DE68913753T2

DE68913753T2 - Zielmittel.

Info

Publication number: DE68913753T2
Application number: DE68913753T
Authority: DE
Inventors: David Bard; Clive Knight; David Page-Thomas
Original assignee: Cancer Research Campaign Technology Ltd
Current assignee: Cancer Research Campaign Technology Ltd
Priority date: 1988-10-04
Filing date: 1989-10-04
Publication date: 1994-08-11
Anticipated expiration: 2009-10-05
Also published as: EP0437487A1; JPH04500805A; DE68913753D1; WO1990003798A2; EP0437487B1; NZ230897A; AU635721B2; WO1990003798A3; AU4403289A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft zielgerichtete Mittel die gegen bösartige Melanomazellen gerichtet sind, sowie ihre Herstellung und Verwendung.
Bösartige Melanome treten weltweit mit einer jährlichen Rate von zwischen 1 und 6 Fällen pro 100,000 Einwohnern auf. Sie sind insbesondere weit verbreitet unter der kaukasischen Bevölkerung von Australasien, in den Vereinigten Staaten von Nordamerika, der Schweiz und Skandinavien und haben eine ausgeprägte Zunahme der Häufigkeit während der letzten zwei Dekaden gezeigt. Die Prognose ist schlecht verglichen mit anderen Hautkarzinomen aufgrund der Tendenz von Melanomen zur frühen Metastasierung und ihrer Resistenz gegen Bestrahlung mit Gamma - Strahlen und systemische cytotoxische Chemotherapie. Der Erfolg der Therapie würde wesentlich durch Mittel verbessert werden, die diagnostische und therapeutische Mittel gegen primäre Melanoma und ihre Metastasen richten könnten.
Viel Arbeit wurde auf diesem Gebiet auf die Entwicklung von monoklonalen Antikörpern gegen spezifische Zelloberflächen Marker aufgewendet. Solch eine Methode leidet unter der Schwierigkeit einen Zelloberflächen Marker aufzufinden der eindeutig gegen Melanoma ausgerichtet ist, an dem jedoch alle Varianten des Tumors und der Erkennung und Entfernung des Antikörpermoleküls durch das Immunsystem des Patienten beteiligt sind. Eine alternative Auffassung macht Gebrauch von der Beobachtung, dass sowohl bösartige als auch normale Melanocyten Rezeptoren für das Peptidhormon Alpha - Melanocyten Stimulierendes Hormon (MSH) besitzen. MSH stimuliert die Produktion von Melanin durch Melanocyten in einem weiten Bereich der Chordata Spezies. In Säugetieren erfolgt dies durch Kombination mit Zelloberflächen Rezeptoren, wobei dadurch eine Aufeinanderfolge von Ereignissen ausgelöst wird die schliesslich zur Stimulierung der Synthese von Tyrosinase führen, dem Enzym das Tyrosin in L-DOPA, dem unmittelbaren Vorgänger von Melanin, überführt.
MSH kann am N-Terminus mit geringem oder keinem Verlust an hormonaler Aktivität modifiziert werden und es wurde gezeigt, dass MSH, das auf diese Art mit Diphterietoxin verknüpft ist, selektiv in vitro Melanomazellen tötet. (Murphy, J.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 83, 8258 - 8262 (1986) ). In ähnlicher Weise wird durch den Chelat Bildner, Diethylentriamin Pentaessigsäure ( DTPA ), am N - Terminus ( MSH - DTPA ) substituiertes MSH rasch mit Melanomazellen sowohl in vitro als auch in vivo verbunden.(Bard D R et al., Biochem. Soc. Trans. London 14, 614 - 615 (1986) ).
Es wurde nunmehr überraschenderweise entdeckt, dass neue zielgerichtete Mittel, die zwei oder mehrere N - Terminus - verknüpfte Gruppen vom MSH Typus umfassen, eine verbesserte Bindung an Melanocyten und/oder eine rasche Abscheidung aus Tieren aufweisen, denen die Mittel verabreicht wurden.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung eine Verbindung der Formel ( I )
R - (M)n ( I )
worin n grösser als 1 ist, vorzugsweise 2 oder mehr, jedes M ein N-terminus-gebundenes Polypeptid ist, das ausgewählt ist aus dem Alpha-Melanocyten-stimulierenden Hormon (MSH) und Derivaten und Analoga davon und R ein zielgerichteter Teil ist, der gegebenenfalls an die Gruppen M durch eine Verknüpfungsgruppe gebunden ist.
Die Gruppe R kann eine direkt gebundener zielgerichteter Teil sein, der zumindest zwei Stellungen besitzt an die die N-Termini von Polypeptiden gebunden sein können ohne die Verwendbarkeit des zielgerichteten Teiles zu zerstören. Alternativ hierzu kann die Gruppe R mittels einer Verknüpfungsgruppe gebunden sein, die ihrerseits an die Gruppen M gebunden ist. Zielgerichtete Teile mit nur einer Bindungsstelle können mit dem bis - MSH durch Vereinigung der beiden Peptidketten durch ein Verknüpfungsreagenz, das eine reaktive funktionelle Gruppe behält, verknüpft sein. Ein Beispiel eines solchen Reagenz ist der Disuccinimidyl Ester des Succinyl - lysyl (Fmoc) - beta - alanins, der eine geschützte Aminogruppe enthält.
Geeignete zielgerichtete Teile enthalten cytotoxische Mittel wie Dacarbazin (5 - [3, 3 - Dimethyl - 1 - triazenyl] - 1H - imidazol - 4 - carboxamid), Actinomycin D, Methotrexat und Methyl CCNU (N - (2 - Chloroethyl) - N' - (trans - 4 - methylcyclohexyl) N - nitrosoharnstoff) und ihre Vorgänger und Zytokinese Mittel wie Tumor Necrosis Faktor (TNF) und Gammmainterferon.
Andere zielgerichtete Teile sind nachweisbare Marker wie Radiomarker, zur Lokalisierung und zur Sichtbarmachung von Tumoren. Besonders geeignete Radionuklide zur Verwendung als cytotoxische Mittel enthalten Beta Strahler mit kurzer Halbwertszeit wie Erbium 169, Yttrium 90, Rhenium 186 und Lutetium 177 und zur Verwendung als Mittel zur Sichtbarmachung enthalten sie Indium 111, Indium 113m und Gallium 67.
Im allgemeinen, sind kleine, zielgerichtete Teile wie Radionuclide wahrscheinlich nicht geeignet zur direkten Bindung an die Gruppen M und werden deshalb über eine Verknüpfungsgruppe gebunden. Geeignete Verknüpfungsgruppen zur Bindung vieler Typen von zielgerichteten Teilen an Peptide, werden denen, die auf dem Gebiet bewandert sind, bekannt sein. Zur Verknüpfung von Radionukliden ist es besonders bevorzugt Chelat bildende Mittel zu verwenden wie beispielsweise Diethylentriamin Pentaessigsäure (DTPA); Ethylendiamin Tetraessigsäure (EDTA); Etylenglykol - O,O' - bis(2 - aminoethyl) - N, N, N', N' - tetraessigsäure (EGTA); Triethylentetramin Hexaessigsäure (TTHA) und N N' -bis(Hydroxybenzyl)ethylendiamin - N, N' - diessigsäure (HBED).
Die Gruppen M können gleich oder verschieden sein, es ist jedoch bevorzugt, dass sie alle gleich sind. Jede Gruppe M ist ein N-terminus-verknüpftes MSH Peptid oder ein Analoges oder Derivat davon. Untersuchungen anderer haben zur Identifizierung verschiedener Analoga und Derivate von MSH geführt, die eine verbesserte Bindung an MSH Rezeptoren aufweisen und es ist insbesondere bevorzugt N - terminus - verknüpftes MSH oder ein "superpotentes" synthetisches Melanotropin zu verwenden wie [Nle&sup4; , D - Phe&sup7; ] -alpha -MSH, das von Sawyer T. K.. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 , 5754 - 5788 (1980) beschrieben wird und diejenigen, die beschrieben werden von F. Al - Obeidi et al. , J. Med.Chem., 32 , 174 - 179 (1989) , insbesondere die superpotenten MSH&sub4; &submin; &sub1;&sub0; Analoga [Nle&sup4;, D - Phe&sup7; , Lys¹&sup0; , Gly¹¹ ] alpha - MSH&sub1; &submin; &sub1;&sub3; - NH&sub2; ; [Nle&sup4;,Asp&sup5;, D - Phe&sup7; , Lys¹&sup0; , Gly¹¹ ] alpha - MSH&sub1; &submin; &sub1;&sub3; - NH&sub2; ; [Nle&sup4; , D - Phe&sup7; , Lys¹&sup0; , Gly¹¹ ] alpha - MSH&sub4; &submin; &sub1;&sub3; - NH&sub2; ; [Nle&sup4; , Asp&sup5; , D - Phe&sup7;, Lys¹&sup0;, Gly¹¹ ] alpha - MSH&sub4; &submin;&sub1;&sub3; - NH&sub2; ; [Nle&sup4; , Asp&sup5;, D - Phe&sup7; ] alpha - MSH&sub4; &submin; &sub1;&sub0; - NH&sub2; ; [Nle&sup4;, D - Phe&sup7; , Lys¹&sup0; ]alpha - MSH&sub4; &submin; &sub1;&sub0; - NH&sub2; ; [Nle&sup4; , D - Phe&sup7; , Orn¹&sup0; ] alpha - MSH&sub4; &submin; &sub1;&sub0; - NH&sub2; ; [Nle&sup4; , Asp&sup5;, D - Phe&sup7; , Orn¹&sup0; ] alpha - MSH&sub4; &submin; &sub1;&sub0; - NH&sub2; ; [Nle&sup4; , D - Phe&sup7; , Dab¹&sup0;] alpha - MSH&sub4; &submin; &sub1;&sub0; - NH&sub2; ; [Nle&sup4; , Asp&sup5; , D - Phe&sup7; , Dpr¹&sup0;] alpha - MSH&sub4; &submin; &sub1;&sub0; - NH&sub2; ; [Nle&sup4;, Asp&sup5;, D - Phe&sup7; , Lys¹&sup0;]alpha - MSH&sub4; &submin; &sub1;&sub0; - NH&sub2;und [Nle&sup4; , Asp&sup5; , D - Phe&sup7; , Dab¹&sup0; , Lys¹&sup0; ] alpha - MSH&sub4; &submin; &sub1;&sub0; - NH&sub2; und die cyclischen alpha - Melanotropine die von Al - Obeidi et al., J. Am Chem. Soc. , III, 3413 - 3417 (1989) beschrieben wurden.
Die Verbindungen gemäss der vorliegenden Erfindung können Gemische oder reine Produkte sein. Falls sie Gemische sind, so können die einzelnen Komponenten des Gemisches verschiedene Werte von n besitzen, sodass im gesamten Produkt n einen Durchschnittswert besitzt der integral oder fraktional sein kann. Vorzugsweise sind die Verbindungen gemäss der Erfindung im wesentlichen reine Produkte, in diesem Fall wird n eine ganze Zahl von 2 oder mehr sein.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung eine Verbindung der Formel ( II )
L - (M)n ( II )
worin M und n im Zusammenhang mit der Formel ( I ) definiert sind und L für eine Verknüpfungsgruppe steht, vorzugsweise ein Chelat bildendes Mittel wie DTPA.
Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel ( II ) sind 2 MSH - DTPA der Formel ( II a )
und die Analoga der Formeln ( II b ) bis ( II m ).
Die Verbindungen gemäss der vorliegenden Erfindung können mit Hilfe üblicher Methoden hergestellt werden. Um zwei oder mehr Peptide zu einem einzelnen zielgerichteten Teil oder einer Verknüpfungsgruppe zu verknüpfen, wird es oft zweckmässig sein die Peptide an ein festes Substrat zu binden, beispielsweise an die Harzperlen, die üblicherweise bei der Pepetidsynthese verwendet werden.
Die Erfindung betrifft deshalb ferner ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel ( I ), das die Umsetzung einer Gruppe R oder eines reaktiven Derivates hiervon mit Gruppen M oder deren reaktiven Derivaten umfasst. Falls die Gruppe R eine zielgerichteter Teil ist der über eine Verknüpfungsgruppe gebunden ist, wird das Verfahren im allgemeinen die Stufe ( a ) enthalten, die aus der Umsetzung einer Gruppe L oder eines reaktiven Derivates hiervon mit Gruppen M oder deren reaktiven Derivaten zwecks Bildung einer Verbindung der Formel ( II ), die oben definiert ist, besteht und ( b ) der Umsetzung einer Verbindung der Formal ( II ) oder eines reaktiven Derivates hiervon mit einer Verbindung R' oder eines reaktiven Derivates hiervon die den zielgerichteten Teil R enthält.
Die Reaktionsbedingungen wie Temperatur, Dauer und Auswahl der Lösungsmittel und die Art der reaktiven Derivate wird bestimmt durch die Art der Gruppen R, L und R' und es liegt in den Fähigkeiten von Fachleuten diese angemessen auszuwählen.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren ferner auch noch die Trennung und die Reinigung der Verbindung. Für Verbindungen, worin der zielgerichtete Teil R über eine Verknüpfungsgruppe L, die ein Chelat bildendes Mittel wie DTPA ist, gebunden ist umfasst das Herstellungsverfahren vorzugsweise die Synthese der Peptidketten auf einem Harzsubstrat durch aufeinanderfolgende Zugabe von geschützten Aminosäureresten, Entschützung falls notwendig und anschliessend Umsetzung der Peptidketten mit einem Verknüpfungsreagenz vor der Entfernung der Peptidketten vom Harzsubstrat und schliesslich Reinigung des so hergestellten Mittels beispielsweise durch Umkehrphasen Chromatographie.
Die Verbindungen gemäss der vorliegenden Erfindung sind verwendbar zur Diagnose und der chirurgischen oder therapeutischen Behandlung von Melanomen,beispielsweise zur Sichtbarmachung von Tumoren und Verabreichung von Arzneimitteln an denTumorstellen. Die vorliegende Erfindung betrifft deshalb ferner auch eine Verbindung der Formel ( I) oder ( II) zur Verwendung bei der Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Chirurgie oder Therapie oder in einem Diagnoseverfahren ausgeführt an einem menschlichen oder tierischen Körper. Es werden ferner Diagnoseverfahren unter Verwendung der Verbindungen der Formel ( I ) oder ( II ) zur Prüfung von Proben oder Geweben, die menschlichen oder tierischen Körpern entnommen wurden,zur Verfügung gestellt.Die Erfindung betrifft ferner auch die Verwendung einer Verbindung der Formel ( I ) als Medikament zur Behandlung oder Diagnose von Melanomen. Die Verbindungen der Formel ( I ) oder ( II ) können direkt oder in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen die die Verbindung der Formel ( I ) oder ( II ) und pharmazeutisch annehmbare Verdünnungsmittel oder Träger enthalten, verwendet werden.
Solche Verdünnungsmittel und Träger enthalten Tablettierungsmittel, Netzmittel, Bindemittel und Füllstoffe, Konservierungsmittel wie Antioxidantien und antimikrobielle Mittel, Puffersubstanzen und Salze als auch übliche Injektionsmedien, insbesondere Wasser zur Injektion. Solche pharmazeutische Zusammensetzungen und Verfahren zu deren Formulierung bilden ebenfalls einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wie dies ebenfalls die Verwendung einer Verbindung der Formel ( I ) oder ( II ) bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Diagnose oder der chirurgischen oder therapeutischen Behandlung von Melanomen darstellt.
Die Verbindungen der Formel ( I ) oder ( II ) oder deren Zusammensetzungen werden auf jedem üblichen Weg verabreicht, in begriffen auf enteralem oder parenteralem Weg insbesondere durch Injektion auf intravenösem, intramuskulärem, subkutanem oder peritonealem Weg.
Die Dosierungen und Dosisbereiche werden davon abhängen ob das Mittel für Lokalisierungs- oder Sichtbarmachungszwecke oder als therapeutisches Mittel verabreicht wurde und vom Alter, der Gesundheit, dem Gewicht und Geschlecht des Empfängers. Typische Dosierungen bewegen sich geeigneterweise im Bereich von 0.001 mg/kg bis 0.05 mg/kg täglich, vorzugsweise von 0.003 mg/kg bis 0.02 mg/kg täglich. Für erwachsene Menschen beträgt die normale tägliche Dosis von 0.05 mg bis 5 mg, vorzugsweise von 0.01 mg bis 1 mg, beispielsweise 0.5 mg. Diese Dosis kann als Einzeldosis oder in geteilten Dosen in Intervallen verabreicht werden. Die Dosierungen können wiederholt werden, falls notwendig.
Die Erfindung wird nunmehr in den nachfolgenden Abbildungen der begleitenden Zeichnungen und den nachfolgenden, nicht begrenzenden, Beispielen dargestellt.
In den begleitenden Zeichnungen
Abbildung 1 zeigt einen Vergleich von MSH, Des-Acetyl MSH, MSH - DTPA und 2MSH - DTPA in der Tyrosinase Untersuchung.
Abbildung 2 zeigt ¹¹¹In markierte 2 MSH - DTPA Konzentrationen in verschiedenen Geweben, nach Verabreichung an Mäuse durch Injektion in Intervallen.
Abbildung 3 zeigt einen Vergleich des Verhältnisses von Tumor/Blutkonzentration von 2 MSH - DTPA, MSH - DTPA und Indiumcitrat 42 Stunden nach Verabreichung an Mäuse durch Injektion.
Abbidung 4 zeigt die Ganzkörperklärungsraten für 2MSH - DTPA, MSH - DTPA und Indiumcitrat nach Verabreichung an Ratten durch Injektion.
Abbildung 5 zeigt die Resultate einer ( a ) vorhergehenden und ( b ) nachfolgenden Ganzkörper I. G. E. Abtastung nach 4 Stunden und 5 Minuten.
Abbildung 6 zeigt eine punktförmige I. G. E. Abtastung des Nackens und Kopfes (vorhergehend ) nach 4 Stunden und 5 Minuten.
Abbildung 7 zeigt die Resultate einer ( a ) vorhergehenden und ( b ) nachfolgenden Ganzkörper I. G. E. Abtastung nach 48 Stunden.
Abbildung 8 ist eine graphische Darstellung einer Ganzkörper - Retention von 2 MSH - DTPA berechnet aus den Fühlermessungen, der Ganzkörper I. G. E. Abtastung und der im Urin bestimmten Radioaktivität.
Abbildung 9 ist eine graphische Darstellung einer Klärung des Blutes von 2 MSH - DTPA.
Abbildung 10 ist eine graphische Darstellung von mit dem Tumor, den Nieren, der Leber, der Lunge und der Milz assoziierten Radioaktivität ausgedrückt als Proportionen der Ganzkörper Radioaktivität zur Zeit 0. Die Angaben sind für die Masse jedes Organs nicht korrigiert.
Abbildung 11 ist eine graphische Darstellung von mit dem Tumor, den Nieren, der Leber, der Lunge und der Milz assoziierten Radioaktivität ausgedrückt als Verhältnis der zu jedem Zeitpunkt verbleibenden Ganzkörper Radioaktivität. Die Angaben sind für die Masse jedes Organs nicht korrigiert.
Abbildung 12 ist eine graphische Darstellung der Radioaktivität im Tumor, den Nieren und der Leber berechnet als absolute Anzahl pro Volumenseinheit des Gewebes. Die Volumina wurden berechnet als ( Fläche bei Abtastung )3/2 und die Resultate sind relativ zueinander auf einer willkürlichen Scala dargestellt.

Beispiel 1

A) SYNTHESE VON 2MSH - DTPA

Das Peptid wurde stufenweise ausgehend vom C-Terminus mit Hilfe der Fmoc - Polyamid Methode unter Verwendung von Standard Verfahren auf einem Cambridge Research Biochemicals Pepsynthesiser ( cf. Dryland, A. & Sheppard, R. C. Tetrahedron 44 , 859 - 876 (1988) ) synthetisiert. Es wurde das Pepsyn K Harz ( 2 g 0.1 Mmole von Norleucin/g) verwendet und das VerknüpfungsmiUel war Fmoc - Amino (2, 4 - dimethoxy 4' - carboxymethoxy) diphenylmethan. Die Fmoc Gruppe des Verknüpfungsmittels wurde entfernt und das verbleibende Amino - Harz mit Fmoc - Valin Pentafluorophenylester und 1 - Hydroxy - benzotriazol ( 0.8 Mmole von jedem ) behandelt. Nach 30 Minuten war das Kuppeln an das Amin beendet und das Harz wurde vor der Entfernung der Fmoc Gruppe und das Kuppeln des nächsten Restes gewaschen. Dieser Vorgang wurde in jeder Stufe unter Verwendung von Fmoc Aminosäure Pentafluorophenylester wiederholt, ausgenommen im Falle des Serins, das als Oxobenzotriazinester gekuppelt wurde. Die Seitenketten wurden als tert. Butyl Derivate geschützt, ausgenommen im Falle des Arginins, wo die 4 - Methoxy - 2, 3, 6 - trimethylbenzolsulfonyl Gruppe verwendet wurde.
Nach Beendigung des Zusammenbaus des Peptids wurde die Fmoc Gruppe vom N- terminalen Rest entfernt und das Peptidharz mit DTPA bis - Anhydrid ( 108 mg, 0.3 Mmole ) in Anwesenheit von Di - Isopropylethylamin ( 0.025 ml, 0.15 Mmole ) umgesetzt. Die Umsetzung war nach einer Stunde beendet und das Harz wurde mit Dimethylformamid ( DMF), Wasser, DMF, Dichlormethan und Ether gewaschen. Nach dem Trocknen, wurde ein Teil des Harzes ( 0.7 g ) über Nacht mit einem Gemisch von Trifluoressigsäure ( TFA Ethandithiol, Phenol und Anisol ( 97 : 1 : 1 : 1, Volumensverhältnis ) behandelt.
Das Verdampfen der TFA Lösung gefolgt von Digerieren mit Ether ergab einen weissen Festkörper ( 110 mg ). Dieser wurde durch Umkehrphasen Chromatographie auf einer Kolonne ( 15 mm x 500 mm ) von Vydac C18 ( 15 - 20 um ) in einem Niederdrucksystem gereinigt. Es wurde ein linearer Gradient von 0.1 % TFA in Wasser bis 35 % (v/v ) Acetonitril in 0.1 % TFA über 1.5 Liter angelegt. Fraktionen enthaltend 2 MSH - DTPA wurden mit Hilfe von Hochdruck Flüssigkeitschromatographie identifiziert und kombiniert und lyophilisiert um 11 mg zu erhalten. Die Identität des Produktes wurde durch Schnell Atombombardierungs Massenspektrometrie bestätigt die eine relative Molekularmasse von 3602 ± 2 ergab.

B. HERSTELLUNG VON ¹¹¹INDIUM MARKIERTEM 2MSH - DTPA

Das Peptid ( 0.5 mg ) wurde in Wasser ( 0.5 ml ) gelöst und Citrat Puffer ( 0.1 M, pH 5.6, 1.0 ml ) wurde hinzugefügt. Diese Lösung wurde mit ¹¹¹InCl&sub3; (1.0 MCi in 0.1 ml 0.04 M Chlorwasserstoffsäure ( Amersham )) markiert. Die Bindung an das Peptid wurde mittels Dünnschicht Chromatographie auf Silica Gel unter Verwendung eines Doppel Anstiegsystems bestätigt. Das erste Lösungsmittel war 10 % iges wässriges Ammoniumacetat/Methanol ( 1 : 1, v/v) und das zweite Methanol/Wasser ( 8.5 : 1.5, v/v ). In diesem System bildet nicht gebundenes Indium ein kolloidales Hydroxyd das einen Rf von 0.5 besitzt, während sich markiertes Peptid zur Vorderseite des Lösungsmittels bewegt. 100 % der Radioaktivität wurde auf der Vorderseite des Lösungsmittels angetroffen, falls die Lösung sofort nach Zugabe von lndium und nach Stehen während 18 Stunden bei 18º C analysiert wurde.

C) TYROSINASE AKTIVITÄT IN VITRO

Cloudman S91 Zellen wurden in Monolagen bis zu einer Dichte von ungefähr 25,000 Zellen cm&supmin;² im 25 cm² Züchtungskolben unter Verwendung von 4 ml Ham's F10 Medium ergänzt durch 10 % hitzeinaktiviertes foetales Kalbsserum gezüchtet. Das Medium wurde ersetzt und 10&supmin;&sup5; und 10&supmin;&sup9; molare Konzentrationen von MSH, Des - Acetyl MSH, MSH - DTPA oder 2MSH - DTPA zugesetzt. Nach 24 Stunden wurden das Medium und die Melanotropine erneuert und luCi, 3, 5 -³ H Tyrosin eingefügt. Die endgültige spezifische Aktivität dem 3, 5 - ³H - Tyrosin Inkubanonsmediums betrug 0.1 Ci/Mmol.
Nach weiteren 24 Stunden, wurden 0.2 ml des Mediums jeder Inkubation in Zentrifugierröhren enthaltend 1 ml aktivierte Holzkohlensuspension (100 mg/ml in 0.1 M Citronensäure ), übergeführt. Die Röhren wurde stark geschüttelt und bei 700 x g während 5 Minuten zentrifugiert. Gleiche Teile ( 0.5 ml ) jedes Überstandes wurden in Szintillationsbehälter übergeführt und in einem Packard Tri - Carb 300D Szintillationszähler gezählt. Gleiche Teile ( 0.1 ml ) des nicht extrahierten Mediums wurden ebenfalls gezählt. Schliesslich wurde das verbleibende Medium entfernt und die Zell Monolage in 1 ml isotonischer Trypsin/EDTA suspendiert. Die dispergierten Zellen wurden in einem Coulter Zähler gezählt.
Die Menge des von dem Tyrosin per 10&sup5; Zellen erzeugten Wassers wurde berechnet und die Resultate durch die, bei der Melanotropin - freien Kontrolle erhaltenen , Werte dividiert. Die Resultate werden in der Abbildung 1 gezeigt.

D) VERGLEICHSUNTERSUCHUNG IN VIVO

2MSH - DTPA oder MSH - DTPA wurden mit ¹¹¹In mit Hilfe der in ( B ) beschriebenen allgemeinen Methode markiert, jedoch unter Verwendung von 2.5 Nmol DTPA- Peptid ( 0.277 pg 2MSH - DTPA, 0.153 pg MSH - DTPA ) in 0.05 ml Wasser, 0.2 ml Citratpuffer und 5uCi ¹¹¹In. Die Lösung wurde nach Zugabe von Indium mit physiologischer Salzlösung auf 2.5 ml eingestellt. 0.1 ml dieser Lösung wurden i. p.20 DBA2 Mäuse injiziert, die 14 Tage vorher mit Cloudman S91 Zellen inokuliert worden sind. In einigen Experimenten wurde Mäusen ebenfalls eine, oben beschriebene, jedoch unter Weglassung des DTPA - Peptids, hergestellte, Lösung injiziert.
Die Tiere wurden in Gruppen zu 5 nach 5, 17, 26 und 42 Stunden nach der Injektion des markierten Peptids getötet. Blut (0.1 - 0.3 g ), Hirn (ganz ), Augen, Leber ( annähernd 1 g) , Milz ( ganz ), Herz ( ganz ), Lungen ( ganz ), Skelettmuskel ( annähernd 0.1 g ) und Tumor ( 0.1 - 0.5 g ) wurden entfernt. Die einzelnen Gewebe wurden gewogen und auf einem Packard Multi - Prias 4 Gamma Szintillationszähler unter Verwendung eines Fensters von 50 - 500 KeV gezählt. Die Resultate wurden als CPM/g Nassgewichi ausgedrückt und durch den Blutwert zu jedem Zeitpunkt dividiert.
Zur Durchführung des Ganzkörper Retentionsexperimentes wurden jeweils 0.5 ml jeder der drei radioaktiven Präparationen normalen Ratten i. p. injiziert. Die Radioaktivität wurde in den sedierten Tieren mit Hilfe eines externen Gamma Szintillationsfühlers der an der hinteren Seite des Tieres angebrachracht war und entlang der Achse des Tieres verschoben wurde,sodass der gesamte Körper innerhalb des Empfangskegels des Fühlers lag, gemessen. Messungen wurden 0, 4, 21, 46 und 72 Stunden nach der Inlektion durchgeführt und die Resultate als ein Verhältnis der nachgewiesenen Maximalzählungen dargestellt.
Resultate werden in den Abbildungen 2 bis 4 gezeigt.

BEISPIEL 9

Synthese von bis( Nle&sup4;, Asp&sup5;, D - Phe&sup7;, Lys¹&sup0; ) alpha - MSH&sub4; &submin; &sub1;&sub0; - DTPA.

Das Peptid wurde stufenweise ausgehend vom C - Terminus mit Hilfe der Fmoc - Polyamid Methode unter Verwendung von Standardverfahren auf einem Cambridge Research Biochemicals Pepsynthesiser ( cf. Dryland, A. & Sheppard, R. C. Tetrahedron 44, 859 - 876 ( 1988 )) synthetisiert. Es wurde ein Pepsyn KB Harz ( 1 g, 0.2 Mmole von Norleucin/g ) verwendet und das Verknüpfungsmittel war Fmoc - Amino - ( 2, 4 - dirnethoxy - 4' - carboxymethoxy) diphenylmethan. Die Fmoc Gruppe des Verknüpfungsmittels wurde entfernt und das resultierende Amino - Harz wurde mit Fmoc - Lysin ( Boc ) Pentafluorophenylester und 1 - Hydroxybenzotriazol ( 0.6 Mmole von jedem ) behandelt. Nach 1 Stunde war die Kupplung an das Amin beendet und das Harz wurde vor der Entfernung der Fmoc Gruppe gewaschen. Der nächste Rückstand, Tryptophan, wurde ebenfalls als Pentafluorophenylester hinzugefügt. Die dritten und vierten Rückstände, Arginin und D - Phenylalanin, wurden als freie Säuren in Anwesenheit von Benzotriazol - 1 - yloxy - tris( dimethylamino ) phosphonium Hexafluorophosphat ( BOP ) und Di - Isopropylethylamin ( 0.6 Mmole von jedem Reagenz ) gekuppelt. Die verbliebenen Rückstände wurden als Pentafluorophenylester hinzugefügt. Die Seitenketten wurden als tert. Butyl Derivate geschützi mit Ausnahme von Arginin, für das die 2, 2, 5, 7, 8 - Pentamethylchroman - 6 -sulphonyl Gruppe verwendet wurde.
Nach Beendigung des Zusammenfügens des Peptids wurde die Fmoc Gruppe vom N - terminal Rückstand entfernt und das Peptidharz mit DTPA bis - Anhydrid ( 55 mg. 0.15 Mmole ) in Anwesenheit von 1 - Hydroxybenzotriazol und Di - Isopropylethylamin (jeweils 0.15 Mmole von jedem ) umgesetzt. Nach Stehen über Nacht wurde das Harz mit Dimethylformamid ( DMF ) gewaschen und die Umsetzung mit frischen Reagenzien wiederholt. Die Umsetzung war 24 Stunden später beendet und das Harz wurde mit DMF, Wasser, DMF, Essigsäure und Ether gewaschen Nach dem Trocknen wurde das Harz (1.21 g) leicht mit einem Gemisch von Trifluoroessigsäure ( 58 ml ), Anisol ( 1 ml ), Ethandithiol (0.5 ml ) und Indol ( 1 g ) gerührt. Nach 2 Stunden wurde das Harz filtriert, mit TFA gewaschen und die vereinigten Filtrate am Rotationsverdampfer verdampft. Ether ( 100 ml ) wurde dem Rückstand hinzugefügt um das rohe Peptid ( 173 g ) auszufällen. Die Verbindung wurde durch Umkehrphasenchromatographie auf Vydac C18 gereinigt. Die Verbindung wurde mit In¹¹¹ wie in Beispiel 1 beschrieben markiert.

BEISP1EL 3

Synthese von bis ( Nle&sup4; , Asp&sup5;, D - Phe&sup7;, Dab¹&sup0; ) MSH&sub4; &submin; &sub1;&sub0; - DTPA.

Dieses wurde in der gleichen Weise hergestellt und gereinigt wie oben angegeben, mit der Ausnahme, dass die erste Aminosäure die L - Diaminobuttersäure ( Dab ) war. Die Verbindung wurde mit In¹¹¹, wie in Beispiel 1 beschrieben, markiert.

BEWEIS EINER ZIELRICHTUNG AUF EIN MENSCHLICHES MELANOM

Der Patient war 57 Jahre alt und hatte seit 4 Jahren ein Melanom. Ein Primärtumor am linken Augenlid ( chirurgisch entfernt ) bildete Metastasen unter Ausbildung von grossen Knoten auf der linken Seite des Nackens. Der Patient erhielt Chemotherapie.
2MSH - DTPA, 0.5 mg, markiert mit 35 MBq ¹¹¹In wurde mittels einer langsamen intravenösen Infusion während einiger Minuten verabreicht. Eine Ganzkörperradioaktivität wurde sofort nach der Infusion mit Hilfe einer Sonde gemessen. Vorhergehende und nachfolgende Ganzkörper und Tumorstellen I. G. E. A. Abtastungen ( mit Erfassung von Computerdaten) und Ganzkörperfühlermessungen wurden 4 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden nach der Infusion durchgeführt. Heparinisierte Blutproben, 10 ml wurden nach 10 Minuten, 2 Stunden, 4 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden entnommen und Urin wurde von 0 - 4 Stunden, 4 - 24 Stunden und 24 - 48 Stunden gesammelt.
Die Resultate werden in den Abbildungen 5 bis 12 gezeigt.

Claims

1. Eine Verbindung der Formel I

R-(M)n (I)

worin n grösser als 1 ist, jedes M ein N-terminus-gebundenes Polypeptid ausgewählt aus dem α-Melanocyten-stimulierenden Hormon (MSH) und Derivaten und Analoga davon, welche eine Bindungsaffinität zu MSH Rezeptoren haben, und R ein zielgerichteter Teil ausgewählt aus einem cytostatischen Mittel, einem Vorgänger davon, einem Cytokin-Mittel und einem Radionuklid ist,

R und die Gruppen M durch eine Verknüpfungsgruppe gebunden sind, welche fähig ist, ein Chelat mit einem Radionuklid zu bilden, wenn R ein Radionuclid ist.

2. Eine Verbindung gemäss Anspruch 1, worin R an die Gruppen M durch eine Verknüpfungsgruppe gebunden ist, welche fähig ist R mit den Endaminogruppen von M zu verbinden wenn R anders als ein Radionuklid ist.

3. Eine Verbindung gemäss Anspruch 1 oder 2, worin n für 2 steht.

4. Eine Verbindung gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Gruppen M gleich sind und jeweils ein N-terminus-gebundenes α-Melanocyten- stimulierendes Hormon (MSH) oder ein N-terminus-gebundenes superwirksames synthetisches Melanotropin ausgewählt aus

[Nle&sup4;, D-Phe&sup7;]-α-MSH;

superwirksamen MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0; Analoga von MSH und cyklischen α-Melanotropinen, ist.

5. Eine Verbindung gemäss irgendeinem der Ansprüche 1, 3 und 4, worin R ein Radionuklid, das an die Gruppen M durch eine Verknüpfungsgruppe gebunden ist, welche fähig ist, ein Chelat mit dem Radionuklid zu bilden.

6. Eine Verbindung gemäss Anspruch 5, worin R ein Radionuklid zur Lokalisierung und Abbildung von Tumoren oder ein β-emitierendes Radionuklid ist.

7. Eine Verbindung gemäss Anspruch 5 oder 6, worin R an die Gruppen M durch Diethylentriamin Pentaessigsäure gebunden ist.

8. Eine Verbindung der Formel II

L-(M)n (II)

worin M und n wie in Anspruch 1 definiert sind und L für eine Verknüpfungsgruppe steht, die fähig ist, ein Chelat mit einem Radionuklid zu bilden.

9. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, das die Umsetzung einer Gruppe R oder eines reaktiven Derivates davon mit Gruppen M oder reaktiven Derivaten davon umfasst.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine Verbindung der Formel oder 11 gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff oder Verdünnungsmittel.

11. Eine Verbindung gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 zur Verwendung in der Herstellung eines Arzneitmittels zur Verwendung in der Diagnose oder chirurgischen oder therapeutischen Behandlung von Melanomen.