Verbindung gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 zur Verwendung in einer Diagnose- oder Behandlungsmethode, die auf menschlichem oder tierischem Körper angewendet wird.

12. Verwendung einer Verbindung gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 in der Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung in einer Diagnose- oder Behandlungsmethode von Melanoma, die auf menschlichem oder tierischem Körper angewendet wird.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine Verbindung gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff oder Verdünnungsmittel.