DE102008009039B4

DE102008009039B4 - Neue Verbindungen aus Antrodia camphorata

Info

Publication number: DE102008009039B4
Application number: DE102008009039A
Authority: DE
Inventors: Sheng-Yun Danshuei Liu; Mao-Tien Danshuei Kuo; Wu-Che Danshuei Wen
Original assignee: Golden Biotechnology Corp
Current assignee: Golden Biotechnology Corp
Priority date: 2007-10-19
Filing date: 2008-02-14
Publication date: 2009-11-12
Anticipated expiration: 2028-02-15
Also published as: FR2922549A1; KR100897988B1; DE102008009039A1; US7385088B1; TWI335314B; KR20090040194A; GB2453808A; US20080119565A1; GB2453808A8; GB0801621D0; GB2453808B; FR2922549B1; JP2009102286A; TW200918498A; JP5014959B2

Abstract

Verbindung mit der folgenden Formel, worin x Hydroxyl (-OH) oder Methoxy (-OCH₃) ist.

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen und deren Verwendung, insbesondere Antrochinonol B- und Antrochinonol C-Verbindungen, die aus Antrodia camphorata-Extrakten isoliert worden sind, und deren Verwendung zur Wachstumsinhibierung von Tumorzellen. Es werden erstmals Verbindungen aus Antrodia camphorata beschrieben, die nicht nur zur Inhibierung des Wachstums von Brustkrebs, Lungenkrebs, Leberkrebs und Prostatakrebs verwendet werden können, sondern auch in medizinischen Antikrebs-Zusammensetzungen für die vorstehend genannten Krebszellen.
2. Stand der Technik
Antrodia camphorata wird auch als Chang-Zhi, Niu Chang-zhi, roter Kampferpilz und dergleichen bezeichnet und ist ein mehrjähriger Pilz, der zur Ordnung Aphyllophorales, Familie Polyporaceae, gehört. Es handelt sich um eine in Taiwan endemische Art, die auf der inneren, morschen Kernholzwand von Cinnamomum kanehirae Hay wächst. Cinnamomum kanehirae Hay kommt selten vor und wird illegal übermäßig abgeerntet, wodurch Antrodia camphorata, der wild innerhalb des Baums wächst, sogar selten geworden ist. Da die Wachstumsgeschwindigkeit von natürlichem Antrodia camphorata, der nur von Juni bis Oktober wächst, extrem gering ist, ist der Preis von Antrodia camphorata sehr hoch.
Die Fruchtkörper von Antrodia camphorata sind mehrjährig, ungestielt, hart und holzig und geben einen starken Geruch von Sassafras (Kampferaroma) ab. Das Aussehen ist verschiedenartig und weist plattenartige, glockenartige, hufartige oder turmartige Formen auf. Sie weisen eine rötliche Farbe auf und sind flach, wenn sie jung sind, und haften an der Oberfläche von Holz. Dann werden die Ränder des vorderen Endes geringfügig gewellt und neigen sich und erstrecken sich in die Umgebung. Die Farbe wandelt sich in ein blasses rot-braun oder ein cremefarbenes gelb-braun um, wobei überall Ostiolen vorliegen. Dieser Bereich ist von sehr hohem medizinischen Wert.
In der traditionellen taiwanesischen Medizin wird Antrodia camphorata gebräuchlich als Gegengift, Leberschutzmittel und Antikrebsmittel verwendet. Antrodia camphorata ist wie allgemein essbare und medizinische Pilze reich an zahlreichen Nährstoffen, einschließlich Triterpenoiden, Polysacchariden (wie z. B. β-Glukosan), Adenosin, Vitaminen (wie z. B. Vitamin B, Nikotinsäure), Proteinen (Immunglobulinen), Superoxiddismutase (SOD), Spurenelementen (wie z. B. Calcium, Phosphor und Germanium, usw.), Nukleinsäuren, Steroiden und Blutdruckstabilisatoren (wie z. B. Antodia-Säure) und dergleichen. Es wird davon ausgegangen, dass diese physiologisch aktiven Bestandteile z. B. die folgenden Effekte aufweisen: Antitumoraktivitäten, eine Erhöhung von immunmodulierenden Aktivitäten, antiallergische Effekte, antibakterielle Effekte, eine Blutdrucksenkung, eine Blutzuckersenkung, eine Cholesterinsenkung und dergleichen.
Bei den Triterpenoiden handelt es sich um die am intensivsten untersuchte Komponente von den zahlreichen Zusammensetzungen von Antrodia camphorata. Triterpenoide ist der Sammelbegriff für natürliche Verbindungen, die 30 Kohlenstoffatome mit pentacyclischen oder hexacyclischen Strukturen enthalten. Der bittere Geschmack von Antrodia camphorata ist auf die Triterpenoidkomponente zurückzuführen. Drei neue Triterpenoide des Ergostan-Typs (Antcin A, Antcin B, Antcin C) wurden von Cherng et al. aus den Fruchtkörpern von Antrodia camphorata isoliert (I. H. Cherng und H. C. Chiang, 1995, Three new triterpenoids from Antrodia cinnamomea, J. Nat. Prod., 58, 365–371). Drei neue Verbindungen, die als „Zhankuic”-Säure A, „Zhankuic”-Säure B und „Zhankuic”-Säure bezeichnet werden, wurden von Chen et al. aus den Fruchtkörpern von Antrodia camphorata mit Ethanol extrahiert (C. H. Chen und S. W. Yang, 1995, New steroid acids from Antrodia cinnamomea – a fungus parasitic an Cinnamomum micranthum, J. Nat. Prod. 58, 1655–1661). Darüber hinaus haben Cherng et al. auch drei andere neue Triterpenoide aus den Fruchtkörpern von Antrodia camphorata gefunden, bei denen es sich um von Sesquiterpenlacton und 2-Biphenyl abgeleitete Verbindungen handelt, 4,7-Dimethoxy-5-methyl-1,3-benzodioxol und 2,2',5,5'-Tetramethoxy-3,4,3',4'-bi-methylendioxy-6,6'-dimethylbiphenyl (H. C. Chiang, D. P. Wu, I. W. Cherng und C. H. Ueng, 1995, A sesquiterpene lactone, phenyl and biphenyl compounds from Antrodia cinnamomea, Phytochemistry, 39, 613–616). 1996 wurden vier neue Triterpenoide des Ergostan-Typs (Antcine E und F und Methylantcinate G und H) von Cherng et al. mit den gleichen analytischen Verfahren isoliert (I. H. Cherng, D. P. Wu und H. C. Chiang, 1996, Triterpenoids from Antrodia cinnamomea, Phytochemistry 41, 263–267). Zwei mit Ergostan verwandte Steroide, „Zhankuic”-Säuren D und E wurden zusammen mit drei mit Lanostan verwandten Triterpenen, 15-alpha-Acetyldehydrosulfurensäure, Dehydroeburicosäure, Dehydrosulfurensäure, von Yang et al. isoliert (S. W. Yang, Y. C. Shen und C. H. Chen, 1996, Steroids and triterpenoids of Antrodia cinnamomea – a fungus parasitic an Cinnamomum micranthum, Phytochemistry 41, 1389–1392).
Obwohl aufgrund von vorangegangenen Experimenten (wie z. B. die vorstehend genannte Veröffentlichung von Chen und Yang, 1995) berichtet worden ist, dass Antrodia camphorata-Extrakte Antitumoreffekte aufweisen, sind weitere Experimente erforderlich, um die wirksame Zusammensetzung für die Tumorinhibierung zu identifizieren. Die Anwendung in der Krebstherapie wird sehr nützliche Effekte haben, wenn die tatsächlich wirksamen Zusammensetzungen gefunden werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Um die Verbindungen, die Antitumoreffekte aufweisen, in den Extrakten von Antrodia camphorata zu identifizieren, wurde die Verbindung der Formel (1) in der vorliegenden Erfindung isoliert und gereinigt, worin x Hydroxyl (-OH) oder Methoxy (-OCH₃) sein kann.
Wenn x Hydroxyl ist, ist die Struktur derart, wie es in der Formel (2) gezeigt ist. Die chemische Bezeichnung ist Antrochinonol B, das die Molekülformel C₂₄H₃₈O₅ und ein Molekulargewicht von 406 aufweist.
Wenn x Methoxy ist, ist die Struktur derart, wie es in der Formel (3) gezeigt ist. Die chemische Bezeichnung ist Antrochinonol C, das die Molekülformel C₂₅H₄₀O₅ und ein Molekulargewicht von 420 aufweist.
Die Verbindungen Antrochinonol B- und Antrochinonol C werden durch eine wässrige Extraktion oder eine organische Lösungsmittel-Extraktion von Antrodia camphorata isoliert. Die verwendeten organischen Lösungsmittel umfassen unter anderem Alkohole, wie z. B. Methanol, Ethanol oder Propanol, Ester, wie z. B. Ethylacetat, Alkane, wie z. B. Hexan, oder halogenierte Alkane, wie z. B. Chlormethan, Chlorethan. Von diesen Lösungsmitteln ist ein Alkohol bevorzugt und Ethanol ist besonders bevorzugt.
Die vorstehend genannten Verbindungen der vorliegenden Erfindung können zur Inhibierung des Tumorzellenwachstums eingesetzt werden und können ferner als medizinische Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs und zur Verstärkung der therapeutischen Effekte eingesetzt werden. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können zum Inhibieren einer Reihe von Krebszellen, einschließlich Brustkrebs, Lungenkrebs, Leberkrebs und Prostatakrebs, was zu einer beträchtlichen Verlangsamung des Wachstums von Krebszellen führt, und ferner zur Inhibierung der Proliferation von Krebszellen und zur Verminderung des Risikos einer Malignität eingesetzt werden. Daher können sie zur Behandlung von Brustkrebs, Lungenkrebs, Leberkrebs, Prostatakrebs, usw., eingesetzt werden.
Andererseits können die Verbindungen der Formel (2) und/oder der Formel (3) der vorliegenden Erfindung in medizinische Zusammensetzungen zur Behandlung von Brustkrebs, Lungenkrebs, Leberkrebs und Prostatakrebs einbezogen werden, um das Wachstum von Tumorzellen zu inhibieren. Die medizinischen Zusammensetzungen umfassen nicht nur die wirksamen Mengen von Antrochinonol B und Antrochinonol C, sondern auch pharmazeutisch verträgliche Träger. Die Träger umfassen unter anderem Vehikel, wie z. B. Wasser, Füllstoffe, wie z. B. Saccharose oder Stärke, Bindemittel, wie z. B. Cellulosederivate, Verdünnungsmittel, Sprengmittel, Absorptionsverstärker oder Süßungsmittel. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können durch Mischen der Verbindungen Antrochinonol B und Antrochinonol C mit mindestens einem der Träger mittels herkömmlicher Verfahren, die in dem technischen Gebiet der Pharmazie bekannt sind, hergestellt und unter anderem als Pulver, Tablette, Kapsel, Pellets, Körner oder als andere, flüssige Formulierung formuliert werden.
Die vorliegende Erfindung wird in der folgenden veranschaulichten Ausführungsform und in Beispielen weiter erläutert. Diese nachstehenden Beispiele sollten jedoch nicht so aufgefasst werden, dass sie den Schutzbereich der Erfindung beschränken, und Modifizierungen sind für den Fachmann offensichtlich, wobei die Modifizierungen vom Wesen der Erfindung und vom Schutzbereich der beigefügten Ansprüche umfasst sind.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Die Myzelien, Fruchtkörper oder ein Gemisch von beiden von Antrodia camphorata werden zuerst mit Wasser oder organischen Lösungsmitteln extrahiert, um den wässrigen Extrakt oder den organischen Lösungsmittel-Extrakt von Antrodia camphorata unter Verwendung bekannter Verfahren zu erhalten. Die organischen Lösungsmittel umfassen unter anderem Alkohole, wie z. B. Methanol, Ethanol oder Propanol, Ester, wie z. B. Ethylacetat, Alkane, wie z. B. Hexan, oder halogenierte Alkane, wie z. B. Chlormethan und Chlorethan. Von diesen Lösungsmitteln ist ein Alkohol bevorzugt und Ethanol ist besonders bevorzugt.
Die wässrigen oder organischen Lösungsmittel-Extrakte von Antrodia camphorata wurden zur Isolierung und Reinigung einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unterzogen. Jede Fraktion wurde gewonnen und in einem Antitumortest eingesetzt. Die wirksamen Fraktionen mit einer Antitumorwirksamkeit wurden bezüglich der Zusammensetzung analysiert und ferner gegen verschiedene Krebszellen getestet. Der vorstehend beschriebene Ansatz führte dann zur Identifizierung der Verbindungen Antrochinonol B und Antrochinonol C zur Inhibierung des Wachstums von Brustkrebs, Lungenkrebs, Leberkrebs, Prostatakrebs, usw. Diese Verbindungen aus Antrodia camphorata werden als neue Verbindungen erachtet, da sie in keiner Literatur bzw. Veröffentlichung beschrieben worden sind.
Die Antikrebseffekte von Antrochinonol B und Antrochinonol C wurden durch den 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid(MTT)-Test gemäß dem Antitumor-Arzneistoffscreeningmodell des National Cancer Institute (NCI) bezüglich Zellüberlebensraten unter Verwendung von Zelllinien von Brustkrebs, Lungenkrebs, Leberkrebs und Prostatakrebs getestet. Die vorstehend genannten Tests haben gezeigt, dass Antrochinonol B und Antrochinonol C die Überlebensraten von Brustkrebszelllinien (MCF-7 und MDA-MB-231), Lungekrebszelllinien (A-549), hepatozellulären Karzinom-Zelllinien (Hep 3B und Hep G2) und Prostatakrebs-Zelllinien (LNCaP und DU-145) senkten und gleichzeitig relativ niedrige halbmaximale Inhibierungskonzentrationswerte (IC₅₀-Werte) zeigten. Daher können Antrochinonol B und Antrochinonol C zur Inhibierung eines Krebszellenwachstums von Brustkrebs, Lungenkrebs, Leberkrebs und Prostatakrebs verwendet werden und daher ferner für eine Krebsbehandlung von Brustkrebs, Lungenkrebs, Leberkrebs, Prostatakrebs und dergleichen verwendet werden. Die Details der Beispiele sind nachstehend beschrieben.
Beispiel 1
Isolierung von Antrochinonol B und Antrochinonol C
100 g Myzelien, Fruchtkörper oder ein Gemisch von beiden von Antrodia camphorata wurden in einen Kolben eingebracht. Eine geeignete Menge Wasser und Alkohol (70 bis 100%ige Alkohollösung) wurde dem Kolben zugesetzt und es wurde mindestens 1 Stunde bei 20 bis 25°C gerührt. Die Lösung wurde durch einen Filter und eine 0,45 μm-Membran filtriert und das Filtrat wurde als Extrakt gesammelt.
Das Filtrat von Antrodia camphorata wurde einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie(HPLC)-Analyse unterzogen. Die Trennung wurde auf einer RP18-Säule durchgeführt, wobei die mobile Phase aus Methanol (A) und 0,1 bis 0,5% Essigsäure (B) bestand, wobei die Gradientenbedingungen 0 bis 10 min in 95% bis 20% B, 10 bis 20 min in 20% bis 10% B, 20 bis 35 min in 10% bis 90% B, 35 bis 40 min in 10% bis 95% B bei einer Flussrate von 1 ml/min betrugen. Der Säulenausfluss wurde mit einem UV-VIS-Detektor verfolgt.
Die bei 21,2 bis 21,4 min gesammelten Fraktionen wurden gesammelt und konzentriert, wobei Antrochinonol B erhalten wurde, ein Produkt, das als blassgelbes Pulver vorlag. Die Analyse dieses Produkts zeigte die Molekülformel C₂₄H₃₈O₅ und ein Molekulargewicht von 406. Die Untersuchung der NMR-Spektren zeigte, dass ¹H-NMR (CDCl₃) δ (ppm) = 1,21, 1,36, 1,67, 1,71, 1,75, 1,94, 2,03, 2,07, 2,22, 2,25, 3,68, 4,05, 5,71 und 5,56, ¹³C-NMR (CDCl₃) δ (ppm) = 12,31, 16,1, 16,12, 17,67, 25,67, 26,44, 26,74, 27,00, 39,71, 39,81, 40,27, 43,34, 59,22, 60,59, 71,8, 120,97, 123,84, 124,30, 131,32, 134,61, 135,92, 138,05, 160,45 und 197,11.
Die bei 23,7 bis 24 min gesammelten Fraktionen wurden gesammelt und konzentriert, wobei Antrochinonol C erhalten wurde, ein Produkt, das als blassgelbes Pulver vorlag. Die Analyse dieses Produkts zeigte die Molekülformel C₂₅H₄₀O₅ und ein Molekulargewicht von 420. Die Untersuchung der NMR-Spektren zeigte, dass ¹H-NMR (CDCl₃) δ (ppm) = 1,21, 1,36, 1,67, 1,71, 1,75, 1,94, 2,03, 2,07, 2,22, 2,25, 3,24, 3,68, 4,05, 5,12, 5,50 und 5,61, ¹³C-NMR (CDCl₃) δ (ppm) = 12,31, 16,1, 16,12, 17,67, 24,44, 26,44, 26,74, 27,00, 37,81, 39,81, 40,27, 43,34, 49,00, 59,22, 60,59, 120,97, 123,84, 124,30, 135,92, 138,05, 160,45 und 197,12.
Die Strukturen von Antrochinonol B und Antrochinonol C wurden in einer Datenbank chemischer Verbindungen verglichen. Es wurde keine Verbindung mit einer entsprechenden Struktur gefunden. Daher werden diese Verbindungen als neue Verbindungen erachtet, da sie bisher nicht beschrieben worden sind.
Beispiel 2
Ex vivo-Überlebenstest bezüglich Antibrustkrebseffekte
Das NCI-Antikrebs-Arzneistoffscreeningmodell wurde zum Testen des Antikrebseffekts der isolierten Verbindungen von Beispiel 1 in der vorliegenden Erfindung verwendet. Die isolierten Antrochinonol B und Antrochinonol C von Beispiel 1 wurden den Kulturmedien von menschlichen Brustkrebszellen, MCF-7 oder MDA-MB-231 zugesetzt, um das Tumorzellen-Überleben zu testen. Dieser Überlebenstest wurde mit dem bekannten MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)-Test durchgeführt. Die MCF-7-Zelllinie stammte von primären Brustkrebszellen (frühes Stadium), die bezüglich Östrogen empfindlich und daher Östrogenabhängig sind, während MDA-MB-231 bezüglich Östrogen unempfindlich und daher Östrogen-unabhängig ist, wobei es sich um einen schwierigen Tumor mit einer niedrigen Überlebensrate handelt.
Der MTT-Test wird üblicherweise zur Bestimmung der Zellproliferation, des Prozentsatzes lebensfähiger Zellen und der Cytotoxizität verwendet. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) ist ein gelber Farbstoff, der von den lebenden Zellen absorbiert und durch Succinattetrazoliumreduktase in den Mitochondrien zu violett-blauen Formazankristallen reduziert werden kann. Die Formazanbildung kann daher verwendet werden, um die Überlebensrate von Zellen zu bewerten und zu bestimmen.
Die menschlichen Brustkrebszellen MCF-7 (vom Bioresources Collection and Research Center (BCRC) mit der Zugangsnummer BCRC60436 erworben) und MDA-MB-231 (von National Health Research Institutes (NHRI) mit der Zugangsnummer CCRC 60425 erworben) wurden in Medien, die fetales Kälberserum enthielten, 24 Stunden kultiviert. Die proliferierten Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen, dann mit 1 × Trypsin-EDTA behandelt und 5 min bei 1200 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde durch vorsichtiges Schütteln in 10 ml frischem Kulturmedium resuspendiert. Die Zellen wurden in einer 96 Well-Platte angeordnet. Ethanolgesamtextrakte von Antrodia camphorata ohne Reinigung (die Kontrollgruppe), Antrochinonol B oder Antrochinonol C (die Experimentgruppe) wurden jedem der 96 Wells bei den folgenden Konzentrationen zugesetzt: 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1 bzw. 0,03 μg/ml. Die Zellen wurden 48 Stunden bei 37°C in einem 5% CO₂-Inkubator inkubiert. MTT wurde in einer Konzentration von 2,5 mg/ml jedem Well im Dunklen zugesetzt und 4 Stunden inkubiert, worauf 100 μl Lysepuffer zugesetzt wurden, um die Reaktion zu stoppen. Die Platten wurden auf einem ELISA-Lesegerät bei einer Wellenlänge von 570 nm gelesen, um die Überlebensraten zu bestimmen.
Die halbmaximalen Inhibierungskonzentrationswerte (IC₅₀-Werte) wurden ebenfalls berechnet und sind in der Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Ergebnisse eines ex-vivo-Überlebenstests bezülich der Inhibierung von Brustkrebszellen

Proben IC₅₀ (μg/ml)

MCF-7 MDA-MB-231

Kontrollgruppe Rohextrakte von A. camphorata 11,13 25,81

Experimentgruppe Antrochinonol B 1,94 8,72

Antrochinonol C 1,17 21,9
Aus dem Ergebnis in der Tabelle 1 ist ersichtlich, dass Antrochinonol B und Antrochinonol C die Überlebensrate der Östrogen-abhängigen Brustkrebszellen MCF-7 vermindern können. Der IC₅₀-Wert von Antrochinonol B bezüglich MCF-7 fiel auf 1,94 μg/ml, was um 82,56% niedriger war als derjenige von Rohextrakten von A. camphorata (11,13 μg/ml). Ferner fiel der IC₅₀-Wert von Antrochinonol C bezüglich MCF-7 auf 1,17 μg/ml, was um 89,49% niedriger war als derjenige von Rohextrakten von A. camphorata (11,13 μg/ml). Daher können Antrochinonol B und Antrochinonol C von A. camphorata eingesetzt werden, um das Wachstum der Östrogenabhängigen Brustkrebszellen MCF-7 zu inhibieren.
Andererseits können Antrochinonol B und Antrochinonol C die Überlebensrate der Östrogen-unabhängigen Brustkrebszellen MDA-MB-231 vermindern. Die IC₅₀-Werte von Antrochinonol B und Antrochinonol C bezüglich MDA-MB-231 betrugen 8,72 μg/ml bzw. 21,9 μg/ml, wobei diese Werte 66,21% und 15,15% niedriger waren als diejenigen von Rohextrakten von A. camphorata (25,81 μg/ml). Die Konzentration von Antrochinonol B und Antrochinonol C, die für die halbmaximale inhibierende Konzentration von MDA-MB-231 erforderlich war, war bezüglich der Rohextrakte in der Kontrollgruppe vermindert und bei Antrochinonol B wurde ein besserer inhibierender Effekt gefunden. Daher können Antrochinonol B und Antrochinonol C aus Antrodia camphorata zur Inhibierung des Wachstums der Östrogen-unabhängigen Brustkrebszellen MDA-MB-231 eingesetzt werden.
Beispiel 3
Ex vivo-Überlebenstest bezüglich Antilungenkrebseffekte
Das NCI-Antikrebs-Arzneistoffscreeningmodell wurde auch zum Testen des Antilungenkrebseffekts von Antrochinonol B und Antrochinonol C in der vorliegenden Erfindung verwendet. Die isolierten Antrochinonole von Beispiel 1 wurde den Kulturmedien von menschlichen Lungenkrebszellen A549 zugesetzt, um mit dem vorstehend beschriebenen MTT-Test die Überlebensraten von Lungenkrebszellen zu analysieren.
Die menschlichen Lungenkrebszellen A549 wurden vom Bioresources Collection and Research Center (BCRC) des Food Industry Research and Development Institute mit der Zugangsnummer BCRC 60074 erworben. A549-Zellen wurden in Medien, die fetales Kälberserum enthielten, 24 Stunden kultiviert. Die proliferierten Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen, dann mit 1 × Trypsin-EDTA behandelt und 5 min bei 1200 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde durch vorsichtiges Schütteln in 10 ml frischem Kulturmedium resuspendiert. Die Zellen wurden in einer 96 Well-Platte angeordnet. Ethanolgesamtextrakte von Antrodia camphorata ohne Reinigung (die Kontrollgruppe), Antrochinonol B oder Antrochinonol C (die Experimentgruppe) wurden jedem der 96 Wells bei den folgenden Konzentrationen zugesetzt: 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1 bzw. 0,03 μg/ml. Die Zellen wurden 48 Stunden bei 37°C in einem 5% CO₂-Inkubator inkubiert. MTT wurde in einer Konzentration von 2,5 mg/ml jedem Well im Dunklen zugesetzt und 4 Stunden inkubiert, worauf 100 μl Lysepuffer zugesetzt wurden, um die Reaktion zu stoppen. Die Platten wurden auf einem ELISA-Lesegerät bei einer Wellenlänge von 570 nm gelesen, um die Überlebensraten zu bestimmen. Die halbmaximale Inhibierungskonzentration (IC₅₀-Werte) wurde ebenfalls berechnet und ist in der Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Ergebnisse eines ex-vivo-Überlebenstests bezüglich der Inhibierung von Lungenkrebszellen

Proben IC₅₀ (μg/ml)

A549

Kontrollgruppe Rohextrakte von A. camphorata 13,21

Experimentgruppe Antrochinonol B 11,9

Antrochinonol C 8,21
Aus dem Ergebnis in der Tabelle 2 ist ersichtlich, dass Antrochinonol B und Antrochinonol C die Überlebensraten der menschlichen Lungenkrebszelllinie A549 effektiv vermindern können. Die IC₅₀-Werte von Antrochinonol B und Antrochinonol C bezüglich A549 betrugen 11,9 μg/ml bzw. 8,21 μg/ml, wobei diese Werte 9,92% und 37,85% niedriger waren als diejenigen von Rohextrakten von A. camphorata (13,21 μg/ml).
Sowohl Antrochinonol B als auch Antrochinonol C wiesen bezogen auf die Kontrollgruppe verminderte IC₅₀-Werte auf und bei Antrochinonol B wurde ein besserer inhibierender Effekt gefunden. Daher können Antrochinonol B und Antrochinonol C aus A. camphorata eingesetzt werden, um das Wachstum der Lungenkrebszellen A549 zu inhibieren.
Beispiel 4
Ex vivo-Überlebenstest bezüglich Antileberkrebseffekte
Das NCI-Antikrebs-Arzneistoffscreeningmodell wurde zum Testen des Antikrebseffekts von Antrochinonol B und Antrochinonol C in der vorliegenden Erfindung ver wendet. Die isolierten Antrochinonole von Beispiel 1 wurden den Kulturmedien von menschlichen Leberkrebszellen Hep 3B oder Hep G2 für einen Tumorzellenüberlebenstest zugesetzt. Die Leberkrebszellen Hep 3B (BCRC 60434) und Hep G2 (BCRC 60025) wurden vom Bioresources Collection and Research Center (BCRC) des Food Industry Research and Development Institute erhalten.
Die menschlichen Leberkrebszellen Hep 3B und Hep G2 wurden in Medien, die fetales Kälberserum enthielten, 24 Stunden kultiviert. Die proliferierten Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen, dann mit 1 × Trypsin-EDTA behandelt und 5 min bei 1200 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde durch vorsichtiges Schütteln in 10 ml frischem Kulturmedium resuspendiert. Die Zellen wurden in einer 96 Well-Platte angeordnet. Ethanolgesamtextrakte von Antrodia camphorata ohne Reinigung (die Kontrollgruppe), Antrochinonol B oder Antrochinonol C (die Experimentgruppe) wurden jedem der 96 Wells bei den folgenden Konzentrationen zugesetzt: 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1 bzw. 0,03 μg/ml. Die Zellen wurden 48 Stunden bei 37°C in einem 5% CO₂-Inkubator inkubiert. MTT wurde in einer Konzentration von 2,5 mg/ml jedem Well im Dunklen zugesetzt und 4 Stunden inkubiert, worauf 100 μl Lysepuffer zugesetzt wurden, um die Reaktion zu stoppen. Die Platten wurden auf einem ELISA-Lesegerät bei einer Wellenlänge von 570 nm gelesen, um die Überlebensraten zu bestimmen. Die halbmaximalen Inhibierungskonzentrationswerte (IC₅₀-Werte) wurden ebenfalls berechnet und sind in der Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3 Ergebnisse eines ex-vivo-Überlebenstests bezüglich der Inhibierung von Leberkrebszellen

Proben IC₅₀ (μg/ml)

Hep 36 Hep G2

Kontrollgruppe Rohextrakte von A. camphorata 5,10 18,63

Experimentgruppe Antrochinonol B 1,21 3,32

Antrochinonol C 1,32 5,12
Aus dem Ergebnis in der Tabelle 3 ist ersichtlich, dass Antrochinonol B und Antrochinonol C die Überlebensraten der menschlichen Leberkrebszelllinien Hep 3B und Hep G2 effektiv vermindern können. Der IC₅₀-Wert von Antrochinonol B bezüglich Hep 3B betrug 1,21 μg/ml, was um 76,27% niedriger war als derjenige von Rohextrakten von A. camphorata (5,10 μg/ml). Der IC₅₀-Wert von Antrochinonol C bezüglich Hep 3B betrug 1,32 μg/ml, was um 74,12% niedriger war als derjenige von Rohextrakten von A. camphorata. Beide Verbindungen zeigten in Hep 3B-Zellen bezüglich der Kontrollgruppe beträchtlich verminderte IC₅₀-Werte. Die IC₅₀-Werte von Antrochinonol B und Antrochinonol C bezüglich Hep G2 betrugen 3,32 μg/ml bzw. 5,12 μg/ml, wobei diese Werte 82,18% und 72,52% niedriger waren als diejenigen von Rohextrakten von A. camphorata (18,63 μg/ml). Beide Verbindungen zeigten in Hep G2-Zellen bezüglich der Kontrollgruppe beträchtlich verminderte IC₅₀-Werte. Daher können Antrochinonol B und Antrochinonol C von A. camphorata eingesetzt werden, um das Wachstum von Leberkrebszellen zu inhibieren.
Darüber hinaus zeigten Leberkrebszellen, die mit Antrochinonol B behandelt worden sind, niedrigere IC₅₀-Werte als Zellen, die mit Antrochinonol C behandelt worden sind, d. h. zur Inhibierung des Wachstums von Leberkrebszellen Hep 3B und Hep G2 war eine niedrigere Konzentration von Antrochinonol B erforderlich. Antrochinonol B weist bezüglich des Wachstums von Leberkrebszellen bessere inhibierende Effekte auf als Antrochinonol C.
Beispiel 5
Ex vivo-Überlebenstest bezüglich Antiprostatakrebseffekte
Das NCI-Antikrebs-Arzneistoffscreeningmodell wurde auch zum Testen des Antikrebseffekts der Antrochinonole in der vorliegenden Erfindung verwendet. Antrochinonol B und Antrochinonol C, die im Beispiel 2 isoliert worden sind, wurden den Kulturmedien von menschlichen Prostatakrebszellen LNCaP oder DU-145 zugesetzt und die Überlebensraten von Prostatakrebszellen wurden mit dem vorstehend genannten MTT-Test analysiert. LNCaP stammte von Epithelzellen der Prostatadrüse, die in der frühen Stufe von Androgen abhängen, und folglich handelt es sich um eine Androgen-abhängige Krebszelle. DU-145 ist eine Prostatakrebszelle des wiederauftretenden Typs, die für das Wachstum nicht von Androgen abhängig ist und daher Androgen-unabhängig ist. Für diesen Prostatakrebs des wiederauftretenden Typs gibt es bisher keine wirksame Behandlung. Sowohl LNCaP als auch DU-145 wurden vom NHRI mit den Zugangsnummern CCRC 60088 bzw. CCRC 60348 erhalten.
Die menschlichen Prostatakrebszellen LNCaP und DU-145 wurden in Medien, die fetales Kälberserum enthielten, 24 Stunden kultiviert. Die proliferierten Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen, dann mit 1 × Trypsin-EDTA behandelt und 5 min bei 1200 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde durch vorsichtiges Schütteln in 10 ml frischem Kulturmedium resuspendiert. Die Zellen wurden in einer 96 Well-Platte angeordnet. Ethanolgesamtextrakte von Antrodia camphorata ohne Reinigung (die Kontrollgruppe), Antrochinonol B oder Antrochinonol C (die Experimentgruppe) wurden jedem der 96 Wells bei den folgenden Konzentrationen zugesetzt: 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1 bzw. 0,03 μg/ml. Die Zellen wurden 48 Stunden bei 37°C in einem 5% CO₂-Inkubator inkubiert. MTT wurde in einer Konzentration von 2,5 mg/ml jedem Well im Dunklen zugesetzt und 4 Stunden inkubiert, worauf 100 μl Lysepuffer zugesetzt wurden, um die Reaktion zu stoppen. Die Platten wurden auf einem ELISA-Lesegerät bei einer Wellenlänge von 570 nm gelesen, um die Überlebensraten zu bestimmen. Die halbmaximalen Inhibierungskonzentrationswerte (IC₅₀-Werte) wurden ebenfalls berechnet und sind in der Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4 Ergebnisse eines ex-vivo-Überlebenstests bezüglich der Inhibierung von Prostatakrebszellen

Proben IC₅₀ (μg/ml)

LNCaP DU-145

Kontrollgruppe Rohextrakte von A. camphorata 11,49 41,39

Experimentgruppe Antrochinonol B 5,67 10,12

Antrochinonol C 8,72 12,21
Aus dem Ergebnis in der Tabelle 4 ist ersichtlich, dass die Überlebensraten von Zellen von LNCaP und DU-145 durch die Aktivitäten von Antrochinonol B oder Antrochinonol C effektiv vermindert wurden. Die IC₅₀-Werte von Antrochinonol B und Antrochinonol C bezüglich LNCaP betrugen 5,67 μg/ml bzw. 8,72 μg/ml, wobei diese Werte 50,65% und 24,11% niedriger waren als der IC₅₀-Wert der Kontrollgruppe (11,49 μg/ml). Die IC₅₀-Werte von Antrochinonol B und Antrochinonol C bezüglich DU-145 betrugen 10,12 μg/ml bzw. 12,21 μg/ml, wobei diese Werte 75,55% und 70,5% niedriger waren als der IC₅₀-Wert der Kontrollgruppe (41,39 μg/ml). Daher waren die halbmaximalen inhibierenden Konzentrationen dieser zwei Antrochinonole aus A. camphorata bezüglich der Prostatakrebszellen LNCaP und DU-145 im Vergleich zu den Rohextrakten in der Kontrollgruppe beträchtlich vermindert. Darüber hinaus zeigten LNCaP-Prostatakrebszellen, die mit Antrochinonol B behandelt worden sind, viel niedrigere IC₅₀-Werte als Antrochinonol C-behandelte Zellen, d. h. bezüglich der Inhibierung von Prostatakrebszellen wurde ein besserer inhibierender Effekt für Antrochinonol B gefunden.
Andererseits kann sowohl Antrochinonol B als auch Antrochinonol C das Wachstum von LNCaP- und DU-145-Prostatakrebszellen mit zwei verschiedenen Charakteristika effektiv inhibieren. Daher können Antrochinonol B und Antrochinonol C zur Inhibierung nicht nur des Wachstums der Androgen-abhängigen Prostatakrebszellen LNCaP, sondern auch der Androgen-unabhängigen Prostatakrebszellen DU-145 eingesetzt werden. Dies ist für die Therapie von Prostatakrebs und von wiederauftretendem Prostatakrebs nützlich.
Zusammenfassend können Antrochinonol B und Antrochinonol C, die aus Extrakten von A. camphorata isoliert worden sind, das Wachstum von Brustkrebs, Lungenkrebs, Leberkrebs und Prostatakrebs effektiv inhibieren. Diese Verbindungen können in medizinische Zusammensetzungen zur Behandlung der vorstehend genannten Krebszellen einbezogen werden. Die medizinischen Zusammensetzungen enthalten nicht nur die Verbindungen von Antrochinonol B und Antrochinonol C, sondern auch pharmazeutisch verträgliche Träger. Die Träger umfassen unter anderem Vehikel, wie z. B. Wasser, Füllstoffe, wie z. B. Saccharose oder Stärke, Bindemittel, wie z. B. Cellulosederivate, Verdünnungsmittel, Sprengmittel, Absorptionsverstärker oder Süßungsmittel. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann durch Mischen der Verbindungen Antrochinonol B und Antrochinonol C mit mindestens einem der Träger mittels herkömmlicher Verfahren, die in dem technischen Gebiet der Pharmazie bekannt sind, hergestellt und unter anderem als Pulver, Tablette, Kapsel, Pellets, Körner oder als andere, flüssige Formulierung formuliert werden.

Claims

Verbindung mit der folgenden Formel, worin x Hydroxyl (-OH) oder Methoxy (-OCH₃) ist.
Verfahren zur Isolierung der Verbindung nach Anspruch 1 aus Antrodia camphorata.
Verwendung der Verbindung nach Anspruch 1 zur Inhibierung des Wachstums von Krebszellen, wobei die Krebszellen Brustkrebszellen, Leberkrebszellen oder Prostatakrebszellen sind.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Brustkrebszellen aus der Gruppe, bestehend aus der Brustkrebszelllinie MCF-7 und der Brustkrebszelllinie MDA-MB-231, ausgewählt sind.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Leberkrebszellen aus der Gruppe, bestehend aus der Leberkrebszelllinie Hep 3B und der Leberkrebszelllinie Hep G2, ausgewählt sind.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Prostatakrebszellen aus der Gruppe, bestehend aus der Prostatakrebszelllinie LNCaP und der Brustkrebszelllinie DU-145, ausgewählt sind.