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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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1. Technisches Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Massenspektrometrie, die zur quantitativen Analyse und gleichzeitigen qualitativen Analyse von Spurenanteilen in Präparaten sowie zur Strukturanalyse von Probenionen verwendet werden.
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2. Beschreibung des Standes der Technik
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MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization = Matrix unterstützte Laserdesorption/-Ionisation) ist eine bestimmte Art einer Laserionisation. Dieses Verfahren verwendet eine Matrix (beispielsweise ein flüssiges, kristallines Gemisch oder ein Metallpulver), die bei der verwendeten Laserwellenlänge ein Absorptionsband aufweist. Eine Probe wird mit der Matrix vermischt und in dieser aufgelöst. Dann wird die Matrix auch auf einer Probenplattform festgehalten. Die Matrix wird mit Laserlicht beaufschlagt, um die Probe zu verdampfen oder zu ionisieren. Da es sich um ein Verfahren mit gepulster Ionisation unter Verwendung eines gepulsten Lasers handelt, ist MALDI kompatibel mit Flugzeitmassenspektrometern (TOFMS = time-of-flight mass spectrometers).
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In den letzten Jahren wurde ein matrixfreies lonisationsverfahren entwickelt, bei dem auf den Vorgang des Mischens einer Matrix mit einer Probe verzichtet werden kann. In vielen Fällen wird eine mikroskopische Struktur auf einer Probenplattform verwendet
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Andererseits handelt es sich bei einem TOFMS um ein Massenspektrometer zum Auffinden der Verhältnisse zwischen Masse und Ladung von Ionen mittels der Zeit, die die Ionen benötigen, den Detektor zu erreichen, nachdem ein vorbestimmter Betrag an Energie auf die Ionen aufgebracht wurde, um diese zu beschleunigen, so dass die Ionen fliegen. In einem TOFMS werden die Ionen mit einer konstanten gepulsten Spannung von V
a beschleunigt. Zu diesem Zeitpunkt ergibt sich aus dem Gesetz der Energieerhaltung die Geschwindigkeit v der Ionen zu
wobei m die Masse des jeweiligen Ions, q die elektrische Ladung des jeweiligen Ions und e die Elementarladung sind.
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Die Ionen erreichen einen Detektor nach einer Flugzeit T, wobei sich der Detektor an einer Position in einem vorgegebenen Abstand von L befindet.
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Aus Gleichung (3) ist ersichtlich, dass die Flugzeit T in Abhängigkeit von der Masse m der Ionen variiert. Ein TOFMS ist ein Gerät zur Trennung von Massen unter Verwendung dieses Prinzips. Ein Beispiel eines linearen TOFMS ist in 1 gezeigt. Weiterhin sind Reflektron-TOFMS-Geräte, in denen die Energiefokussierung verbessert und die Flugstrecke verlängert werden kann, indem zwischen die Ionenquelle und den Detektor ein Reflektronfeld angeordnet wird, weit verbreitet. Ein Beispiel eines Reflektron-TOFMS ist in 2 dargestellt.
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Bei TOFMS existieren zwei Verfahren zur Messung der Flugzeiten. Bei einem Verfahren werden die von einer Ionenquelle erzeugten Ionen direkt mit einer hohen gepulsten Spannung abgezogen und die Flugzeit wird gemessen. Dieses Verfahren ist als koaxiales TOFMS bekannt. Häufig wird dieses Verfahren in der Praxis mit einer gepulsten Ionenquelle kombiniert. Beim zweiten Verfahren werden die von einer Ionenquelle erzeugten Ionen mit einer kinetischen Energie von einigen 10 Elektronenvolt transportiert. Die Ionen werden mit einer hohen gepulsten Spannung in einer Richtung beschleunigt, die zu der Richtung (Achse) des Transports senkrecht steht. Unter diesen Bedingungen wird die Flugzeit gemessen. Dieses Verfahren ist als TOFMS mit orthogonaler Beschleunigung bekannt. Es wird häufig in der Praxis mit einer kontinuierlichen Ionenquelle kombiniert.
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Ein lonisationsverfahren unter Verwendung von Laserbestrahlung kann beide dieser TOFMS-Verfahren verwenden. Im Fall des koaxialen Aufbaus werden die Laserbestrahlung und die Messung der Flugzeit synchronisiert. Im Fall eines Aufbaus mit orthogonaler Beschleunigung werden die Laserbestrahlung und die Messung der Flugzeit nicht synchronisiert.
- Patentreferenz 1: JP-H7-178070 A
- Patentreferenz 2: JP 2005-134181 A .
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MALDI übertrifft andere derzeit in der Massenspektrometrie verwendete lonisationsverfahren durch seine Fähigkeit zur Ionisierung höchst unterschiedlicher Bestandteile. Jedoch wird beim Mischen und Auskristallisieren eines Matrixmaterials mit einer Probe häufig eine Verteilung von ungefähr 1 mm Durchmesser erzeugt. Oft ist die Probe in diesem Bereich lokal vorhanden. Die Ionisation wird durch Laserbestrahlung durchgeführt. Der Durchmesser des bestrahlenden Laserlichts beträgt 100 µm, was erheblich kleiner als der kristallisierte Bereich ist. Folglich besteht das Problem, dass die lonenintensität in Abhängigkeit von der Strahlposition auf der Probe aufgrund der Lokalisierung der Probe stark schwankt. Insbesondere zeigen sich, wie in 3 dargestellt, mehrere spektrale Peaks, wenn die spektrale Intensität auf der vertikalen Achse eines Diagramms (im Folgenden als zeitlicher Verlauf „time trace“ bezeichnet) und die Datenerfassungszeit auf der horizontalen Achse angetragen werden.
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Die
US 2005/0258357 A1 beschreibt dabei ein Massenanalyseverfahren zum Auffinden von Massenspektren, wobei eine Datenmatrix von dem Spektrometer erhalten wird, eine Rauschunterdrückung durchgeführt wird und sodann interessante Spektren identifiziert werden und sodann eine Reduktions-Transformation auf die Datenmatrix angewendet wird, um interessante Spektren aus der Datenmatrix zu erhalten.
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Die
DE 101 52 8021 A1 betrifft das Entfernen des elektronischen Rauschens aus solchen Massenspektren, die als Einzelspektren aufgenommen und zu einem Summenspektrum addiert werden. Dabei erfolgt die Entfernung des Rauschens in dem Einzelspektrum und nicht im Summenspektrum.
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In einem herkömmlichen Massenspektrometer werden hunderte oder tausende von Massenspektren gesammelt und summiert. Als Ergebnis erhält man ein summiertes Massenspektrum mit einem guten Signal-Rausch-Verhältnis. Da die Spektren während des Laserbestrahlungsvorgangs zufällig summiert werden, werden auch Massenspektren mit extrem niedrigen Signalintensitäten mit erfasst. Insgesamt gesehen kann sich dadurch das Signal-Rausch-Verhältnis verschlechtern.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Angesichts des vorstehenden Problems ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Massenanalyseverfahren zu schaffen, das ein lonisationsverfahren wie beispielsweise MALDI verwendet, um Spektren zu erfassen, deren Intensitäten über die Zeit gesehen nicht einheitlich sind, und das ein summiertes Massenspektrum mit einem guten Signal-Rausch Verhältnis liefert.
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Ein Massenanalyseverfahren gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung löst diese Aufgabe und ermittelt ein summiertes Massenspektrum, indem unter Verwendung eines Massenspektrometers mehrere Massenmessungen durchgeführt werden, die Massenspektren der Messungen gesammelt und die gesammelten Massenspektren summiert werden. Dieses Verfahren umfasst dazu die Schritte des Patentanspruchs 1. Die Unteransprüche richten sich auf bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens.
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Folglich kann ein Massenanalyseverfahren bereitgestellt werden, bei dem das Signal-Rausch-Verhältnis der Massenspektren sich nicht aufgrund des Summierens verschlechtert, falls ein lonisierungsverfahren wie z.B. MALDI verwendet wird, das spektrale Intensitäten erzeugt, die über die Zeit gesehen nicht einheitlich sind.
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Weitere Aufgaben und Merkmale der Erfindung werden aus der sich anschließenden Beschreibung derselben ersichtlich.
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Figurenliste
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Es zeigen:
- 1: ein schematisches Diagramm eines linearen Flugzeitmassenspektrometers aus dem Stand der Technik;
- 2: ein schematisches Diagramm eines Reflektron-Flugzeitmassenspektrometers aus dem Stand der Technik;
- 3: ein Diagramm, das den zeitlichen Verlauf spektraler Intensitäten von Massen zeigt, die mit einem MALDI-TOF-MS Verfahren nach dem Stand der Technik erhalten wurde;
- 4 ein Blockdiagramm eines TOF-MS, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird;
- 5: ein Diagramm, das ein Massenanalyseverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt;
- 6 ein Diagramm, das ein weiteres Massenanalyseverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt;
- 7 ein Diagramm, das ein weiteres Massenanalyseverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt;
- 8 ein Diagramm, das ein Beispiel einer grafischen Benutzeroberfläche zur Verwendung in einem Massenspektrometer gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt; und
- 9 ein Diagramm, das die Effekte der Drift von Massenpeaks darstellt.
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BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Im Folgenden werden Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die begleitenden Abbildungen beschrieben.
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4 zeigt ein in der vorliegenden Erfindung verwendetes Flugzeitmassenspektrometer (TOF-MS). Das Spektrometer weist eine über einen Vakuumbereich mit einem TOF-Massenanalysator 2 verbundene MALDIIonenquelle 1 auf. Mit dem Auslass des Massenanalysators 2 ist über einen Vakuumbereich ein Detektorsystem 3 verbunden. Die MALDI-Ionenquelle 1, der TOF-Massenanalysator 2 und das Detektorsystem 3 werden gemeinsam von einem Steuersystem 4, beispielsweise einem Computer, gesteuert. Die von dem Detektorsystem 3 gemessenen Massenspektren-Daten werden an eine Datenerfassungs- und Verarbeitungsvorrichtung 5 geschickt, in der die Daten verarbeitet und gespeichert werden. Die Vorrichtung 5 besteht aus einem Computer und einer Speichereinheit.
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Bei diesem Aufbau werden jeweils zehn der von der MALDI-Ionenquelle 1, dem TOF-Massenanalysator 2 und dem Detektorsystem 3 gemessenen Massenspektren summiert. Die summierten Massenspektren werden sukzessive als primäre summierte Massenspektren in der Speichereinheit innerhalb der Datenerfassungs- und Verarbeitungsvorrichtung 5 gespeichert.
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Zu diesem Zeitpunkt können zeitliche Veränderungen der spektralen Intensitäten der primären summierten Spektren als zeitlicher Verlauf auf einem Monitorgerät dargestellt werden. Bei den spektralen Intensitäten kann es sich um die Intensitäten der maximalen Peaks der gesammelten Massenspektren handeln. Alternativ kann es sich bei den spektralen Intensitäten um einen Wert handeln, der durch Summierung aller Signalintensitäten erhalten wird. Weiterhin kann es sich bei dem Massenbereich, innerhalb dessen die Intensität spezifiziert wird, um den gesamten spektralen Massenbereich oder einen bestimmten Bereich von Masse-Ladung-Verhältnissen handeln.
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Nach dem Beenden aller Laserbestrahlungsvorgänge und Messungen in der MALDI-Ionenquelle 1, werden lediglich diejenigen primären summierten Spektren aus den gespeicherten primären summierten Spektren ausgewählt, die ein Signal-Rausch-Verhältnis aufweisen, das einen vorgegebenen Wert überschreitet. Dann werden die ausgewählten primären summierten Spektren zum Erzeugen eines sekundären summierten Spektrums aufsummiert. Da dieser Vorgang des sekundären Summierens nach dem Ende der Messungen durchgeführt wird, können verschiedene Ansätze ausprobiert werden, um das beste Resultat zu erzielen.
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Das Verfahren der Auswahl primärer summierter Spektren zur Erzeugung eines sekundären summierten Spektrums kann die folgenden fünf Formen annehmen:
- 1. Wie in 5 dargestellt, wählt der Benutzer einen oder mehrere diskrete Zeitabschnitte aus, in denen bei einer Untersuchung des zeitlichen Verlaufs der primären summierten Spektren hohe spektrale Intensitäten beobachtet werden.
- 2. Der Benutzer setzt einen minimalen Grenzwert für die spektralen Intensitäten bei der Untersuchung des zeitlichen Verlaufs der primären summierten Spektren und wählt primäre summierte Spektren aus, die Intensitäten aufweisen, die den Grenzwert überschreiten, um Spektren mit Intensitäten unter dem minimalen Grenzwert auszuschließen.
- 3. Wie in 6 dargestellt, legt der Benutzer beim Untersuchen des zeitlichen Verlaufs der primären summierten Spektren einen maximalen Grenzwert sowie einen minimalen Grenzwert für die spektralen Intensitäten fest und wählt diejenigen primären summierten Spektren aus, die Intensitäten aufweisen, die zwischen dem maximalen Grenzwert und dem minimalen Grenzwert liegen. Der minimale Grenzwert wird dazu verwendet, Spektren mit niedrigen Intensitäten auszuschließen. Der maximale Grenzwert wird dazu verwendet, primäre summierte Spektren auszuschließen, deren Intensitäten den maximalen Grenzwert überschreiten.
- 1. Wie in 7 dargestellt, können die oben beschriebenen Formen 1 und 3 zur Form 4 kombiniert werden. Alternativ können die Formen 1 und 2 kombiniert werden.
- 2. Primäre summierte Spektren werden automatisch vom stärksten Spektrum ausgehend absteigend ausgewählt und summiert. Die Summierung wird derart durchgeführt, dass das sich ergebende sekundäre summierte Spektrum das beste Signal-Rausch-Verhältnis aufweist. Während dieses Schrittes wird das Signal-Rausch-Verhältnis des sekundären summierten Spektrums konstant überwacht. Der sekundäre Summierungsvorgang wird automatisch beendet, wenn sich das Signal-Rausch-Verhältnis nicht mehr verbessert.
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8 zeigt ein Beispiel einer grafischen Benutzeroberfläche, die es dem Benutzer ermöglicht, derartige Verfahrensformen auszuwählen und verschiedene Bedingungen einschließlich der Zeitabschnitte und Grenzwerte einzugeben. Ein Fenster 11 stellt einen zeitlichen Verlauf eines primären summierten Massenspektrums dar. Steuertasten ermöglichen es dem Benutzer, die auf der rechten Seite des Fensters dargestellten fünf Verfahrensarten anzuwählen.
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Wird die Taste „Verfahrensart 1“ betätigt, so wird in dem Fenster 11 eine vertikale Cursorlinie dargestellt. Durch ein Bewegen der Cursorlinie mit der Tastatur oder der Maus können ein oder mehrere disjunkte Zeitabschnitte festgelegt werden, in denen hohe spektrale Intensitäten beobachtet werden, während der zeitliche Verlauf der primären summierten Spektren untersucht werden kann. Nach dem Festlegen wird bei Betätigung der „Ausführtaste 12“ ein sekundärer Summierungsvorgang innerhalb des Zeitabschnittes bzw. der Zeitabschnitte durchgeführt. Dies ist die oben beschriebene Verfahrensart 1.
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Wird die „Verfahrensart 2“-Taste betätigt, so wird in dem Fenster 11 eine horizontale Cursorlinie dargestellt. Durch ein Bewegen der Cursorlinie mit der Tastatur oder der Maus kann ein minimaler Grenzwert für spektrale Intensitäten festgelegt werden, während der zeitliche Verlauf der primären zusammengefassten Spektren untersucht wird. Nach dem Festlegen wird bei Betätigung der Ausführtaste 12 ein sekundärer Zusammenfassungsvorgang in denjenigen Bereichen durchgeführt, deren Intensitäten den Grenzwert überschreiten. Dies ist die oben beschriebene Verfahrensart 2.
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Wird die Taste „Verfahrensart 3“ betätigt, so wird eine horizontale Cursorlinie in dem Fenster 11 dargestellt. Durch Bewegen der Cursorlinie mit der Tastatur oder der Maus können ein maximaler Grenzwert sowie ein minimaler Grenzwert für spektrale Intensitäten festgelegt werden, während der zeitliche Verlauf der primären zusammengefassten Spektren untersucht wird. Nach dem Festlegen wird bei Betätigung der Ausführtaste 12 innerhalb des durch die Grenzwerte festgelegten Bereichs ein sekundärer Zusammenfassungsvorgang durchgeführt. Dies ist die oben beschriebene Verfahrensart 3.
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Wird die „Verfahrensart 4“-Taste betätigt, so wird in dem Fenster 11 ein cursorgesteuerter Bereich dargestellt. Ein oder mehrere disjunkte Zeitabschnitte, in denen hohe spektrale Intensitäten beobachtet werden, sowie ein maximaler und minimaler Grenzwert für die spektralen Intensitäten können durch ein Auseinanderziehen oder Zusammenschieben des Bereichs mit der Tastatur oder der Maus gleichzeitig festgelegt werden, während der zeitliche Verlauf der primären zusammengefassten Spektren untersucht wird. Nach dem Festlegen wird bei Betätigung der Ausführtaste 12 innerhalb der Zeitabschnitte und innerhalb des von den Grenzwerten begrenzten Bereichs ein sekundärer Zusammenfassungsvorgang durchgeführt. Dies ist die oben beschriebene Verfahrensart 4.
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Veränderungen in dem Signal-Rausch-Verhältnis des sekundären summierten Spektrums in Form von Zahlen jederzeit dargestellt. Der sekundäre Summierungsvorgang wird automatisch beendet, wenn sich das Signal-Rausch-Verhältnis nicht mehr verbessert. Dies ist die oben beschriebene Verfahrensart 5. Falls zeitliche Veränderungen des Signal-Rausch-Verhältnisses während des sekundären Summierungsvorgangs grafisch dargestellt werden, können die Variationen in dem Signal-Rausch-Verhältnis auf einer Echtzeitbasis überwacht werden.
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Bei einem TOFMS kommt es aufgrund der Temperaturänderungen über die Zeit gesehen zu einer Drift bzgl. der Flugstrecke in der Flugröhre sowie bzgl. der Spannung der Energieversorgung. Folglich weichen die Werte der Masse-Ladung-Verhältnisse von Massenpeaks bei Messungen von Ionen mit demselben Masse-Ladung-Verhältnis oft voneinander ab.
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Wie in 9 dargestellt, wird das Signal-Rausch-Verhältnis durch ein summieren natürlich nicht verbessert, wenn die Massenpeaks driften. Weiterhin verbreitern sich die Massenpeaks, was zu einer Verschlechterung der Auflösung führt.
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Folglich kann ein Summierungsvorgang effektiver durchgeführt werden, wenn der Vorgang durchgeführt wird, nachdem zumindest ein als Referenz dienender Massenpeak jedes Spektrums ausgewählt wurde und die Masse-Ladung-Verhältnis-Achse derart korrigiert wird, dass der Wert des Masse-Ladung-Verhältnisses des ausgewählten Massenpeaks mit einem vorbestimmten Wert übereinstimmt. Falls die spezifizierten Massenpeaks alle von bekannten Substanzen stammen, handelt es sich bei dem vorgegebenen Wert um einen theoretischen Wert. Falls irgendeine nicht bekannte Substanz vorhanden sein sollte, so ist der vorgegebene Wert gleich dem Wert des Masse-Ladung-Verhältnisses in dem ersten erfassten Massenspektrum.
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Die vorliegende Erfindung kann auf einen weiten Bereich von Massenspektrometern angewendet werden.