KR100999044B1 - 킬레이트제 접합 α-ＭＳＨ 펩타이드 유도체, 이의제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 흑색종 진단 및치료용 조성물 - Google Patents

킬레이트제 접합 α-ＭＳＨ 펩타이드 유도체, 이의제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 흑색종 진단 및치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 킬레이트제가 접합된 α-MSH 펩타이드 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 흑색종 진단 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 킬레이트제가 접합된 새로운 α-MSH 펩타이드 유도체는 흑색종에서 발현되는α-MSH 수용체인 멜라노코르틴-1 수용체에 대한 선택성이 높고, 방사성 동위원소의 표지율이 높으며, 신장에서 머무르는 시간이 짧고, 종양 섭취율이 높으므로 흑색종의 조기 진단 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
α-MSH 펩타이드 유도체, 흑색종, 진단, 방사성 동위원소, 킬레이트제

Description

킬레이트제 접합 α-ＭＳＨ 펩타이드 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 흑색종 진단 및 치료용 조성물{Chelating agent-αMSH peptide derivates, preparation method thereof and composition for diagnosis or treatment of melanoma tumor containing the same as an active ingredient}
본 발명은 킬레이트제가 접합된 α-MSH 펩타이드 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 흑색종 진단 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
피부에서 발생하는 피부암에는 여러 종류가 있지만, 악성 흑색종은 그 중에서도 아주 치사율이 높은 위험한 질병이다. 피부색과 관계되는 멜라닌색소를 생성하는 멜라닌세포와 모반세포의 악성 종양을 단순히 흑색종 또는 멜라노마(melanoma)라고 한다.
상기 흑생종은 국내에서도 인구 10만명 당, 1~1.5명 정도의 환자수로 나타나며 해마다 증가하는 추세이다. 최근의 전국 설문조사 집계에 따르면, 남성이 48.7%, 여성이 51.3%로 나타나 여성에게서 약간 더 많은 것으로 조사되고 있다. 20 세 까지는 발생률이 적지만, 40대 이상이 되면 급격하게 늘어나고 70세 이상에서도 흔히 나타난다. 또한, 피부색갈이 연한 사람일수록 강한 일광에 노출시, 상기 흑색종의 발현율이 증가하는 것으로 알려져 있다. 세포의 주기를 조절하는 유전자인 CDKN2A와 CDK4에 돌연변이가 생기면, 흑색종에 대한 유전적인 감수성이 10배나 증가한다는 보고도 나오고 있다.
이러한 흑생종은 초기에 발견하고 발병부위를 충분이 절제하면 치료효과를 볼 수 있으며, 전초 림프구절의 생검(sentinel lymph node biopsy)을 통한 시술과 전이를 막는 효과가 논의되고 있다. 이밖에 자기공명 분광기를 이용한 검사방법과 전이부위에 대한 수술도 시도되고 있으나, 이러한 수술후의 보조적인 치료방법은 아직까지 별 진전을 보지 못하는 상태이다. 백신 또는 세포 활성물질 등도 사용되고 있으나 생존에는 큰 도움을 주지 못한다.
이와 같이, 흑생종은 조기에 발견하면 완치가 가능하지만 치료하지 않으면 임파선을 따라 급속하게 전이되며, 전이된 흑생종에는 만족할 만한 치료방법이 없는 관계로 1차 흑생종의 조기발견 및 전이 부분을 효과적으로 발견하고 치료하는 것은 매우 중요하다[Paula D. Raposinho, JoD.G. Correia, Susana Alves, Maria F. Botelho, Ana C. Santos and Isabel Santos, A 99mTc(CO)3-labeled pyrazolylα-melanocyte-stimulating hormone analog conjugate for melanoma targeting , Nuclear Medicine and Biology , 2008 (35) 91-99].
특히, 흑생종의 전이가 일어난 경우에는 현재까지 알려진 치료방법으로는 환 자의 생존율을 늘리는 것에는 불충분하다고 알려져 있음에 따라 종양을 효과적으로 영상화 하며 방사성동위원소가 방출하는 에너지를 이용한 치료제 개발에 많은 관심이 모아지고 있다.
현재까지 방사성동위원소가 접합된 항체 및 항체 분체를 이용한 흑생종의 치료는 멜라노마 관련 항체(Melanoma-associated antigen)를 표적화할 수 있는 항체가 아직 발견되지 않을 뿐 아니라 시도되고 있는 항체의 경우도 종양 섭취도가 낮고 종양 내에서 방사성 동위원소의 느린 방출로 인해 어려운 실정이다. 그러나, α-MSH 수용체인 멜라노코르틴-1 수용체(Melanocortin-1 Receptor; MC1-R)가 쥐 멜라노마 세포 및 사람 멜라노사이트(human melanocytes)에 발현되어 있는 것으로 알려짐에 따라 방사성동위원소가 표지된 α-MSH 유도체를 이용한 영상진단 및 치료를 위한 다양한 연구가 시도되고 있다[Wei L, Butcher C, Miao Y, Gallazzi F, Quinn TP , Welch MJ , Lewis JS.Synthesis and biologic evaluation of 64 Cu - labeled rhenium - cyclized alpha -MSH peptide analog using a cross - bridged cyclam chelator . J Nucl Med . 2007: 48: 64-72].
α-MSH는 트리데카펩타이드(tridecapeptide)로서 구조-생리활성 관계(Structure-bioactivity relationship)를 평가한 결과 α-MSH 아미노산 서열중 His-Phe-Arg-Trp가 수용체를 인식하는데 있어서 충분한 역할을 하고 있음이 알려져 있다. 이중 Phe의 D-form-Phe로 변환된 경우 1500배 정도 수용체 결합이 증가한다 알려져 있다[Design , synthesis , and conformation of superpotent and prolonged acting melanotropins . Hruby VJ , Sharma SD , Toth K, Jaw JY , al - Obeidi F, Sawyer TK , Hadley ME . Ann N Y Acad Sci . 1993 (680) 51-63; Sawyer TK , Castrucci AM , Staples DJ , Affholter JA , De Vaux A, Hruby VJ , Hadley ME . Structure - activity relationships of [ Nle4 , D- Phe7 ] alpha - MSH . Discovery of a tripeptidyl agonist exhibiting sustained bioactivity . Ann N Y Acad Sci . 1993 (680) 597-9].
그러나, 상기 α-MSH 펩타이드를 이용하여 방사성동위원소를 표지한 다양한 연구들 가운데 동물모델을 이용한 실험에서 종양 섭취가 있음을 확인함에도 불구하고 그들이 높은 신장 머무름 및 낮은 종양 섭취율 등으로 인하여 실질적인 사용의 제약이 되고 있다.
이에 본 발명자들은 흑색종을 조기에 발견하고 치료하기 위하여 종양 섭취율이 높고, α-MSH 펩타이드의 수용체인 멜라노코르틴-1 수용체에 선택적으로 결합하고, 결합능력이 뛰어나며 신장에서 머무르는 시간이 짧고 방사성 동위원소의 방출이 빠른 α-MSH 펩타이드 유도체를 제조하기 위해 연구하던 중, 킬레이트제가 접합된 새로운 α-MSH 펩타이드 유도체를 합성하고, 상기 유도체가 α-MSH 수용체인 멜라노코르틴-1 수용체에 대한 선택성이 높고, 신장에서 머무르는 시간이 짧고, 종양 섭취율이 높은 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 방사성 동위원소의 흡착력이 뛰어나고, 흑색종에 대한 종양 섭취이 높은 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체를 이용한 흑색종 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체를 이용한 흑색종 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체의 제조방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체의 제조방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체를 이용한 흑색종 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체를 이용한 흑색종 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 킬레이트제가 접합된 새로운 α-MSH 펩타이드 유도체는 흑색종에서 발현되는α-MSH 수용체인 멜라노코르틴-1 수용체에 대한 선택성이 높고, 방사성 동위원소의 표지율이 높으며, 신장에서 머무르는 시간이 짧고, 종양 섭취율이 높으므로 흑색종의 조기 진단 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체를 제공한다.
본 발명에 따른 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체에 있어서, 상기 킬레이트제는 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 DOTA 킬레이트제는 금속 동위원 소와 표지 후 장시간 탈착현상이 없으며 안정성이 뛰어나다. 이는 DOTA 접합 α-MSH 펩타이드 유도체의 고온 표지(90 ℃)에서 안정성이 확인되었다.
이때 사용되는 DOTA는 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산(NOTA), 트리에틸렌테트라민(TETA) 또는 디퍼옥사민(DFO)으로 변환될 수 있으며, 본 발명에서는 DOTA 또는 DTPA가 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체에 있어서, 상기 α-MSH 펩타이드 유도체는 흑색종에 발현되는 멜라노코르틴-1 수용체에 대한 결합력을 높이기 위하여 하기와 같은 서열로 이루어지는 것이 바람직하다:
1) Gly-Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-CONH2;
2) Gly-Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-Lys-Pro-Val-CONH2;
3) Gly-Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-Arg-Pro-Val-CONH2;
4) Gly-Dap-Gln-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-CONH2;
5) Gly-Dap-Gln-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-Lys-Pro-Val-CONH2; 및
6) Gly-Dap-Gln-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-Arg-Pro-Val-CONH2 .
이때, Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp은 직쇄 또는 고리형으로 연결될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체는
α-MSH 펩타이드 유도체를 제조하는 단계(단계 1);
상기 단계 1에서 제조된 α-MSH 펩타이드 유도체에 킬레이트제를 접합시키는 단계(단계 2); 및
보호기를 제거하는 단계(단계 3)를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
이하, 상기 제조방법을 상세히 설명한다.
먼저, 단계 1은 α-MSH 펩타이드 유도체를 제조하는 단계이다.
상기 α-MSH 펩타이드 유도체의 제조방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 아미노산 짝지움 반응을 이용하여 제조할 수 있다.
이때, 아미노산 짝지움 반응은 NH2-MBHA 레진을 과량의 HOBt, HBTU, DIPEA 및 N α-Fmoc 아미노산이 포함되어 있는 DMF 용액과 반응시켜 이루어지며, 이에 한정되지는 않는다.
다음으로 단계 2는 상기 단계 1에서 제조된 α-MSH 펩타이드 유도체에 킬레이트제를 접합시키는 단계이다.
상기 킬레이트제 접합은 상기 단계 1에서 제조된 α-MSH 펩타이드 유도체에 DOTA-mono-NHS-tris(tBu ester), 3 당량의 DIPEA가 포함된 DMF 용액을 첨가하여 반응시킴으로써 이루어진다.
이때 사용되는 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA)은 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산(NOTA), 트리에틸렌테트라민(TETA) 또는 디퍼옥사민(DFO)으로 변환될 수 있으며, 본 발명에서는 DOTA 또는 DTPA가 사용되는 것이 바람직하다.
이후, Asp의 알릴기를 카르복실기로 산화시킨 후 Dap의 NH2기와 반응시키는 고리화 반응을 추가적으로 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 고리화반응은 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐이 1,3-디메틸바르비투르산 및 메틸클로라이 혼합용액에 용해된 용액을 첨가하고 교반시켜 Asp(O-Allyl)의 알릴기를 카르복실기로 전환시킨 후, DIC, HOAT 및 DMF을 첨가하여 수행할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
다음으로, 단계 3은 보호기를 제거하는 단계이다.
상기 단계에서는 단계 2에서 제조된 펩타이드 유도체에서 보호기 제거를 위해 TFA, TIS, EDT, 티오나이졸(Thioanisole) 및 물을 첨가한다. 이때 효과적인 보호기 제거를 위하여 TFA, TIS, EDT, 티오나이졸 및 물의 첨가 비율은 TFA : TIS : EDT : 티오나이졸 : 물 = 90~92 : 2.0~2.5 : 2.0~2.5 : 2.0~2.5 : 2.0~2.5인 것이 바람직하다.
이렇게 제조된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체는 흑색종에서 발현되는α-MSH 수용체인 멜라노코르틴-1 수용체에 대한 선택성이 높고(도 7), 방사성 동위원소의 표지율이 98% 이상으로 뛰어나며(도 2~5 참조), 신장에서 머무르는 시간이 짧고(도 6 참조), 종양 섭취율이 높으므로(도 7 참조) 흑색종의 조기 진단 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
나아가, 본 발명은 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체를 제공한다.
본 발명에 따른 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체에 있어서, 상기 방사성 동위원소는 생체내에 존재시 MRI, CT, 감마카메라 등으로 검출될 수 있는 성질을 갖는 금속 및 전이금속 이온 및 방사선을 방출하는 방사성 동위원소를 포함한다. 예를 들면, Sc-47, Cu-64, Cu-67, Ga-67, Ga-68, Y-86, Y-90, Tc-99m, In-111, Pm-149, Sm-153, Dy-165, Ho-166, Er-169, Lu-177, Re-186, Re-188 및 Bi-212로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 Lu-177 또는 Sm-153을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체의 제조방법을 제공한다.
상기 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체는 본 발명에 따라 제조된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체에 안정제를 넣고, 방사성 동위원소를 넣어 반응시켜 제조될 수 있다. 이때 상기 안정제로는 아스코르브산 및 디하이드록시벤조산을 사용할 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체를 이용한 흑색종 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체를 이용한 흑색종 치료용 조성물을 제공한다.
이렇게 제조된 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체는 흑색종에서 발현되는α-MSH 수용체인 멜라노코르틴-1 수용체에 대한 선택성이 높고(도 7), 방사성 동위원소의 표지율이 98% 이상으로 뛰어나며(도 2~5 참조), 신장에서 머무르는 시간이 짧고(도 6 참조), 종양 섭취율이 높으므로(도 7 참조) 의료영상장비를 이용한 흑색종 진단 및 방사성 동위원소가 방출하는 에너지를 이용한 흑색종의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> DOTA - Gly - Dap - Glu - His - dPhe - Arg - Trp - Asp - CONH 2 의 제조
(1) 펩타이드 합성
NH2-MBHA-레진을 DMF(N,N-Dimethylformamide)로 세척한 후 DMF에 녹인 1.0M HOBT 용액으로 세척하였다. 이후, 3당량의 HOBt, 3당량의 HBTU, 6당량의 DIPEA, 3당량의 N α-Fmoc 아미노산이 포함되어 있는 DMF 용액을 레진에 첨가한 후 2시간 동안 교반하여 아미노산을 짝지움시켰다. 합성의 확인은 카이져 테스트(kaiser test, E. Kaiser et al., Anal . Biochem . (1970) 34, 595)를 통해 음성반응으로 확인하였다. 양성반응이 나올 시 레진을 DMF로 세척하고 3당량의 HOBt, 3당량의 HBTU, 6당량의 DIPEA, 3당량의 N α-Fmoc 아미노산이 포함되어 있는 DMF 용액을 첨가하여 3시간 동안 교반하고 카이져 테스트가 음성이 나올때까지 짝지움 반응을 진행시켰다. 반응이 완결되면 상기 레진을 DMF로 세척하고 처음 레진에 포함된 아민기의 미반응 부위를 20% 무수아세트산이 포함된 DMF 용액과 20% DIPEA이 포함됨 DMF 용액을 각 각 1:1비율로 넣고 10분간 교반시켰다. N α-Fmoc을 제거하기 위해 20% 피페리딘이 포함된 DMF 용액을 첨가하여 10분간 교반시켰다. 그 후 레진을 DMF, DCM, DMF순으로 세척한 다음 N α-Fmoc 보호기가 포함된 Asp(O-tBu), Trp(N i -Boc), Arg(Ng-Pbf), D form-Phe, His(N im-Trt), Glu(Nδ-Trt), Dap(Boc), Gly의 순서로 N α-Fmoc 아미노산을 첨가하여 짝지움 반응을 수행하여 Gly-Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp- Asp-CONH2 펩타이드를 합성하였다.
(2) DOTA 킬레이트제와 접합
DOTA 킬레이터를 부착시키기 위해 3당량의 DOTA-mono-NHS-tris(tBu ester), 6당량의 DIPEA이 포함된 DMF 용액을 상기 (1)에서 합성된 펩타이드에 넣고 12시간 동안 교반하였다. 보호기의 제거와 레진에서의 분리를 위해 TFA : TIS : EDT : Thioanisole : Water = 90 : 2.5 : 2.5 : 2.5 :2.5를 첨가하여 2시간 동안 반응하여 목적하는 화합물을 분리하고, 이렇게 얻어진 혼합 용액은 냉장 보관된 디에틸 에테르 용매를 과량 처리함으로써 침전물을 생성시켰다. 얻어진 침전물을 원심분리시켜 완전히 침전시키고 과량의 TFA를 일차 제거하고 이상과 같은 절차를 2회 정도 반복하여 고형화시킨 펩타이드를 얻었다.
얻어진 펩타이드를 C-18 칼럼을 사용하고 50분에 걸쳐 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물 농도 구배 용매 시스템을 사용하는 HPLC로 정제하였다. 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말 형태로 목적하는 DOTA-Gly-Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-CONH2를 제조하였다(수율: 10 %).
< 실시예 2> DOTA - Gly - Dap - Glu - His - dPhe - Arg - Trp - Asp - Lys - Pro - Val - CONH 2 의 제조
N α-Fmoc 보호기가 포함된 Val, Pro, Lys(Nε-Boc), Asp(O-Allyl), Trp(N i - Boc), Arg(Ng-Pbf), Phe, His(N im-Trt), Glu(Nδ-Trt), Dap(Alloc), Gly의 순서로 아미노산의 짝지움 반응을 수행하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 목적하는 DOTA-Gly-Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-Lys-Pro-Val-CONH2를 제조하였다(수율: 10 %).
< 실시예 3> DOTA - Gly - Dap - Glu - His - dPhe - Arg - Trp - Asp - Arg - Pro - Val - CONH 2 의 제조
Lys 대신 Arg를 치환시킨 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하여 목적하는 DOTA-Gly-Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-Asp-Pro-Val-CONH2를 제조하였다(수율: 10 %).
< 실시예 4> DOTA - Gly - Dap - Gln - His - dPhe - Arg - Trp - Asp - CONH 2 의 제조
Glu 대신 Gln을 치환시킨 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 목적하는 DOTA-Gly-Dap-Gln-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-CONH2를 제조하였다(수율: 10 %).
< 실시예 5> DOTA - Gly - Dap - Gln - His - dPhe - Arg - Trp - Asp - Lys - Pro - Val - CONH 2 의 제조
Glu 대신 Gln을 치환시킨 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하여 목적하는 DOTA-Gly-Dap-Gln-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-Lys-Pro-Val-CONH2를 제조하였다(수율: 10 %).
< 실시예 6> DOTA - Gly - Dap - Gln - His - dPhe - Arg - Trp - Asp - Arg - Pro - Val - CONH 2 의 제조
Glu 대신 Gln을 치환시킨 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 수행하여 목적하는 DOTA-Gly-Dap-Gln-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-Arg-Pro-Val-CONH2를 제조하였다(수율: 10 %).
< 실시예 7> DOTA - Gly -c yclic ( Dap - Glu - His - dPhe - Arg - Trp - Asp )- CONH 2 의 제조
(1) 펩타이드 합성
NH2-MBHA-레진을 DMF(N,N-Dimethylformamide)로 세척한 후 DMF에 녹인 1.0M HOBT 용액으로 세척하였다. 이후, 3당량의 HOBt, 3당량의 HBTU, 6당량의 DIPEA, 3당량의 N α-Fmoc 아미노산이 포함되어 있는 DMF 용액을 상기 레진에 첨가한 후 2시간 동안 교반하여 아미노산을 짝지움시켰다. 합성의 확인은 카이져 테스트를 통해 음성반응으로 확인하였다. 양성반응이 나올 시 레진을 DMF로 세척하고 3당량의 HOBt, 3당량의 HBTU, 6당량의 DIPEA, 3당량의 N α-Fmoc 아미노산이 포함되어 있는 DMF 용액을 첨가하여 3시간 동안 교반하고 카이져 테스트가 음성이 나올때까지 짝지움 반응을 진행시켰다. 반응이 완결되면 레진을 DMF로 세척하고 처음 레진에 포함된 아민기의 미반응 부위를 20% 무수아세트산이 포함된 DMF 용액과 20% DIPEA이 포함된 DMF 용액을 각각 1:1 비율로 혼합한 혼합용액에 넣고 10분간 교반시켰다. 다음으로 N α-Fmoc을 제거하기 위해 20% 피페리딘이 포함된 DMF 용액을 첨가하여 10분간 교반시켰다. 그 후 레진을 DMF, DCM, DMF순으로 세척한 다음 N α-Fmoc 보호기가 포함된 Asp(O-Allyl), Trp(N i -Boc), Arg(Ng-Pbf), D form-Phe, His(N im-Trt), Glu(Nδ-Trt), Dap(Alloc), Gly의 순서로 N α-Fmoc 아미노산을 첨가하여 짝지움 반응을 수행하여 Gly-Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-CONH2 펩타이드를 합성하였다.
(2) DOTA 킬레이트제와 접합
DOTA 킬레이터를 부착시키기 위해 3당량의 DOTA-mono-NHS-tris(tBu ester), 6당량의 DIPEA이 포함된 DMF 용액을 상기 (1)에서 합성된 펩타이드 레진에 넣고 12시간 동안 교반하였다.
이후, 0.2당량의 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐, 10당량의 1,3-디메틸바르비투르산이 포함된 디틀로로메탄 혼합용액을 상기 레진에 첨가하고 4시간 동안 반응시킨 후, 상기 레진을 DMF, 20% 피페리딘을 포함하는 DMF, 메탄올, DMF순으로 세척하여 Dap와 Asp의 보호기인 Alloc과 Allyl를 제거하여 Dap 잔기의 NH2와 Asp 잔 기의 COOH가 자유로운 상태로 전환시켰다.
다음으로, 상기 펩타이드 레진에 8당량의 DIC, 8당량의 HOAT가 포함된 DMF용액을 첨가하여 Dap의 NH2기와 Asp의 COOH기가 결합하는 고리화 반응을 수행하였다.
이후, 보호기의 제거와 레진에서의 분리를 위해 TFA : TIS : EDT : 티오아니졸(Thioanisole) : 물 = 90 : 2.5 : 2.5 : 2.5 :2.5를 첨가하여 2시간 동안 반응하여 목적하는 화합물을 분리하고, 이렇게 얻어진 혼합 용액에 냉장 보관된 디에틸에테르 용매를 과량 처리함으로써 침전물을 생성시켰다. 얻어진 침전물을 원심분리 시켜 완전히 침전시키고 과량의 TFA를 일차 제거하였다. 이상과 같은 절차를 2회 정도 반복하여 고형화시킨 펩타이드를 얻었다.
얻어진 펩타이드를 C-18 칼럼을 사용하고 50분에 걸쳐 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물 농도 구배 용매 시스템을 사용하는 HPLC로 정제하였다. 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말 형태로 목적하는 DOTA-Gly-cyclic(Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp)-CONH2를 제조하였다(수율: 10 %).
< 실시예 8> DOTA - Gly -c yclic ( Dap - Glu - His - dPhe - Arg - Trp - Asp )- Lys - Pro - Val -CONH 2 의 제조
N α-Fmoc 보호기가 포함된 Val, Pro, Lys(Nε-Boc), Asp(O-Allyl), Trp(N i -Boc), Arg(Ng-Pbf), Phe, His(N im-Trt), Glu(Nδ-Trt), Dap(Alloc), Gly의 순서로 아 미노산의 짝지움 반응을 수행하는 것을 제외하고는 실시예 7과 동일한 방법으로 수행하여 목적하는 DOTA-Gly-cyclic(Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp)-Lys-Pro-Val-CONH2를 제조하였다(수율: 10 %).
< 실시예 9> DOTA - Gly - cyclic ( Dap - Glu - His - dPhe - Arg - Trp - Asp )- Arg - Pro - Val -CONH 2 의 제조
Lys 대신 Arg를 치환시킨 것을 제외하고는 실시예 8과 동일한 방법으로 수행하여 목적하는 DOTA-Gly-Cyclic(Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp)-Arg-Pro-Val-CONH2를 제조하였다(수율: 10 %).
< 실시예 10> DOTA - Gly - cyclic ( Dap - Gln - His - dPhe - Arg - Trp - Asp )- CONH 2 의 제조
Glu 대신 Gln을 치환시킨 것을 제외하고는 실시예 7과 동일한 방법으로 수행하여 목적하는 DOTA-Gly-cyclic(Dap-Gln-His-dPhe-Arg-Trp-Asp)-CONH2를 제조하였다(수율: 10 %).
< 실시예 11> DOTA - Gly - cyclic ( Dap - Gln - His - dPhe - Arg - Trp - Asp )- Lys - Pro - Val -CONH 2 의 제조
Glu 대신 Gln을 치환시킨 것을 제외하고는 실시예 8과 동일한 방법으로 수행 하여 목적하는 DOTA-Gly-cyclic(Dap-Gln-His-dPhe-Arg-Trp-Asp)-Lys-Pro-Val-CONH2를 제조하였다(수율: 10 %).
< 실시예 12> DOTA - Gly - cyclic ( Dap - Gln - His - dPhe - Arg - Trp - Asp )- Arg - Pro - Val -CONH 2 의 제조
Glu 대신 Gln을 치환시킨 것을 제외하고는 실시예 9와 동일한 방법으로 수행하여 목적하는 DOTA-Gly-cyclic(Dap-Gln-His-dPhe-Arg-Trp-Asp)-Arg-Pro-Val-CONH2를 제조하였다(수율: 10 %).
< 실시예 13> 177 Lu 표지된 DOTA - Gly - cyclic ( Dap - Glu - His - dPhe - Arg - Trp - Asp )-Lys-Pro-Val-CONH 2 의 제조
실시예 11에서 제조된 DOTA-Gly-cyclic(Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp)-Lys-Pro-Val-CONH2 1 g을 1M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.0)에 넣은 후, 100 ㎍을 취하여 바이엘에 넣고, 안정제로서 50 mg 의 아스코르브산 및 6 mg의 디하이드록시벤조산을 넣고 177LuCl3 1mCi를 넣은 후, 90 ℃에서 30분 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 얼음수조에서 냉각시켰다.
반응 정도를 TLC 플레이트로 확인하였다. 이때, TLC 플레이트는 ITLC-SG를 사용하였고, 이동상으로는 식염수를 사용하여 전개시킨 후 사이클론으로 분석하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 177LuCl3의 Rf 값은 용매 앞쪽(0.9~1.0)에 위치하며, 표지된 펩타이드는 0~0.1 사이에 위치함을 알 수 있다.
또한, 표지된 방사성리간드에 대하여 HPLC를 이용하여 분석하였다.
컬럼은 C-18 역상 X-Terra(5 ㎛, 4×250 mm) 컬럼을 이용하였으며, 용매의 조건은 농도구배 시스템으로 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유하는 물(A)과 아세토니트릴(B)을 이용하여 1 ml/min의 유속으로 분석하였다((A) 용매 흐름조건: 100~90% 2분; 90~60% 10분; 60~30% 2분; 30% 3분; 및 30~100% 3분)
분석 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 177Lu 표지된 DOTA-Gly-cyclic(Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp)-Lys-Pro-Val-CONH2는 표지 수율이 99% 이상의 높은 수율로 제조됨을 알 수 있다.
< 실시예 14> 153 Sm 표지된 DOTA - Gly - cyclic ( Dap - Glu - His - dPhe - Arg - Trp - Asp )-Lys-Pro-Val-CONH 2 의 제조
방사성 동위원소 포함 용액으로서 177LuCl3 대신 153Sm 1mCi을 넣는 것을 제외하고는 실시예 13의 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.
표지 수율 확인은 실시예 13의 HPLC를 이용한 방법과 동일한 방법으로 분석하였다((A) 용매 흐름조건: 90~50% 10분; 50~30% 2분; 30% 1분; 및 30~90% 1분).
분석 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 153Sm 표지된 DOTA-Gly-cyclic(Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp)-Lys-Pro-Val-CONH2 의 표지 효율은 100%의 높은 수율로 제조됨을 알 수 있다.
< 실시예 15> 153 Sm 표지된 DOTA - Gly - cyclic ( Dap - Glu - His - dPhe - Arg - Trp - Asp )-Arg-Pro-Val-CONH 2 의 제조
DOTA-Gly-cyclic(Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp)-Lys-Pro-Val-CONH2 대신 실시예 9에서 제조된 DOTA-Gly-cyclic(Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp)-Arg-Pro-Val-CONH2를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 14와 동일한 방법으로 수행하고, 분석 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 153Sm 표지된 DOTA-Gly-cyclic(Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp)-Arg-Pro-Val-CONH2의 표지 효율은 100%의 높 은 수율로 제조됨을 알 수 있다.
< 실시예 16> 153 Sm 표지된 DOTA - Gly - cyclic ( Dap - Glu - His - dPhe - Arg - Trp - Asp )-CONH 2 의 제조
DOTA-Gly-cyclic(Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp)-Lys-Pro-Val-CONH2 대신 실시예 7에서 제조된 DOTA-Gly-cyclic(Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp)-CONH2를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 14와 동일한 방법으로 수행하고, 분석 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 153Sm 표지된 DOTA-Gly-cyclic(Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp)-CONH2의 표지 효율은 98%의 높은 수율로 제조됨을 알 수 있다.
< 실험예 > 체내거동 평가
본 발명에 따른 펩타이드 화합물의 흑색종 종양에 대한 표적 선택성을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
(1) 정상 동물을 이용한 체내거동평가
실시예 13에서 제조된 177Lu-DOTA-Gly-Cyclic(Dap-Gln-His-dPhe-Arg-Trp-Asp)-Lys-Pro-Val-CONH2를 대상으로 정상 동물을 이용한 체내거동평가를 수행하였다.
실험을 위하여 정상 Balb/C 마우스 9 마리를 1주일 정도 순응시킨 후 꼬리정맥을 통하여 20 μCi의 제조된 방사성 리간드를 주입하고 2, 4, 및 24 시간 후에 희생시켜 장기를 적출하였다. 적출된 장기의 방사능량은 감마카운터(1470 WIZARD Automatic Gamma Conter, PerkinElmer)를 이용하여 측정하여 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 2시간 후, 신장에서 방사능량이 가장 많이 검출되었으나, 4시간 후에는 검출된 방사능량이 감소되었고, 24시간 후에는 방사능량이 검출되지 않았다. 그 외의 장기들에서는 방사능량이 거의 검출되지 않았다. 이로부터 본 발명에 따른 펩타이드 화합물은 비뇨기 시스템을 통하여 배출됨을 확인할 수 있으며, 24시간 경과 후에는 체내에 남아 있는 방사능량이 검출되지 않는 것으로 보아 주입된 방사성 표지 화합물의 대부분이 배출됨을 확인할 수 있다.
(2) 종양 동물을 이용한 체내거동평가
종양 동물을 제작하기 위하여 18~23 g의 암컷 C57BL 마우스 12 마리의 목덜미 부분에 종양세포의 일종인 B16/F1 무린 멜라노마 세포(106 cells/mL)를 주입하였다. 이후, 2주 경과 후, 종양의 크기가 0.5~1 g 정도가 되었을 때 상기 실시예 13 에서 제조된 177Lu-DOTA-Gly-Cyclic(Dap-Gln-His-dPhe-Arg-Trp-Asp)-Lys-Pro-Val-CONH2 5 μCi(식염수 100 ㎕에 상기 방사성리간드 1.6 ㎍)를 주입하고, 2, 4, 및 24 시간 후에 희생시켜 장기를 적출하였다. 흑색종 종양에 대한 표적 선택성을 알아보기 위하여 대조군으로는 실험 후 2시간째에 해당되는 마우스를 대상으로 방사성 동위원소가 표지되지 않은 펩타이드 2 ㎍을 주입한 후, 방사성 표지 펩타이드를 주입하였다.
적출된 장기의 방사능량은 감마카운터(1470 WIZARD Automatic Gamma Conter, PerkinElmer)를 이용하여 측정하여 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드를 주입한 후 2시간째부터 종양에 섭취됨을 확인할 수 있고, 동일 조건에서 대조군은 실험군에 비하여 종양에 섭취가 낮음을 확인할 수 있다. 이로부터 본 발명에 따른 펩타이드 화합물은 수용체 선택성을 가짐을 알 수 있다. 또한 본 발명에 따른 펩타이드를 주입한 후 24시간 이후에는 종양 섭취가 더욱 증가한 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 펩타이드는 멜라노마 종양 표적 영상진단제 및 방사성 동위원소 이용 표적 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체의 TLC 사진이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체의 HPLC 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체의 HPLC 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체의 HPLC 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체의 HPLC 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체 투여시 정상 동물의 장기의 방사능량을 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체 투여시 종양 동물의 장기의 방사능량을 나타내는 그래프이다.

Claims (13)

  1. 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체에 있어서, α-MSH 펩타이드는 하기 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체:
    1) Gly-Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-CONH2;
    2) Gly-Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-Lys-Pro-Val-CONH2;
    3) Gly-Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-Arg-Pro-Val-CONH2;
    4) Gly-Dap-Gln-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-CONH2;
    5) Gly-Dap-Gln-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-Lys-Pro-Val-CONH2; 및
    6) Gly-Dap-Gln-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-Arg-Pro-Val-CONH2.
  2. 제1항에 있어서, 상기 킬레이트제는 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA) 또는 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)인 것을 특징으로 하는 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 -Dap-Gln-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-는 직쇄 또는 고리형으로 연결되는 것을 특징으로 하는 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체.
  5. 아미노산 짝지움 반응을 이용하여 하기 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 α-MSH 펩타이드 유도체를 제조하는 단계(단계 1):
    1) Gly-Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-CONH2;
    2) Gly-Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-Lys-Pro-Val-CONH2;
    3) Gly-Dap-Glu-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-Arg-Pro-Val-CONH2;
    4) Gly-Dap-Gln-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-CONH2;
    5) Gly-Dap-Gln-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-Lys-Pro-Val-CONH2; 및
    6) Gly-Dap-Gln-His-dPhe-Arg-Trp-Asp-Arg-Pro-Val-CONH2;
    상기 단계 1에서 제조된 α-MSH 펩타이드 유도체에 킬레이트제를 접합시키는 단계(단계 2); 및
    보호기를 제거하는 단계(단계 3)를 포함하는 제1항의 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단계 1의 아미노산 짝지움 반응은 NH2-MBHA 레진을 과량의 HOBt, 과량의 HBTU, 과량의 DIPEA, 과량의 N α-Fmoc 아미노산이 포함되어 있는 DMF 용액과 반응시켜 이루어지는 것을 특징으로 하는 α-MSH 펩타이드 유도체의 제조방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 킬레이트제 접합은 상기 단계 1에서 제조된 α-MSH 펩타이드 유도체에 DOTA-mono-NHS-tris(tBu ester), 과량의 DIPEA가 포함된 DMF 용액을 첨가하여 반응시킴으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 α-MSH 펩타이드 유도체의 제조방법.
  8. 제1항의 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체에 방사성 동위원소가 표지된, 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 방사성 동위원소는 Sc-47, Cu-64, Cu-67, Ga-67, Ga-68, Y-86, Y-90, Tc-99m, In-111, Pm-149, Sm-153, Dy-165, Ho-166, Er-169, Lu-177, Re-186, Re-188 및 Bi-212로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체.
  10. 제1항의 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체에 안정제를 넣고, 방사성 동위원소를 넣어 반응시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 제8항의 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 안정제는 아스코르브산 및 디하이드록시벤조산인 것을 특징으로 하는 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체의 제조방법.
  12. 제8항의 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체를 유효성분으로 함유하는 흑색종 진단용 조성물.
  13. 제8항의 방사성 동위원소가 표지된 킬레이트제 접합 α-MSH 펩타이드 유도체를 유효성분으로 함유하는 흑색종 치료용 조성물.
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