EP3952945A1 - Verfahren und vorrichtung zur reinigung von blut - Google Patents
Verfahren und vorrichtung zur reinigung von blutInfo
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- EP3952945A1 EP3952945A1 EP20718276.7A EP20718276A EP3952945A1 EP 3952945 A1 EP3952945 A1 EP 3952945A1 EP 20718276 A EP20718276 A EP 20718276A EP 3952945 A1 EP3952945 A1 EP 3952945A1
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Definitions
- the present invention relates to a method for purifying blood
- the invention further relates to the use of a diethylaminoethyl (DEAE) anion exchanger, in particular a DEAE anion exchanger with tentacle technology, for purifying
- DEAE diethylaminoethyl
- Lung cancer is the cause of death. Sepsis is the third most common cause of death in Germany.
- the Sepsis Competence Network gives the following figures: 550,000 illnesses, 146,000 deaths per year, death rate 26.5%. From a global perspective, sepsis is a common cause of death according to the data from the Sepsis Competence Network: around 1,500,000 diseases occur annually, which lead to 500,000 deaths, which corresponds to a death rate of 33.3%.
- LTA lipoteichoic acid
- LPS lipopolysaccharides
- DNA deoxyribonucleic acid
- RNA ribonucleic acid
- Viruses, deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA) from the blood of a patient is known from the prior art, ion exchange chromatography using ion exchangers or ion adsorbers.
- DNA deoxyribonucleic acid
- RNA ribonucleic acid
- anion exchangers remove pathogenic substances such as endotoxins, viruses, deoxyribonucleic acid (DNA) and
- RNA Ribonucleic acid
- essential blood components such as clotting factors
- Acute phase proteins belong and are therefore in some cases only slowly reproduced, which is why the unintentional removal of these proteins has particularly serious and long-lasting consequences for patient safety.
- H.E.L.P. apheresis heparin-induced extracorporeal LDL precipitation
- Plasma obtained is precipitated by adding acetate buffer for acidification and heparin, LDL (low density lipoprotein) cholesterol, fibrinogen and lipoprotein (a).
- the precipitate is then removed from the treated plasma using a special filter and excess heparin by adsorption. Finally, bicarbonate dialysis is performed to restore the plasma to its initial volume and a physiological pH. The purified plasma is combined with the blood cells and returned to the patient.
- the H.E.L.P. Apheresis is mainly used for the treatment of severe, otherwise therapy-refractory lipid metabolism disorders and theological diseases, such as sudden hearing loss.
- a method for supporting the liver function is known from the prior art, in which the pH value of the blood plasma is increased and decreased in order to reduce the strength of the binding of protein-bound molecules to albumin.
- the pH value of the blood plasma is increased and decreased in order to reduce the strength of the binding of protein-bound molecules to albumin.
- Anion exchangers are ion exchangers in which a cationic group (cation) is covalently bound to a solid, insoluble matrix, while the neutralizing anion (neutral) is only ionically bound and can therefore be exchanged for other anions.
- a cationic group cation
- neutral neutralizing anion
- Anion exchangers (anion exchange chromatography) is an important tool for the analysis and binding of proteins and nucleic acids or their components, the peptides, amino acids, oligonucleotides and mononucleotides.
- anion exchangers are aminoethyl, diethylaminoethyl (DEAE), quaternary aminoethyl (QAE) and quaternary ammonium groups, coupled to cellulose, agarose (agar), dextran (dextrans) or polystyrene. DEAE cellulose is often used.
- Diethylaminoethyl (DEAE) ion exchangers with tentacle technology have a very high binding capacity and binding strength and are therefore particularly effective in removing pathogens and endotoxins even with complex solutions such as human plasma.
- DEAE ion exchangers are among the most effective known
- Endotoxin and virus binders are used with great success in technology, especially in biotechnology, chemical engineering and process technology.
- Tentacle technology uses special gels for chromatography, which have thread-like structures, the so-called tentacles. These tentacles carry charges over their entire length and can thus carry the substances to be separated, e.g. Proteins, depending on their load, hold or
- Binding than normal gels which have a smaller surface.
- DEAE ion exchangers also known as DEAE adsorbers
- LTA lipoteichoic acid
- LPS Lipopolysaccharides
- Blood clotting is switched off and the patient can bleed to death.
- the present invention is based on the object of alleviating or eliminating the problems known from the prior art.
- the present invention is based on the object of providing a clinically applicable method and a device for effective blood purification with high patient safety at the same time.
- Another aspect of the present invention relates to the use of a DEAE anion exchanger according to claim 12.
- One aspect of the invention relates to a method for purifying blood, in particular blood plasma, with the steps:
- the core idea of the invention is that by means of the adjustment of the pH, the charge of proteins, such as, for example, coagulation factors, is selectively and consciously changed and adjusted.
- the adsorption on the ion exchanger and thus the removal of proteins, such as the coagulation factors, from the blood depends on the charge of the proteins / molecules.
- the predetermined protein is preferably a coagulation factor, for example factor I, factor II, factor IV, factor V, factor VI, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor IX, factor X, factor XI or factor XII.
- the method for purifying blood is preferably carried out or used in the context of an extracorporeal blood treatment.
- Coagulation factors are amphoteric proteins, i. Proteins that have both positive and negative charges. The predominant charge depends on the pH of the solution in which the protein / molecule is located.
- the isoelectric point denotes the pH value at which the number of positive and negative charges of an amphoteric protein / molecule is exactly the same on a statistical average and the entire protein / molecule is therefore electrically neutral.
- the blood plasma After the blood has been separated into blood plasma and blood cells, the blood plasma initially has a physiological pH of approx. 7.4. Most coagulation factors have a negative charge at a physiological pH of around 7.4. If the pH value of the plasma is shifted towards lower pH values (i.e. into the acidic range), the negative charge of the coagulation factors is reduced. If the pH of the blood plasma reaches the isoelectric point of a certain protein / molecule, e.g. of a coagulation factor, the charge of this specific protein / molecule is neutral and the protein / molecule or the coagulation factor is no longer adsorbed by the ion exchanger and no longer removed from the blood plasma.
- a certain protein / molecule e.g. of a coagulation factor
- Non-amphoteric molecules such as LPS, LTA, other endotoxins and viruses generally do not change their charge depending on the pH of the solution in which the endotoxins are located. you are therefore adsorbed by the ion exchanger largely independently of the pH of the surrounding solution.
- the core idea of the invention to adjust the charge of at least one predetermined protein by adjusting the pH value of the solution surrounding this protein to the pH value corresponding to the isoelectric point of the predetermined protein is applicable to any chromatography method which is electrically charged on the interaction Components (such as ions) is based.
- the electrically neutral predetermined protein becomes when the pH of the solution surrounding the predetermined protein reaches the isoelectric point of the
- chromatography process e.g. ion exchange chromatography
- electrically charged components e.g. ions
- other undesirable blood plasma components such as e.g. Endotoxins, the electrical charge of which is not neutral, but predominantly positive or predominantly negative, are retained by means of the chromatography process and effectively removed from the blood plasma.
- the pH value to which the pH value of the blood plasma is adjusted preferably corresponds to the isoelectric point of the predetermined protein except for
- the pH of the blood plasma can also be adjusted to a pH which is lower than the isoelectric point of the predetermined protein.
- the predetermined protein is a
- Coagulation factor, in particular factor II, and / or the pH value of the blood plasma is adjusted to a pH value which is lower than the isoelectric point of the coagulation factor.
- the pH of the blood plasma can be adjusted by means of a direct or indirect supply of protons (H + ) to the blood plasma, for example in the form of an acidic solution or as a solid and / or by means of dialysis of the blood plasma with an acidic buffer, in particular an acetate buffer , respectively.
- H + protons
- hydroxide ions can also be removed from the blood plasma.
- the pH value of the blood plasma can be neutralized by means of a direct or indirect supply of hydroxide ions (OH-) to the blood plasma and / or by means of dialysis of the blood plasma with a basic buffer, in particular a bicarbonate buffer.
- Dialysis of the blood plasma with a basic buffer, in particular a bicarbonate buffer has the advantage that excess fluid can be removed from the blood plasma.
- protons (H + ) can also be withdrawn from the blood plasma.
- the blood plasma is treated by means of anion exchange chromatography, preferably using a DEAE anion exchanger, in particular a DEAE anion exchanger with tentacle technology.
- Anion exchange chromatography is limited, but also includes other types of ion exchange chromatography, such as the
- Cation exchange chromatography or also various multimodal chromatographies, which preferably include ion exchange chromatography.
- Ion exchangers in which an anionic group (anion) is covalently bound to a solid, insoluble matrix, while the neutralizing cation (neutral) is only ionically bound and therefore exchangeable with other cations.
- a number or a plurality of predetermined proteins can also be taken into account.
- the different predetermined proteins of the plurality of proteins can each have different isoelectric points.
- ion exchange chromatography takes into account the isoelectric points of all proteins of the majority of proteins.
- the pH of the blood plasma is adjusted to a pH at which all proteins of the plurality of predetermined proteins have a desired charge (positive, neutral, negative).
- the pH of the blood plasma can be adjusted to an average value of the pH values corresponding to the isoelectric points of the proteins of the plurality of predetermined proteins.
- the pH of the blood plasma can be adjusted to an average value of the pH values corresponding to the isoelectric points of the proteins of the plurality of predetermined proteins.
- Blood plasma can also be adjusted to the lowest or the highest of the pH values corresponding to the isoelectric points of the proteins of the plurality of predetermined proteins.
- Another aspect of the present invention relates to a program product which, when read by a device, causes a device to carry out a method according to the invention.
- a program product which, when read by a device, causes a device to carry out a method according to the invention.
- Another aspect of the invention relates to a blood treatment machine, in particular an apheresis machine, which is designed or configured to carry out a method according to the invention.
- Such a blood treatment machine has, for example:
- Ion exchanger which is preferably an anion exchanger
- a dialyzer fluidically connected downstream of the ion exchanger, by means of which dialysis can be carried out using acidic or basic dialysis fluid.
- the ion exchanger is preferably an anion exchanger
- DEAE anion exchanger for example a DEAE anion exchanger, in particular a DEAE anion exchanger with tentacle technology.
- the ion exchanger can also be used for multimodal chromatography, for example with additional hydrophobic
- Feed device / mixing pump take place, which the blood plasma directly or indirectly supplies protons (H + ), for example in the form of an acidic solution or as a solid.
- the pH can also be adjusted by means of dialysis of the blood plasma with an acidic buffer, in particular an acetate buffer.
- an acidic buffer in particular an acetate buffer.
- a dialyzer fluidly connected upstream of the ion exchanger can be provided, by means of which dialysis using acidic
- Dialysis fluid (and in principle also basic dialysis fluid) can be carried out.
- the pH of the blood plasma can be neutralized by means of the
- Feed device / mixing pump take place, which directly or indirectly supplies hydroxide ions (OH-) to the blood plasma, for example in the form of a basic solution or also as a solid.
- OH- hydroxide ions
- the pH of the blood plasma can also be neutralized by means of dialysis of the blood plasma with a basic buffer, in particular a bicarbonate buffer.
- Dialysis of the blood plasma with a basic buffer, in particular a bicarbonate buffer has the advantage that excess fluid can be removed from the blood plasma.
- a dialyzer downstream of the ion exchanger is preferably provided, by means of which dialysis can be carried out using basic dialysis fluid (and in principle also acid dialysis fluid) .
- Another aspect of the invention relates to the use of a DEAE anion exchanger, in particular a DEAE anion exchanger
- the present invention makes it possible to use anion exchangers, in particular DEAE anion exchangers, in particular DEAE anion exchangers with tentacle technology, for extracorporeal blood treatment / for extracorporeal preparation / purification of blood or blood plasma.
- Blood plasma can thus be effectively and selectively purified from endotoxins without important components of the blood plasma, such as e.g. Clotting factors are removed from the blood plasma unintentionally.
- the method according to the invention can be used, for example, in blood banks for treating donor blood.
- a method according to the invention can also be used in the context of an extracorporeal blood treatment.
- the invention relates to a method with the steps:
- the blood plasma can be neutralized by any method, for example by adding a base, OH ions, by removing the H + ions or by means of a basic buffer such as a bicarbonate buffer.
- the pH of the blood plasma can be reduced by adding H + ions in various forms, for example by adding an acid such as HCl or a buffer with an acidic pH such as an acetate buffer.
- Has passed through ion exchangers can by adding a base, e.g. NaOH or by dialysis with a basic buffer, e.g. a bicarbonate buffer.
- a base e.g. NaOH
- a basic buffer e.g. a bicarbonate buffer
- an acetate buffer with a pH of approx. 4 is added to the plasma and the pH of the plasma is thus lowered to a pH of approx. 5.
- the blood plasma then flows through the ion exchanger.
- Bicarbonate buffer preferably flows through this on the dialysate side.
- a bicarbonate buffer is used as the dialysis fluid.
- the blood plasma is physiological
- Composition including a physiological pH value and blood coagulation factors present in the blood plasma
- Composition is effectively cleaned of any endotoxins previously contained in the blood plasma, such as LPS, LTA, viruses, etc.
- 1 shows, by way of example, the adsorption of various coagulation factors on a DEAE anion exchanger at a physiological pH value of the blood plasma.
- FIGS. 3a-b illustrate the pH-dependent adsorption of various coagulation factors on a DEAE anion exchanger.
- FIG. 4 shows an example of a device according to the invention.
- Factors II, IX and X of the blood coagulation cascade were effectively adsorbed by the DEAE anion exchanger and largely removed from the blood. At a point in time t1, the measurable amount of the coagulation factors II, IX and X in the blood plasma is zero. The global coagulation status thus fell to a dangerously low level after treatment with the DEAE anion exchanger.
- Coagulation factors II and X were no longer adsorbed by the DEAE anion exchanger after a volume of plasma (approx. 3L, after a point in time t2 in FIG. 1) had passed through. Therefore, the amounts of coagulation factors II and X increase after time t2 in FIG. 1.
- the amounts of coagulation factors II, IX and X remain stable and there is no adsorption on the DEAE anion exchanger.
- the collapse of the curves at time t3 in FIG. 2 is an artifact and is due to a dilution effect of the rinsing solution present in the system.
- FIGS. 3a-b illustrate the pFI-dependent adsorption of the
- Coagulation factors factor I, factor II, factor IV, factor V, factor VI, factor VII, factor VIla, factor VIII, factor IX, factor X, factor XI and factor XII to a DEAE anion exchanger The position of the vertical arrows on the pFI scale shows the isoelectric point of the respective coagulation factors.
- 3a shows the adsorption of the coagulation factors when the blood plasma has a pH of about 7.4.
- 3b shows the adsorption of the coagulation factors when the blood plasma has a pH of about 5.1.
- DNA Deoxyribonucleic acid
- RNA ribonucleic acid
- Ion exchange chromatography can therefore selectively influence the adsorption or binding behavior of amphoteric proteins / molecules such as coagulation factors in such a way that these proteins / molecules are not adsorbed or removed from the blood plasma, while non-amphoteric proteins / molecules such as pathogens and endotoxins continue to be effectively adsorbed and thus removed from the blood plasma.
- Fig. 4 shows schematically the structure of an inventive
- Blood treatment machine an apheresis machine.
- the blood machine is connected or can be connected to a patient via a blood inflow line and a blood outflow line.
- the blood from the blood supply line is pumped through a first feed pump 5 and then flows further into a two
- Blood cells are separated, the blood plasma from an outlet of the
- Plasma filter 1 flows out and the blood cells from another outlet of the
- Plasma filter 1 flow out.
- the blood plasma separated by the plasma filter 1 is further in a
- the blood plasma treated in this way is fed from the feed device / mixing pump 2 to a valve / shut-off device for controlling the flow. From there it flows on into an ion exchanger 3, which in this embodiment is an anion exchanger, preferably an anion exchanger with tentacle technology.
- the blood plasma flows through a blood side of a dialyzer 4, the dialysate side of the dialyzer 4 being supplied with a bicarbonate buffer from another fluid supply / source 6 as dialysis fluid
- Blood plasma is further fed through a third dialyzer 4 downstream
- Feed pump 5 promoted and then with the blood cells from the plasma filter 1
- the treated blood then continues to flow through an air trap with a
- Air detector in which air bubbles are detected and removed, and flows to another downstream valve / shut-off device to control the
- the blood treatment machine has a plasma filter 1 for separating blood into blood plasma and blood cells, a supply device / mixing pump 2 fluidly connected downstream of the plasma filter 1 for setting the pH of the Blood plasma, an ion exchanger 3 downstream of the feed device / mixing pump 2, which is preferably an anion exchanger, and a dialyzer 4 fluidically downstream of the ion exchanger 3, by means of which dialysis can be carried out using acidic or basic dialysis fluid.
- an acetate buffer with a pH of 4 provided by a fluid supply / source 6 is added to the blood plasma by means of the feed device / mixing pump 2 in order to bring the pH of the blood plasma to a Lower the pH value by approx. 5.
- the blood plasma then flows through a valve / a shut-off device into the ion exchanger 3, which in this embodiment is an anion exchanger, preferably an anion exchanger with tentacle technology.
- the blood plasma flows through the dialyzer 4. This is flowed through on the dialysate side with a bicarbonate buffer provided by another fluid supply / source 6 and conveyed by a second delivery pump 5 as dialysis fluid. A neutral physiological pH value of the blood plasma is thus restored by the dialyzer 4 and additional liquid is removed from the blood plasma.
- the purified blood plasma is then reunited with the blood cells from the plasma filter 1 by a third feed pump 5.
- the pooled and purified blood flows through an air trap with an air detector and another downstream valve / shut-off device and finally from the blood treatment machine back to the patient.
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Blut mit den Schritten: Trennen des Blutplasmas von den Blutzellen, Einstellen des pH-Werts des Blutplasmas auf einen einem isoelektrischen Punkt mindestens eines vorbestimmten Proteins nahekommenden pH-Wert, Behandeln des Blutplasmas mittels Ionenaustauschchromatographie, Neutralisieren des pH-Werts des Blutplasmas, Zusammenführen des Blutplasmas und der Blutzellen und eine Vorrichtung zur Ausführung eines derartigen Verfahrens.
Description
Verfahren und Vorrichtung zur Reinigung von Blut
Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Blut,
insbesondere zur Entfernung von Endotoxinen aus dem Blutplasma, sowie eine
Vorrichtung zur Ausführung eines derartigen Verfahrens. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung eines Diethylaminoethyl (DEAE)-Anionenaustauschers, insbesondere eines DEAE-Anionenaustauschers mit Tentakeltechnologie, zur Reinigung von
Blutplasma.
Technischer Hintergrund
In Deutschland erkranken nach Berechnungen des Kompetenznetzes Sepsis jedes Jahr etwa 154.000 Menschen an einer Sepsis oder Blutvergiftung. Davon sterben ca. 56.000 an den Folgen der Erkrankung. Das sind etwa 154 Todesopfer pro Tag, ähnlich viele wie bei Herzinfarkten mit Todesfolge und mehr Opfer als bei der
Todesursache Lungenkrebs. Die Sepsis steht damit an dritter Stelle der Todesursachen in Deutschland.
Für Europa gibt das Kompetenznetz Sepsis folgende Zahlen an: jährlich 550.000 Erkrankungen, 146.000 Todesfälle, Sterberate 26,5 %. Auch global betrachtet ist gemäß den Daten des Kompetenznetzes Sepsis die Sepsis eine häufige Todesursache: jährlich treten ca.1.500.000 Erkrankungen auf, welche zu 500.000 Todesfällen führen, was einer Sterberate von 33,3 % entspricht.
Nach Angaben der Deutschen Sepsis-Hilfe sterben weltweit somit mehr als 1400 Menschen pro Tag an einer schweren Sepsis. Auch in den USA hat sich die Inzidenz der Sepsis im Verlauf von Jahrzehnten auf etwa 3 pro 1000 Einwohner und Jahr gesteigert.
Eine Ursache für den schweren Verlauf der Sepsis und somit für eine erhöhte Mortalität sind beispielsweise nach einer Antibiotikatherapie im Blut eines Patienten
zirkulierende Bakterienbestandteile, wie beispielsweise Endotoxine wie Lipoteichonsäue (Lipoteichoic Acid (LTA)), Lipopolysaccharide (LPS), Viren, Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA).
Eine Entfernung dieser Partikel bzw. Endotoxine aus dem Blut eines Patienten, beispielsweise mittels geeigneter Adsorbertechnologie, könnte einen weniger schweren Verlauf der Sepsis zur Folge haben und somit die mit der Sepsis assoziierte Mortalität senken.
Als Verfahren zur Entfernung von pathogenen Substanzen wie Endotoxinen,
Viren, Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA) aus dem Blut eines Patienten ist aus dem Stand der Technik die lonenaustauschchromatographie mittels Ionenaustauschern bzw. lonenadsorbern bekannt. Hierbei werden vor Allem
Anionenaustauscher bzw. Anionenadsorber im Rahmen der
Anionenaustauschchromatographie eingesetzt.
Unglücklicherweise entfernen diese Anionenaustauscher neben den pathogenen Substanzen wie Endotoxinen, Viren, Desoxyribonukleinsäure (DNA) und
Ribonukleinsäure (RNA) auch lebensnotwendige Blutbestandteile, wie beispielsweise Gerinnungsfaktoren, aus dem Blut des Patienten.
Zudem kommt erschwerend hinzu, dass Gerinnungsfaktoren nicht zu den
Akutphasenproteinen gehören und somit zum Teil nur langsam nachgebildet werden, weswegen die ungewollte Entfernung dieser Proteine besonders schwerwiegende und langanhaltende Folgen für die Patientensicherheit mit sich bringt.
Es besteht somit bei der Verwendung der lonenaustauschchromatographie, insbesondere der Anionenaustauschchromatographie, zur Blutreinigung aufgrund der unerwünschten Entfernung lebensnotwendiger Blutgerinnungsfaktoren die Gefahr innerer und äußerer Blutungen des Patienten, die zum Tode des Patienten führen können.
Stand der Technik
Ein aus dem Stand der Technik bekanntes Blutreinigungsverfahren ist die H.E.L.P.-Apherese (Heparin-induzierte Extrakorporale LDL-Präzipitation).
Bei diesem extrakorporalen Blutreinigungsverfahren erfolgt nach der
Blutentnahme zunächst eine Plasmaseparation. Aus dem gewonnenen Plasma wird durch Zusatz von Acetatpuffer zur Ansäuerung und von Heparin LDL(low density lipoprotein)-Cholesterin, Fibrinogen und Lipoprotein(a) ausgefällt.
Anschließend wird das Präzipitat mit einem speziellen Filter und überschüssiges Heparin durch Adsorption aus dem behandelten Plasma entfernt. Abschließend wird eine Bikarbonatdialyse durchgeführt, um das Plasma wieder auf das anfängliche Volumen und einen physiologischen pH-Wert einzustellen. Das gereinigte Plasma wird mit den Blutzellen vereinigt und dem Patienten zurückgegeben.
Die H.E.L.P. Apherese wird vor Allem zur Behandlung schwerer, ansonsten therapierefraktärer Fettstoffwechselstörungen und Theologisch bedingter Erkrankungen, wie dem Hörsturz, eingesetzt.
Weiterhin ist aus dem Stand der Technik ein Verfahren zur Unterstützung der Leberfunktion bekannt, bei dem der pH-Wert des Blutplasmas zur Verringerung der Bindungsstärke von proteingebundenen Molekülen an Albumin erhöht und gesenkt wird. Durch die Veränderung des pH-Werts des Blutplasmas verändert sich die Struktur bzw. Konfiguration des Albumins, wodurch die gebundenen Moleküle weniger stark gebunden werden, leichter in Lösung gehen und somit leichter mittels der Dialyse entfernt werden können.
Anionenaustauscher (auch basische lonentauscher) sind Ionenaustauscher, bei denen eine kationische Gruppe (Kation) kovalent an eine feste unlösliche Matrix gebunden ist, während das neutralisierende Anion (neutral) nur ionisch gebunden und daher durch andere Anionen austauschbar ist. Die Chromatographie an
Anionenaustauschern (Anionen-Austauschchromatographie) ist ein wichtiges Hilfsmittel
zur Analyse und Bindung von Proteinen und Nucleinsäuren bzw. von deren Komponenten, den Peptiden, Aminosäuren, Oligonukleotiden und Mononukleotiden.
Beispiele von Anionenaustauschern sind Aminoethyl-, Diethylaminoethyl- (DEAE), quarternäre Aminoethyl- (QAE-) und quarternäre Ammoniumgruppen, gekoppelt an Cellulose, Agarose (Agar), Dextran (Dextrane) oder Polystyrol. Häufig verwendet wird DEAE-Cellulose.
Von den bekannten Anionenaustauschern haben insbesondere
Diethylaminoethyl-(DEAE)-lonenaustauscher mit Tentakeltechnologie eine sehr hohe Bindungskapazität und Bindungsstärke und sind somit auch bei komplexen Lösungen wie humanem Plasma besonders effektiv in der Entfernung von Pathogenen und Endotoxinen. DEAE-Ionenaustauscher gehören zu den effektivsten bekannten
Endotoxin- und Virenbindern und werden dazu mit sehr großem Erfolg in der Technik, insbesondere in der Biotechnologie, im Chemieingenieurwesen und der Prozesstechnik eingesetzt.
Bei der Tentakeltechnologie kommen besondere Gele bei der Chromatographie zum Einsatz, welche fadenartige Strukturen, die so genannten Tentakel, aufweisen. Diese Tentakel tragen über ihre ganze Länge Ladungen und können so die zu trennenden Stoffe, z.B. Proteine, je nach ihrer Ladung viel besser Festhalten bzw.
Binden als normale Gele, welche eine geringere Oberfläche aufweisen.
DEAE- Ionenaustauscher (auch als DEAE-Adsorber bezeichnet) entfernen neben pathogenen Stoffen, wie Lipoteichonsäure (Lipoteichoic Acid (LTA)) und
Lipopolysacchariden (LPS), Viren etc., aber auch sehr effektiv wichtige Stoffe bzw. Faktoren des Blutgerinnungssystems aus dem Blut. Damit wird das System der
Blutgerinnung ausgeschaltet und der Patient kann verbluten.
Beispielsweise wurden in einem in-vitro Versuchsaufbau DEAE-Adsorber mit Blutplasma durchströmt und die Adsorption von Gerinnungsfaktoren bestimmt. Die Faktoren II, IX und X der Blutgerinnungskaskade wurden vom DEAE-Adsorber adsorbiert und in großem Ausmaß aus dem Blut entfernt. Die Entfernung von
Gerinnungsfaktoren durch Ionenaustauscher in den in-vitro Versuchen wurde zudem in einem klinischen Test mit gesunden Probenden bestätigt. Der globale Gerinnungsstatus sank nach der Behandlung mit dem DEAE Ionenaustauscher auf ein gefährlich niedriges Maß.
Aufgrund dieser unerwünschten Adsorption wichtiger Gerinnungsfaktoren ist eine klinische Anwendung der DEAE-Ionenaustauscher momentan nicht möglich.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die aus dem Stand der Technik bekannten Probleme abzumildern oder zu beheben. Insbesondere liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein klinisch anwendbares Verfahren und eine Vorrichtung zur effektiven Blutreinigung bei gleichzeitig hoher Patientensicherheit bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß Anspruch 1 und die Vorrichtung gemäß Anspruch 9 gelöst. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines DEAE-Anionenaustauschers gemäß Anspruch 12.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der
Unteransprüche.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Blut, insbesondere von Blutplasma, mit den Schritten:
- Trennen des Blutplasmas von den Blutzellen,
- Einstellen des pH-Werts des Blutplasmas auf einen einem isoelektrischen Punkt eines vorbestimmten Proteins nahekommenden pH-Wert,
- Behandlung des Blutplasmas mittels lonenaustauschchromatographie,
- Neutralisierung des pH-Werts des Blutplasmas,
- Zusammenführen des Blutplasmas und der Blutzellen.
Der Kerngedanke der Erfindung liegt hierbei darin, dass mittels der Einstellung des pH-Werts die Ladung von Proteinen, wie z.B. von Gerinnungsfaktoren, selektiv und bewusst verändert und eingestellt wird. Die Adsorption an den Ionenaustauscher und somit die Entfernung der Proteine, wie z.B. der Gerinnungsfaktoren, aus dem Blut ist abhängig von der Ladung der Proteine / Moleküle.
Vorzugsweise ist das vorbestimmte Protein ein Gerinnungsfaktor, beispielsweise Faktor I, Faktor II, Faktor IV, Faktor V, Faktor VI, Faktor VII, Faktor Vlla, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X, Faktor XI oder Faktor XII. Vorzugsweise wird das Verfahren zur Reinigung von Blut im Rahmen einer extrakorporalen Blutbehandlung ausgeführt bzw. angewandt.
Gerinnungsfaktoren sind amphotere Proteine, d.h. Proteine, welche sowohl positive als auch negative Ladungen aufweisen. Welche Ladung überwiegt, hängt vom pH-Wert der Lösung ab, in der sich das Protein / Molekül befindet. Der isoelektrische Punkt (IEP oder pl) bezeichnet den pH-Wert, bei dem die Zahl der positiven und negativen Ladungen eines amphoteren Protein/ Moleküls im statistischen Mittel genau gleich ist und das gesamte Protein/ Molekül somit elektrisch neutral ist.
Nach dem Auftrennen des Bluts in Blutplasma und Blutzellen hat das Blutplasma zunächst einen physiologischen pH von ca. 7,4. Bei einem physiologischen pH-Wert von ca. 7,4 haben die meisten Gerinnungsfaktoren eine negative Ladung. Wird der pH- Wert des Plasmas in Richtung geringerer pH-Werte (d.h. in den sauren Bereich) verschoben, wird die negative Ladung der Gerinnungsfaktoren geringer. Erreicht der pH-Wert des Blutplasmas den isoelektrischen Punkt eines bestimmten Proteins / Moleküls, wie z.B. eines Gerinnungsfaktors, ist die Ladung dieses bestimmten Proteins / Moleküls neutral und das Protein / Molekül bzw. der Gerinnungsfaktor wird nicht mehr vom Ionenaustauscher adsorbiert und nicht mehr aus dem Blutplasma entfernt.
Im Gegensatz zu Proteinen wie Gerinnungsfaktoren sind die bei der Sepsis eine kausale Rolle spielenden Endotoxine überwiegend nicht-amphoter. Nicht-amphotere Moleküle, wie LPS, LTA, andere Endotoxine und Viren verändern ihre Ladung generell nicht in Abhängigkeit vom pH-Wert der Lösung, in der sich die Endotoxine befinden. Sie
werden deshalb weitgehend unabhängig vom pH-Wert der umgebenden Lösung vom Ionenaustauscher adsorbiert.
Der Kerngedanke der Erfindung, die Ladung mindestens eines vorbestimmten Proteins durch eine Einstellung des pH-Werts der dieses Protein umgebenden Lösung auf den dem isoelektrischen Punkt des vorbestimmten Proteins entsprechenden pH- Wert neutral einzustellen, ist auf jegliches Chromatographieverfahren anwendbar, welches auf der Interaktion elektrisch geladener Komponenten (wie z.B. Ionen) beruht.
Das elektrisch neutrale vorbestimmte Protein wird, wenn der pH-Wert der das vorbestimmte Protein umgebenden Lösung dem isoelektrischen Punkt des
vorbestimmten Proteins entspricht, mittels des Chromatographieverfahrens (z.B. der lonenaustauschchromatographie), welches auf der Interaktion elektrisch geladener Komponenten (wie z.B. Ionen) beruht, nicht adsorbiert bzw. zurückgehalten, während andere unerwünschte Blutplasmabestandteile wie z.B. Endotoxine, deren elektrische Ladung nicht neutral, sondern überwiegend positiv oder überwiegend negativ ist, mittels des Chromatographieverfahrens zurückgehalten und effektiv aus dem Blutplasma entfernt werden.
Es hat sich hierbei gezeigt, dass es reicht, den pH-Wert des Blutplasmas in die Nähe des isoelektrischen Punktes eines vorbestimmten Proteins zu verschieben, um eine ungewollte Adsorption dieses Proteins an den Ionenaustauscher und somit eine ungewollte Entfernung dieses Proteins aus dem Blutplasma zu unterbinden. In anderen Worten ist es nicht erforderlich, dass der pH-Wert des Blutplasmas dem isoelektrischen Punkt eines vorbestimmten Proteins genau entspricht, vielmehr reicht es aus, wenn der pH-Wert des Blutplasmas dem isoelektrischen Punkt eines vorbestimmten Proteins nahe kommt bzw. näherungsweise entspricht.
Vorzugsweise entspricht der pH-Wert, auf den der pH-Wert des Blutplasmas eingestellt wird, dem isoelektrischen Punkt des vorbestimmten Proteins bis auf
+1 ,5/+0,0 pH-Punkt, vorzugsweise bis auf +1 ,5/+0,5 pH-Punkt, insbesondere bis auf +1 ,5/+0,75 pH-Punkt, besonders bevorzugt bis auf +1 ,5/+1 ,0 pH-Punkt. Beispielsweise kann der isoelektrische Punkt bei pH=5,5 liegen und der pH-Wert des Blutplasmas wird
auf pH=5,5-pH=7,0 (pH= 5,5 +1 ,5/+0,0 pH-Punkt), vorzugsweise auf pH=6,0-pH=7,0 (pH= 5,5 +1 ,5/+0,5 pH-Punkt), insbesondere auf pH=6,25-pH=7,0 (pH=5,5 +1 ,51+0,75 pH-Punkt), besonders bevorzugt auf pH= 6,5-pH=7,0 (pH=5,5 +1 ,5/+1 ,0 pH-Punkt) eingestellt.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung kann der pH-Wert des Blutplasmas auch auf einen pH-Wert eingestellt werden, welcher niedriger als der isoelektrische Punkt des vorbestimmten Proteins ist. Beispielsweise kann der isoelektrische Punkt bei pH=5,5 liegen und der pH-Wert des Blutplasmas wird auf einen beliebigen pH-Wert eingestellt, welcher niedriger als pH=5,5 ist. Beispielsweis kann vorgesehen sein, dass der pH-Wert des Blutplasmas auf einen pH-Wert eingestellt wird, welcher niedriger als pH=5,5. Insbesondere ist ein Wert zwischen pH=5,5 und pH=5,0 bevorzugt.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist das vorbestimmte Protein ein
Gerinnungsfaktor, insbesondere Faktor II, und / oder der pH-Wert des Blutplasmas wird auf einen pH-Wert eingestellt, welcher niedriger als der isoelektrische Punkt des Gerinnungsfaktors ist.
Die Einstellung des pH-Werts des Blutplasmas kann mittels einer direkten oder indirekten Zuführung von Protonen (H+) zu dem Blutplasma beispielsweise in Form einer sauren Lösung oder auch als Feststoff und / oder mittels einer Dialyse des Blutplasmas mit einem sauren Puffer, insbesondere einem Acetatpuffer, erfolgen.
Alternativ oder zusätzlich können dem Blutplasma auch Hydroxid-Ionen (OH-) entzogen werden.
Die Neutralisierung des pH-Werts des Blutplasmas kann mittels einer direkten oder indirekten Zuführung von Hydroxid-Ionen (OH-) zu dem Blutplasma und / oder mittels einer Dialyse des Blutplasmas mit einem basischen Puffer, insbesondere einem Bikarbonatpuffer, erfolgen. Eine Dialyse des Blutplasmas mit einem basischen Puffer, insbesondere einem Bikarbonatpuffer, hat den Vorteil, dass überschüssige Flüssigkeit aus dem Blutplasma entfernt werden kann. Alternativ oder zusätzlich können dem Blutplasma auch Protonen (H+) entzogen werden.
Als neutral bzw. neutralisiert ist ein pH-Wert von pH=7,4 anzusehen, oder ein pH- Wert, welcher nur unwesentlich von pH=7,4 abweicht. Insbesondere ist ein pH-Wert zwischen pH=7,2 und pH=7,6 als neutral bzw. neutralisiert zu verstehen.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung erfolgt die Behandlung des Blutplasmas mittels Anionenaustauschchromatographie, vorzugsweise unter Verwendung eines DEAE-Anionenaustauschers, insbesondere eines DEAE-Anionenaustauschers mit Tentakeltechnologie.
Grundsätzlich ist die vorliegende Erfindung jedoch nicht auf die
Anionenaustauschchromatographie beschränkt, sondern umfasst auch andere Arten der lonenaustauschchromatographie, wie beispielsweise die
Kationenaustauschchromatographie oder auch verschiedene Multimodal- Chromatographien, welche vorzugsweise lonenaustauschchromatographie umfassen.
Grundsätzlich wäre es auch denkbar, ein erfindungsgemäßes Verfahren mit Kationenaustauschchromatographie auszuführen. Kationenaustauscher sind
Ionenaustauscher, bei denen eine anionische Gruppe (Anion) kovalent an eine feste unlösliche Matrix gebunden ist, während das neutralisierende Kation (neutral) nur ionisch gebunden und daher durch andere Kationen austauschbar ist.
Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren kann auch eine Anzahl oder eine Mehrzahl von vorbestimmten Proteinen (beispielsweise mehrere Gerinnungsfaktoren) berücksichtigt werden. Hierbei können die verschiedenen vorbestimmten Proteine der Mehrzahl an Proteinen jeweils unterschiedliche isoelektrische Punkte aufweisen.
Bei der Einstellung des pH-Werts des Blutplasmas vor der
lonenaustauschchromatographie werden in diesem Fall die isoelektrischen Punkte aller Proteine der Mehrzahl an Proteinen berücksichtigt. Allgemein gesagt, wird der pH-Wert des Blutplasmas auf einen pH-Wert eingestellt, bei dem alle Proteine der Mehrzahl an vorbestimmten Proteinen eine gewünschte Ladung (positiv, neutral, negativ) aufweisen.
Beispielsweise kann der pH-Wert des Blutplasmas auf einen Mittelwert der den isoelektrischen Punkten der Proteine der Mehrzahl an vorbestimmten Proteinen entsprechenden pH-Werte eingestellt werden. Alternativ kann der pH-Wert des
Blutplasmas auch auf den niedrigsten oder den höchsten der den isoelektrischen Punkten der Proteine der Mehrzahl an vorbestimmten Proteinen entsprechenden pH- Werte eingestellt werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Programm produkt, welches beim Auslesen durch eine Vorrichtung bewirkt, dass eine Vorrichtung ein erfindungsgemäßes Verfahren ausführt. Mittels eines derartigen Programmprodukts können bestehende Vorrichtungen zur Ausführung eines erfindungsgemäßen
Verfahrens nachgerüstet werden.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft eine Blutbehandlungsmaschine, insbesondere eine Apheresemaschine, welche dazu ausgelegt bzw. dazu konfiguriert ist, ein erfindungsgemäßes Verfahren auszuführen.
Eine derartige Blutbehandlungsmaschine weist beispielsweise auf:
- einen Plasmafilter zum Trennen von Blut in Blutplasma und Blutzellen,
- eine dem Plasmafilter fluidisch nachgeschaltete
Zuführvorrichtung/Mischpumpe zum Einstellen des pH- Werts des
Blutplasmas,
- einen der Zuführvorrichtung/Mischpumpe nachgeschalteten
Ionenaustauscher, welcher vorzugsweise ein Anionenaustauscher ist, und
- einen dem Ionenaustauscher fluidisch nachgeschalteten Dialysator, mittels dem eine Dialyse unter Verwendung von saurer oder basischer Dialysierflüssigkeit ausgeführt werden kann.
Hierbei ist der Ionenaustauscher bevorzugt ein Anionenaustauscher,
beispielsweise ein DEAE-Anionenaustauscher, insbesondere ein DEAE- Anionenaustauscher mit Tentakeltechnologie. Der Ionenaustauscher kann auch für eine Multimodal-Chromatographie beispielsweise mit zusätzlichen hydrophobischen
Interaktionen konfiguriert sein.
Die Einstellung des pH-Werts des Blutplasmas kann mittels der
Zuführvorrichtung/Mischpumpe erfolgen, welche dem Blutplasma direkt oder indirekt Protonen (H+), beispielsweise in Form einer sauren Lösung oder auch als Feststoff, zuführt.
Alternativ oder zusätzlich kann die Einstellung des pH-Werts auch mittels einer Dialyse des Blutplasmas mit einem sauren Puffer, insbesondere einem Acetatpuffer, erfolgen. Hierfür kann ein dem Ionenaustauscher fluidisch vorgeschalteter Dialysator vorgesehen sein, mittels dem eine Dialyse unter Verwendung von saurer
Dialysierflüssigkeit (und grundsätzlich auch von basischer Dialysierflüssigkeit) ausgeführt werden kann.
Die Neutralisierung des pH-Werts des Blutplasmas kann mittels der
Zuführvorrichtung/Mischpumpe erfolgen, welche dem Blutplasma direkt oder indirekt Hydroxid-Ionen (OH-), beispielsweise in Form einer basischen Lösung oder auch als Feststoff, zuführt.
Alternativ oder zusätzlich kann die Neutralisierung des pH-Werts des Blutplasmas auch mittels einer Dialyse des Blutplasmas mit einem basischen Puffer, insbesondere einem Bikarbonatpuffer, erfolgen. Eine Dialyse des Blutplasmas mit einem basischen Puffer, insbesondere einem Bikarbonatpuffer, hat den Vorteil, dass überschüssige Flüssigkeit aus dem Blutplasma entfernt werden kann.
Da die Neutralisierung des pH-Werts des Blutplasmas erfolgt, nachdem das Blutplasma den Ionenaustauscher durchströmt hat, ist hierfür vorzugsweise ein dem Ionenaustauscher fluidisch nachgeschalteter Dialysator vorgesehen, mittels dem eine Dialyse unter Verwendung von basischer Dialysierflüssigkeit (und grundsätzlich auch von saurer Dialysierflüssigkeit) ausgeführt werden kann.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines DEAE- Anionenaustauschers, insbesondere eines DEAE-Anionenaustauschers mit
Tentakeltechnologie, zur extrakorporalen Blutbehandlung.
In anderen Worten ermöglicht es die vorliegende Erfindung, Anionenaustauscher, insbesondere DEAE-Anionenaustauscher, insbesondere DEAE-Anionenaustauscher mit Tentakeltechnologie, zur extrakorporalen Blutbehandlung / zur extrakorporalen Aufbereitung / Reinigung von Blut oder Blutplasma einzusetzen.
Blutplasma kann somit effektiv und selektiv von Endotoxinen gereinigt werden, ohne dass wichtige Bestandteile des Blutplasmas, wie z.B. Gerinnungsfaktoren, ungewollt aus dem Blutplasma entfernt werden.
Gemäß diesem Aspekt kann das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise in Blutbanken zum Behandeln von Spenderblut Einsatz kommen. Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann auch im Rahmen einer extrakorporalen Blutbehandlung angewandt werden.
In anderen Worten ausgedrückt, betrifft die Erfindung gemäß einer Ausführungsform ein Verfahren mit den Schritten:
-Trennen des Blutplasmas von den Blutzellen,
- Anreichern des Blutplasmas mit H+ - Ionen (Protonen), bis der pH-Wert des Blutplasmas dem isoelektrischen Punkt des Gerinnungsfaktors II nahekommt (pH-Wert des Blutplasmas ist niedriger als pH=5,5),
-Einsetzen der Anionenaustauschchromatographie / eines Anionenaustauschers zur Entfernung von Pathogenen aus dem Blutplasma,
- Neutralisieren des pH-Werts des Blutplasmas auf einen pH-Wert von
ca. 7,4,
- Zusammenführen des Blutplasmas und der Blutzellen.
Die Neutralisierung des Blutplasmas kann mittels eines beliebigen Verfahrens, beispielsweise durch die Zuführung einer Base, OH -Ionen, durch Entfernung der H+- lonen oder mittels einem basischen Puffer, wie z.B. einem Bikarbonatpuffer, erfolgen.
Eine Senkung des pH-Werts des Blutplasmas kann durch Zugabe von H+-lonen in verschiedener Form erreicht werden, beispielsweise durch Zugabe einer Säure wie HCl oder eines Puffers mit saurem pH-Wert wie z.B. eines Azetatpuffers.
Die Neutralisierung des pH-Werts des Blutplasmas, nachdem dieses den
Ionenaustauscher durchlaufen hat, kann durch Zugabe einer Base, wie z.B. NaOH oder durch eine Dialyse mit einem basischen Puffer, wie z.B. einem Bikarbonatpuffer, erreicht werden.
Beispielsweise wird nach der Trennung des Blutplasmas von den Blutzellen das Plasma mit einem Acetatpuffer mit einen pH-Wert von ca. 4 versetzt und somit der pH- Wert des Plasmas auf einen pH-Wert von ca. 5 gesenkt. Das Blutplasma fließt daraufhin durch den Ionenaustauscher.
Nach dem Ionenaustauscher fließt das Blutplasma durch einen Dialysator. Dieser wird vorzugsweise auf der Dialysatseite mit Bikarbonatpuffer durchströmt. In anderen Worten wird als Dialysierflüssigkeit ein Bikarbonatpuffer eingesetzt. Dadurch wird der neutrale pH-Wert oder der physiologische pH-Wert des Blutplasmas wieder hergestellt und zusätzliche Flüssigkeit, welche beispielsweise durch die
lonenaustauschchromatographie in das Blutplasma eingebracht wurde, aus dem
Blutplasma entfernt.
Das Blutplasma hat in diesem gereinigten Zustand seine physiologische
Zusammensetzung (inklusive eines physiologischen pH-Werts und im Blutplasma vorhandenen Blutgerinnungsfaktoren) und ist von etwaigen zuvor im Blutplasma enthaltenen Endotoxinen, wie LPS, LTA, Viren etc. effektiv gereinigt.
Kurzbeschreibung der Figuren
Fig. 1 zeigt beispielhaft die Adsorption verschiedener Gerinnungsfaktoren an einen DEAE-Anionenaustauscher bei einem physiologischen pH-Wert des Blutplasmas.
Fig. 2 zeigt beispielhaft die Adsorption verschiedener Gerinnungsfaktoren an einen DEAE-Anionenaustauscher bei einem pH-Wert des Blutplasmas von pH=5,1.
Die Fign. 3a-b veranschaulichen die pH-Wert-abhängige Adsorption verschiedener Gerinnungsfaktoren an einen DEAE- Anionenaustauscher.
Fig. 4 zeigt beispielhaft eine erfindungsgemäße Vorrichtung.
Beschreibung der Ausführungsformen
Nachstehend werden Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die zugehörigen Figuren beschrieben.
Fig.1 zeigt beispielhaft die Adsorption verschiedener Gerinnungsfaktoren an einen DEAE-Anionenaustauscher bei einem physiologischen pH-Wert des Blutplasmas. In einem in-vitro Versuchsaufbau wurden DEAE-Anionenaustauscher mit Blutplasma mit physiologischem pH-Wert von PH=7,4 durchströmt und die Adsorption von
Gerinnungsfaktoren bestimmt.
Die Faktoren II, IX und X der Blutgerinnungskaskade wurden vom DEAE- Anionenaustauscher effektiv adsorbiert und in großem Ausmaß aus dem Blut entfernt. Zu einem Zeitpunkt t1 liegt die messbare Menge der Gerinnungsfaktoren II, IX und X im Blutplasma bei null. Der globale Gerinnungsstatus sank nach der Behandlung mit dem DEAE-Anionenaustauscher somit auf ein gefährlich niedriges Maß.
Die Menge des Gerinnungsfaktors IX blieb dauerhaft niedrig, während die
Gerinnungsfaktoren II und X nach dem Durchlauf eines Plasmavolumens (ca. 3L, nach einem Zeitpunkt t2 in Fig. 1 ) durch den DEAE-Anionenaustauscher nicht mehr adsorbiert wurden. Daher steigen die Mengen der Gerinnungsfaktoren II und X nach dem Zeitpunkt t2 in Fig. 1 an.
Fig. 2 zeigt beispielhaft die Adsorption verschiedener Gerinnungsfaktoren an einen DEAE-Anionenaustauscher bei einem pH-Wert des Blutplasmas von pH=5,1.
Die Mengen der Gerinnungsfaktoren II, IX und X bleiben stabil und es erfolgt keine Adsorption an den DEAE-Anionenaustauscher. Der Einbruch der Kurven zum Zeitpunkt t3 in Fig. 2 ist ein Artefakt und rührt von einem Verdünnungseffekt von im System vorhandener Spüllösung her.
Die Fign. 3a-b veranschaulichen die pFI-Wert-abhängige Adsorption der
Gerinnungsfaktoren Faktor I, Faktor II, Faktor IV, Faktor V, Faktor VI, Faktor VII, Faktor Vlla, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X, Faktor XI und Faktor XII an einen DEAE- Anionenaustauscher. Die Position der senkrechten Pfeile auf der pFI-Skala zeigt den isoelektrischen Punkt von den jeweiligen Gerinnungsfaktoren. Fig. 3a zeigt hierbei die Adsorption der Gerinnungsfaktoren, wenn das Blutplasma einen pH von ca. 7,4 hat. Fig. 3b zeigt hierbei die Adsorption der Gerinnungsfaktoren, wenn das Blutplasma einen pH von ca. 5,1 hat.
Wie in Fig. 3a gezeigt, erfolgt bei einem pFI-Wert des Blutplasmas von ca. 7,4 eine Adsorption der Faktoren II, IX und X an den DEAE- Anionenaustauscher, während die Faktoren V, I, Vlla, VII, VIII, XII und XI nicht adsorbiert werden. Bei einer Verschiebung des pFI-Werts von dem neutralen pFI-Wert von 7,4 in den sauren Bereich (niedrigerer pFI-Wert), nimmt die negative Ladung der Proteine / Moleküle zu. Bei einer
Verschiebung des pH-Werts von dem neutralen pH-Wert von 7,4 in den basischen Bereich (höherer pH-Wert), nimmt die positive Ladung der Proteine / Moleküle zu.
Wie in Fig. 3b gezeigt ist, erfolgt bei einem pH-Wert des Blutplasmas von ca. 5,1 keine Adsorption der Faktoren II, IX, X, V, I, Vlla, VII, VIII, XII und XI an den DEAE- Anionenaustauscher. Der pH-Wert von ca. 5,1 kommt dem isoelektrischen Punkt von Faktor II nahe, welcher bei pH=4,4 liegt und ist 1 ,1 höher als der isoelektrische Punkt von Faktor II.
Bei einer Verschiebung des pH-Werts von dem sauren pH-Wert von 5,1 weiter in den sauren Bereich (niedrigerer pH-Wert), nimmt die negative Ladung der Proteine / Moleküle zu. Bei einer Verschiebung des pH-Werts von dem sauren pH-Wert von 5,1 in den basischen Bereich (höherer pH-Wert), nimmt die positive Ladung der Proteine / Moleküle zu.
Sowohl bei dem in Fig. 3a gezeigten Fall als auch dem in Fig. 3b gezeigten Fall werden nicht-amphotere pathogene Substanzen wie Endotoxine, Viren,
Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA), mit gleichbleibender Effektivität von dem DEAE- Anionenaustauscher gebunden und somit aus dem
Blutplasma entfernt.
Mit der Einstellung des pFI-Werts des Blutplasmas vor der
lonenaustauschchromatographie kann daher das Adsorptions- bzw. Bindungsverhalten von amphoteren Proteinen / Molekülen wie Gerinnungsfaktoren selektiv derart beeinflusst werden, dass diese Proteine / Moleküle nicht adsorbiert bzw. aus dem Blutplasma entfernt werden, während nicht amphotere Proteinen / Moleküle wie beispielsweise Pathogene und Endotoxine weiterhin effektiv adsorbiert und somit aus dem Blutplasma entfernt werden.
Fig. 4 zeigt schematisch den Aufbau einer erfindungsgemäßen
Blutbehandlungsmaschine, welche dazu ausgelegt / konfiguriert ist, ein
erfindungsgemäßes Verfahren auszuführen. Vorzugsweise ist die
Blutbehandlungsmaschine eine Apheresemaschine.
Die Blutmaschine ist über eine Blutzuflussleitung und eine Blutabflussleitung mit einem Patienten verbunden bzw. verbindbar. Das Blut von der Blutzuflussleitung wird durch eine erste Förderpumpe 5 gefördert und fließt dann weiter in einen zwei
Ausgänge aufweisenden Plasmafilter 1 , in welchem das Blut in Blutplasma und
Blutzellen aufgetrennt wird, wobei das Blutplasma von einem Ausgang des
Plasmafilters 1 ausfließt und die Blutzellen von einem anderen Ausgang des
Plasmafilters 1 ausfließen.
Das durch den Plasmafilter 1 abgetrennte Blutplasma wird weiter in einer
Zuführvorrichtung/Mischpumpe 2 mit einem von einem Fluidvorrat/-Quelle 6
bereitgestellten Acetatpuffer mit einem pFI-Wert von 4 gemischt, um den pFI-Wert des Blutplasmas auf einen pFI-Wert von ca. 5 zu senken.
Das so beahndelte Blutplasma wird von der Zuführvorrichtung/Mischpumpe 2 zu einem Ventil/einer Absperrvorrichtung zur Steuerung der Durchströmung geführt. Von dort fließt es weiter in einen Ionenaustauscher 3, welcher in dieser Ausführung ein Anionenaustauscher, vorzugweise ein Anionenaustauscher mit Tentakeltechnologie, ist.
Im Ionenaustauscher 3 findet ein lonenaustausch mit Ladungen der Moleküle statt. Liegt der pH-Wert des Blutplasmas in der Nähe des isoelektrischen Punktes, wird der amphotere Gerinnungsfaktor nicht mehr vom Ionenaustauscher 3 adsorbiert. Nicht amphotere Moleküle, wie LPS, LTA und Viren werden weitergehend unabhängig vom pH-Wert des Blutplasmas im Ionenaustauscher 3 adsorbiert.
Nach dem Ionenaustauscher 3 strömt das Blutplasma durch eine Blutseite eines Dialysators 4, wobei die Dialysatseite des Dialysators 4 mit eineraus einem weiteren Fluidvorrat/-Quelle 6 bereitgestellten Bikarbonatpuffer als Dialysierflüssigkeit
durchströmt wird, um einen neutralen physiologischen pH-Wert des Blutplasmas wieder herzustellen, wobei eine zweite Förderpumpe 5 zwischen dem Fluidvorrat/-Quelle 6 mit Bikarbonatpuffer und einem Eingang des Dialysators 4 angeordnet ist, um den
Bikarbonatpuffer zu fördern.
Das gereinigte und wieder einen physiologischen pH-Wert aufweisende
Blutplasma wird weiter durch eine dritte dem Dialysator 4 nachgeschaltete
Förderpumpe 5 gefördert und dann mit den Blutzellen aus dem Plasmafilter 1
wiedervereint.
Das behandelte Blut strömt dann weiter durch eine Luftfalle mit einem
Luftdetektor, in welcher Luftblasen entdeckt und entfernt werden, und fließt zu einem anderen nachgeschalteten Ventil/ einer Absperrvorrichtung zur Steuerung der
Durchströmung, welches/welche mit der Blutabflussleitung verbunden ist. Von dort gelangt das behandelte Blut wieder zum Patienten zurück.
Zusammenfassend weist die Blutbehandlungsmaschine einen Plasmafilter 1 zum Trennen von Blut in Blutplasma und Blutzellen, eine dem Plasmafilter 1 fluidisch nachgeschaltete Zuführvorrichtung/Mischpumpe 2 zum Einstellen des pH- Wertes des
Blutplasmas, einen der Zuführvorrichtung/Mischpumpe 2 nachgeschalteten Ionenaustauscher 3, welcher vorzugsweise ein Anionenaustauscher ist, und einen dem Ionenaustauscher 3 fluidisch nachgeschalteten Dialysator 4 auf, mittels dem eine Dialyse unter Verwendung von saurer oder basischer Dialysierflüssigkeit ausgeführt werden kann.
Nachdem das Blut in dem Plasmafilter 1 in Blutplasma und Blutzellen aufgetrennt wurde, wird das Blutplasma mittels der Zuführvorrichtung/Mischpumpe 2 mit einem von einem Fluidvorrat/-Quelle 6 bereitgestellten Acetatpuffer mit einem pH von 4 versetzt, um den pH- Wert des Blutplasmas auf einen pH-Wert von ca. 5 zu senken.
Daraufhin strömt das Blutplasma durch ein Ventil/eine Absperrvorrichtung in den Ionenaustauscher 3, welcher in dieser Ausführungsform ein Anionenaustauscher, vorzugsweise ein Anionenaustauscher mit Tentakeltechnologie, ist.
Nach dem Ionenaustauscher 3 fließt das Blutplasma durch den Dialysator 4. Dieser wird auf der Dialysatseite mit einem von einem anderen Fluidvorrat/-Quelle 6 bereitgestellten und durch eine zweite Förderpumpe 5 geförderten Bikarbonatpuffer als Dialysierflüssigkeit durchströmt. Somit wird durch den Dialysator 4 wieder ein neutraler physiologischer pH-Wert des Blutplasmas hergestellt und zusätzliche Flüssigkeit aus dem Blutplasma entfernt.
Anschließend wird das gereinigte Blutplasma durch eine dritte Förderpumpe 5 wieder mit den Blutzellen aus dem Plasmafilter 1 vereint. Das vereinte und gereinigte Blut fließt durch eine Luftfalle mit einem Luftdetektor und ein anderes nachgeschaltetes Ventil/eine Absperrvorrichtung und schließlich von der Blutbehandlungsmaschine zurück zum Patienten.
Claims
1. Verfahren zur Reinigung von Blut, mit den Schritten:
- Trennen des Blutplasmas von den Blutzellen,
- Einstellen des pH-Werts des Blutplasmas auf einen einem isoelektrischen Punkt mindestens eines vorbestimmten Proteins nahekommenden pH- Wert,
- Behandeln des Blutplasmas mittels lonenaustauschchromatographie,
- Neutralisieren des pH-Werts des Blutplasmas,
- Zusammenführen des Blutplasmas und der Blutzellen.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert, auf den der pH-Wert des Blutplasmas eingestellt wird, dem isoelektrischen Punkt des vorbestimmten Proteins bis auf +1 ,5/+0,0 pH-Punkt, vorzugsweise bis auf +1.5/+0,5 pH- Punkt, insbesondere bis auf + 1 ,5/+0,75 pH-Punkt, besonders bevorzugt bis auf +1 ,5
/+ 1 ,0 pH-Punkt entspricht.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass der pH-Wert des Blutplasmas auf einen pH-Wert eingestellt wird, welcher niedriger als der isoelektrischen Punkt des vorbestimmten Proteins ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass das vorbestimmte Protein ein Gerinnungsfaktor, insbesondere Faktor II, ist und / oder der pH-Wert des Blutplasmas auf einen pH-Wert eingestellt wird, welcher niedriger als der isoelektrischen Punkt des Gerinnungsfaktors ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass der pH-Wert des Blutplasmas auf einen pH-Wert eingestellt wird, welcher niedriger als pH=5,5 ist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass die Einstellung des pH-Werts des Blutplasmas mittels der Zuführung von Protonen zu dem Blutplasma und / oder einer Dialyse des Blutplasmas mit einem sauren Puffer, insbesondere einem Acetatpuffer, erfolgt.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass die Neutralisierung des pH-Werts des Blutplasmas mittels der Zuführung von Hydroxid-Ionen zu dem Blutplasma und / oder einer Dialyse des
Blutplasmas mit einem basischen Puffer, insbesondere einem Bikarbonatpuffer, erfolgt.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass die Behandlung des Blutplasmas mittels
Anionenaustauschchromatographie, vorzugsweise unter Verwendung eines DEAE- Anionenaustauschers, insbesondere eines DEAE-Anionenaustauschers mit
Tentakeltechnologie, erfolgt.
9. Programmprodukt, welches beim Auslesen durch eine Vorrichtung bewirkt, dass die Vorrichtung ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 -8 ausführt.
10. Blutbehandlungsmaschine, insbesondere Apheresemaschine, welche dazu konfiguriert ist, ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 -8 auszuführen.
11. Blutbehandlungsmaschine nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Blutbehandlungsmaschine aufweist:
einen Plasmafilter (1 ) zum Trennen von Blut in Blutplasma und Blutzellen, eine dem Plasmafilter (1 ) fluidisch nachgeschaltete
Zuführvorrichtung/Mischpumpe (2) zum Einstellen des pH- Werts des Blutplasmas, einen der Zuführvorrichtung/Mischpumpe (2) nachgeschalteten Ionenaustauscher (3), welcher vorzugsweise ein Anionenaustauscher ist, und
einen dem Ionenaustauscher (3) fluidisch nachgeschalteten Dialysator (4), mittels dem eine Dialyse unter Verwendung von saurer oder basischer Dialysierflüssigkeit ausgeführt werden kann.
12. Blutbehandlungsmaschine nach Anspruch 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, dass der Ionenaustauscher (3) ein DEAE-Anionenaustauscher, insbesondere ein DEAE-Anionenaustauscher mit Tentakeltechnologie, ist.
13. Verwendung eines DEAE-Anionenaustauschers, insbesondere eines DEAE- Anionenaustauschers mit Tentakeltechnologie, zur Reinigung von Blutplasma, insbesondere im Rahmen einer extrakorporalen Blutbehandlung.
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