DE102019109646A1

DE102019109646A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Reinigung von Blut

Info

Publication number: DE102019109646A1
Application number: DE102019109646.4A
Authority: DE
Inventors: Peter Mandry
Original assignee: B Braun Avitum AG
Current assignee: B Braun Avitum AG
Priority date: 2019-04-11
Filing date: 2019-04-11
Publication date: 2020-10-15
Also published as: EP3952945A1; WO2020207992A1; US20220347366A1; CN113874055A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Blut mit den Schritten: Trennen des Blutplasmas von den Blutzellen, Einstellen des pH-Werts des Blutplasmas auf einen einem isoelektrischen Punkt mindestens eines vorbestimmten Proteins nahekommenden pH-Wert, Behandeln des Blutplasmas mittels Ionenaustauschchromatographie, Neutralisieren des pH-Werts des Blutplasmas, Zusammenführen des Blutplasmas und der Blutzellen und eine Vorrichtung zur Ausführung eines derartigen Verfahrens.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Blut, insbesondere zur Entfernung von Endotoxinen aus dem Blutplasma, sowie eine Vorrichtung zur Ausführung eines derartigen Verfahrens. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung eines Diethylaminoethyl (DEAE)-Anionenaustauschers, insbesondere eines DEAE-Anionenaustauschers mit Tentakeltechnologie, zur Reinigung von Blutplasma.
Technischer Hintergrund
In Deutschland erkranken nach Berechnungen des Kompetenznetzes Sepsis jedes Jahr etwa 154.000 Menschen an einer Sepsis oder Blutvergiftung. Davon sterben ca. 56.000 an den Folgen der Erkrankung. Das sind etwa 154 Todesopfer pro Tag, ähnlich viele wie bei Herzinfarkten mit Todesfolge und mehr Opfer als bei der Todesursache Lungenkrebs. Die Sepsis steht damit an dritter Stelle der Todesursachen in Deutschland.
Für Europa gibt das Kompetenznetz Sepsis folgende Zahlen an: jährlich 550.000 Erkrankungen, 146.000 Todesfälle, Sterberate 26,5 %. Auch global betrachtet ist gemäß den Daten des Kompetenznetzes Sepsis die Sepsis eine häufige Todesursache: jährlich treten ca. 1.500.000 Erkrankungen auf, welche zu 500.000 Todesfällen führen, was einer Sterberate von 33,3 % entspricht.
Nach Angaben der Deutschen Sepsis-Hilfe sterben weltweit somit mehr als 1400 Menschen pro Tag an einer schweren Sepsis. Auch in den USA hat sich die Inzidenz der Sepsis im Verlauf von Jahrzehnten auf etwa 3 pro 1000 Einwohner und Jahr gesteigert.
Eine Ursache für den schweren Verlauf der Sepsis und somit für eine erhöhte Mortalität sind beispielsweise nach einer Antibiotikatherapie im Blut eines Patienten zirkulierende Bakterienbestandteile, wie beispielsweise Endotoxine wie Lipoteichonsäue (Lipoteichoic Acid (LTA)), Lipopolysaccharide (LPS), Viren, Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA).
Eine Entfernung dieser Partikel bzw. Endotoxine aus dem Blut eines Patienten, beispielsweise mittels geeigneter Adsorbertechnologie, könnte einen weniger schweren Verlauf der Sepsis zur Folge haben und somit die mit der Sepsis assoziierte Mortalität senken.
Als Verfahren zur Entfernung von pathogenen Substanzen wie Endotoxinen, Viren, Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA) aus dem Blut eines Patienten ist aus dem Stand der Technik die Ionenaustauschchromatographie mittels Ionenaustauschern bzw. lonenadsorbern bekannt. Hierbei werden vor Allem Anionenaustauscher bzw. Anionenadsorber im Rahmen der Anionenaustauschchromatographie eingesetzt.
Unglücklicherweise entfernen diese Anionenaustauscher neben den pathogenen Substanzen wie Endotoxinen, Viren, Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA) auch lebensnotwendige Blutbestandteile, wie beispielsweise Gerinnungsfaktoren, aus dem Blut des Patienten.
Zudem kommt erschwerend hinzu, dass Gerinnungsfaktoren nicht zu den Akutphasenproteinen gehören und somit zum Teil nur langsam nachgebildet werden, weswegen die ungewollte Entfernung dieser Proteine besonders schwerwiegende und langanhaltende Folgen für die Patientensicherheit mit sich bringt.
Es besteht somit bei der Verwendung der Ionenaustauschchromatographie, insbesondere der Anionenaustauschchromatographie, zur Blutreinigung aufgrund der unerwünschten Entfernung lebensnotwendiger Blutgerinnungsfaktoren die Gefahr innerer und äußerer Blutungen des Patienten, die zum Tode des Patienten führen können.
Stand der Technik
Ein aus dem Stand der Technik bekanntes Blutreinigungsverfahren ist die H.E.L.P.-Apherese (Heparin-induzierte Extrakorporale LDL-Präzipitation).
Bei diesem extrakorporalen Blutreinigungsverfahren erfolgt nach der Blutentnahme zunächst eine Plasmaseparation. Aus dem gewonnenen Plasma wird durch Zusatz von Acetatpuffer zur Ansäuerung und von Heparin LDL(low density lipoprotein)-Cholesterin, Fibrinogen und Lipoprotein(a) ausgefällt.
Anschließend wird das Präzipitat mit einem speziellen Filter und überschüssiges Heparin durch Adsorption aus dem behandelten Plasma entfernt. Abschließend wird eine Bikarbonatdialyse durchgeführt, um das Plasma wieder auf das anfängliche Volumen und einen physiologischen pH-Wert einzustellen. Das gereinigte Plasma wird mit den Blutzellen vereinigt und dem Patienten zurückgegeben.
Die H.E.L.P. Apherese wird vor Allem zur Behandlung schwerer, ansonsten therapierefraktärer Fettstoffwechselstörungen und rheologisch bedingter Erkrankungen, wie dem Hörsturz, eingesetzt.
Weiterhin ist aus dem Stand der Technik ein Verfahren zur Unterstützung der Leberfunktion bekannt, bei dem der pH-Wert des Blutplasmas zur Verringerung der Bindungsstärke von proteingebundenen Molekülen an Albumin erhöht und gesenkt wird. Durch die Veränderung des pH-Werts des Blutplasmas verändert sich die Struktur bzw. Konfiguration des Albumins, wodurch die gebundenen Moleküle weniger stark gebunden werden, leichter in Lösung gehen und somit leichter mittels der Dialyse entfernt werden können.
Anionenaustauscher (auch basische Ionentauscher) sind Ionenaustauscher, bei denen eine kationische Gruppe (Kation) kovalent an eine feste unlösliche Matrix gebunden ist, während das neutralisierende Anion (neutral) nur ionisch gebunden und daher durch andere Anionen austauschbar ist. Die Chromatographie an Anionenaustauschern (Anionen-Austauschchromatographie) ist ein wichtiges Hilfsmittel zur Analyse und Bindung von Proteinen und Nucleinsäuren bzw. von deren Komponenten, den Peptiden, Aminosäuren, Oligonukleotiden und Mononukleotiden.
Beispiele von Anionenaustauschern sind Aminoethyl-, Diethylaminoethyl-(DEAE), quarternäre Aminoethyl- (QAE-) und quarternäre Ammoniumgruppen, gekoppelt an Cellulose, Agarose (Agar), Dextran (Dextrane) oder Polystyrol. Häufig verwendet wird DEAE-Cellulose.
Von den bekannten Anionenaustauschern haben insbesondere Diethylaminoethyl-(DEAE)-Ionenaustauscher mit Tentakeltechnologie eine sehr hohe Bindungskapazität und Bindungsstärke und sind somit auch bei komplexen Lösungen wie humanem Plasma besonders effektiv in der Entfernung von Pathogenen und Endotoxinen. DEAE-Ionenaustauscher gehören zu den effektivsten bekannten Endotoxin- und Virenbindern und werden dazu mit sehr großem Erfolg in der Technik, insbesondere in der Biotechnologie, im Chemieingenieurwesen und der Prozesstechnik eingesetzt.
Bei der Tentakeltechnologie kommen besondere Gele bei der Chromatographie zum Einsatz, welche fadenartige Strukturen, die so genannten Tentakel, aufweisen. Diese Tentakel tragen über ihre ganze Länge Ladungen und können so die zu trennenden Stoffe, z.B. Proteine, je nach ihrer Ladung viel besser Festhalten bzw. Binden als normale Gele, welche eine geringere Oberfläche aufweisen.
DEAE- Ionenaustauscher (auch als DEAE-Adsorber bezeichnet) entfernen neben pathogenen Stoffen, wie Lipoteichonsäure (Lipoteichoic Acid (LTA)) und Lipopolysacchariden (LPS), Viren etc., aber auch sehr effektiv wichtige Stoffe bzw. Faktoren des Blutgerinnungssystems aus dem Blut. Damit wird das System der Blutgerinnung ausgeschaltet und der Patient kann verbluten.
Beispielsweise wurden in einem in-vitro Versuchsaufbau DEAE-Adsorber mit Blutplasma durchströmt und die Adsorption von Gerinnungsfaktoren bestimmt. Die Faktoren II, IX und X der Blutgerinnungskaskade wurden vom DEAE-Adsorber adsorbiert und in großem Ausmaß aus dem Blut entfernt. Die Entfernung von Gerinnungsfaktoren durch Ionenaustauscher in den in-vitro Versuchen wurde zudem in einem klinischen Test mit gesunden Probenden bestätigt. Der globale Gerinnungsstatus sank nach der Behandlung mit dem DEAE Ionenaustauscher auf ein gefährlich niedriges Maß.
Aufgrund dieser unerwünschten Adsorption wichtiger Gerinnungsfaktoren ist eine klinische Anwendung der DEAE-Ionenaustauscher momentan nicht möglich.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die aus dem Stand der Technik bekannten Probleme abzumildern oder zu beheben. Insbesondere liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein klinisch anwendbares Verfahren und eine Vorrichtung zur effektiven Blutreinigung bei gleichzeitig hoher Patientensicherheit bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß Anspruch 1 und die Vorrichtung gemäß Anspruch 9 gelöst. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines DEAE-Anionenaustauschers gemäß Anspruch 12.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Blut, insbesondere von Blutplasma, mit den Schritten:

- Trennen des Blutplasmas von den Blutzellen,
- Einstellen des pH-Werts des Blutplasmas auf einen einem isoelektrischen Punkt eines vorbestimmten Proteins nahekommenden pH-Wert,
- Behandlung des Blutplasmas mittels Ionenaustauschchromatographie,
- Neutralisierung des pH-Werts des Blutplasmas,
- Zusammenführen des Blutplasmas und der Blutzellen.

Der Kerngedanke der Erfindung liegt hierbei darin, dass mittels der Einstellung des pH-Werts die Ladung von Proteinen, wie z.B. von Gerinnungsfaktoren, selektiv und bewusst verändert und eingestellt wird. Die Adsorption an den Ionenaustauscher und somit die Entfernung der Proteine, wie z.B. der Gerinnungsfaktoren, aus dem Blut ist abhängig von der Ladung der Proteine / Moleküle.
Vorzugsweise ist das vorbestimmte Protein ein Gerinnungsfaktor, beispielsweise Faktor I, Faktor II, Faktor IV, Faktor V, Faktor VI, Faktor VII, Faktor Vlla, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X, Faktor XI oder Faktor XII. Vorzugsweise wird das Verfahren zur Reinigung von Blut im Rahmen einer extrakorporalen Blutbehandlung ausgeführt bzw. angewandt.
Gerinnungsfaktoren sind amphotere Proteine, d.h. Proteine, welche sowohl positive als auch negative Ladungen aufweisen. Welche Ladung überwiegt, hängt vom pH-Wert der Lösung ab, in der sich das Protein / Molekül befindet. Der isoelektrische Punkt (IEP oder pl) bezeichnet den pH-Wert, bei dem die Zahl der positiven und negativen Ladungen eines amphoteren Protein/ Moleküls im statistischen Mittel genau gleich ist und das gesamte Protein/ Molekül somit elektrisch neutral ist.
Nach dem Auftrennen des Bluts in Blutplasma und Blutzellen hat das Blutplasma zunächst einen physiologischen pH von ca. 7,4. Bei einem physiologischen pH-Wert von ca. 7,4 haben die meisten Gerinnungsfaktoren eine negative Ladung. Wird der pH-Wert des Plasmas in Richtung geringerer pH-Werte (d.h. in den sauren Bereich) verschoben, wird die negative Ladung der Gerinnungsfaktoren geringer. Erreicht der pH-Wert des Blutplasmas den isoelektrischen Punkt eines bestimmten Proteins / Moleküls, wie z.B. eines Gerinnungsfaktors, ist die Ladung dieses bestimmten Proteins / Moleküls neutral und das Protein / Molekül bzw. der Gerinnungsfaktor wird nicht mehr vom Ionenaustauscher adsorbiert und nicht mehr aus dem Blutplasma entfernt.
Im Gegensatz zu Proteinen wie Gerinnungsfaktoren sind die bei der Sepsis eine kausale Rolle spielenden Endotoxine überwiegend nicht-amphoter. Nicht-amphotere Moleküle, wie LPS, LTA, andere Endotoxine und Viren verändern ihre Ladung generell nicht in Abhängigkeit vom pH-Wert der Lösung, in der sich die Endotoxine befinden. Sie werden deshalb weitgehend unabhängig vom pH-Wert der umgebenden Lösung vom Ionenaustauscher adsorbiert.
Der Kerngedanke der Erfindung, die Ladung mindestens eines vorbestimmten Proteins durch eine Einstellung des pH-Werts der dieses Protein umgebenden Lösung auf den dem isoelektrischen Punkt des vorbestimmten Proteins entsprechenden pH-Wert neutral einzustellen, ist auf jegliches Chromatographieverfahren anwendbar, welches auf der Interaktion elektrisch geladener Komponenten (wie z.B. Ionen) beruht.
Das elektrisch neutrale vorbestimmte Protein wird, wenn der pH-Wert der das vorbestimmte Protein umgebenden Lösung dem isoelektrischen Punkt des vorbestimmten Proteins entspricht, mittels des Chromatographieverfahrens (z.B. der Ionenaustauschchromatographie), welches auf der Interaktion elektrisch geladener Komponenten (wie z.B. Ionen) beruht, nicht adsorbiert bzw. zurückgehalten, während andere unerwünschte Blutplasmabestandteile wie z.B. Endotoxine, deren elektrische Ladung nicht neutral, sondern überwiegend positiv oder überwiegend negativ ist, mittels des Chromatographieverfahrens zurückgehalten und effektiv aus dem Blutplasma entfernt werden.
Es hat sich hierbei gezeigt, dass es reicht, den pH-Wert des Blutplasmas in die Nähe des isoelektrischen Punktes eines vorbestimmten Proteins zu verschieben, um eine ungewollte Adsorption dieses Proteins an den Ionenaustauscher und somit eine ungewollte Entfernung dieses Proteins aus dem Blutplasma zu unterbinden. In anderen Worten ist es nicht erforderlich, dass der pH-Wert des Blutplasmas dem isoelektrischen Punkt eines vorbestimmten Proteins genau entspricht, vielmehr reicht es aus, wenn der pH-Wert des Blutplasmas dem isoelektrischen Punkt eines vorbestimmten Proteins nahe kommt bzw. näherungsweise entspricht.
Vorzugsweise entspricht der pH-Wert, auf den der pH-Wert des Blutplasmas eingestellt wird, dem isoelektrischen Punkt des vorbestimmten Proteins bis auf +1,5/+0,0 pH-Punkt, vorzugsweise bis auf +1,5/+0,5 pH-Punkt, insbesondere bis auf +1,5/+0,75 pH-Punkt, besonders bevorzugt bis auf +1,5/+1,0 pH-Punkt. Beispielsweise kann der isoelektrische Punkt bei pH=5,5 liegen und der pH-Wert des Blutplasmas wird auf pH=5,5-pH=7,0 (pH= 5,5 +1,5/+0,0 pH-Punkt), vorzugsweise auf pH=6,0-pH=7,0 (pH= 5,5 +1,5/+0,5 pH-Punkt), insbesondere auf pH=6,25-pH=7,0 (pH=5,5 +1,5/+0,75 pH-Punkt), besonders bevorzugt auf pH= 6,5-pH=7,0 (pH=5,5 +1,5/+1,0 pH-Punkt) eingestellt.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung kann der pH-Wert des Blutplasmas auch auf einen pH-Wert eingestellt werden, welcher niedriger als der isoelektrische Punkt des vorbestimmten Proteins ist. Beispielsweise kann der isoelektrische Punkt bei pH=5,5 liegen und der pH-Wert des Blutplasmas wird auf einen beliebigen pH-Wert eingestellt, welcher niedriger als pH=5,5 ist. Beispielsweis kann vorgesehen sein, dass der pH-Wert des Blutplasmas auf einen pH-Wert eingestellt wird, welcher niedriger als pH=5,5. Insbesondere ist ein Wert zwischen pH=5,5 und pH=5,0 bevorzugt.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist das vorbestimmte Protein ein Gerinnungsfaktor, insbesondere Faktor II, und / oder der pH-Wert des Blutplasmas wird auf einen pH-Wert eingestellt, welcher niedriger als der isoelektrische Punkt des Gerinnungsfaktors ist.
Die Einstellung des pH-Werts des Blutplasmas kann mittels einer direkten oder indirekten Zuführung von Protonen (H⁺) zu dem Blutplasma beispielsweise in Form einer sauren Lösung oder auch als Feststoff und / oder mittels einer Dialyse des Blutplasmas mit einem sauren Puffer, insbesondere einem Acetatpuffer, erfolgen. Alternativ oder zusätzlich können dem Blutplasma auch Hydroxid-Ionen (OH^-) entzogen werden.
Die Neutralisierung des pH-Werts des Blutplasmas kann mittels einer direkten oder indirekten Zuführung von Hydroxid-Ionen (OH^-) zu dem Blutplasma und / oder mittels einer Dialyse des Blutplasmas mit einem basischen Puffer, insbesondere einem Bikarbonatpuffer, erfolgen. Eine Dialyse des Blutplasmas mit einem basischen Puffer, insbesondere einem Bikarbonatpuffer, hat den Vorteil, dass überschüssige Flüssigkeit aus dem Blutplasma entfernt werden kann. Alternativ oder zusätzlich können dem Blutplasma auch Protonen (H⁺) entzogen werden.
Als neutral bzw. neutralisiert ist ein pH-Wert von pH=7,4 anzusehen, oder ein pH-Wert, welcher nur unwesentlich von pH=7,4 abweicht. Insbesondere ist ein pH-Wert zwischen pH=7,2 und pH=7,6 als neutral bzw. neutralisiert zu verstehen.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung erfolgt die Behandlung des Blutplasmas mittels Anionenaustauschchromatographie, vorzugsweise unter Verwendung eines DEAE-Anionenaustauschers, insbesondere eines DEAE-Anionenaustauschers mit Tentakeltechnologie.
Grundsätzlich ist die vorliegende Erfindung jedoch nicht auf die Anionenaustauschchromatographie beschränkt, sondern umfasst auch andere Arten der Ionenaustauschchromatographie, wie beispielsweise die Kationenaustauschchromatographie oder auch verschiedene Multimodal-Chromatographien, welche vorzugsweise Ionenaustauschchromatographie umfassen.
Grundsätzlich wäre es auch denkbar, ein erfindungsgemäßes Verfahren mit Kationenaustauschchromatographie auszuführen. Kationenaustauscher sind Ionenaustauscher, bei denen eine anionische Gruppe (Anion) kovalent an eine feste unlösliche Matrix gebunden ist, während das neutralisierende Kation (neutral) nur ionisch gebunden und daher durch andere Kationen austauschbar ist.
Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren kann auch eine Anzahl oder eine Mehrzahl von vorbestimmten Proteinen (beispielsweise mehrere Gerinnungsfaktoren) berücksichtigt werden. Hierbei können die verschiedenen vorbestimmten Proteine der Mehrzahl an Proteinen jeweils unterschiedliche isoelektrische Punkte aufweisen.
Bei der Einstellung des pH-Werts des Blutplasmas vor der Ionenaustauschchromatographie werden in diesem Fall die isoelektrischen Punkte aller Proteine der Mehrzahl an Proteinen berücksichtigt. Allgemein gesagt, wird der pH-Wert des Blutplasmas auf einen pH-Wert eingestellt, bei dem alle Proteine der Mehrzahl an vorbestimmten Proteinen eine gewünschte Ladung (positiv, neutral, negativ) aufweisen.
Beispielsweise kann der pH-Wert des Blutplasmas auf einen Mittelwert der den isoelektrischen Punkten der Proteine der Mehrzahl an vorbestimmten Proteinen entsprechenden pH-Werte eingestellt werden. Alternativ kann der pH-Wert des Blutplasmas auch auf den niedrigsten oder den höchsten der den isoelektrischen Punkten der Proteine der Mehrzahl an vorbestimmten Proteinen entsprechenden pH-Werte eingestellt werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Programmprodukt, welches beim Auslesen durch eine Vorrichtung bewirkt, dass eine Vorrichtung ein erfindungsgemäßes Verfahren ausführt. Mittels eines derartigen Programmprodukts können bestehende Vorrichtungen zur Ausführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens nachgerüstet werden.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft eine Blutbehandlungsmaschine, insbesondere eine Apheresemaschine, welche dazu ausgelegt bzw. dazu konfiguriert ist, ein erfindungsgemäßes Verfahren auszuführen.
Eine derartige Blutbehandlungsmaschine weist beispielsweise auf:

- einen Plasmafilter zum Trennen von Blut in Blutplasma und Blutzellen,
- eine dem Plasmafilter fluidisch nachgeschaltete Zuführvorrichtung/Mischpumpe zum Einstellen des pH- Werts des Blutplasmas,
- einen der Zuführvorrichtung/Mischpumpe nachgeschalteten Ionenaustauscher, welcher vorzugsweise ein Anionenaustauscher ist, und
- einen dem Ionenaustauscher fluidisch nachgeschalteten Dialysator, mittels dem eine Dialyse unter Verwendung von saurer oder basischer Dialysierflüssigkeit ausgeführt werden kann.

Hierbei ist der Ionenaustauscher bevorzugt ein Anionenaustauscher, beispielsweise ein DEAE-Anionenaustauscher, insbesondere ein DEAE-Anionenaustauscher mit Tentakeltechnologie. Der Ionenaustauscher kann auch für eine Multimodal-Chromatographie beispielsweise mit zusätzlichen hydrophobischen Interaktionen konfiguriert sein.
Die Einstellung des pH-Werts des Blutplasmas kann mittels der Zuführvorrichtung/Mischpumpe erfolgen, welche dem Blutplasma direkt oder indirekt Protonen (H⁺), beispielsweise in Form einer sauren Lösung oder auch als Feststoff, zuführt.
Alternativ oder zusätzlich kann die Einstellung des pH-Werts auch mittels einer Dialyse des Blutplasmas mit einem sauren Puffer, insbesondere einem Acetatpuffer, erfolgen. Hierfür kann ein dem Ionenaustauscher fluidisch vorgeschalteter Dialysator vorgesehen sein, mittels dem eine Dialyse unter Verwendung von saurer Dialysierflüssigkeit (und grundsätzlich auch von basischer Dialysierflüssigkeit) ausgeführt werden kann.
Die Neutralisierung des pH-Werts des Blutplasmas kann mittels der Zuführvorrichtung/Mischpumpe erfolgen, welche dem Blutplasma direkt oder indirekt Hydroxid-Ionen (OH^-), beispielsweise in Form einer basischen Lösung oder auch als Feststoff, zuführt.
Alternativ oder zusätzlich kann die Neutralisierung des pH-Werts des Blutplasmas auch mittels einer Dialyse des Blutplasmas mit einem basischen Puffer, insbesondere einem Bikarbonatpuffer, erfolgen. Eine Dialyse des Blutplasmas mit einem basischen Puffer, insbesondere einem Bikarbonatpuffer, hat den Vorteil, dass überschüssige Flüssigkeit aus dem Blutplasma entfernt werden kann.
Da die Neutralisierung des pH-Werts des Blutplasmas erfolgt, nachdem das Blutplasma den Ionenaustauscher durchströmt hat, ist hierfür vorzugsweise ein dem Ionenaustauscher fluidisch nachgeschalteter Dialysator vorgesehen, mittels dem eine Dialyse unter Verwendung von basischer Dialysierflüssigkeit (und grundsätzlich auch von saurer Dialysierflüssigkeit) ausgeführt werden kann.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines DEAE-Anionenaustauschers, insbesondere eines DEAE-Anionenaustauschers mit Tentakeltechnologie, zur extrakorporalen Blutbehandlung.
In anderen Worten ermöglicht es die vorliegende Erfindung, Anionenaustauscher, insbesondere DEAE-Anionenaustauscher, insbesondere DEAE-Anionenaustauscher mit Tentakeltechnologie, zur extrakorporalen Blutbehandlung / zur extrakorporalen Aufbereitung / Reinigung von Blut oder Blutplasma einzusetzen.
Blutplasma kann somit effektiv und selektiv von Endotoxinen gereinigt werden, ohne dass wichtige Bestandteile des Blutplasmas, wie z.B. Gerinnungsfaktoren, ungewollt aus dem Blutplasma entfernt werden.
Gemäß diesem Aspekt kann das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise in Blutbanken zum Behandeln von Spenderblut Einsatz kommen. Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann auch im Rahmen einer extrakorporalen Blutbehandlung angewandt werden.
In anderen Worten ausgedrückt, betrifft die Erfindung gemäß einer Ausführungsform ein Verfahren mit den Schritten:

-Trennen des Blutplasmas von den Blutzellen,
- Anreichern des Blutplasmas mit H⁺ - Ionen (Protonen), bis der pH-Wert des Blutplasmas dem isoelektrischen Punkt des Gerinnungsfaktors II nahekommt (pH-Wert des Blutplasmas ist niedriger als pH=5,5),
-Einsetzen der Anionenaustauschchromatographie / eines Anionenaustauschers zur Entfernung von Pathogenen aus dem Blutplasma,
- Neutralisieren des pH-Werts des Blutplasmas auf einen pH-Wert von ca. 7,4,
- Zusammenführen des Blutplasmas und der Blutzellen.

Die Neutralisierung des Blutplasmas kann mittels eines beliebigen Verfahrens, beispielsweise durch die Zuführung einer Base, OH^--Ionen, durch Entfernung der H⁺-Ionen oder mittels einem basischen Puffer, wie z.B. einem Bikarbonatpuffer, erfolgen.
Eine Senkung des pH-Werts des Blutplasmas kann durch Zugabe von H⁺-Ionen in verschiedener Form erreicht werden, beispielsweise durch Zugabe einer Säure wie HCl oder eines Puffers mit saurem pH-Wert wie z.B. eines Azetatpuffers.
Die Neutralisierung des pH-Werts des Blutplasmas, nachdem dieses den Ionenaustauscher durchlaufen hat, kann durch Zugabe einer Base, wie z.B. NaOH oder durch eine Dialyse mit einem basischen Puffer, wie z.B. einem Bikarbonatpuffer, erreicht werden.
Beispielsweise wird nach der Trennung des Blutplasmas von den Blutzellen das Plasma mit einem Acetatpuffer mit einen pH-Wert von ca. 4 versetzt und somit der pH-Wert des Plasmas auf einen pH-Wert von ca. 5 gesenkt. Das Blutplasma fließt daraufhin durch den Ionenaustauscher.
Nach dem Ionenaustauscher fließt das Blutplasma durch einen Dialysator. Dieser wird vorzugsweise auf der Dialysatseite mit Bikarbonatpuffer durchströmt. In anderen Worten wird als Dialysierflüssigkeit ein Bikarbonatpuffer eingesetzt. Dadurch wird der neutrale pH-Wert oder der physiologische pH-Wert des Blutplasmas wieder hergestellt und zusätzliche Flüssigkeit, welche beispielsweise durch die Ionenaustauschchromatographie in das Blutplasma eingebracht wurde, aus dem Blutplasma entfernt.
Das Blutplasma hat in diesem gereinigten Zustand seine physiologische Zusammensetzung (inklusive eines physiologischen pH-Werts und im Blutplasma vorhandenen Blutgerinnungsfaktoren) und ist von etwaigen zuvor im Blutplasma enthaltenen Endotoxinen, wie LPS, LTA, Viren etc. effektiv gereinigt.
Figurenliste

1 zeigt beispielhaft die Adsorption verschiedener Gerinnungsfaktoren an einen DEAE-Anionenaustauscher bei einem physiologischen pH-Wert des Blutplasmas.
2 zeigt beispielhaft die Adsorption verschiedener Gerinnungsfaktoren an einen DEAE-Anionenaustauscher bei einem pH-Wert des Blutplasmas von pH=5,1.
Die 3a-b veranschaulichen die pH-Wert-abhängige Adsorption verschiedener Gerinnungsfaktoren an einen DEAE-Anionenaustauscher.
4 zeigt beispielhaft eine erfindungsgemäße Vorrichtung.

Beschreibung der Ausführungsformen
Nachstehend werden Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die zugehörigen Figuren beschrieben.
1 zeigt beispielhaft die Adsorption verschiedener Gerinnungsfaktoren an einen DEAE-Anionenaustauscher bei einem physiologischen pH-Wert des Blutplasmas. In einem in-vitro Versuchsaufbau wurden DEAE-Anionenaustauscher mit Blutplasma mit physiologischem pH-Wert von PH=7,4 durchströmt und die Adsorption von Gerinnungsfaktoren bestimmt.
Die Faktoren II, IX und X der Blutgerinnungskaskade wurden vom DEAE-Anionenaustauscher effektiv adsorbiert und in großem Ausmaß aus dem Blut entfernt. Zu einem Zeitpunkt t1 liegt die messbare Menge der Gerinnungsfaktoren II, IX und X im Blutplasma bei null. Der globale Gerinnungsstatus sank nach der Behandlung mit dem DEAE-Anionenaustauscher somit auf ein gefährlich niedriges Maß.
Die Menge des Gerinnungsfaktors IX blieb dauerhaft niedrig, während die Gerinnungsfaktoren II und X nach dem Durchlauf eines Plasmavolumens (ca. 3L, nach einem Zeitpunkt t2 in 1) durch den DEAE-Anionenaustauscher nicht mehr adsorbiert wurden. Daher steigen die Mengen der Gerinnungsfaktoren II und X nach dem Zeitpunkt t2 in 1 an.
2 zeigt beispielhaft die Adsorption verschiedener Gerinnungsfaktoren an einen DEAE-Anionenaustauscher bei einem pH-Wert des Blutplasmas von pH=5,1.
Die Mengen der Gerinnungsfaktoren II, IX und X bleiben stabil und es erfolgt keine Adsorption an den DEAE-Anionenaustauscher. Der Einbruch der Kurven zum Zeitpunkt t3 in 2 ist ein Artefakt und rührt von einem Verdünnungseffekt von im System vorhandener Spüllösung her.
Die 3a-b veranschaulichen die pH-Wert-abhängige Adsorption der Gerinnungsfaktoren Faktor I, Faktor II, Faktor IV, Faktor V, Faktor VI, Faktor VII, Faktor Vlla, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X, Faktor XI und Faktor XII an einen DEAE-Anionenaustauscher. Die Position der senkrechten Pfeile auf der pH-Skala zeigt den isoelektrischen Punkt von den jeweiligen Gerinnungsfaktoren. 3a zeigt hierbei die Adsorption der Gerinnungsfaktoren, wenn das Blutplasma einen pH von ca. 7,4 hat. 3b zeigt hierbei die Adsorption der Gerinnungsfaktoren, wenn das Blutplasma einen pH von ca. 5,1 hat.
Wie in 3a gezeigt, erfolgt bei einem pH-Wert des Blutplasmas von ca. 7,4 eine Adsorption der Faktoren II, IX und X an den DEAE- Anionenaustauscher, während die Faktoren V, I, VIIa, VII, VIII, XII und XI nicht adsorbiert werden. Bei einer Verschiebung des pH-Werts von dem neutralen pH-Wert von 7,4 in den sauren Bereich (niedrigerer pH-Wert), nimmt die negative Ladung der Proteine / Moleküle zu. Bei einer Verschiebung des pH-Werts von dem neutralen pH-Wert von 7,4 in den basischen Bereich (höherer pH-Wert), nimmt die positive Ladung der Proteine / Moleküle zu.
Wie in 3b gezeigt ist, erfolgt bei einem pH-Wert des Blutplasmas von ca. 5,1 keine Adsorption der Faktoren II, IX, X, V, I, Vlla, VII, VIII, XII und XI an den DEAE-Anionenaustauscher. Der pH-Wert von ca. 5,1 kommt dem isoelektrischen Punkt von Faktor II nahe, welcher bei pH=4,4 liegt und ist 1,1 höher als der isoelektrische Punkt von Faktor II.
Bei einer Verschiebung des pH-Werts von dem sauren pH-Wert von 5,1 weiter in den sauren Bereich (niedrigerer pH-Wert), nimmt die negative Ladung der Proteine / Moleküle zu. Bei einer Verschiebung des pH-Werts von dem sauren pH-Wert von 5,1 in den basischen Bereich (höherer pH-Wert), nimmt die positive Ladung der Proteine / Moleküle zu.
Sowohl bei dem in 3a gezeigten Fall als auch dem in 3b gezeigten Fall werden nicht-amphotere pathogene Substanzen wie Endotoxine, Viren, Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA), mit gleichbleibender Effektivität von dem DEAE- Anionenaustauscher gebunden und somit aus dem Blutplasma entfernt.
Mit der Einstellung des pH-Werts des Blutplasmas vor der Ionenaustauschchromatographie kann daher das Adsorptions- bzw. Bindungsverhalten von amphoteren Proteinen / Molekülen wie Gerinnungsfaktoren selektiv derart beeinflusst werden, dass diese Proteine / Moleküle nicht adsorbiert bzw. aus dem Blutplasma entfernt werden, während nicht amphotere Proteinen / Moleküle wie beispielsweise Pathogene und Endotoxine weiterhin effektiv adsorbiert und somit aus dem Blutplasma entfernt werden.
4 zeigt schematisch den Aufbau einer erfindungsgemäßen Blutbehandlungsmaschine, welche dazu ausgelegt / konfiguriert ist, ein erfindungsgemäßes Verfahren auszuführen. Vorzugsweise ist die Blutbehandlungsmaschine eine Apheresemaschine.
Die Blutmaschine ist über eine Blutzuflussleitung und eine Blutabflussleitung mit einem Patienten verbunden bzw. verbindbar. Das Blut von der Blutzuflussleitung wird durch eine erste Förderpumpe 5 gefördert und fließt dann weiter in einen zwei Ausgänge aufweisenden Plasmafilter 1, in welchem das Blut in Blutplasma und Blutzellen aufgetrennt wird, wobei das Blutplasma von einem Ausgang des Plasmafilters 1 ausfließt und die Blutzellen von einem anderen Ausgang des Plasmafilters 1 ausfließen.
Das durch den Plasmafilter 1 abgetrennte Blutplasma wird weiter in einer Zuführvorrichtung/Mischpumpe 2 mit einem von einem Fluidvorrat/-Quelle 6 bereitgestellten Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 4 gemischt, um den pH-Wert des Blutplasmas auf einen pH-Wert von ca. 5 zu senken.
Das so beahndelte Blutplasma wird von der Zuführvorrichtung/Mischpumpe 2 zu einem Ventil/einer Absperrvorrichtung zur Steuerung der Durchströmung geführt. Von dort fließt es weiter in einen Ionenaustauscher 3, welcher in dieser Ausführung ein Anionenaustauscher, vorzugweise ein Anionenaustauscher mit Tentakeltechnologie, ist.
Im Ionenaustauscher 3 findet ein Ionenaustausch mit Ladungen der Moleküle statt. Liegt der pH-Wert des Blutplasmas in der Nähe des isoelektrischen Punktes, wird der amphotere Gerinnungsfaktor nicht mehr vom Ionenaustauscher 3 adsorbiert. Nicht-amphotere Moleküle, wie LPS, LTA und Viren werden weitergehend unabhängig vom pH-Wert des Blutplasmas im Ionenaustauscher 3 adsorbiert.
Nach dem Ionenaustauscher 3 strömt das Blutplasma durch eine Blutseite eines Dialysators 4, wobei die Dialysatseite des Dialysators 4 mit eineraus einem weiteren Fluidvorrat/-Quelle 6 bereitgestellten Bikarbonatpuffer als Dialysierflüssigkeit durchströmt wird, um einen neutralen physiologischen pH-Wert des Blutplasmas wieder herzustellen, wobei eine zweite Förderpumpe 5 zwischen dem Fluidvorrat/-Quelle 6 mit Bikarbonatpuffer und einem Eingang des Dialysators 4 angeordnet ist, um den Bikarbonatpuffer zu fördern.
Das gereinigte und wieder einen physiologischen pH-Wert aufweisende Blutplasma wird weiter durch eine dritte dem Dialysator 4 nachgeschaltete Förderpumpe 5 gefördert und dann mit den Blutzellen aus dem Plasmafilter 1 wiedervereint.
Das behandelte Blut strömt dann weiter durch eine Luftfalle mit einem Luftdetektor, in welcher Luftblasen entdeckt und entfernt werden, und fließt zu einem anderen nachgeschalteten Ventil/ einer Absperrvorrichtung zur Steuerung der Durchströmung, welches/welche mit der Blutabflussleitung verbunden ist. Von dort gelangt das behandelte Blut wieder zum Patienten zurück.
Zusammenfassend weist die Blutbehandlungsmaschine einen Plasmafilter 1 zum Trennen von Blut in Blutplasma und Blutzellen, eine dem Plasmafilter 1 fluidisch nachgeschaltete Zuführvorrichtung/Mischpumpe 2 zum Einstellen des pH- Wertes des Blutplasmas, einen der Zuführvorrichtung/Mischpumpe 2 nachgeschalteten Ionenaustauscher 3, welcher vorzugsweise ein Anionenaustauscher ist, und einen dem Ionenaustauscher 3 fluidisch nachgeschalteten Dialysator 4 auf, mittels dem eine Dialyse unter Verwendung von saurer oder basischer Dialysierflüssigkeit ausgeführt werden kann.
Nachdem das Blut in dem Plasmafilter 1 in Blutplasma und Blutzellen aufgetrennt wurde, wird das Blutplasma mittels der Zuführvorrichtung/Mischpumpe 2 mit einem von einem Fluidvorrat/-Quelle 6 bereitgestellten Acetatpuffer mit einem pH von 4 versetzt, um den pH- Wert des Blutplasmas auf einen pH-Wert von ca. 5 zu senken.
Daraufhin strömt das Blutplasma durch ein Ventil/eine Absperrvorrichtung in den Ionenaustauscher 3, welcher in dieser Ausführungsform ein Anionenaustauscher, vorzugsweise ein Anionenaustauscher mit Tentakeltechnologie, ist.
Nach dem Ionenaustauscher 3 fließt das Blutplasma durch den Dialysator 4. Dieser wird auf der Dialysatseite mit einem von einem anderen Fluidvorrat/-Quelle 6 bereitgestellten und durch eine zweite Förderpumpe 5 geförderten Bikarbonatpuffer als Dialysierflüssigkeit durchströmt. Somit wird durch den Dialysator 4 wieder ein neutraler physiologischer pH-Wert des Blutplasmas hergestellt und zusätzliche Flüssigkeit aus dem Blutplasma entfernt.
Anschließend wird das gereinigte Blutplasma durch eine dritte Förderpumpe 5 wieder mit den Blutzellen aus dem Plasmafilter 1 vereint. Das vereinte und gereinigte Blut fließt durch eine Luftfalle mit einem Luftdetektor und ein anderes nachgeschaltetes Ventil/eine Absperrvorrichtung und schließlich von der Blutbehandlungsmaschine zurück zum Patienten.

Claims

Verfahren zur Reinigung von Blut, mit den Schritten: - Trennen des Blutplasmas von den Blutzellen, - Einstellen des pH-Werts des Blutplasmas auf einen einem isoelektrischen Punkt mindestens eines vorbestimmten Proteins nahekommenden pH-Wert, - Behandeln des Blutplasmas mittels Ionenaustauschchromatographie, - Neutralisieren des pH-Werts des Blutplasmas, - Zusammenführen des Blutplasmas und der Blutzellen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert, auf den der pH-Wert des Blutplasmas eingestellt wird, dem isoelektrischen Punkt des vorbestimmten Proteins bis auf +1,5/+0,0 pH-Punkt, vorzugsweise bis auf +1.5/+0,5 pH-Punkt, insbesondere bis auf + 1,5/+0,75 pH-Punkt, besonders bevorzugt bis auf +1,5 /+1,0 pH-Punkt entspricht.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert des Blutplasmas auf einen pH-Wert eingestellt wird, welcher niedriger als der isoelektrischen Punkt des vorbestimmten Proteins ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das vorbestimmte Protein ein Gerinnungsfaktor, insbesondere Faktor II, ist und / oder der pH-Wert des Blutplasmas auf einen pH-Wert eingestellt wird, welcher niedriger als der isoelektrischen Punkt des Gerinnungsfaktors ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert des Blutplasmas auf einen pH-Wert eingestellt wird, welcher niedriger als pH=5,5 ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Einstellung des pH-Werts des Blutplasmas mittels der Zuführung von Protonen zu dem Blutplasma und / oder einer Dialyse des Blutplasmas mit einem sauren Puffer, insbesondere einem Acetatpuffer, erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Neutralisierung des pH-Werts des Blutplasmas mittels der Zuführung von Hydroxid-Ionen zu dem Blutplasma und / oder einer Dialyse des Blutplasmas mit einem basischen Puffer, insbesondere einem Bikarbonatpuffer, erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung des Blutplasmas mittels Anionenaustauschchromatographie, vorzugsweise unter Verwendung eines DEAE-Anionenaustauschers, insbesondere eines DEAE-Anionenaustauschers mit Tentakeltechnologie, erfolgt.
Programmprodukt, welches beim Auslesen durch eine Vorrichtung bewirkt, dass die Vorrichtung ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-8 ausführt.
Blutbehandlungsmaschine, insbesondere Apheresemaschine, welche dazu konfiguriert ist, ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8 auszuführen.
Blutbehandlungsmaschine nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Blutbehandlungsmaschine aufweist: einen Plasmafilter (1) zum Trennen von Blut in Blutplasma und Blutzellen, eine dem Plasmafilter (1) fluidisch nachgeschaltete Zuführvorrichtung/Mischpumpe (2) zum Einstellen des pH- Werts des Blutplasmas, einen der Zuführvorrichtung/Mischpumpe (2) nachgeschalteten Ionenaustauscher (3), welcher vorzugsweise ein Anionenaustauscher ist, und einen dem Ionenaustauscher (3) fluidisch nachgeschalteten Dialysator (4), mittels dem eine Dialyse unter Verwendung von saurer oder basischer Dialysierflüssigkeit ausgeführt werden kann.
Blutbehandlungsmaschine nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Ionenaustauscher (3) ein DEAE-Anionenaustauscher, insbesondere ein DEAE-Anionenaustauscher mit Tentakeltechnologie, ist.
Verwendung eines DEAE-Anionenaustauschers, insbesondere eines DEAE-Anionenaustauschers mit Tentakeltechnologie, zur Reinigung von Blutplasma, insbesondere im Rahmen einer extrakorporalen Blutbehandlung.