TWI407100B - 利用高效液相層析分析牛樟芝三萜類之方法 - Google Patents
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Description
本發明所屬之技術領域係關於一種利用高效液相層析分析牛樟芝三萜類之方法，其特徵在於高效液相層析之移動相組成與流速及紫外線偵測波長的特定條件。
樟芝(Antrodia camphorata
)，民間別名牛樟芝、牛樟菇、紅樟菇等。為台灣特有之真菌種，因生長緩慢，且僅生長在台灣特有老齡牛樟樹(Cinnamomum kanehirae
Hay.)之腐朽內壁，因其數量稀少不易採集，樟芝屬腐生菌，但病源性似乎不強，因此不易造成活樹死亡。牛樟樹之所以具有極佳的耐腐朽能力，主要是因為牛樟樹木材中含有抑制腐朽菌生長的抽出成份，牛樟樹抽出成份卻有促進樟芝生長芝效果，此外，樟芝亦能分泌抗生物質，抑制其他腐朽菌生長，故除了樟芝以外，它種腐朽菌或一般真菌皆無法生長於牛樟樹上。牛樟樹因具濃厚香氣，可作為驅蟲使用，在自然界中族群稀少，因寄生於牛樟樹中之樟芝數量更是稀少，故被視為民間最珍貴的藥材；已知功效在民間僅止於口耳相傳或偏方，長久以來就是原住民解酒、解毒養生與食補的藥材，舉凡農藥中毒、食物中毒、治療腹瀉、腹痛、嘔吐、高血壓、皮膚病、肝癌等症狀，都具有作用。台灣原住民為牛樟芝最早使用的使用者，是因在山中採伐時無意間發現了樟芝，取之嚼食或將其烹煮食用。由於原住民生活型態的關係，平時體力消耗甚大且愛好飲酒，服用樟芝之後，可強肝解毒、強健身體並有解酒的功能，經口耳相傳，而被視為臺灣特有的上等藥材被民間視為「靈芝之王」，是臺灣特有的菇類。也因為樟芝的特殊身份及療效，許多的研究也如火如荼的展開。隨著科學的方式作為佐證，牛樟真菌在於野外為數不多，且為單一宿主牛樟樹，導致其價格水漲船高，市價每台斤十多萬到數十萬不等，被視為全球最昂貴的野生真菌，亦有人稱其為森林中的紅寶石。牛樟芝子實體長於老齡牛樟空幹之內面，初期為扁平型，之後前緣捲起生長，有牛樟氣味，味道極苦。子實體形態多變化，有板狀、鐘狀、馬蹄狀或塔狀，無固定型態。初生時鮮紅色，漸長變為白色、淡紅褐色、淡褐色或淡黃褐色。子實體為多年生，無菌柄，表面新鮮時呈橘紅色，老化時呈褐色至黑褐色，頂面平滑，具同心環。菌孔為圓形至多角形，內含孢子。菌絲有分營養菌絲(generative hyphae)、扣子體(clamp connections)及骨架菌絲(skeletal hyphae)；有性器官為擔孢子(basidiospore)，型態為微彎之圓柱狀(cylindrical)，而擔子柄呈棍棒狀(clavate)，菌絲體型態其活躍時呈橘紅色，老化後呈紅褐色。
樟芝的成份分析從1990年始有文獻報導，由許多分離與分析的研究所得知。野生樟芝子實體乾重約為30%，其中約含有32%的粗脂肪、粗纖維23%、碳水化合物37%、蛋白質約7%。樟芝主要生物活性成份可分為多醣體(polysaccharides)、三萜類化合物(triterpenoids)及固醇類(steroids)，其中多醣體可提升人體免疫力及抑制B型肝炎病毒，而三萜類則與抗癌、保肝方面有關，固醇類具有消炎效果。可因子實體與菌絲體的生理、代謝不同，造成三萜類及固醇類等的生化合成能力降低。然而，目前針對牛樟芝三萜類化合物，尚無一準確且實用的分析方法發表。
樟芝子實體中含有多種三萜類化合物，將樟芝子實體粉碎後，三萜類化合物可於有機溶劑中加熱迴流萃取製備而得。由於三萜類具有抗癌、保肝等功效，極具具商業及研究上的價值，因此有必要發展有效的牛樟芝三萜類化合物純化方法及準確的分析方法。
本發明目的為牛樟芝子實體的指標三萜類成份之高效液相層析(HPLC)鑑定與含量分析，利用已製備得之牛樟芝三萜類化合物標準品，測定牛樟芝產品三萜類種類與含量。
本發明係關於一種利用高效液相層析分析牛樟芝三萜類(triterpenoids)之方法，其中高效液相層析條件在下列情況下：移動相線性梯度程序為：1)初始自以60%乙腈(ACN)及40%水(含0.1%至0.2%甲酸或乙酸)開始，經過60分鐘，至2)90%乙腈及10%水(含0.1%至0.2%甲酸或乙酸)；流速為0.8至1.0毫升/分鐘；及偵側器：紫外線波長235至255奈米之間；於特定滯留時間時具有特定波峰值。
在本發明之一較佳實施例中，其中牛樟芝三萜類包括牛樟芝甲酯B(methyl antcinate B)、去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid)、15α-乙醯去氫硫色多孔菌酸(15α-acetyl dehydrosulphurenic acid)、3β,15α-二羥羊毛甾-7,9(11),24-三烯-21酸(3β,15α-dihydroxy lanosta-7,9(11),24-triene-21-oic acid)、樟芝酸A(zhankuic acid A)、樟芝酸C(zhankuic acid C)、硫色多孔菌酸(sulphurenic acid)及牛樟芝甾A(antcin A)。
在本發明之一較佳實施例中，牛樟芝甲酯B(methyl antcinate B)於滯留時間為約35分鐘時具有特定波峰值。
在本發明之一較佳實施例中，去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid)於滯留時間為約53分鐘時具有特定波峰值。
在本發明之一較佳實施例中，15α-乙醯去氫硫色多孔菌酸(15α-acetyl dehydrosulphurenic acid)於滯留時間為約28分鐘時具有特定波峰值。
在本發明之一較佳實施例中，3β,15α-二羥羊毛甾-7,9(11),24-三烯-21酸(3β,15α-dihydroxy lanosta-7,9(11),24-triene-21-oic acid)於滯留時間為約16分鐘時具有特定波峰值。
在本發明之一較佳實施例中，樟芝酸A(zhankuic acid A)於滯留時間為約18分鐘時具有特定波峰值。
在本發明之一較佳實施例中，樟芝酸C(zhankuic acid C)於滯留時間為約11分鐘時具有特定波峰值。
在本發明之一較佳實施例中，硫色多孔菌酸(sulphurenic acid)於滯留時間為約5分鐘時具有特定波峰值。
在本發明之一較佳實施例中，牛樟芝甾A(antcin A)於滯留時間為約27分鐘時具有特定波峰值。
在本發明之一較佳實施例中，高效液相層析條件之移動相線性梯度程序為：1)初始自以60%乙腈(ACN)及40%水(含0.2%乙酸)開始，經過60分鐘，至2)90%乙腈及10%水(含0.2%乙酸)。
在本發明之一較佳實施例中，高效液相層析條件之移動相流速為0.8毫升/分鐘。
在本發明之一較佳實施例中，高效液相層析條件之偵側器紫外線波長係248奈米。
實施例1、自牛樟芝萃取物分離8種三萜類化合物
本發明使用將風乾之牛樟芝(Antrodia camphorata
)子實體粉末(101.9 g)依序以正己烷、三氯甲烷及甲醇於加熱迴流萃取裝置進行萃取(3×1000 mL)。在完整萃取步驟後，收得之萃取物分別於減壓條件下濃縮，分別獲得3.02 g(以乾重計算占2.96%)正己烷殘餘物、46.3 g(45.43%)三氯甲烷殘餘物及2.7 g(2.64%)甲醇殘餘物。藉由己烷/乙酸乙酯混合液增加極性，將三氯甲烷萃取殘餘物以重覆性矽膠管柱層析(5×90 cm)沖提。在薄層層析(TLC)分析後，將具相似層析結果之沖出物合併，得到6組分液(F1-F6)。分液F2以己烷/乙酸乙酯於矽膠管柱梯度沖提方式進行再層析，分別產出牛樟芝甲酯B(methyl antcinate B)(三萜類化合物1
)、去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid)(三萜類化合物2
)及15α-乙醯去氫硫色多孔菌酸(15α-acetyl dehydrosulphurenic acid)(三萜類化合物3
)。分液F3以己烷/乙酸乙酯於矽膠管柱梯度沖提方式進行純化，獲得化合物3β,15α-二羥羊毛甾-7,9(11),24-三烯-21酸(3β,15α-dihydroxy lanosta-7,9(11),24-triene-21-oic acid)(三萜類化合物4
)及樟芝酸A(zhankuic acid A)(三萜類化合物5
)。分液F4及F5以正己烷/乙酸乙酯梯度沖提管柱層析純化，產出4種次分液(D-1至D-4)。樟芝酸C(zhankuic acid C)(三萜類化合物6
)及硫色多孔菌酸(sulphurenic acid)(三萜類化合物7
)分別來自次分液D-3及D-4。使用100%三氯甲烷至20%甲醇之三氯甲烷/甲醇混合液，進行分液F6矽膠管柱層析純化，產出牛樟芝甾A(antcin A)(三萜類化合物8
)。三萜類化合物1-8結構以1
H和13
C核磁共振(NMR)光譜測定，所得光譜資料並與已發表數值比較(Shen,C.C.,Kuo,Y.C.,Huang,R.L.,Lin,L.C.,Don,M.J.,Chang,T.T.,Chou,C.T.,(2003). New ergostane and lanostane fromAntrodia camphorata.
Journal of Chinese Medicine,14,247-258；Male,K.B.,Rao,Y.K.,Tzeng,Y.M.,Montes,J.,Kamen,A.,Luong,J.H.,(2008). Probing inhibitory effects ofAntrodia camphorata
isolates using insect cell-based impedance spectroscopy: inhibition vs chemical structure. Chemical Research in Toxicology 21,2127-2133；Yeh,C.T.,Rao,Y.K.,Yao,C.J.,Yeh,C.F.,Li,C.H.,Chuang,S.E.,Luong,J.H.,Lai,GM.,Tzeng,Y.M.,(2009). Cytotoxic triterpenes fromAntrodia camphorata
and their mode of action in HT-29 human colon cancer cells. Cancer Letters 285,73-79；Geethangili,M.,Fang,S.H.,Lai,C.H.,Rao,Y.K.,Lien,H.M.,Tzeng,Y.M.,(2010). Inhibitory effect ofAntrodia camphorata
constituents on theHelicobacter pylori
-associated gastric inflammation. Food Chemistry 119,149-153)。
8種三萜類化合物的分子量列於表1。
圖1至圖8分別為三萜類化合物1至三萜類化合物8之化學式。
實施例2、利用高效液相層析分析牛樟芝三萜類
利用高效液相層析分析三萜類化合物1至三萜類化合物8。其中高效液相層析分析用溶劑為：乙醇(Ethanol)(ECHO，苗栗，臺灣)、乙腈(Acetonitrile)(ECHO，苗栗，臺灣)、甲酸(Formic acid)(ECHO，苗栗，臺灣)及乙酸(Acetic acid)(ECHO，苗栗，臺灣)。
其中高效能液相層析儀設備為：偵測器：Diode Array UV Detector L-7400(Hitachi，Tokyo，日本)；泵浦：L-7100(Hitachi，Tokyo，日本)以及分析型管柱：J，sphere ODS-M80 C18管柱(250×4.6毫米，4奈米粒徑)(YMC Sep，Technol，日本)。
將牛樟芝子實體萃取物以乙醇回溶後，利用高效液相層析分析其內含之三萜類成份。其中高效能液相層析儀分析條件為：移動相係乙腈及水(含0.2%乙酸)；移動相線性梯度程序：1)初始自以60%乙腈(ACN)及40%水(含0.2%乙酸)開始，經過60分鐘，至2)90%乙腈及10%水(含0.2%乙酸)；流速為0.8毫升/分鐘；偵側器設定紫外線波長235奈米、248奈米及255奈米；注射體積為5微升。
圖9顯示以高效能液相層析儀分析牛樟芝三萜類化合物1之結果。其中高效能液相層析儀分析條件為：移動相係乙腈及水(含0.2%乙酸)；移動相線性梯度程序：1)初始自以60%乙腈(ACN)及40%水(含0.2%乙酸)開始，經過60分鐘，至2)90%乙腈及10%水(含0.2%乙酸)；流速為0.8毫升/分鐘。(A)表示偵側器設定紫外線波長235奈米，(B)表示偵側器設定紫外線波長248奈米，(C)表示偵側器設定紫外線波長255奈米，結果顯示紫外線波長248奈米可於滯留時間約35分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物1。
圖10顯示以高效能液相層析儀分析牛樟芝三萜類化合物2之結果。其中高效能液相層析儀分析條件為：移動相係乙腈及水(含0.2%乙酸)；移動相線性梯度程序：1)初始自以60%乙腈(ACN)及40%水(含0.2%乙酸)開始，經過60分鐘，至2)90%乙腈及10%水(含0.2%乙酸)；流速為0.8毫升/分鐘。(A)表示偵側器設定紫外線波長235奈米，(B)表示偵側器設定紫外線波長248奈米，(C)表示偵側器設定紫外線波長255奈米，結果顯示紫外線波長248奈米可於滯留時間約53分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物2。
圖11顯示以高效能液相層析儀分析牛樟芝三萜類化合物3之結果。其中高效能液相層析儀分析條件為：移動相係乙腈及水(含0.2%乙酸)；移動相線性梯度程序：1)初始自以60%乙腈(ACN)及40%水(含0.2%乙酸)開始，經過60分鐘，至2)90%乙腈及10%水(含0.2%乙酸)；流速為0.8毫升/分鐘。(A)表示偵側器設定紫外線波長235奈米，(B)表示偵側器設定紫外線波長248奈米，(C)表示偵側器設定紫外線波長255奈米，結果顯示紫外線波長248奈米可於滯留時間約28分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物3。
圖12顯示以高效能液相層析儀分析牛樟芝三萜類化合物4之結果。其中高效能液相層析儀分析條件為：移動相係乙腈及水(含0.2%乙酸)；移動相線性梯度程序：1)初始自以60%乙腈(ACN)及40%水(含0.2%乙酸)開始，經過60分鐘，至2)90%乙腈及10%水(含0.2%乙酸)；流速為0.8毫升/分鐘。(A)表示偵側器設定紫外線波長235奈米，(B)表示偵側器設定紫外線波長248奈米，(C)表示偵側器設定紫外線波長255奈米，結果顯示紫外線波長248奈米可於滯留時間約16分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物4。
圖13顯示以高效能液相層析儀分析牛樟芝三萜類化合物5之結果。其中高效能液相層析儀分析條件為：移動相係乙腈及水(含0.2%乙酸)；移動相線性梯度程序：1)初始自以60%乙腈(ACN)及40%水(含0.2%乙酸)開始，經過60分鐘，至2)90%乙腈及10%水(含0.2%乙酸)；流速為0.8毫升/分鐘。(A)表示偵側器設定紫外線波長235奈米，(B)表示偵側器設定紫外線波長248奈米，(C)表示偵側器設定紫外線波長255奈米，結果顯示紫外線波長248奈米可於滯留時間約18分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物5。
圖14顯示以高效能液相層析儀分析牛樟芝三萜類化合物6之結果。其中高效能液相層析儀分析條件為：移動相係乙腈及水(含0.2%乙酸)；移動相線性梯度程序：1)初始自以60%乙腈(ACN)及40%水(含0.2%乙酸)開始，經過60分鐘，至2)90%乙腈及10%水(含0.2%乙酸)；流速為0.8毫升/分鐘。(A)表示偵側器設定紫外線波長235奈米，(B)表示偵側器設定紫外線波長248奈米，(C)表示偵側器設定紫外線波長255奈米，結果顯示紫外線波長248奈米可於滯留時間約11分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物6。
圖15顯示以高效能液相層析儀分析牛樟芝三萜類化合物7之結果。其中高效能液相層析儀分析條件為：移動相係乙腈及水(含0.2%乙酸)；移動相線性梯度程序：1)初始自以60%乙腈(ACN)及40%水(含0.2%乙酸)開始，經過60分鐘，至2)90%乙腈及10%水(含0.2%乙酸)；流速為0.8毫升/分鐘。(A)表示偵側器設定紫外線波長235奈米，(B)表示偵側器設定紫外線波長248奈米，(C)表示偵側器設定紫外線波長255奈米，結果顯示紫外線波長248奈米可於滯留時間約5分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物7。
圖16顯示以高效能液相層析儀分析牛樟芝三萜類化合物8之結果。其中高效能液相層析儀分析條件為：移動相係乙腈及水(含0.2%乙酸)；移動相線性梯度程序：1)初始自以60%乙腈(ACN)及40%水(含0.2%乙酸)開始，經過60分鐘，至2)90%乙腈及10%水(含0.2%乙酸)；流速為0.8毫升/分鐘。(A)表示偵側器設定紫外線波長235奈米，(B)表示偵側器設定紫外線波長248奈米，(C)表示偵側器設定紫外線波長255奈米，結果顯示紫外線波長248奈米可於滯留時間約27分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物8。
實施例3、製作牛樟芝指標三萜類標準品及檢量線
將本發明純化的標準品--牛樟芝三萜類化合物1至8，均以0.80毫克/毫升濃度回溶，以高效能液相層析分析其圖譜。檢量線濃度範圍為約0.05毫克/毫升至約0.80毫克/毫升。
圖17顯示以高效能液相層析儀分析本發明純化之標準品之結果，本實驗包含牛樟芝三萜類化合物1至8一同分析之結果，其中高效能液相層析儀分析條件為：移動相係乙腈及水(含0.2%乙酸)；移動相線性梯度程序：1)初始自以60%乙腈(ACN)及40%水(含0.2%乙酸)開始，經過60分鐘，至2)90%乙腈及10%水(含0.2%乙酸)；流速為0.8毫升/分鐘。(A)表示三萜類化合物濃度為0.05毫克/毫升；(B)表示三萜類化合物濃度為0.10毫克/毫升；(C)表示三萜類化合物濃度為0.20毫克/毫升；(D)表示三萜類化合物濃度為0.40毫克/毫升；(E)表示三萜類化合物濃度為0.80毫克/毫升。此結果顯示，使用上述高效能液相層析條件分析在濃度範圍為約0.05毫克/毫升至約0.80毫克/毫升間之牛樟芝三萜類化合物1至8，其高效液相層析圖之波峰不會重疊，可輕易判讀。
圖18顯示牛樟芝三萜類化合物1至8標準品溶液定量標準曲線，其中標準曲線參數如下表2。
表2、牛樟芝三萜類化合物1至8標準品溶液定量標準曲線參數
實施例4、利用高效能液相層析儀使用含甲酸或乙酸流動相並以不同流速分析標準品
利用高效液相層析分析三萜類化合物1至三萜類化合物8。其中高效液相層析分析用溶劑為：乙醇(Ethanol)(ECHO，苗栗，臺灣)、乙腈(Acetonitrile)(ECHO，苗栗，臺灣)、甲酸(Formic acid)(ECHO，苗栗，臺灣)及乙酸(Acetic acid)(ECHO，苗栗，臺灣)。
其中高效能液相層析儀設備為：偵測器：Diode Array UV Detector L-7400(Hitachi，Tokyo，日本)；泵浦：L-7100(Hitachi，Tokyo，日本)以及分析型管柱：J，sphere ODS-M80 C18管柱(250×4.6毫米，4奈米粒徑)(YMC Sep，Technol，日本)。
將本發明純化的標準品--牛樟芝三萜類化合物1至8，均以0.80毫克/毫升濃度回溶，以高效能液相層析分析其圖譜。其中高效能液相層析儀分析條件為：移動相係乙腈及水(含0.1%至0.2%甲酸或乙酸)；移動相線性梯度程序：1)初始自以60%乙腈(ACN)及40%水(含0.1%至0.2%甲酸或乙酸)開始，經過60分鐘，至2)90%乙腈及10%水(含0.1%至0.2%甲酸或乙酸)；流速為0.8至1.0毫升/分鐘；偵側器設定紫外線波長248奈米；注射體積為5微升。
圖19顯示以高效能液相層析儀使用含甲酸或乙酸之移動相，並以移動相不同流速分析牛樟芝三萜類化合物1至8標準品溶液之結果。
圖19(A)、(B)之高效能液相層析儀分析條件為：移動相係乙腈及水((A)、含0.1%乙酸；(B)、含0.2%乙酸)；移動相線性梯度程序：1)初始自以60%乙腈(ACN)及40%水((A)、含0.1%乙酸；(B)、含0.2%乙酸)開始，經過60分鐘，至2)90%乙腈及10%水((A)、含0.1%乙酸；(B)、含0.2%乙酸)；流速為0.8毫升/分鐘；偵側器設定紫外線波長248奈米；注射體積為5微升。圖19(A)、(B)之結果顯示在上述條件下，移動相為乙腈及含0.1%至0.2%乙酸之水可針對牛樟芝三萜類化合物1至8於特定滯留時間獲得特定波峰值，且各種三萜化合物之高效液相層析圖之波峰不會重疊，可輕易判讀。
在圖19(A)之條件下，可於滯留時間約34分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物1，於滯留時間約53分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物2，於滯留時間約28分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物3，於滯留時間約15分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物4，於滯留時間約18分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物5，於滯留時間約11分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物6，於滯留時間約5分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物7，於滯留時間約26分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物8。在圖19(B)之條件下，可於滯留時間約34分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物1，於滯留時間約53分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物2，於滯留時間約28分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物3，於滯留時間約15分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物4，於滯留時間約18分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物5，於滯留時間約11分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物6，於滯留時間約5分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物7，於滯留時間約26分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物8。
圖19(C)、(D)之高效能液相層析儀分析條件為：移動相係乙腈及水(含0.1%甲酸)；移動相線性梯度程序：1)初始自以60%乙腈(ACN)及40%水(含0.1%甲酸)開始，經過60分鐘，至2)90%乙腈及10%水(含0.1%甲酸)；流速為(C)、0.8毫升/分鐘及(D)、1.0毫升/分鐘；偵側器設定紫外線波長248奈米；注射體積為5微升。圖19(C)、(D)之結果顯示在移動相係乙腈及水(含0.1%甲酸)的情況下，流速為0.8毫升/分鐘至1.0毫升/分鐘可針對牛樟芝三萜類化合物1至8於特定滯留時間獲得特定波峰值，且各種三萜化合物之高效液相層析圖之波峰不會重疊，可輕易判讀。
在圖19(C)之條件下，可於滯留時間約35分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物1，於滯留時間約53分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物2，於滯留時間約28分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物3，於滯留時間約15分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物4，於滯留時間約18分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物5，於滯留時間約11分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物6，於滯留時間約5分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物7，於滯留時間約26分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物8。在圖19(D)之條件下，可於滯留時間約30分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物1，於滯留時間約47分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物2，於滯留時間約25分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物3，於滯留時間約13分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物4，於滯留時間約15分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物5，於滯留時間約9分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物6，於滯留時間約4分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物7，於滯留時間約23分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物8。
圖19(E)、(F)之高效能液相層析儀分析條件為：移動相係乙腈及水(含0.2%甲酸)；移動相線性梯度程序：1)初始自以60%乙腈(ACN)及40%水(含0.2%甲酸)開始，經過60分鐘，至2)90%乙腈及10%水(含0.2%甲酸)；流速為(E)、0.8毫升/分鐘及(F)、1.0毫升/分鐘；偵側器設定紫外線波長248奈米；注射體積為5微升。圖19(E)、(F)之結果顯示在移動相係乙腈及水(含0.2%甲酸)的情況下，流速為0.8毫升/分鐘至1.0毫升/分鐘可針對牛樟芝三萜類化合物1至8於特定滯留時間獲得特定波峰值，且各種三萜化合物之高效液相層析圖之波峰不會重疊，可輕易判讀。
在圖19(E)之條件下，可於滯留時間約35分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物1，於滯留時間約53分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物2，於滯留時間約28分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物3，於滯留時間約15分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物4，於滯留時間約18分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物5，於滯留時間約11分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物6，於滯留時間約5分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物7，於滯留時間約26分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物8。在圖19(F)之條件下，可於滯留時間約30分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物1，於滯留時間約47分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物2，於滯留時間約24分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物3，於滯留時間約12分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物4，於滯留時間約15分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物5，於滯留時間約9分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物6，於滯留時間約4分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物7，於滯留時間約22分鐘時獲得最明顯波峰代表牛樟芝三萜類化合物8。
實施例5、利用高效液相層析分析牛樟芝子實體乙醇萃取液
將牛樟芝子實體以乙醇萃取(100克/升)，利用上述之高效液相層析條件分析該乙醇萃取液，其中高效能液相層析儀分析條件為：移動相係乙腈及水(含0.2%乙酸)；移動相線性梯度程序：1)初始自以60%乙腈(ACN)及40%水(含0.2%乙酸)開始，經過60分鐘，至2)90%乙腈及10%水(含0.2%乙酸)；流速為0.8毫升/分鐘；偵側器設定紫外線波長248奈米；注射體積為5微升。分析結果顯示於圖20。由圖20可知，上述之高效能液相層析儀分析條件可針對牛樟芝子實體之乙醇萃取液中之牛樟芝三萜化合物2至8於特定滯留時間獲得特定波峰值，且各種三萜化合物之高效液相層析圖之波峰不會重疊，可輕易判讀。
利用牛樟芝三萜類化合物1至8標準品溶液定量標準曲線(實施例3)得出三萜類化合物2至8於牛樟芝子實體乙醇萃取液之濃度，列於下表3。
圖1、牛樟芝三萜類化合物1之化學式。
圖2、牛樟芝三萜類化合物2之化學式。
圖3、牛樟芝三萜類化合物3之化學式。
圖4、牛樟芝三萜類化合物4之化學式。
圖5、牛樟芝三萜類化合物5之化學式。
圖6、牛樟芝三萜類化合物6之化學式。
圖7、牛樟芝三萜類化合物7之化學式。
圖8、牛樟芝三萜類化合物8之化學式。
圖9、以高效能液相層析儀分析牛樟芝三萜類化合物1之結果。
圖10、以高效能液相層析儀分析牛樟芝三萜類化合物2之結果。
圖11、以高效能液相層析儀分析牛樟芝三萜類化合物3之結果。
圖12、以高效能液相層析儀分析牛樟芝三萜類化合物4之結果。
圖13、以高效能液相層析儀分析牛樟芝三萜類化合物5之結果。
圖14、以高效能液相層析儀分析牛樟芝三萜類化合物6之結果。
圖15、以高效能液相層析儀分析牛樟芝三萜類化合物7之結果。
圖16、以高效能液相層析儀分析牛樟芝三萜類化合物8之結果。
圖17、以高效能液相層析儀分析本發明純化之標準品之結果。
圖18、牛樟芝三萜類化合物1至8標準品溶液定量標準曲線。
圖19、以高效能液相層析儀使用含甲酸或乙酸之移動相，並以移動相不同流速分析牛樟芝三萜類化合物1至8標準品溶液之結果。
圖20、以高效能液相層析儀分析牛樟芝子實體乙醇萃取液之結果。
2．．．代表牛樟芝三萜類化合物2
3．．．代表牛樟芝三萜類化合物3
4．．．代表牛樟芝三萜類化合物4
5．．．代表牛樟芝三萜類化合物5
6．．．代表牛樟芝三萜類化合物6
7．．．代表牛樟芝三萜類化合物7
8．．．代表牛樟芝三萜類化合物8
Claims (10)
- 一種利用高效液相層析分析牛樟芝三萜類(triterpenoids fromAntrodia camphorata )之方法，其中高效液相層析條件在下列情況下：(A)、移動相線性梯度程序為：1)初始自以60%乙腈(ACN)及40%水(含0.1%至0.2%甲酸或乙酸)開始，經過60分鐘，至2)90%乙腈及10%水(含0.1%至0.2%甲酸或乙酸)；流速為0.8至1.0毫升/分鐘；及(B)、偵側器：紫外線波長235至255奈米之間；於特定滯留時間時具有特定波峰值，其中牛樟芝三萜包括牛樟芝甲酯B(methyl antcinate B)、去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid)、15α-乙醯去氫硫色多孔菌酸(15α-acetyl dehydrosulphurenic acid)、3β,15α-二羥羊毛甾-7,9(11),24-三烯-21酸(3β,15α-dihydroxy lanosta-7,9(11),24-triene-21-oic acid)、樟芝酸A(zhankuic acid A)、樟芝酸C(zhankuic acid C)、硫色多孔菌酸(sulphurenic acid)及牛樟芝甾A(antcin A)。
- 根據申請專利範圍第1項所述之方法，其中牛樟芝甲酯B(methyl antcinate B)於滯留時間為約30至約35分鐘時具有特定波峰值。
- 根據申請專利範圍第1項所述之方法，其中去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid)於滯留時間為約47至約53分鐘時具有特定波峰值。
- 根據申請專利範圍第1項所述之方法，其中15α-乙醯去氫硫色多孔菌酸(15α-acetyl dehydrosulphurenic acid)於滯留時間為約24至約28分鐘時具有特定波峰值。
- 根據申請專利範圍第1項所述之方法，其中3β,15α-二羥羊毛甾-7,9(11),24-三烯-21酸(3β,15α-dihydroxy lanosta-7,9(11),24-triene-21-oic acid)於滯留時間為約12至約16分鐘時具有特定波峰值。
- 根據申請專利範圍第1項所述之方法，其中樟芝酸A(zhankuic acid A)於滯留時間為約15至約18分鐘時具有特定波峰值。
- 根據申請專利範圍第2項所述之方法，其中樟芝酸C(zhankuic acid C)於滯留時間為約9至約11分鐘時具有特定波峰值。
- 根據申請專利範圍第1項所述之方法，其中硫色多孔菌酸(sulphurenic acid)於滯留時間為約4至約5分鐘時具有特定波峰值。
- 根據申請專利範圍第1項所述之方法，其中牛樟芝甾A(antcin A)於滯留時間為約22至約27分鐘時具有特定波峰值。
- 根據申請專利範圍第1項所述之方法，其中移動相線性梯度程序為：1)初始自以60%乙腈(ACN)及40%水(含0.2%乙酸)開始，經過60分鐘，至2)90%乙腈及10%水(含0.2%乙酸)；流速為0.8毫升/分鐘；偵側器紫外線波長係248奈米。
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