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Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Polymyxin Das Hauptpatent
941012 betrifft ein Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Polymyxin unter Verwendung
von bei der Herstellung von Antibiotika bekannten Ionenaustauschern, dadurch gekennzeichnet,
daß man eine wäßrige Lösung von Polymyxin mit einem Ionenaustauscher, dessen Austauscheigenschaft
durch Anwesenheit von Carboxylgruppen bedingt ist, in Berührung bringt und dann
das adsorbierte Polymyxin mit der Lösung eines Elektrolyts auslaugt.
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Die Erfindung stellt eine weitere Ausbildung dieses Verfahrens dar
und ist dadurch gekennzeichnet, daß anschließend an das Verfahren des Hauptpatents
der so erhaltene Extrakt nacheinander oder gleichzeitig mit einem Anionenaustauscher,
dessen Austauschfähigkeit von (ler Gegenwart eines basischen, vorzugsweise mit ersetzbaren
Hydroxylgruppen verbundenen Stickstoffatoms abhängt, und mit einem Kationenaustauscher,
welcher ein vernetztes Kunstharz mit stark sauren Gruppen in der Form von freier
Säure ist, behandelt und das gereinigte Polymyxin isoliert wird.
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Für die Zwecke der Erfindung brauchbare Anionenaustauscher sind bekannte
Kunstharze wie modifizierte Formaldehyd-Phenolpolymerisate mit Amingruppen oder
Styrol enthaltende Polymerisate mit quaternären Ammoniumgruppen.
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Die Benutzung eines solchen Austauschers hat die Adsorption von in
der Lösung als Verunreinigungen anwesenden Anionen und damit deren Ersatz durch
Hydroxylionen zur Folge. Als weiteres Ergebnis kann der PH-Wert der Lösung sich
ändern. Daher können diese Stoffe auch zur Regelung des PH-Wertes der Lösung gebraucht
werden.
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Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht darin, daß man
den Kontakt zwischen dem Extrakt und dem Anionenaustauscher so lange aufrechterhält,
bis die vor sich gehenden Verdrängungsreaktionen bis zu einem vorher bestimmten
Grad im Wechsel des PH-Wertes, z. B. im Säurebereich und vorzugsweise zwischen 3
und 4, gediehen sind. Extrakt und Austauschmaterial können getrennt werden, sobald
dieser Wert erreicht ist.
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Ein weiterer Vorzug der Anwendung des AustauscheT-s besteht darin,
daß nur Hvdroxylionen in die Lösung gelangen, welche sich leicht als nicht ionisiertes
Wasser in einem späteren Reinigungsvorgang entfernen lassen, ohne daß weitere Schritte
zur Adsorption von Anionen zu unternehmen sind.
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Der Kationenaustauscher, mit welchem der Extrakt gemäß der Erfindung
ebenfalls in Berührung gebracht wird, ist ein solcher mit stark sauren Gruppen,
z. B. Sulfonsäuregruppen, die als freie Säuren vorliegen, wobei diese Austauschet
einen erheblichen Grad von Vernetzung innerhalb des Materials aufweisen. Solche
Austauschet sind Stvrolmischpolvmerisate, wobei die Substanz, mit der das Styrol
polymerisiert worden ist, aktive Gruppen besitzt, welche zur Vernetzung führen.
Solche Substanzen sind z. B. Divinylbenzol. Die Sulfongruppen sind an die Benzolkerne
gebunden.
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Derartige Austauscher haben die Eigenschaft, daß in Berührung mit
dem Extrakt eine selektive Adsorption vor sich geht, bei welcher das Polymyxinkation
sehr wenig adsorbiert wird, während aber wesentlich kleinere, als Verunreinigungen
anwesende Kationen in größerem Ausmaße adsorbiert werden. Wenn dieser Vorgang bis
zu dem gewünschten Grade fortgeschritten ist, trennt man die Lösung von dem Austauscher.
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Die Anwendung dieser Austauscher in saurer Form hat den Vorteil, daß
die aus der Lösung adsorbierten Kationen im wesentlichen durch Wasserstoffionen
ersetzt werden. Daher werden durch die gemeinschaftliche Anwendung der beiden Ionenaustauscher
sowohl Anion wie auch Kationen, welche als Verunreinigungen zugegen sind, im wesentlichen
aus der Lösung entfernt und durch Hydroxyl- bzw. Wasserstoffionen ersetzt, welche
als nicht ionisiertes Wasser entfernt werden, beispielsweise durch Konzentrieren
der Lösung oder durch Ausfällung, wobei das Polymyxin weitgehend unbeeinflußt bleibt.
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Es liegt auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, daß man die aus
dem Carboxylionenaustauscher ausgelaugte Lösung mit einer Mischung dieser beiden
Ionenaustauscher, z. B. in einem »gemischten Bett«, in
Berührung
bringt. Solche »gemischte Betten« der Austauscher enthalten 'die- verschiedenen
Kunstharze in zur Erzielung des gewünschten Resultates geeigneten Verhältnissen.
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DieAbtrennung des Polymyxins aus den gereinigten Lösungen nach der
Adsorption der Verunreinigungen in der oben beschriebenen Weise läßt sich nach irgendeiner
der bekannten Methoden durchführen, doch wird vorgezogen, den pH-Wert der Lösung,
wenn erforderlich, auf einen sauren Wert, z. B. zwischen etwa 3 und 4, wieder einzustellen.
Bei diesem Wert besitzt das Polymyxin eine angemessene Löslichkeit und gute Haltbarkeit.
Die Einstellung erfolgt zweckmäßig mit Hilfe des Anionenaustauschers.
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Die Lösung kann so-dann bis zu einem geeigneten Grade beispielsweise
auf 100 000 bis 300 000 Einheiten je cm3 unter vermindertem Druck eingeengt werden.
Hierauf gewinnt man das Polymyxin durch Fällung auf den Zusatz von Alkali, z. B.
einer Ammoniaklösung, bis der pH Wert alkalisch ist. Vorteilhafterweise erwärmt
man die konzentrierte Polymyxinlösung auf etwa 70°, ehe man die Fällung vornimmt,
weil dadurch die Fällung in einer sich leichter zu handhabenden Form anfällt.
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Das so gewonnene Polymyxin kann dann weiteren lfaßnahmen, wie Trocknen
über einem geeigneten Trocknungsmittel bei vermindertem Druck, unterworfen und nach
bekannten Methoden, z. B. durch Umkristallisieren, weiter gereinigt werden.
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Die Zeichnung zeigt in schematischer Weise die Ausführung der Erfindung
im Zusammenhang mit dem Verfahren des Hauptpatents. Sie stellt nur zwei Säulen (Kolonnen)
mit Carboxylionenaustauscher dar, doch läßt sich nach Wunsch eine beliebige Anzahl
von Säulen oder 11ischgefäßen benutzen. Weiterhin läßt sich das Ionenaustauschmaterial
in einfacher Weise derart anordnen, daß, wenn eine Einheit mit den zu adsorbierenden
Bestandteilen bis zur Sättigung beladen ist, diese ausgeschaltet und extrahiert
oder regeneriert werden kann, ohne daß die Fortdauer des Gebrauches der anderen
Einheiten dadurch verhindert wird.
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In der Zeichnung tritt die Polymyxin enthaltende Flüssigkeit durch
Ventil 6 ein, während Ventile 7, 8, 10, 11 und 20 geschlossen bleiben und Ventile
9 und 12 geöffnet werden. Die Flüssigkeit strömt daher durch die Carboxylionenaustauscher
enthaltenden Kolonnen 1 und 2. Wenn nötig, kann alkalische Lösung durch Ventil 13
eingeführt werden. Die bei 15 austretende Flüssigkeit kann dann durch weitere Kolonnen
mit dem gleichen Austauscher oder ins Freie geleitet werden. Häufige Proben werden
der das Ventil 9 passierenden Flüssigkeit entnommen, und es wird, wenn ihr Polymyxingehalt
anzeigt, daß in Kolonne 1 keine weitere Adsorption mehr stattfindet, der Zustrom
zum Ventil 6 durch Ventil 20 in die Kolonne 2 geleitet, welcher gegebenenfalls Alkali
durch Ventil 21 zugeführt wird. Ventile 6, 9 und 13 sind geschlossen, wodurch die
Kolonne 1 von dem Zustrom der Brühe abgetrennt wird. Ventile 7, 8 und 16 werden
geöffnet, wodurch Gefäß 3, welches den extrahierenden Elektrolyt, zweckmäßig verdünnte
Schwefelsäure, enthält, mit Kolonne 1 verbunden wird. Der Elektrolyt geht durch
die Kolonne und fließt durch Gefäß 3, gegebenenfalls unter Zugabe von Schwefelsäurelösung,
vermittels Ventil 14, bis der gewünschte, im wesentlichen konstante pH-Wert erreicht
ist. Zweckmäßig wäscht man die Kolonne 1 mit deionisiertem Wasser aus, ehe man sie
extrahiert. Die in der extrahierten Kolonne 1 zurückbleibende Flüssigkeit wird ausgeblasen
oder auslaufen gelassen und mit der Flüssigkeit im Gefäß 3 vereinigt. Ventil 16
wird dann geschlossen und der Inhalt des Gefäßes 3 durch Ventil 17 dem Gefäß 4 zugeführt,
in dem der pH-Wert durch Zusatz des Anionenaustauschers auf den erforderlichen Wert
eingestellt wird. Sodann wird Ventil 19 geöffnet und die Lösung der Kolonne 5, welche
den Kationenaustauscher enthält, zu und durch achtzehn weiteren Kolonnen mit solchem
Austauscher oder, wenn gewünscht, anderen Reinigungsstufen zugeleitet. Kolonne 5
wird durch eine ähnliche Kolonne ersetzt, wenn sie mit adsorbierten Verunreinigungen
gesättigt ist, und nach Bedarf regeneriert.
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Die folgenden Beispiele sollen zur Erläuterung des erfindungsgemäßen
Verfahrens dienen: Beispiel 1 und 3 beschreiben die Abtrennung und Reinigung von
Polymyxin nach dem vorliegenden Verfahren.
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Beispiel 2 zeigt den Reinigungsgrad in einem einzelnen Versuch auf
der Basis des Gesamtgehalts an Festem und den Gehalt von mit Schwefelsäure veraschtem
Material.
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Beispiel 4 zeigt einen Vergleich des Adsorptionsausmaßes von Polymyxin
unt°r Verwendung a) eines Carboxylionenaustauschers, im wesentlichen in Gestalt
seines Ammoniumsalzes, und b) eines Carboxylionenaustauschers in Gestalt seiner
freien Säure unter Zugabe von Ammoniak während der Adsorption. Beispiel 1 Unfiltrierte
Polymyxin enthaltende Brühe mit einem analysierten Gehalt von 6244 Einheiten je
cm3 wurde von unten nach oben durch eine einen Kationenaustauscher in Form seines
Ammoniumsalzes mit einem pH-Wert von 7,5 enthaltende Kolonne geleitet. Die austretende
Brühe wurde mit der gleichen Strömungsgeschwindigkeit abermals durch die Kolonne
geleitet und dann fortlaufen gelassen. Die Säule und ihr Inhalt wurde dann mit deionisiertem
Wasser gewaschen und der Ionenaustauscher ausgelaugt, indem man verdünnte Schwefelsäure
durch die Kolonne leitete, bis der pH Wert des Extraktes auf einen Wert von ungefähr
1 zurückgegangen war und praktisch bei diesem Wert stehenblieb.
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Der Extrakt wurde sodann ansatzweise mit dem Anionenaustauscher in
Hydroxylform in Berührung gebracht, bis der PH-Wert ungefähr 3,7 betrug. Der Extrakt
wurde darauf filtriert und dann zwei Kationenaustauscher in der Säureform und mit
einem PH 3,7 enthaltende Kolonnen in Aufwärtsrichtung durchfließen gelassen.
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Der p$ Wert der ausströmenden Flüssigkeit wurde dann durch weitere
Berührung mit dem Anionenaustauscher in der Hydroxylform auf einen Wert von 3,6
eingestellt. Die Flüssigkeit wurde darauf filtriert und das Filtrat auf etwa ein
Zehntel seines Volumens in einem Kletterfilmv erdampfer bei 30 bis 50° eingeengt.
Ein Teil des Konzentrats wurde weiter in ähnlicher Weise auf die Hälfte des Volumens
eingedampft, auf 70° erwärmt und unter Umrühren tropfenweise mit Ammoniaklösung
(spezifisches Gewicht: 0,880) versetzt, bis ein pH Wert von mehr als 10 mit einem
Thymolphthaleinindikator erreicht war.
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Das ausgefällte Polymyxin wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen
und unter vermindertem Druck bei 40° getrocknet.
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Beispiel 2 100 cm3 einer Lösung, welche durch Einstellung des pH-Wertes
mittels Anionenaustauscher in einem
Extrakt erhalten worden war,
wurden durch eine 17 cm hohe und 15,6 mm weite Kolonne, welche mit Kationenaustauscher
in Säureform mit einem PH-Wert von 3,5 beladen war, mit einer Strömungsgeschwindigkeit
von 20 em3 in der Minute hinabgeführt. Die Kolonne wurde dann zweimal mit 10 cm3
Wasser gewaschen und trocken geblasen. Die ausfließende Lösung wurde abermals mit
dem Anionenaustauscher in der Hydroxylform (pH-Wert 8,0) in Berührung gebracht,
bis ein pH-Wert von 3,7 in der Flüssigkeit erhalten worden war.
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Bestimmung der festen Substanz und des mit Schwefelsäure behandelten
Aschengehaltes wurde vor und nach der Behandlung mit dem Austauscher durchgeführt
und zeigte folgende Resultate: Ausgangslösung Gesamtfestsubstanz . . . . . . . .
. . . . . . . . 40,88 mg/cm3 Schwefelsäure behandelte Asche .... 9,9 mg/cms
Ausfluß aus der Kationenaustauscher-Kolonne (nach pH-Einstellung) Gesamtfestsubstanz
. . . . . . . . . . . . . . . . 15,78 mg/cm3 Schwefelsäure behandelte Asche
.... 4,6 mg/cm3 Die Ausgangslösung hatte ein Wirkungsvermögen von 1123 Einheiten/mg
der Festsubstanz, die Lösung nach der Behandlung eine solche von 2163 Einheiten/mg
der Festsubstanz. Beispiel 3 Es wurde ein Volumen der Fermentationsbrühe von Bacillus
Polymyxa mit der Hälfte seines Volumens Wasser verdünnt und zur Entfernung von größeren
Partikeln abgesiebt. Die anfallende, Bakterienzellen enthaltende Flüssigkeit wurde
von unten nach oben durch zwei hintereinandergeschaltete, mit Kationenaustauscher
gefüllte Säulen geleitet, wobei der Austause,her in Säureform vorlag und einen PH-Wert
von 3,5 besaß. Wäßrige Ammoniaklösung (2,5 Gewichtsprozent) wurde jeder Säule in
einem Ausmaße zugeführt, die erforderlich war, um das PH der ausströmenden Flüssigkeit
bei 6 bis 7 zu erhalten. Die ausgezogene Brühe wurde wiederholt unter ähnlichen
Bedingungen durch die Kolonnen geleitet und dann fortlaufen gelassen. Die Kolonnen
wurden darauf mit deionisiertem Wasser gewaschen und getrennt mit Schwefelsäure
bis zu einem pH-Wert von 0,8 ausgezogen. Die Auszüge wurden voneinander getrennt
aufbewahrt. Die Säulen wurden abermals getrennt ausgezogen und die Auszüge aufbewahrt.
Die Auszüge wurden einzeln mit dem Anionenaustauscher in der Hydroxylform mit einem
PH-Wert von 8,5 neutralisiert, bis die Auszüge einen pH Wert zwischen 3 und 4 aufwiesen.
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Die beiden Auszüge von der ersten Kolonne wurden dann getrennt durch
Überleiten über den Kationenaustauscher in Gestalt der freien Säure und mit einem
pH-Wert von 3,5 demineralisiert und der PH-Wert mit dem Anionenaustauscher auf einen
PH-Wert von 3 bis 4 eingestellt. Die demineralisierten Auszüge mit einem PH-Wert
von 3 bis 4 wurden getrennt bei 35° unter vermindertem Druck eingeengt und dann
mit Ammoniaklösung (spezifisches Gewicht 0,880) zur Fällung des Polymyxins als freie
Base behandelt. Die Fällungen wurden abgesondert, mit Wasser gewaschen und unter
vermindertem Druck getrocknet.
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Polymyxingehaltsbestimmungen wurden von den verschiedenen Stufen,
wie angegeben, ausgeführt und die Ergebnisse in der folgenden Tabelle niedergelegt.
Die Zahlen beziehen sich auf Mega-Einheiten von Polymyxin.
| Gesamtpolymyxin Gesamtpolymyxin, Gesamtpolymyxin, Polymyxin,
extrahiert |
| adsorbiert durch extrahiert aus aus erster IRC 50-Kolonne |
| in der Brühe beide IRC 50-Säulen beiden Säulen |
| 1. Auszug I 2. Auszug |
| 10927 |
| 7942 |
| 6665 3615 1216 |
| Neutralisiert Demineralisiert erneut neutralisiert |
| Anionenaustauscher |
| Kationenaustauscher Anionenaustauscher |
| Erster Auszug ....... 3042 3063 3068 |
| Zweiter Auszug ..... 1111 1024 1129 |
Wirkungsgrad der endgültig erhaltenen Polymyxinbase Erste Kolonne, erster Auszug
... 5838 Einheiten/mg Erste Kolonne, zweiter Auszug .. 5387 Einheiten/mg
Beispiel 4 a) 100 cm3, (feuchtes Volumen) eines Kationenaustauschers in Form der
freien Säure mit einem p11-Wert von 3,5 wurden mit Ammoniaklösung behandelt, bis
der pH Wert auf 7,4 gestiegen war und dort verblieb. Dieser Ionenaustauscher, der
praktisch in Form seines Ammoniaksalzes vorlag, wurde in die Kolonne 1 gefüllt.
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b) Eine zweite Säule wurde mit 100 cm3 (feuchtes Volumen) des gleichen
Kationenaustauschers in Form der freien Säure mit einem PH-Wert von 3,5 gefüllt.
Unfiltrierbare Brühe, die Polymyxin enthielt, wurde von oben nach unten mit genau
gleichen Strömungsgeschwindigkeiten von 170 cms in der Minute durch die Kolonne
geleitet. Jede Kolonne wurde gerührt. Verdünnte Ammoniaklösung wurde während des
Durchgangs der Brühe der Kolonne 2 zugegeben, um den PH-Wert der ausströmenden Flüssigkeit
zwischen 6 und 7 zu halten. Gleiche Raumteile der Brühe wurden durch jede Kolonne
geleitet. Der Gehalt der Brühe wurde in jedem Falle vor dem Passieren über den Ionenaustauscher
und auf ähnliche Weise hinterher bestimmt, und es wurden die folgenden Resultate
erhalten
| Kolonne 1 Kolonne 2 |
| pH-Wert des Austauschers . . 7,5 3,5 (Ammonial |
| zugefügt) |
| Gesamtpolymyxin adsorbiert 30,9 53 |
| Prozent Polymyxin |
| adsorbiert in gleicher Zeit 24°/0 41o/0 |